CN116410317A - 抗体-药物偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

抗体-药物偶联物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116410317A CN202211640665.XA CN202211640665A CN116410317A CN 116410317 A CN116410317 A CN 116410317A CN 202211640665 A CN202211640665 A CN 202211640665A CN 116410317 A CN116410317 A CN 116410317A
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刘金明
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袁晓曦
张运刚
宋宏梅
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Abstract

本发明涉及抗体药物偶联物及其制备方法和应用，具体涉及一类特异性地识别人ROR1抗体的药物偶联物，其具有式I所示结构。制得的抗体药物偶联物具有较优的药物抗体偶联比，所述化合物可用作治疗细胞异常增殖方面疾病的药物，Ab‑[M‑L‑E‑D]x式Ⅰ。

Description

抗体-药物偶联物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一类特异性地识别人ROR1(酪氨酸激酶样受体孤儿受体1，receptortyrosinekinase-like orphan receptor 1)的抗体药物偶联物，制得的抗体药物偶联物具有较优的药物抗体偶联比，所述偶联物可用作治疗细胞异常增殖方面疾病的药物。
背景技术
近年来的研究表明，免疫疗法有潜力成为癌症治疗的新方法。免疫可分为先天性免疫和适应性免疫(Allergy Asthma Clin Immunol.14:49.2018)。先天性免疫是快速的非特异性免疫应答(固有免疫)，可抵抗环境侵害，包括但不限于病原体(例如细菌或病毒)。适应性免疫是较慢但更具特异性的免疫应答，赋予宿主长期或保护性免疫，并涉及初始T淋巴细胞分化和激活为CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞，从而促进细胞和体液免疫。先天性免疫系统的抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)，通过吞噬和处理外来抗原并且在细胞表面上呈递它们给T细胞由此激活T细胞应答，从而作为在先天性和适应性免疫系统之间的关键环节。近年来，关于免疫调节剂的开发日趋高涨，例如Toll-Like Receptor激动剂(Oncoimmuology.9,1–12,2020；OncoTargets and Therapy.13,10039–10060,2020)、STING激动剂、NLRP3激动剂、PD-1/PD-L1抑制剂等免疫调节分子(J Gerontol A Biol SciMed Sci.13,1457-1464,2020；European Journal of Medicinal Chemistry.218,113356,2021；J Immunol January 1,202,11-19,2019)。
然而单独免疫调节剂(激动剂/抑制剂)在全身给药后呈现出与广泛的免疫激活相关的毒性(免疫风暴)。近年来有研究表明，利用抗体的靶向性，通过连接子把免疫调节剂递送到肿瘤微环境(Nature Cancer.2,18–33,2021)，在肿瘤微环境中触发局部免疫反应，从而达到肿瘤清除和免疫记忆的目的，因此具有临床治疗的潜力。
ROR1是ROR受体家族的成员，也称为酪氨酸蛋白激酶跨膜受体，属于I型膜蛋白。生理条件下，ROR1在胚胎发育过程中高表达，在调节胚胎的肌肉和骨骼发育中具有重要作用。近年来研究发现，ROR1在脂肪组织、胰腺、肺、少量B前体细胞中也有极少量表达，而在多种肿瘤组织中呈现高表达。研究表明，ROR1能够与配体分子Wnt5a(主要)或EGF结合(Protein&Cell 5.496–502,2014.)，参与调节细胞增殖、存活与迁移。ROR1过表达与肿瘤不良预后相关，研究发现靶向ROR1能有效抑制移植瘤的生长。
目前临床在研ROR1靶点适应症涵盖了血液瘤和实体瘤。主要的治疗策略集中在单抗、CAR-T、抗体偶联药物(ADC)等几个方向。其中Anti-ROR1抗体偶联药物包括VLS-101、NBE-002、LCB-71等，治疗MCL、BCL、NHL、NSCLC、TNBC等适应症。以上ROR1-ADC所使用的效应分子作用机制多为微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶抑制剂和DNA交联剂。上述效应分子均为细胞毒类化合物，具有血液毒性、神经毒性等不良反应(Nat Biotechnol.30(2):184-9,2012；Bioconjugate Chem.26,145-152,2015；Bioorg.Med.Chem.Lett.30,127640,2020)
目前尚未有ROR1-免疫调节剂的抗体药物偶联物报道。我们通过研究惊奇地发现ROR1-免疫调节剂抗体药物偶联物具有良好的抗肿瘤效果。
发明内容
本发明涉及一类特异性地识别人ROR1的抗体药物偶联物。制得的抗体药物偶联物具有较优的药物抗体偶联比，所述偶联物可用作治疗细胞异常增殖方面疾病的药物。
在第一个方面，本发明提供一种抗体药物偶联物，其具有式I所示结构：
Ab-[M-L-E-D]x
式I
其中:
Ab是与ROR1特异性结合的抗体或其抗原结合片段；
M是和抗体的接头部位；
L是连接接头M和E之间的连接子；
E是连接L和D的结构片段；
D是药物分子片段；
且x为1～10，例如x为1，2，3，4，5，6，7，8，9或10。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含下述VH(重链可变区)和/或VL(轻链可变区)，其中CDR(互补决定区)按Chothia编号系统定义：
(a)包含如下3个CDR的VH：具有SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQID NO.:4所示氨基酸序列的CDR-H2，具有SEQ ID NO.:5所示氨基酸序列的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的VL：具有SEQ ID NO.:6所示氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO.:7所示氨基酸序列的CDR-L2，具有SEQ ID NO.:8所示氨基酸序列的CDR-L3；
(b)包含如下3个CDR的VH：具有SEQ ID NO.:11所示氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQID NO.:12所示氨基酸序列的CDR-H2，具有SEQ ID NO.:13所示氨基酸序列的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的VL：具有SEQ ID NO.:14所示氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO.:15所示氨基酸序列的CDR-L2，具有SEQ ID NO.:16所示氨基酸序列的CDR-L3；
(c)包含如下3个CDR的VH：具有SEQ ID NO.:19所示氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQID NO.:20所示氨基酸序列的CDR-H2，具有SEQ ID NO.:21所示氨基酸序列的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的VL：具有SEQ ID NO.:22所示氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO.:15所示氨基酸序列的CDR-L2，具有SEQ ID NO.:16所示氨基酸序列的CDR-L3；
(d)具有SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的VH；和/或，具有SEQ IDNO.:2所示氨基酸序列的VL；
(e)具有SEQ ID NO.:9所示氨基酸序列的VH；和/或，具有SEQ IDNO.:10所示氨基酸序列的VL；或者，
(f)具有SEQ ID NO.:17所示氨基酸序列的VH；和/或，具有SEQ ID NO.:18所示氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO.:24所示的CH(重链恒定区)；和/或SEQ ID NO.:25所示的CL(轻链恒定区)。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自：
(1)包含SEQ ID NO.:1所示的VH和SEQ ID NO.:24所示的CH的重链，和，包含SEQID NO.:2所示的VL和SEQ ID NO.:25所示的CL的轻链；
(2)包含SEQ ID NO.:9所示的VH和SEQ ID NO.:24所示的CH的重链，和，包含SEQID NO.:10所示的VL和SEQ ID NO.:25所示的CL的轻链；或者，
(3)包括SEQ ID NO.:17所示的VH和SEQ ID NO.:24所示的CH的重链，和，包括SEQID NO.:18所示的VL和SEQ ID NO.:25所示的CL的轻链。
在一些实施方案中，所述的抗体药物偶联物中Ab通过巯基(-SH)或者氨基(-NH2)与M连接。
在一些实施方案中，所述的抗体药物偶联物中M通过取代、加成或缩合反应与Ab上的巯基或氨基连接。
在一些实施方案中，
Figure BDA0004008803350000041
选自/>
Figure BDA0004008803350000042
其中，A为5元或6元脂杂环或芳杂环，当A为脂杂环时，其任选地被一个或两个氧基(＝O)取代；
Z1选自化学键、C1-6亚烷基和C1-6亚酰基，所述C1-6亚酰基中的一个或多个碳原子任选地被选自N、O和S的杂原子取代；
Z2和Z3各自独立地选自化学键、C1-20亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基、C1-6亚酰氨基、聚乙二醇亚基和5元或6元脂杂环，所述C1-20亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基和C1-6亚酰氨基任选地被一个或多个氨基或选自N、O和S的杂原子取代，所述脂杂环任选地被一个或两个氧基(＝O)取代；
Z4选自化学键、C1-20亚烷基和5元或6元亚环烷基；
Z5选自
Figure BDA0004008803350000051
条件是，Z1、Z2、Z3和Z4不同时为化学键。
在一些实施方案中，
Figure BDA0004008803350000052
选自/>
Figure BDA0004008803350000053
其中，A为5元或6元脂杂环或芳杂环，当A为脂杂环时，其任选地被一个或两个氧基(＝O)取代；
Z1选自化学键和C1-6亚酰基，所述C1-6亚酰基中的一个或多个碳原子任选地被选自N、O和S的杂原子取代；
Z2和Z3各自独立地选自化学键、C1-20亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基、C1-6亚酰氨基、聚乙二醇亚基和5元或6元脂杂环，所述C1-20亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基和C1-6亚酰氨基任选地被一个或多个选自N、O和S的杂原子取代，所述脂杂环任选地被一个或两个氧基(＝O)取代；
Z4选自化学键、C1-20亚烷基和5元或6元亚环烷基；
Z5为
Figure BDA0004008803350000054
条件是，Z1、Z2、Z3和Z4不同时为化学键。
在一些实施方案中，
Figure BDA0004008803350000055
选自/>
Figure BDA0004008803350000056
其中，A选自琥珀酰亚胺环和嘧啶环；
Z1选自化学键和
Figure BDA0004008803350000057
Z2选自C1-6亚烷基、C2-6亚炔基、亚乙酰氨基、四聚乙二醇亚基和
Figure BDA0004008803350000061
Z3选自化学键、C1-6亚烷基、四聚乙二醇亚基和
Figure BDA0004008803350000062
Z4选自化学键、C1-6亚烷基和环己基；
Z5为
Figure BDA0004008803350000063
在一些实施方案中，
Figure BDA0004008803350000064
选自以下结构：
Figure BDA0004008803350000065
在一些实施方案中，M选自以下结构：
Figure BDA0004008803350000066
Figure BDA0004008803350000071
在一些实施方案中，M选自以下结构：
Figure BDA0004008803350000072
在所述的抗体药物偶联物中，所述L是连接接头M和E之间的连接子。在一些优选实施方案中，L不存在或者选自一个或多个如下所述的基团：C1-6亚烷基、氨基、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Phe、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、聚乙二醇片段、季铵盐片段、磺酸及其盐、磷酸及其盐、
Figure BDA0004008803350000073
Figure BDA0004008803350000074
Figure BDA0004008803350000081
s各自独立地选自1-10的整数。
在一些实施方案中，L优选自不存在或以下结构：
Figure BDA0004008803350000082
Figure BDA0004008803350000091
m为0-10的整数。
在一些实施方案中，L选自以下结构：
Figure BDA0004008803350000092
在一些实施方案中，L不存在。
在一些优选实施方案中，Ab-M-L优选以下结构：
Figure BDA0004008803350000093
Figure BDA0004008803350000101
在一些实施方案中，E不存在或为亚甲基、-NH-CH2-、
Figure BDA0004008803350000102
Figure BDA0004008803350000103
在一些实施方案中，E不存在或为
Figure BDA0004008803350000104
在一些实施方案中，E不存在。
在一些实施方案中，所述药物分子选自Toll-Like Receptor激动剂、STING激动剂、NLRP3激动剂、PD-1/PD-L1抑制剂等免疫调节分子。
在一些实施方案中，所述药物分子选自Toll-Like Receptor激动剂和STING激动剂。
在一些实施方案中，所述药物分子选于以下Toll-Like Receptor激动剂：
Figure BDA0004008803350000111
在一些实施方案中，所述的药物分子选自以下STING激动剂：
Figure BDA0004008803350000112
Figure BDA0004008803350000121
在一些实施方案中，所述的药物分子选自以下Toll-Like Receptor激动剂：
Figure BDA0004008803350000122
在一些实施方案中，D为所述药物分子去氢后形成的结构片段；
优选地，D通过其上的氨基，例如一级氨基或二级胺基与所述抗体药物偶联物中的E连接。
在一些实施方案中，D为以下结构：
Figure BDA0004008803350000131
其中,R1为C1-8烷基；Y1选自-(C1-6亚烷基)-NH-或-(C1-6亚烷基)-(5-10元亚杂环基)-；R2为C1-8烷基；所述D通过Y1与所述抗体药物偶联物中的E连接。
在一些实施方案中，R1为C1-6烷基；Y选自-(C1-6亚烷基)-NH-或-(C1-6亚烷基)-(5-6元含氮亚杂环基)-；R2为C1-6烷基；所述D通过Y1与所述抗体药物偶联物中的E连接。
在一些实施方案中，所述的药物分子选自以下STING激动剂：
Figure BDA0004008803350000132
优选地，D通过其上的羧基或羟基与所述抗体药物偶联物中的E连接。
在一些实施方案中，D为以下结构：
Figure BDA0004008803350000133
其中，R3为H或C1-6烷基；Y2为-O-或-O-(C1-6亚烷基)-；R3为-OR7，R7为H或C1-6烷基；R5为C1-6烷基；R6选自5-6元杂芳基、-ORa、和-C(O)2R8；其中Ra和R8各自独立地选自H或C1-6烷基；X为C1-6亚烷基；f为1、2或3；所述D通过Y2与所述抗体药物偶联物中的E连接；
优选地，R3为H；Y2为-O-或-O-(C1-3亚烷基)-；R4为-OR7，R7为H或C1-3烷基；R5为C1-3烷基；R6为-C(O)2R10；其中R8选自H或C1-6烷基；X为C1-6亚烷基；f为1、2或3；所述D通过Y2与所述抗体药物偶联物中的E连接。
在一些实施方案中，D选自
Figure BDA0004008803350000141
Figure BDA0004008803350000142
在一些实施方案中，
Figure BDA0004008803350000143
选自以下结构：/>
Figure BDA0004008803350000144
/>
Figure BDA0004008803350000151
/>
Figure BDA0004008803350000161
/>
Figure BDA0004008803350000171
/>
Figure BDA0004008803350000181
在一些实施方案中，
Figure BDA0004008803350000182
选自以下结构：
Figure BDA0004008803350000183
/>
Figure BDA0004008803350000191
在一些实施方案中，
Figure BDA0004008803350000192
选自以下结构：
Figure BDA0004008803350000193
在一些实施方案中，所述的抗体药物偶联物Ab-[M-L-E-D]x优选以下化合物：
Figure BDA0004008803350000194
/>
Figure BDA0004008803350000201
/>
Figure BDA0004008803350000211
/>
Figure BDA0004008803350000221
/>
Figure BDA0004008803350000231
/>
Figure BDA0004008803350000241
/>
Figure BDA0004008803350000251
/>
Figure BDA0004008803350000261
在一些实施方案中，所述抗体药物偶联物为
Figure BDA0004008803350000262
其中，Ab的重链可变区如SEQ ID NO：9所示，轻链可变区如SEQ IDNO：10所示。
在第二个方面，本发明提供下式所示化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物，
D-E-L-M’
其中：
M’具有M-Lg所示结构，Lg为亲核取代反应的离去基团(例如，卤素、甲磺酰基、氟代苯酚基、
Figure BDA0004008803350000271
)，或者为羟基(-OH)、巯基(-SH)、氨基(-NH2)；
或者M’选自具有一个不饱和键的杂环基，优选地，M’为
Figure BDA0004008803350000272
D、E、L和M如本发明第一方面任一项所定义。
在一些实施方案中，M’为
Figure BDA0004008803350000273
Figure BDA0004008803350000274
Figure BDA0004008803350000281
在一些实施方案中，所述化合物选自以下结构：
Figure BDA0004008803350000282
/>
Figure BDA0004008803350000291
/>
Figure BDA0004008803350000301
/>
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在第三个方面，本发明提供一种抗体药物偶联物的组合物，其含有第一方面任一项所述的抗体药物偶联物，或者第二方面任一项所述的化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物；或者由第一方面任一项所述的抗体药物偶联物，或者第二方面任一项所述的化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物组成。
在一些实施方案中，所述组合物中药物分子和与ROR1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的摩尔比(DAR值)选自1-10(例如1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，2-3，2-4，2-5，2-6，2-7，2-8，2-9，2-10，3-4，3-5，3-6，3-7，3-8，3-9，3-10，4-5，4-6，4-7，4-8，4-9，4-10，5-6，5-7，5-8，5-9，5-10，6-7，6-8，6-9，6-10，7-8，7-9，7-10，8-9，8-10，或9-10，再例如2.5-5，再例如为2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9或5.0)。
在第四个方面，本发明提供一种药物组合物，其含有第一方面任一项所述的抗体药物偶联物，或者第二方面任一项所述的化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物，或者第三方面任一项所述的抗体药物偶联物的组合物，以及一种或多种药用上可接受的载体。
在第五个方面，本发明提供一种药盒产品，其含有第一方面任一项所述的抗体药物偶联物，或者第二方面任一项所述的化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物，或者第三方面任一项所述的抗体药物偶联物的组合物，或者第四方面任一项所述的药物组合物，以及任选的药品说明书。
在第六个方面，本发明提供第一方面任一项所述的抗体药物偶联物，或者第二方面任一项所述的化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物，或者第三方面任一项所述的抗体药物偶联物的组合物，或者第四方面任一项所述的药物组合物在制备用于预防或治疗细胞异常增殖相关疾病(例如，肿瘤)的药物中的用途。
在第七个方面，本发明提供第一方面任一项所述的抗体药物偶联物，或者第二方面任一项所述的化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物，或者第三方面任一项所述的抗体药物偶联物的组合物，或者第四方面任一项所述的药物组合物，其用于预防或治疗细胞异常增殖相关疾病(例如，肿瘤)。
在第八个方面，本发明提供一种预防或治疗细胞异常增殖相关疾病(例如，肿瘤)的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的第一方面任一项所述的抗体药物偶联物，或者第二方面任一项所述的化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物，或者第三方面任一项所述的抗体药物偶联物的组合物，或者第四方面任一项所述的药物组合物的步骤。
定义
除非在下文中另有定义，本文中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。提及本文中使用的技术意图指在本领域中通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
术语“偶联物”或“缀合物”可以互换，指的是一种或多种异源分子(heterologousmolecule(s))与抗体连接得到的物质，所述异源分子包括但不限于细胞毒剂(cytotoxicagent)，英文名称为ADC(antibody-drug conjugate)。
所述一种或多种异源分子可通过连接体(linker)与抗体连接。所述连接体可以通过各种化学键与抗体连接。例如，在一些实施方式中，所述连接体通过与抗体的巯基形成硫醚键相连接。在一些具体ADC分子结构式中的-S-仅表示连接体与抗体的巯基形成的硫醚键，并不代表-S-是连接体中的一部分。
本申请抗体药物偶联物的结构式可以以Ab-[M-L-E-D]x表示，其中，D为药物分子片段；-M-L-E-为连接抗体和免疫调节剂的连接体；Ab为特异性结合ROR1的抗体或其抗原结合片段；x指每一个抗体分子所连接的免疫调节剂的个数。在抗体药物偶联物制备过程中，各抗体分子可能连接不同数量的免疫调节剂，因此，一般而言，抗体药物偶联物是具有不同药物抗体偶联比例的抗体药物偶联物的混合物。在实践中，通常用DAR表示抗体所连接药物数量的平均值。
如本文中所使用的，术语“抗体”是在最广泛的意义上使用的，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性。例如，可由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences ofProteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883，或AbM，Martin的相关研究(Martin ACR,Cheetham JC,Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariableloops:Acombined algorithm.Proc Natl Acad Sci USA86:9268–9272)的定义。在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)，IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)，或，Martin的相关研究(Martin ACR,CheethamJC,Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariable loops:Acombinedalgorithm.Proc Natl Acad Sci USA86:9268–9272)，此定义方法整合了Kabat及Chothia两者的部分定义，最早应用在Oxford Molecular抗体建模软件中(Martin AC R.Proteinsequence and structure analysis of antibody variable domains[M]//Antibodyengineering.Springer,Berlin,Heidelberg,2010:33-51.)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Chothia编号系统确定。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指完整抗体以外的分子，它包括完整抗体的一部分，与完整抗体所结合的抗原结合。例如全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、结构域抗体(技术来自Ablynx)、和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”或“重链”和两条“全长轻链”或“轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”或“重链”是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地，“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”或“轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。
在本文中，获得抗体的技术可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”、“单抗”、“mAb”具有相同的含义且可互换使用可互换，其是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。此外，修饰语“单克隆”仅表明该抗体的特征为从高度同源的抗体群中获得，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。
本发明的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，例如杂交瘤技术(参见，例如Kohler等人.Nature,256:495,1975)，重组DNA技术(参见，例如美国专利申请4,816,567)，或噬菌体抗体库技术(参见，例如Clackson等.Nature352：624-628,1991，或Marks等.J.Mol.Biol.222：581-597,1991)。
例如，可以如下来制备单克隆抗体。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。可将免疫原预先偶联到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆胰酶抑制剂上，以增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以是弗氏佐剂或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内将产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂，如PEG，使其与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,AcademicPress,1996)。上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，培养液中优选含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养液中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养液敏感等特征。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21或MC-11小鼠肿瘤衍生株(THE Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA)，和SP-2/0或X63-Ag8-653细胞株(American Type CultureCollection,Rockville,Md.USA)。另外也有研究报道，利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。生长杂交瘤细胞的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性的方法包括例如，免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，可利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)描述的Scatchard分析法来测定单抗的亲和力。当确定了杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。
还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。将所得的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞(如E.coli细胞、COS细胞、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，并在合适的条件下进行培养，可以获得重组表达的目标抗体。
抗体可通过公知的技术，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析进行纯化。随后或作为替代，可将特异性抗原(该抗体识别的靶分子)或其抗原表位固定在柱上，并通过免疫亲合层析法来纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化可参考例如D.Wilkinson(TheScientist,published by The Scientist,Inc.,Philadelphia Pa.,Vol.14,No.8(Apr.17,2000),pp.25-28)。
如本文中所使用的，术语“鼠源抗体”是指，来源于免疫接种过的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，进而进行筛选、抗体制备和抗体纯化。或者由于抗原侵入小鼠体后B细胞分化增殖而形成浆细胞，浆细胞可产生分泌抗体。由特异性抗原刺激产生，抗体的产生是由于抗原侵入人体后引起各种免疫细胞相互作用，使淋巴细胞中的B细胞分化增殖而形成浆细胞，浆细胞可产生分泌抗体。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。
人源化抗体既能够保留非人源供体抗体(例如鼠源抗体)的预期性质，又能够有效降低非人源供体抗体(例如鼠源抗体)在人受试者中的免疫原性，因此，是特别有利的。然而，由于供体抗体的CDR与受体抗体的FR之间的匹配问题，人源化抗体的预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)通常低于非人源供体抗体(例如鼠源抗体)。
因此，尽管本领域的研究人员已对抗体的人源化展开了深入的研究，并取得了一些进展(参见例如，Jones et al.,Nature,321:522 525(1986)；Reichmann et al.,Nature,332:323 329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992)；andClark,Immunol.Today 21:397 402(2000))，但是，如何对某一供体抗体进行充分的人源化，以使得所产生的人源化抗体既具有尽可能高的人源化程度，又能够尽可能地保留供体抗体的预期性质，现有技术并没有提供详尽的指导。技术人员需要针对具体供体抗体进行摸索、探究和改造，付出大量的创造性劳动才有可能获得，既具有高人源化程度(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的人源化程度)、又保留具体供体抗体的预期性质的人源化抗体。
在本发明中，为了使人源化抗体尽可能保留供体抗体的性质(包括例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)，本发明的人源化抗体中构架区(FR)可以既包含人源受体抗体的氨基酸残基，也包含相应的非人源供体抗体的氨基酸残基。
本发明的人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。
为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in Antibody Engineering:Methodsand Protocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。或者，还可以利用转基因动物，其能够在免疫后不产生内源性免疫球蛋白、并且能够产生完整人抗体库。例如，已有报道在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失可以完全抑制了内源性抗体产生，然后将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到所述种系突变小鼠中将导致该小鼠在遇到抗原刺激时产生人抗体(参见例如，Jakobovits等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551；Jakobovits等，1993，Nature362：255-258；Bruggermann等，1993，Year inImmunology 7：33；和Duchosal等，1992，Nature 355：258)。上述转基因动物的非限制性实例包括，HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)，其含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座(miniloci)，加之使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859)；或携带人重链转基因和人轻链转染色体的“KM小鼠TM”(参见专利申请WO02/43478)。其它抗体人源化改造的方法还包括噬菌体展示技术(Hoogenboom等，1991，J.Mol.Biol.227：381；Marks等，J.Mol.Biol.1991，222：581-597；Vaughan等，1996，Nature Biotech 14：309)。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)或半最大效应浓度(EC50)表示。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用生物发光干涉测量法(例如ForteBio Octet法)来测量解离常数。除此以外还可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或Kinexa来测量解离常数。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，肿瘤)在受试者体内的发生而实施的方法。
如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有肿瘤，或者，具有患有上述疾病的风险。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如，肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如，肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其它治疗等等。
术语“癌症”“肿瘤”可互换使用，其是指以体内异常细胞的不受控生长为特征的一大类疾病。不受管制的细胞分裂可能导致恶性肿瘤或侵入邻近组织的细胞的形成，并可能通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部位。癌症包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。癌症也包括血液肿瘤，尤其是血液学恶性肿瘤。
术语“药学上可接受的”指当分子本体、分子片段或组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体示例包括糖类(如乳糖)、淀粉、纤维素及其衍生物、植物油、明胶、多元醇(如丙二醇)、海藻酸等。
术语“亚烷基”表示直链或支链烷烃失去两个氢原子得到的二价基团，包括例如“C1-20亚烷基”、“C1-10亚烷基”、“C1-6亚烷基”、“C1-4亚烷基”、“C1-3亚烷基”等，具体实例包括但不限于：亚甲基、亚乙基、1,3-亚丙基、1,4-亚丁基、1,5-亚戊基或1,6-亚己基等。
术语“亚烯基”是指含有至少一个碳碳双键的直链或支链的烃基失去两个氢原子得到的二价基团，包括例如“C2-6亚烯基”、“C2-4亚烯基”等。其实例包括但不限于：亚乙烯基、1-亚丙烯基、2-亚丙烯基、1-亚丁烯基、2-亚丁烯基、1,3-亚丁二烯基、1-亚戊烯基、2-亚戊烯基、3-亚戊烯基、1,3-亚戊二烯基、1,4-亚戊二烯基、1-亚己烯基、2-亚己烯基、3-亚己烯基、1,4-亚己二烯基等。
术语“亚炔基”是指含有至少一个碳碳三键的直链或支链烃基失去两个氢原子得到的二价基团。包括例如“C2-6亚炔基”、“C4-6亚炔基”等。其实例包括但不限于：亚乙炔基、1-亚丙炔基、2-亚丙炔基、1-亚丁炔基、2-亚丁炔基、1,3-亚丁二炔基、1-亚戊炔基、2-亚戊炔基、3-亚戊炔基、1,3-亚戊二炔基、1,4-亚戊二炔基、1-亚己炔基、2-亚己炔基、3-亚己炔基、1,4-亚己二炔基等。
术语“亚酰基”表示一端为羰基的亚烷基，包括例“C1-6亚酰基”、“C1-4亚酰基”、“C1-3亚酰基”等，具体实例包括但不限于：亚甲酰基、亚乙酰基、亚丙酰基等。
术语“亚酰氨基”是指一端含-CONH-结构的亚烷基，包括例“C1-6亚酰氨基”、“C1-4亚酰氨基”、“C1-3亚酰氨基”等，具体实例包括但不限于：亚甲酰氨基、亚乙酰氨基、亚丙酰氨基等。
术语“聚乙二醇亚基”是指具有-(CH2CH2O)n-结构的基团，n为选自1-20的整数，例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
术语“芳杂环”是指含至少一个选自N、O和S的环成员的芳香环状结构。具体实例包括但不限于5-6元芳杂环、5-6元含氮芳杂环、5-6元含氧芳杂环等，例如呋喃、噻吩、吡咯、噻唑、异噻唑、噻二唑、噁唑、异噁唑、噁二唑、咪唑、吡唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、1,2,3-噁二唑、1,2,4-噁二唑、1,2,5-噁二唑、1,3,4-噁二唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、1,2,3-三嗪、1,3,5-三嗪、1,2,4,5-四嗪等。
术语“脂杂环”是指含至少一个选自N、O和S的环成员的饱和或部分饱和的环状结构。具体实例包括但不限于5-6元脂杂环、5-6元含氮脂杂环、5-6元含氧脂杂环等，例如四氢呋喃、吡咯烷、哌啶、四氢吡喃等。
术语“一级氨基”是指-NH2基团。
术语“二级胺基”是指
Figure BDA0004008803350000471
基团。
本文中(说明书及权利要求)，单数形式“一个”、“一种”和“所述”，除非上下文中有清楚的不同的说明，包括其复数形式，例如"一个宿主细胞"包括多个这样的宿主细胞。另外中文中没有对应的英文单复数语法规则，一个名词的单复数需根据上下文或实际情况判断，因此，英译本中，一个名词前面加上了“one or more than one”很可能是正确的。
附图说明
图1显示本发明实施例四和实施例五制备的抗体药物偶联物刺激NCI-N87肿瘤细胞和PBMC共孵育后TNF-α的分泌。
图2显示本发明实施例四和实施例五制备的抗体药物偶联物介导的PBMC对NCI-N87肿瘤细胞的杀伤作用。
具体实施例
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制。本领域技术人员根据本发明的教导，可以做出各种修改或改进，而不脱离本发明的基本思想和范围。
序列信息简表
Figure BDA0004008803350000481
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Figure BDA0004008803350000491
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Figure BDA0004008803350000501
本公开中的缩写具有以下含义：
Figure BDA0004008803350000502
以下的实施例中记载的化合物的结构通过核磁共振(1H NMR)或质谱(MS)来确定。
核磁共振(1H NMR)的测定仪器使用Bruker 400MHz核磁共振仪；六氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)；内标物质为四甲基硅烷(TMS)。
实施例中使用的核磁共振(NMR)图谱中的缩写示于以下。
s：单峰(singlet)、d：二重峰(doublet)、t：三重峰(triplet)、q：四重峰(quartet)、m：多重峰(multiplet)、br：宽峰(broad)、J：偶合常数、Hz：赫兹、DMSO-d6：氘化二甲基亚砜。δ值用ppm值表示。
质谱(MS)的测定仪器使用Agilent(ESI)质谱仪，型号为Agilent 6120B。
实施例一N-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-((2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺的合成(A-01)
Figure BDA0004008803350000511
步骤一：N-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-((2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺的合成(A-01)
25℃下，将市售化合物1(100mg,143.73μmol)溶于DMF(2mL)中，加入DIPEA(55.73mg,431.18μmol)，缓慢滴加(2,5-二氧吡咯烷-1-基)4-[(2,5-二氧吡咯-1-基)甲基]环己烷甲酸酯(57.66mg,172.47μmol)的二氯甲烷(2mL)溶液，室温反应16h。将反应液用乙酸乙酯(5ml)稀释后，加水(3ml)，乙酸乙酯(5ml)萃取三次，饱和氯化钠溶液(3ml)洗涤三次，萃取有机相浓缩至干。用色谱硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝10:1)纯化后，再用制备高效液相色谱纯化(保留时间：7.5～8.0min)得标题化合物A-01 23.7mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
Figure BDA0004008803350000512
Figure BDA0004008803350000521
结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.98(dd,J＝8.3,1.4Hz,1H),7.66(t,J＝5.7Hz,1H),7.59(dd,J＝8.3,1.3Hz,1H),7.42–7.37(m,1H),7.26–7.21(m,1H),7.03(s,2H),6.56(s,2H),4.49(t,J＝7.5Hz,2H),3.21(d,J＝7.0Hz,2H),3.05(q,J＝6.3Hz,2H),2.94–2.86(m,2H),1.95–1.86(m,1H),1.84–1.70(m,4H),1.58–1.40(m,9H),1.16(dd,J＝12.8,3.4Hz,2H),0.95(t,J＝7.4Hz,3H),0.88–0.75(m,2H).
ESI-MS(m/z):531.2[M+H]+.
实施例二N-(4-(4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺(A-02)的制备
Figure BDA0004008803350000522
Figure BDA0004008803350000531
步骤一：(4-((6-硝基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将7-氯-6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶(10.0g,46.59mmol)和N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺(10.53g,55.91mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(150mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中加入N,N-二异丙基乙胺(12.04g,93.18mmol)，缓慢升温至室温搅拌6小时。将反应液倒入水(1500mL)中，并用乙酸乙酯(450mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(150mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到标题化合物(16.61g,收率：97.3％)。
MS m/z(ESI):367.1[M+H]+。
步骤二：(4-((6-氨基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将(4-((6-硝基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(16.61g,49.37mmol)溶于四氢呋喃(100mL)和甲醇(100mL)的混合溶剂中，加入10％钯碳(2.0g,11.97mmol)，氢气置换三次，将反应体系在室温下搅拌12小时，抽滤，甲醇(30mL)洗涤滤饼，滤液浓缩，得到标题化合物(14.47g,收率：87.1％)。
MS m/z(ESI)：337.1[M+H]+。
步骤三：(4-((6-戊酰胺基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将(4-((6-氨基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(14.47g,43.01mmol)和N,N-二异丙基乙胺(11.12g,86.02mmol)溶于四氢呋喃(250mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢滴加正戊酰氯(7.78g,64.52mmol)，缓慢升温至室温搅拌4小时。向反应体系中加入水(100mL)淬灭反应，将体系浓缩尽可能除去四氢呋喃，向所得剩余物中加入水(300mL)，并用乙酸乙酯(300mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(150mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到标题化合物(16.72g,收率：92.4％)。
MS m/z(ESI)：421.0[M+H]+。
步骤四：(4-(2-丁基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将(4-((6-戊酰胺基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(16.72g,39.76mmol)和邻氯苯甲酸(3.11g,19.88mmol)加入到甲苯(300mL)中，升温至溶剂回流并分水反应搅拌4小时。将反应体系冷却至室温后，浓缩除去溶剂，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：100％乙酸乙酯)，得到标题化合物(14.76g,收率：92.2％)。
MS m/z(ESI)：403.2[M+H]+。
步骤五：(4-(7-溴-2-丁基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将(4-(2-丁基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(5.41g,13.44mmol)完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺(75mL)和冰醋酸(25mL)的混合溶剂中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入N-溴代丁二酰亚胺(4.78g,26.88mmol)，缓慢升温至室温搅拌24小时。将反应液倒入水(300mL)中，并用乙酸乙酯(300mL)萃取三次，合并有机相，饱和碳酸氢钠水溶液(150mL)洗涤三次，饱和食盐水(150mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯:石油醚＝1:1)，得到标题化合物(4.95g，收率：76.5％)。
MS m/z(ESI)：481.0[M+H]+。
步骤六：(4-(2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将(4-(7-溴-2-丁基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(1.0g,2.08mmol)、三甲基硼氧六环(50wt.％in THF,2.62g,10.4mmol)、碳酸钾(575.0mg,4.16mmol)和1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(307.3mg,0.42mmol)依次加入1,4-二氧六环(10mL)和水(1mL)的混合溶剂中，反应体系经氮气鼓泡5min后，于微波下升温至100℃搅拌2小时。将反应体系冷却至室温后，浓缩除去溶剂，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：100％乙酸乙酯)，得到标题化合物(0.65g,收率：75.0％)。
MS m/z(ESI)：417.1[M+H]+。
步骤七：1-(4-((叔丁氧羰基)氨基)丁基)-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-5-氧化物的制备
将(4-(2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(0.65g,1.56mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入间氯过氧苯甲酸(538.5mg,3.12mmol)，缓慢升温至室温搅拌4小时。将反应液倒入水(100mL)中，并用二氯甲烷(60mL)萃取三次，合并有机相，饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)洗涤两次，饱和亚硫酸钠水溶液(30mL)洗涤两次，饱和食盐水(45mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到标题化合物(640mg,收率：94.8％)。
MS m/z(ESI)：433.2[M+H]+。
步骤八：(4-(4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将1-(4-((叔丁氧羰基)氨基)丁基)-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-5-氧化物(640mg,1.48mmol)溶于二氯甲烷(10mL)和氨水(5mL)的混合溶剂中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入对甲苯磺酰氯(564.1mg,2.96mmol)，缓慢升温至室温搅拌12小时。向反应体系中加入水(100mL)，二氯甲烷(60mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(45mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯:甲醇＝15:1)，得到标题化合物(266mg,收率：41.6％)。
MS m/z(ESI)：432.2[M+H]+。
步骤九：1-(4-氨基丁基)-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-4-胺的制备(化合物2)
将(4-(4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(266mg,0.62mmol)溶于甲醇(10mL)和氯化氢的1,4-二氧六环溶液(4N,5ml)的混合溶剂中，室温搅拌12小时。浓缩除去溶剂，依次向剩余物中加入二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(体积比为4:1,10mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(2mL)，室温搅拌5min后，浓缩除去溶剂，所得剩余物经高压液相制备色谱制备纯化，得到标题化合物(130mg,收率：63.3％)。
MS m/z(ESI)：332.1[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.34(s,2H),6.98(d,J＝1.2Hz,1H),6.06(s,2H),4.24(t,J＝8.0Hz,2H),2.86(t,J＝8.0Hz,2H),2.78(t,J＝8.0Hz,2H),2.56(d,J＝1.2Hz,1H),1.83-1.75(m,4H),1.62-1.58(m,2H),1.47-1.40(m,2H),0.96(t,J＝8.0Hz,3H)。
步骤十：N-(4-(4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺(A-02)的制备
将1-(4-氨基丁基)-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-4-胺(121mg,346.78μmol)溶于二氯甲烷(5.0mL)中，加入DIPEA(134.45mg,1.04mmol,181.20μL)，搅拌，加入4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(141.96mg,416.14μmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)溶液，室温搅拌12小时，向反应液中加入二氯甲烷30ml，水(10ml*3)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，浓缩除去有机相，所得剩余物经柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇10：1)，得到标题化合物(110mg,199.74μmol,收率57.60％)。
MS m/z(ESI)：551.2[M+H]+。
实施例三1-((4-(4-((4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羰基)环己基)甲基)-1H-吡咯-2,5-二酮(A-03)的制备
Figure BDA0004008803350000571
步骤一：4-(((6-硝基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
采用实施例二的合成路线，将第一步反应原料N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺替换为4-(氨甲基)四氢-1(2H)-吡啶甲酸苄酯，得到标题化合物(1.53g,收率：92.5％)。
MS m/z(ESI)：427.0[M+H]+。
步骤二：4-(((6-氨基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
将4-(((6-硝基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯(2.0g,4.69mmol)完全溶于无水乙醇(30mL)中，加入水(5mL)。冰水浴降温，0℃下向反应液中加入保险粉(8.16g,46.9mmol)，缓慢升温至室温搅拌4小时。将反应液倒入水(150mL)中，搅拌析出固体，过滤，并用水洗涤固体，干燥后得到标题化合物(1.65g,收率：88.7％)。
MS m/z(ESI)：397.1[M+H]+。
步骤三：4-(((6-戊酰胺基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
采用实施例二的合成路线，将第三步反应原料(4-((6-氨基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯替换为苄基4-(((6-氨基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯，得到标题化合物(1.47g,收率：90.2％)。
MS m/z(ESI)：481.1[M+H]+。
步骤四：4-((2-丁基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
采用实施例二的合成路线，将第四步反应原料(4-((6-戊酰胺基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯替换为4-(((6-戊酰胺基噻吩[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯，得到标题化合物(1.18g,收率：91.8％)。
MS m/z(ESI)：463.1[M+H]+。
步骤五：4-((7-溴-2-丁基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
采用实施例二的合成路线，将第五步反应原料(4-(2-丁基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯替换为4-((2-丁基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯，得到标题化合物(726mg,收率：74.3％)。
MS m/z(ESI)：541.1[M+H]+。
步骤六：4-((2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
采用实施例二的合成路线，将第六步反应原料(4-(7-溴-2-丁基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯替换为4-((7-溴-2-丁基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯，得到标题化合物(623mg,收率：76.7％)。
MS m/z(ESI)：477.1[M+H]+。
步骤七：1-((1-((苄氧基)羰基)哌啶)-4-基)甲基)-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-5-氧化物的制备
采用实施例二的合成路线，将第七步反应原料(4-(2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯替换为4-((2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯(517mg,收率：93.2％)。
MS m/z(ESI)：493.2[M+H]+。
步骤八：4-((4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
采用实施例二的合成路线，将第八步反应原料1-(4-((叔丁氧羰基)氨基)丁基)-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-5-氧化物替换为1-((1-((苄氧基)羰基)哌啶)-4-基)甲基)-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-5-氧化物，得到标题化合物(287mg,收率：38.2％)。
MS m/z(ESI)：492.2[M+H]+。
步骤九：2-丁基-7-甲基-1-(哌啶-4-基甲基)-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-4-胺的制备(化合物3)
将4-((4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯(150mg,0.31mmol)加入三氟醋酸(6mL)中，升温至50℃搅拌3小时。浓缩除去溶剂，依次向剩余物中加入二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(体积比为4:1,10mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)，室温搅拌5min后，浓缩除去溶剂，所得剩余物经高压液相制备色谱制备纯化，得到标题化合物(22mg,收率：19.9％)。
MS m/z(ESI)：358.1[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.24(s,1H),6.99-6.98(m,1H),6.11(br,2H),4.14(d,J＝8.0Hz,2H),3.26-3.23(m,2H),2.88-2.76(m,4H),2.57-2.55(m,3H),2.19-2.12(m,1H),1.87-1.76(m,2H),1.68-1.62(m,2H),1.56-1.39(m,4H),0.96(t,J＝8.0Hz,3H)。
步骤十：1-((4-(4-((4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羰基)环己基)甲基)-1H-吡咯-2,5-二酮的制备(A-03)
将2-丁基-7-甲基-1-(哌啶-4-基甲基)-1H-咪唑[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-4-胺(100mg,265.72μmol)溶于二氯甲烷(5.0mL)中，加入DIPEA(103.03mg,797.17μmol,138.85μL)，搅拌，加入4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(108.78mg,318.87μmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)溶液，室温搅拌12小时，向反应液中加入二氯甲烷30ml，水(10ml*3)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，浓缩除去有机相，所得剩余物经柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇10：1)，得到标题化合物(87mg,150.84μmol,收率56.77％)。
MS m/z(ESI)：577.2[M+H]+。
二、包含细胞生物活性分子和连接体的化合物与抗体的偶联
1.偶联样品的制备：
实施例四19F6_Hu35v1-ADC A-01的制备
前期通过免疫Balb/c，C57Bl/6，NZB和A/J小鼠，通过杂交瘤筛选获得鼠源抗体3D8、19F6和38F8，分别经人源化后获得人源化抗体序列3D8_HuC24(重链可变区,SEQ IDNO.:1；轻链可变区,SEQ ID NO.:2)，19F6_Hu35v1(重链可变区,SEQ ID NO.:9；轻链可变区,SEQ ID NO.:10)，38F8_Hu57(重链可变区,SEQ ID NO.:17；轻链可变区,SEQ ID NO.:18)。
用1M磷酸氢二钠溶液调节19F6_Hu35v1抗体(24mg/mL)使其pH＝7.24，再用pH＝7.2-7.4磷酸盐缓冲盐(PBS)定容至10mg/mL。同时以DMSO为溶剂，配置70mM的SATA交联剂。室温下将10倍摩尔过量的SATA加入到抗体中，反应30分钟后，用NAP-5凝胶柱纯化，并用pH＝7.2-7.4磷酸盐缓冲盐(PBS)洗涤，收集滤液。
将所得SATA修饰的抗体溶液与0.05M羟胺和2.5mM EDTA室温反应2小时后，使得该抗体脱乙酰化，再用NAP-5凝胶柱纯化，同时用含5mM EDTA的pH＝7.2-7.4磷酸盐缓冲盐(PBS)洗涤，收集滤液。再将纯化后的脱乙酰化的SATA-修饰的抗体与10倍摩尔过量的化合物(A-01)的DMSO溶液(10mM)于室温下反应30分钟。再用NAP-5凝胶柱纯化，并用pH＝7.2-7.4磷酸盐缓冲盐(PBS)洗涤，收集滤液，得19F6_Hu35v1-ADC A-01。
Figure BDA0004008803350000611
实施例五hIgG-ADC A-01的制备
将实施例四中的抗体19F6_Hu35v1替换为hIgG，用同样的方法制备hIgG-ADC A-01。
Figure BDA0004008803350000612
二、偶联样品的药物/抗体比值：DAR值的测定
1.LC-MS测定19F6_Hu35v1-ADC A-01分子量，计算药物/抗体比DAR值
对19F6_Hu35v1-ADC A-01进行LC-MS分子量分析见表1。
色谱测定条件：
液相色谱柱：Thermo MAbPac RP 3.0*100mm；
流动相A：0.1％FA/H2O；流动相B：0.1％FA/ACN；
流速：0.25ml/min；样品室温度：8℃；柱温：60℃；进样量：2μl；
时间(分钟) 2 20 22 25 26 30
流动相A(体积％) 75 60 5 5 75 75
流动相B(体积％) 25 40 95 95 25 25
质谱测定条件：
质谱型号：AB Sciex Triple TOF 5600+；
GS1 35；GS2 35；CUR 30；TEM 350；ISVF 5500；DP 250；CE 10；Accumulation time0.5s；
m/z 600-4000；Time bins to sum 40。
表1.19F6_Hu35v1-ADC A-01 DAR值
Figure BDA0004008803350000621
2.LC-MS测定hIgG-ADC A-01分子量，计算药物/抗体比DAR值
对hIgG-ADC A-01进行LC-MS分子量分析见表2。
色谱测定条件：
液相色谱柱：Thermo MAbPac RP 3.0*100mm；
流动相A：0.1％FA/H2O；流动相B：0.1％FA/ACN；
流速：0.25ml/min；样品室温度：8℃；柱温：60℃；进样量：2μl；
时间(分钟) 2 20 22 25 26 30
流动相A(体积％) 75 60 5 5 75 75
流动相B(体积％) 25 40 95 95 25 25
质谱测定条件：
质谱型号：AB Sciex Triple TOF 5600+；
GS1 35；GS2 35；CUR 30；TEM 350；ISVF 5500；DP 250；CE 10；Accumulation time0.5s；
m/z 600-4000；Time bins to sum 40。
表2.hIgG-ADC A-01DAR值
Figure BDA0004008803350000631
生物学测试
实验例1：化合物对HEK-Blue hTLR7细胞激动活性的测定
实验步骤：
1.HEK-Blue hTLR7细胞(Invivogen)培养于含有10％FBS热灭活胎牛血清(Corning)的DMEM培养基(Hyclone)中。检测当天，显微镜下观察细胞状态，将细胞收集重悬，计数后，调整细胞浓度，每孔50μL，细胞总量为2×104，接种细胞于96孔板。
2.细胞贴壁过夜后，将50μL不同浓度待测化合物加入孔板中，使其终浓度分别为100μM，33.3μM，11.11μM，3.70μM，1.23μM，0.41μM，0.14μM，0.05μM，0μM，DMSO终浓度为1％。化合物与细胞在37℃、5％CO2培养箱中孵育20h。
3.化合物孵育结束后，在显微镜下观察最大信号孔或化合物最高和最低浓度的细胞状态以及高浓度是否会有化合物结晶析出。取10μL细胞培养上清液转移到新的96孔透明板中，每孔加入90μL QUANTI-Blue(Invivogen-)检测试剂，37℃孵育3h，用多功能酶标仪(BMG LABTECH)读取OD620。
4.EC50通过Graphpad Prism软件log(agonist)vs.response--Variable slope拟合计算，Emax为本次试验化合物激活作用达到最大的OD620。
实验结果：
按照上述方法测定化合物对HEK-Blue hTLR7细胞的激活活性，化合物的活性以EC50和Emax表示，结果如表3所示：
表3.化合物对HEK-Blue hTLR7细胞的激活作用实验结果
化合物 EC50(μM) Emax(OD620)
2 0.22 1.36
3 0.0012 2.13
结果表明化合物2和3对人源TLR7具有较强的激活作用。
实验例2：化合物对HEK-Blue hTLR8细胞激动活性的测定
实验步骤：
1.HEK-Blue hTLR8细胞(Invivogen)培养于含有10％FBS热灭活胎牛血清(Corning)的DMEM培养基(Hyclone)中。检测当天，显微镜下观察细胞状态，将细胞收集重悬，计数后，调整细胞浓度，每孔50μL，细胞总量为2×104，接种细胞于96孔板。
2.细胞贴壁过夜后，将50μL不同浓度待测化合物加入孔板中，使其终浓度分别为100μM，25μM，6.25μM，1.56μM，0.39μM，0.10μM，0.02μM，0.006μM，0μM或100μM，33.3μM，11.11μM，3.70μM，1.23μM，0.41μM，0.14μM，0.05μM，0μM，DMSO终浓度为1％。化合物与细胞在37℃、5％CO2培养箱中孵育20h。
3.化合物孵育结束后，在显微镜下观察最大信号孔或化合物最高和最低浓度的细胞状态以及高浓度是否会有化合物结晶析出。取10μL细胞培养上清液转移到新的96孔透明板中，每孔加入90μL QUANTI-Blue(Invivogen-)检测试剂，37℃孵育3h，用多功能酶标仪(BMG LABTECH)读取OD620。
4.EC50通过Graphpad Prism软件log(agonist)vs.response--Variable slope拟合计算，Emax为本次试验化合物激活作用达到最大的OD620。
实验结果：
按照上述方法测定化合物对HEK-Blue hTLR8细胞的激活活性，化合物的活性以EC50和Emax表示，结果如表4所示：
表4.化合物对HEK-Blue hTLR8细胞的激活作用实验结果
化合物 EC50(μM) Emax(OD620)
2 5.83 1.43
3 19.43 1.86
结果表明化合物2和3对人源TLR8具有较强的激活作用。
实验例3：检测抗体药物偶联物对体外细胞活性的抑制作用
实验例3.1.抗体药物偶联物介导的PBMC对肿瘤细胞的杀伤试验
本试验运用表达ROR1的肿瘤细胞与PBMC共孵育，考察抗体药物偶联物介导的PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用以及抗体药物偶联物刺激PBMC释放TNF-α，来表征抗体药物偶联物的生物学活性。
收集表达ROR1的对数生长期的NCI-N87肿瘤细胞(ATCC)，用PBS清洗两遍，并调整细胞密度为1×106个/ml，加入Cell trace violet(Thermo-C34557)终浓度为5μM，混匀，放在5％CO2，37℃培养箱中避光孵育20分钟，孵育完成后用加入5ml RPMI1640+10％FBS完全培养基清洗细胞，每次5分钟，清洗3次。然后调整细胞密度为4×104个/ml，接种于24孔板(康宁-3524)中，每孔加入500μL细胞悬液即2×104个细胞/孔。复苏PBMC(赛笠生物-XFB-HP010B)，用RPMI1640+10％FBS完全培养基重悬细胞，调整密度为2.5×105个/ml，加入接种了肿瘤细胞的24孔板中，400μl细胞悬液/孔，即1×105个/孔。效应细胞：靶细胞＝5：1。加入用100μL RPMI1640+10％FBS完全培养基稀释配制的待测物，19F6_Hu35v1、hIgG-ADC A-01、19F6_Hu35v1-ADC A-01终浓度设置为60、6、1.2nm，空白孔加入100μl RPMI1640+10％FBS完全培养基。放在5％CO2，37℃培养箱中培养，培养48小时后，各孔取50μl上清检测，根据human TNF-αELISA检测试剂盒(R&D system-DTA00D)步骤孵育一抗抗体及HRP标记的二抗，显色，并读取450nm波长下的吸光度。使用Graphpad Prism软件根据标准曲线，计算出TNF-α的浓度。
孵育96小时后，胰酶消化各孔中细胞，PI染色后，进行流式细胞仪(ThermoAttune)检测存活的肿瘤细胞数目，即Cell trace violet阳性PI阴性细胞数目，以各药物处理组的存活肿瘤细胞数目与空白组的存活肿瘤细胞数目的百分比表示各药物介导的PBMC对肿瘤细胞杀伤作用。结果如图1所示，hIgG-ADC A-01、19F6_Hu35v1-ADC A-01在60、6nM时刺激PBMC释放大量TNF-α，而19F6_Hu35v1无明显释放。图2所示，19F6_Hu35v1-ADC A-01在60、6nM均标出对肿瘤细胞较强杀伤作用，且比等摩尔浓度的hIgG-ADC A-01、19F6_Hu35v1杀伤作用更强。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (41)

1.一种抗体药物偶联物，其具有式I所示结构，
Ab-[M-L-E-D]x
式I
其中：
Ab是与ROR1(受体酪氨酸激酶样孤儿受体家族成员1)特异性结合的抗体或其抗原结合片段；
M是和抗体连接的接头；
L是连接接头M和E之间的连接子；
E是连接L和D的结构片段；
D是药物分子片段；
且x为1～10，例如x为1，2，3，4，5，6，7，8，9或10。
2.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含下述VH(重链可变区)和/或VL(轻链可变区)，其中CDR(互补决定区)按Chothia编号系统定义：
(A)包含如下3个CDR的VH：具有SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ IDNO.:4所示氨基酸序列的CDR-H2，具有SEQ ID NO.:5所示氨基酸序列的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的VL：具有SEQ ID NO.:6所示氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO.:7所示氨基酸序列的CDR-L2，具有SEQ ID NO.:8所示氨基酸序列的CDR-L3；
(B)包含如下3个CDR的VH：具有SEQ ID NO.:11所示氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ IDNO.:12所示氨基酸序列的CDR-H2，具有SEQ ID NO.:13所示氨基酸序列的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的VL：具有SEQ ID NO.:14所示氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO.:15所示氨基酸序列的CDR-L2，具有SEQ ID NO.:16所示氨基酸序列的CDR-L3；
(C)包含如下3个CDR的VH：具有SEQ ID NO.:19所示氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ IDNO.:20所示氨基酸序列的CDR-H2，具有SEQ ID NO.:21所示氨基酸序列的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的VL：具有SEQ ID NO.:22所示氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO.:15所示氨基酸序列的CDR-L2，具有SEQ ID NO.:16所示氨基酸序列的CDR-L3。
3.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)具有SEQ ID NO.:1所示的VH；和/或，具有SEQ ID NO.:2所示的VL；
(b)具有SEQ ID NO.:9所示的VH；和/或，具有SEQ ID NO.:10所示的VL；或者，
(c)具有SEQ ID NO.:17所示的VH；和/或，具有SEQ ID NO.:18所示的VL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体药物偶联物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO.:24所示的CH(重链恒定区)；和/或SEQ ID NO.:25所示的CL(轻链恒定区)。
5.根据权利要求1-4任一项所述的抗体药物偶联物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自：
(1)包括SEQ ID NO.:1所示的VH和SEQ ID NO.:24所示的CH的重链，和，包括SEQ IDNO.:2所示的VL和SEQ ID NO.:25所示的CL的轻链；
(2)包括SEQ ID NO.:9所示的VH和SEQ ID NO.:24所示的CH的重链，和，包括SEQ IDNO.:10所示的VL和SEQ ID NO.:25所示的CL的轻链；或者，
(3)包括SEQ ID NO.:17所示的VH和SEQ ID NO.:24所示的CH的重链，和，包括SEQ IDNO.:18所示的VL和SEQ ID NO.:25所示的CL的轻链。
6.根据权利要求1-5任一项所述的抗体药物偶联物，其中Ab通过巯基(-SH)或者氨基(-NH2)与M连接。
7.权利要求1-6任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
Figure QLYQS_1
选自
Figure QLYQS_2
其中，A为5元或6元脂杂环或芳杂环，当A为脂杂环时，其任选地被一个或两个氧基(＝O)取代；Z1选自化学键、C1-6亚烷基和C1-6亚酰基，所述C1-6亚酰基中的一个或多个碳原子任选地被选自N、O和S的杂原子取代；Z2和Z3各自独立地选自化学键、C1-20亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基、C1-6亚酰氨基、聚乙二醇亚基和5元或6元脂杂环，所述C1-20亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基和C1-6亚酰氨基任选地被一个或多个氨基或选自N、O和S的杂原子取代，所述脂杂环任选地被一个或两个氧基(＝O)取代；Z4选自化学键、C1-20亚烷基和5元或6元亚环烷基；Z5选自/>
Figure QLYQS_3
条件是，Z1、Z2、Z3和Z4不同时为化学键。
8.权利要求1-7任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
Figure QLYQS_4
选自
Figure QLYQS_5
其中，A为5元或6元脂杂环或芳杂环，当A为脂杂环时，其任选地被一个或两个氧基(＝O)取代；Z1选自化学键和C1-6亚酰基，所述C1-6亚酰基中的一个或多个碳原子任选地被选自N、O和S的杂原子取代；Z2和Z3各自独立地选自化学键、C1-20亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基、C1-6亚酰氨基、聚乙二醇亚基和5元或6元脂杂环，所述C1-20亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基和C1-6亚酰氨基任选地被一个或多个选自N、O和S的杂原子取代，所述脂杂环任选地被一个或两个氧基(＝O)取代；Z4选自化学键、C1-20亚烷基和5元或6元亚环烷基；Z5为/>
Figure QLYQS_6
条件是，Z1、Z2、Z3和Z4不同时为化学键。
9.权利要求1-8任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
Figure QLYQS_7
选自
Figure QLYQS_8
其中，A选自琥珀酰亚胺环和嘧啶环；Z1选自化学键和
Figure QLYQS_9
Z2选自C1-6亚烷基、C2-6亚炔基、亚乙酰氨基、四聚乙二醇亚基和/>
Figure QLYQS_10
Z3选自化学键、C1-6亚烷基、四聚乙二醇亚基和/>
Figure QLYQS_11
Z4选自化学键、C1-6亚烷基和环己基；Z5为
Figure QLYQS_12
10.权利要求1-9任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
Figure QLYQS_13
选自以下结构：
Figure QLYQS_14
11.权利要求1-10任一项所述的抗体药物偶联物，其中，M选自以下结构：
Figure QLYQS_15
12.权利要求1-11任一项所述的抗体药物偶联物，其中，M选自以下结构：
Figure QLYQS_16
13.权利要求1-12任一项所述的抗体药物偶联物，其中，L不存在或选自由下述的一个或多个基团组成的二价结构：C1-6烷基、C1-6亚烷基、氨基、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Phe、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、聚乙二醇片段、季铵盐片段、磺酸及其盐、磷酸及其盐、
Figure QLYQS_17
Figure QLYQS_18
Figure QLYQS_19
s为1-10的整数。
14.权利要求1-13任一项所述的抗体药物偶联物，其中，L不存在或选自以下结构：
Figure QLYQS_20
Figure QLYQS_21
15.权利要求1-14任一项所述的抗体药物偶联物，其中，L选自以下结构：
Figure QLYQS_22
16.权利要求1-14任一项所述的抗体药物偶联物，其中，L不存在。
17.权利要求1-16任一项所述的抗体药物偶联物，其中，E不存在或为亚甲基、-NH-CH2-、
Figure QLYQS_23
18.权利要求1-17任一项所述的抗体药物偶联物，其中，E不存在或为
Figure QLYQS_24
19.权利要求1-18任一项所述的抗体药物偶联物，其中，E不存在。
20.根据权利要求1-19任一项所述的抗体药物偶联物，其中，所述药物分子选自Toll-Like Receptor激动剂、STING激动剂、NLRP3激动剂、PD-1/PD-L1抑制剂。
21.权利要求1-20任一项所述的抗体药物偶联物，其中，所述药物分子选自Toll-LikeReceptor激动剂和STING激动剂。
22.权利要求1-21任一项所述的抗体药物偶联物，其中，所述药物分子选自以下Toll-Like Receptor激动剂：
Figure QLYQS_25
23.权利要求1-22任一项所述的抗体药物偶联物，其中，所述药物分子选自以下Toll-Like Receptor激动剂：
Figure QLYQS_26
24.权利要求1-23任一项所述的抗体药物偶联物，其中，所述药物分子选自以下STING激动剂：
Figure QLYQS_27
25.权利要求1-24任一项所述的抗体药物偶联物，其中，所述药物分子选自以下STING激动剂：
Figure QLYQS_28
26.权利要求1-24任一项所述的抗体药物偶联物，其中，所述药物分子通过其上的氨基，例如一级氨基或二级胺基，与所述抗体药物偶联物中的E连接。
27.权利要求1-24任一项所述的抗体药物偶联物，其中，所述药物分子通过其上的羧基或羟基与所述抗体药物偶联物中的E连接。
28.权利要求1-24任一项所述的抗体药物偶联物，其中，D选自
Figure QLYQS_29
29.权利要求1-28任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
Figure QLYQS_30
选自以下结构：
Figure QLYQS_31
Figure QLYQS_32
Figure QLYQS_33
/>
Figure QLYQS_34
/>
Figure QLYQS_35
30.权利要求1-29任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
Figure QLYQS_36
选自以下结构：
Figure QLYQS_37
/>
Figure QLYQS_38
31.权利要求1-30任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
Figure QLYQS_39
选自以下结构：
Figure QLYQS_40
Figure QLYQS_41
32.根据权利要求1-31任一项所述的抗体药物偶联物，其具有如下结构：
Figure QLYQS_42
/>
Figure QLYQS_43
/>
Figure QLYQS_44
/>
Figure QLYQS_45
/>
Figure QLYQS_46
/>
Figure QLYQS_47
/>
Figure QLYQS_48
/>
Figure QLYQS_49
/>
Figure QLYQS_50
其中，Ab选自权利要求2-4任一项中所述的抗体或其抗原结合片段。
33.根据权利要求1-32任一项所述的抗体药物偶联物，其具有如下结构：
Figure QLYQS_51
34.下式所示化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物，
D-E-L-M’
其中：
M’具有M-Lg所示结构，Lg为亲核取代反应的离去基团(例如，卤素、甲磺酰基、氟代苯酚基、
Figure QLYQS_52
或者为羟基(-OH)、巯基(-SH)、氨基(-NH2)；/>
或者M’选自具有一个不饱和键的杂环基，优选地，M’为
Figure QLYQS_53
35.根据权利要求34所述的化合物，其中：
M’为
Figure QLYQS_54
Figure QLYQS_55
Figure QLYQS_56
D、E、L和M如权利要求1-34中任一项所定义。
36.根据权利要求13所述的化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物，其选自以下结构：
Figure QLYQS_57
/>
Figure QLYQS_58
/>
Figure QLYQS_59
/>
Figure QLYQS_60
/>
Figure QLYQS_61
/>
Figure QLYQS_62
/>
Figure QLYQS_63
/>
Figure QLYQS_64
/>
Figure QLYQS_65
37.一种抗体药物偶联物的组合物，其含有权利要求1-33任一项所述的抗体药物偶联物，或者权利要求34-36任意一项所述的化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物；或者由权利要求1-33任一项所述的抗体药物偶联物，或者权利要求34-36任意一项所述的化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物组成。
38.根据权利要求37所说的组合物，其中，所述组合物中药物分子和与ROR1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的摩尔比(DAR值)选自1-10(例如1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，2-3，2-4，2-5，2-6，2-7，2-8，2-9，2-10，3-4，3-5，3-6，3-7，3-8，3-9，3-10，4-5，4-6，4-7，4-8，4-9，4-10，5-6，5-7，5-8，5-9，5-10，6-7，6-8，6-9，6-10，7-8，7-9，7-10，8-9，8-10，或9-10，例如2-5，再例如2.5-5，再例如为2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9或5.0)。
39.一种药物组合物，其含有权利要求1-33任意一项所述的生物活性偶联物，或者权利要求34-36任意一项所述的化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物，或者权利要求37或38所述的抗体药物偶联物的组合物，以及一种或多种药用上可接受的载体。
40.一种药盒产品，其含有权利要求1-33任意一项所述的生物活性偶联物，或者权利要求34-36任意一项所述的化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物，或者权利要求37或38所述的抗体药物偶联物的组合物，或者权利要求39所述的药物组合物，以及任选的药品说明书。
41.权利要求1-33任意一项所述的生物活性偶联物，或者权利要求34-36任意一项所述的化合物、或其立体异构体、多晶型物、溶剂合物，或者权利要求37或38所述的抗体药物偶联物的组合物，或者权利要求39所述的药物组合物在制备用于预防或治疗细胞异常增殖相关疾病(例如，肿瘤)的药物中的用途。
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