CN107400072B - 一种双乙烯磺酰胺连接子及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种双乙烯磺酰胺连接子及其制备和应用。所述的双乙烯磺酰胺连接子的结构式为式I或式II。本发明提供的新型双乙烯磺酰胺连接子不仅一端可以偶联多肽或蛋白，另一端同时可以连接亲和标记物或示踪荧光物质或活性药物。

Description

一种双乙烯磺酰胺连接子及其制备和应用
技术领域
本发明属于生物制药及生物技术领域，具体涉及一种新型的连接子(linker)及其制备，及其应用于亲和标记物、示踪荧光物质及活性药物等特异性的偶联到多肽、蛋白质中可到达的硫-硫键上的方法。本发明涉及的连接子及偶联方法可用于制备靶向示踪诊断试剂、肿瘤靶向治疗药物等并可控制药物/靶向物比值(DAR)。
背景技术
蛋白质的选择性化学修饰在物化学和生物医学研究领域中非常重要。利用化学手段发展蛋白质修饰方法已成功的应用在多个领域中，如：蛋白质荧光标记，细胞内生物过程检测，蛋白质偶联物用于治疗、诊断等。近年来最热门和重要的应用领域为抗体药物偶联物(Antibody drug conjugation，ADCs)。抗体药物偶联物是将具有极高生物活性的药物分子修饰连接到抗体上。ADCs的诞生是基于一种理想的前药设计理念，希望将高活性药物分子和抗体两者的优点结合起来，利用抗体的特异专一性，有效输送高活性物质到特定靶标，提高药效，降低毒性。随着ADCs药物Adcetris和Kadcyla分别于2011和2013年上市，ADCs进入黄金发展期，目前共有超过40个ADCs药物正在进行临床研究。
ADCs由抗体(antibody)、连接子(linker)和细胞毒素(toxin)三部分组成。其中，连接子在ADC药物设计中非常重要，对于靶向药物的制备、功效等起着关键作用。早期的ADCs中的连接子多基于抗体内在的氨基酸残基进行修饰，如胺基、巯基等。但由于多个修饰位点的存在，导致抗体与高活性药物偶联时，化学选择性极差，药物的结合位点及结合数目极其复杂。这类均一性差的ADCs不仅会对药代动力学、药效和药物安全性产生很大的影响，同时对产品质量控制造成极大的挑战。其后，随着定点突变技术的发展，可以在蛋白的特定位点引入半胱氨酸(cysteine)或非天然氨基酸(叠氮，醛基等)，进而进行化学选择性修饰。虽然这类方法对蛋白质的修饰特异性非常好，但突变的产率低，成本高，严重的制约了其发展和应用。
早期的研究认为蛋白质硫-硫键对其结构和功能非常重要，并不适合用来进行化学修饰，但近年来研究表明，硫-硫键修饰后，蛋白质的结构和生物活性都能够很好的保持。基于硫-硫键来发展蛋白质化学选择性修饰新方法，不仅对蛋白质本身的研究有非常积极的作用，同时将该方法用于ADCs的定位合成时也有着独特的优势：单抗中一般含有4对易于接近硫-硫键，如果通过硫-硫键定位偶联高活性物质，不仅可以实现化学选择性偶联，避免对抗体突变的改造，而且可以得到理想的DAR值产物。另外目前报道的技术已经可以实现选择性的对1对或2对硫-硫键偶联。由于蛋白质硫-硫键的修饰研究起步较晚，因此目前的方法并不多，将其用于ADCs的合成中的方法则更有限，目前主要侧重于两大类：(1)α，β-不饱和-β’单砜类化合物(α，β-Unsaturated-β’-monosulfones)；(2)马来酰亚胺类化合物(Maleimides)。单砜类化合物的制备较为繁琐，而马来酰亚胺类化合物的稳定性并不理想。因此，发展新的简单、高效、实用的方法修饰蛋白质硫-硫键是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种双乙烯磺酰胺连接子及其制备，以及以该类连接子一端偶联亲和标记物或示踪荧光物质或活性药物等，另一端特异性偶联多肽或蛋白硫-硫键中的应用。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
一种双乙烯磺酰胺连接子，其结构式为式I或者式II：
Figure BDA0001337806160000021
式I中，X选自C或者N；R选自氢，硝基，羟基，烷基羟基，芳香基羟基，胺基，烷基胺基，芳香基胺基，巯基，烷基巯基，芳香基巯基，羧酸，烷基羧酸，芳香基羧酸，炔基，烷基炔基，芳香基炔基，叠氮，烷基叠氮，芳香基叠氮，羰基，烷基羰基，芳香基羰基，醛基，烷基醛基，芳香基醛基，或其中任意组合；式II中W选自直链、支链或环状烷烃，苄基或其它芳香苄基，苯基或其它芳香基，或其中任意组合；R1选自氢，直链、支链或环状烷烃，苄基或其它芳香苄基，苯基或其它芳香基，或其中任意组合；R2选自氢，直链、支链或环状烷烃，苄基或其它芳香苄基，苯基或其它芳香基，或其中任意组合。
优选地，所述的双乙烯磺酰胺连接子的结构式为式1-式11(图1)、式16、式19、式22、式26以及式30中的至少一种。
上述的双乙烯磺酰胺连接子的制备方法，其特征在于，包括：以胺基化合物为起始物，在氯乙烷基磺酰氯和碱的作用下，反应得到乙烯磺酰胺连接子。
优选地，所述的胺基化合物包括直链、支链或环状烷基胺，苄基或其它芳香苄基胺，苯基或其它芳香基胺，或其中任意组合。
优选地，所述的碱包括三乙胺或其它有机碱，氢氧化钠或其它无机碱。
优选地，上述的双乙烯磺酰胺连接子的制备方法的具体步骤包括：将胺基化合物溶于溶剂中，冰浴下加入碱，充分冷却后加入氯乙烷基磺酰氯，在一定温度下进行反应一段时间，得到双乙烯磺酰胺连接子。
更优选地，所述的反应温度为0℃-45℃。
双乙烯磺酰胺连接子的制备的反应式如下：
Figure BDA0001337806160000031
本发明还提供了上述的双乙烯磺酰胺连接子的应用方法，其特征在于，包括：先在双乙烯磺酰胺连接子的所需官能团上接入Tag，再与多肽或蛋白偶联(方式a)；或者，先将双乙烯磺酰胺连接子同多肽或蛋白偶联，然后再连接Tag(方式b)；其中，所述的双乙烯磺酰胺连接子由在带有反应基团的胺基化合物引入所需官能团(FG)形成。
优选地，所述的胺基化合物包括直链、支链或环状烷基胺，苄基或其它芳香苄基胺，苯基或其它芳香基胺，或其中任意组合。
优选地，所述的所需官能团包括羟基，烷基羟基，芳香基羟基，胺基，烷基胺基，芳香基胺基，巯基，烷基巯基，芳香基巯基，羧酸，烷基羧酸，芳香基羧酸，炔基，烷基炔基，芳香基炔基，叠氮，烷基叠氮，芳香基叠氮，羰基，烷基羰基，芳香基羰基，醛基，烷基醛基，芳香基醛基，或其中任意组合。
优选地，所述的Tag包括亲和标记物(如biotin和folic acid中的至少一种)、示踪荧光物质(如有香豆素和荧光素中的至少一种)以及活性药物(如喜树碱类、美登醇类、抗生素类、毒素类和雷公藤类中的至少一种)中的至少一种。Tag不仅仅局限于上述提到的类别，还包括所有用于亲和标记，荧光失踪以及具有高活性的物质。
优选地，所述的多肽或蛋白包括可达到硫-硫键的多肽，蛋白或者抗体。
本发明同时提供了一种化合物，其特征在于，其结构式为式III：
P-(D-S)n
III
其中，P是多肽或者蛋白；D是上述的双乙烯磺酰胺连接子；S是亲和标记物或示踪荧光物质或活性药物；n是一个范围在0-4的整数。
上述反应的流程如图11所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明提供了简单、高效的方法制备双乙烯磺酰胺连接子；
2.本发明提供的新型双乙烯磺酰胺连接子可选择性的修饰多肽或蛋白的硫-硫键；
3.本发明提供的新型双乙烯磺酰胺连接子不仅一端可以偶联多肽或蛋白，另一端同时可以连接亲和标记物或示踪荧光物质或活性药物。
4.本发明提供的新型双乙烯磺酰胺连接子可选择性在多肽或蛋白的硫-硫键上引入特定官能团后，进一步偶联亲和标记物或示踪荧光物质或活性药物。
5.本发明提供的新型双乙烯磺酰胺连接子可用于抗体药物偶联物，得到DAR(0-4间的整数)值较为均一的产物
附图说明
图1显示了本发明中涉及的典型的双乙烯磺酰胺连接子的结构。
图2显示双乙烯磺酰胺连接子同时含有可偶联的官能团炔基的制备路线。
图3显示双乙烯磺酰胺连接子一端已连接亲和标记物生物素(biotin)的制备路线。
图4显示双乙烯磺酰胺连接子一端已连示踪荧光物质香豆素的制备路线。
图5显示双乙烯磺酰胺连接子一端已连接活性药物喜树碱的制备路线。
图6显示双乙烯磺酰胺连接子对多肽上-SH和-NH2的选择性反应
图7显示一端已连接官能团炔基或亲和标记物生物素或示踪荧光物质香豆素或活性药物喜树碱的双乙烯磺酰胺连接子同多肽Oxytocin的偶联。
图8显示双乙烯磺酰胺连接子偶联多肽Oxytocin中硫-硫键后，引入特定官能团炔基进一步同示踪荧光物质香豆素和荧光素以及活性药物喜树碱偶联的制备路线。
图9显示双乙烯磺酰胺连接子同时偶联踪荧光物质香豆素和多肽Oxytocin的荧光测定结果。
图10显示一端为甲氧基或一端已连接官能团炔基或亲和标记物生物素双乙烯磺酰胺连接子同蛋白sCT的偶联。
图11显示双乙烯磺酰胺连接子偶联多肽或蛋白的实现方式。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
双乙烯磺酰胺连接子合成的通用步骤A：将胺类(1eq.，)溶于CH2Cl2(1mmol/6ml)中，冰浴下加入Et3N(3eq.，)，充分冷却后缓慢滴加2-氯乙烷磺酰氯(2.2eq.，)到上述体系中，在一定温度下反应一段时间，反应温度视底物不同为0℃或者常温或者加热。加入等体积的水淬灭反应。用相等体积的CH2Cl2萃取3次。有机层合并后，等体积的饱和氯化钠洗2次后，无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋蒸除去溶剂，加入CH2Cl2和60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚作为洗脱剂，快速柱层析。
合成化合物的核磁数据1H-NMR和13C-NMR用Bruker-500测定；高分辨质谱(HRMS-ESI)由Agilent Technologies 6230 Accurate Mass TOF LC/MS测定。GCMS-EI由ThermoScienticific ISQ QD测定。
功能性双乙烯磺酰胺连接子与还原后Oxytocin上两个-SH成环的通用步骤B：在微孔板(330ul LABTIDE 96 Round Well)的五个不同的孔中分别均加入12ul的oxytocin(大连美仑生物，MB1177，1mM的水溶液)、20ul的TCEP(1mM的水溶液，用NaOH/H3PO4调节PH为7.0)、120ul PBS缓冲液(商品号Cat.NO.SH30256.0)以及80ul的CH3CN，然后放在微孔板振荡器上室温反应1.5小时。再依次往上述五个孔中分别加入12ul不同的双乙烯磺酰胺连接子溶液(1mM的CH3CN或DMF溶液)，微孔板振荡器上室温反应2小时后用HPLC(型号Waters1525，固定相为C-18硅胶柱，流动相为CH3CN/H2O＝10～100％，0～10分钟)分析，用HRMS-ESI判断产物峰。
基于双乙烯磺酰胺连接子往Oxytoein上引入炔基后的进一步应用的通用步骤C：在微孔板(330ul LABTIDE 96 Round Well)的三个不同的孔中分别均加入炔基修饰后的oxytocin，即化合物35(1mg)、抗坏血酸钠(0.15mg)、硫酸铜(0.12mg)和tBuOH/H2O/DMF(1/1/1)(300ul)。再依次往上述三个孔中分别加入不同的功能性叠氮化物，微孔板振荡器上室温反应2小时后用HPLC(型号Waters 1525，固定相为C-18硅胶柱，流动相为CH3CN/H2O＝10～100％，0～10分钟)分析，用HRMS-ESI判断产物峰。
双乙烯磺酰胺连接子与还原后sCT上两个-SH成环的通用步骤D：在微孔板(330ulLABTIDE 96Round Well)的三个不同的孔中分别均加入12ul的sCT(1mM的水溶液)、20ul的TCEP(1mM的水溶液，用NaOH/H3PO4调节PH为7.0)、120ul PBS缓冲液(商品号Cat.NO.SH30256.0)以及80ul的CH3CN，然后放在微孔板振荡器上室温反应1.5小时。再依次往上述三个孔中分别加入12ul不同的双乙烯磺酰胺连接子溶液(1mM的CH3CN或DMF溶液)，微孔板振荡器上室温反应2小时后用HPLC(型号Waters 1525，固定相为C.18硅胶柱，流动相为CH3CN/H2O＝10～100％，0～10分钟)分析，用HRMS-ESI判断产物峰。
实施例1
双乙烯磺酰胺连接子1的制备
Figure BDA0001337806160000071
使用通用步骤A，加入原料对乙酰基苯胺675.8mg，其它按当量加入，0℃下反应10分钟。其中通用步骤A中加入3ml CH2Cl2和3g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/6作为洗脱剂，过柱得到产物770mg。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.01(d，J＝8.5Hz，2H)，7.38(d，J＝8.5Hz，2H)，7.07(dd，J＝16.5，9.9Hz，2H)，6.30(d，J＝16.6Hz，2H)，6.18(d，J＝9.8Hz，2H)，2.62(s，3H)ppm.13CNMR(126MHz，CDCl3)δ196.95，138.48，137.71，136.07，131.33，130.30，129.62，26.94ppm.ESI-HRMS calcd for C12H14NO5S2[(M+H)+]：316.0313，found：316.0296
实施例2
双乙烯磺酰胺连接子2的制备
Figure BDA0001337806160000072
使用通用步骤A，加入原料对硝基苯胺552.5mg，其它按当量加入，0℃下反应1小时。其中通用步骤A中加入3ml CH2Cl2和2.5g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/6作为洗脱剂，过柱得到产物100mg。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.33-8.24(m，2H)，7.49-7.42(m，2H)，7.07(dd，J＝16.5，9.8Hz，2H)，6.31(dd，J＝16.5，0.9Hz，2H)，6.22(dd，J＝9.9，0.9Hz，2H)ppm.13C NMR(126MHz，CDCl3)δ148.85，139.24，135.86，132.19，130.80，124.90ppm.EI-GCMS calcd forC10H11N2O6S2(M)：317.9980，found：218.20
实施例3
双乙烯磺酰胺连接子3的制备
Figure BDA0001337806160000081
使用通用步骤A，加入原料对甲氧基苯胺1.23g，其它按当量加入，0℃下反应10分钟。其中通用步骤A中加入10ml CH2Cl2和5g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/6作为洗脱剂，过柱得到产物1.93g。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.22-7.14(m，2H)，7.04(dd，J＝16.6，9.9Hz，2H)，6.94-6.88(m，2H)，6.28(d，J＝16.6Hz，2H)，6.13(d，J＝9.8Hz，2H)，3.82(s，3H)ppm.13C NMR(126MHz，CDCl3)δ161.17，136.21，132.19，129.70，125.97，114.91，55.67ppm.ESI-HRMScalcd for C11H14NO5S2[(M+H)+]：304.0313，found：304.0298
实施例4
双乙烯磺酰胺连接子4的制备
Figure BDA0001337806160000082
使用通用步骤A，加入原料对乙炔基苯胺234.3mg，其它按当量加入，加热回流1小时。其中通用步骤A中加入5ml CH2Cl2和1.5g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/6作为洗脱剂，过柱得到产物251mg。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.56(d，J＝8.4Hz，2H)，7.25(d，J＝8.4Hz，2H)，7.07(dd，J＝16.5，9.9Hz，2H)，6.32(d，J＝16.6Hz，2H)，6.18(d，J＝9.8Hz，2H)，3.20(s，1H)ppm.13CNMR(126MHz，CDCl3)δ136.11，133.83，133.40，131.05，130.13，124.89，82.34，79.89ppm.ESI-HRMS calcd for C12H12NO4S2[(M+H)+]：298.0208，found：298.0239.
实施例5
双乙烯磺酰胺连接子5的制备
Figure BDA0001337806160000091
使用通用步骤A，加入原料苯胺372.5mg，其它按当量加入，常温下反应1小时。其中通用步骤A中加入5ml CH2Cl2和2g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/10作为洗脱剂，过柱得到产物339mg。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.48-7.39(m，3H)，7.27-7.23(m，2H)，7.04(dd，J＝16.6，9.9Hz，2H)，6.27(d，J＝16.6Hz，2H)，6.13(d，J＝9.8Hz，2H)ppm.13C NMR(126MHz，CDCl3)δ136.22，133.79，131.02，130.69，129.84，129.72ppm.ESI-HRMS calcd for C10H12NO4S2[(M+H)+]：274.0208，found：274.0208
实施例6
双乙烯磺酰胺连接子6的制备
Figure BDA0001337806160000092
使用通用步骤A，加入原料3-氨基吡啶470.5mg，其它按当量加入，0℃下反应30分钟。其中通用步骤A中加入8ml CH2Cl2和3g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/3作为洗脱剂，过柱得到产物82mg。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.69(dd，J＝4.8，1.4Hz，1H)，8.52(d，J＝2.4Hz，1H)，7.64(ddd，J＝8.1，2.3，1.6Hz，1H)，7.42(dd，J＝8.1，4.8Hz，1H)，7.06(dd，J＝16.5，9.9Hz，2H)，6.30(dd，J＝16.5，0.7Hz，2H)，6.19(dd，J＝9.8，0.7Hz，2H)ppm.13CNMR(126MHz，CDCl3)δ151.16，150.95，138.68，135.86，131.12，130.67，124.47ppm.ESI-HRMS：m/z＝275.0117[M+H]+，296.9929[M+Na]+，312.9662[M+K]+(calcd.exact mass：275.0160[M+H]+，296.9980[M+Na]+，312.9719[M+K]+，formula：C9H10N2O4S2).
实施例7
双乙烯磺酰胺连接子7的制备
Figure BDA0001337806160000101
使用通用步骤A，加入原料对3-氨基-2-氯吡啶642.8mg，其它按当量加入，0℃下反应30分钟。其中通用步骤A中加入10ml CH2Cl2和4g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/6作为洗脱剂，过柱得到产物300mg。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.48(d，J＝4.7Hz，1H)，7.66(d，J＝7.8Hz，1H)，7.33(dd，J＝7.8，4.8Hz，1H)，7.10(dd，J＝16.5，9.8Hz，2H)，6.37(d，J＝16.5Hz，2H)，6.22(d，J＝9.8Hz，2H)ppm.13C NMR(126MHz，CDCl3)δ153.36，151.07，141.37，136.49，130.70，129.29，123.33ppm.ESI-HRMS：m/z＝308.9771[M+H]+，330.9589[M+Na]+，346.9333[M+K]+(calcd.exact mass：308.9770[M+H]+，330.9590[M+Na]+，346.9329[M+K]+，formula：C9H9ClN2O4S2).
实施例8
双乙烯磺酰胺连接子8的制备
Figure BDA0001337806160000102
使用通用步骤A，加入原料3-氨基-4-氯吡啶642.8mg，其它按当量加入，0℃下反应10分钟。其中通用步骤A中加入10ml CH2Cl2和4g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/6作为洗脱剂，过柱得到产物562mg。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.56(d，J＝5.3Hz，1H)，8.48(s，1H)，7.50(d，J＝5.3Hz，1H)，7.11(dd，J＝16.5，9.8Hz，2H)，6.37(d，J＝16.5Hz，2H)，6.22(d，J＝9.8Hz，2H)ppm.13CNMR(126MHz，CDCl3)δ152.92，152.09，145.99，136.37，130.75，129.56，125.91ppm.ESI-HRMS：m/z＝308.9772[M+H]+，330.9589[M+Na]+(calcd.exact mass：308.9770[M+H]+，330.9590[M+Na]+，formula：C9H9ClN2O4S2).
实施例9
双乙烯磺酰胺连接子9的制备
Figure BDA0001337806160000111
使用通用步骤A，加入原料5-氨基-2-氯吡啶642.8mg，其它按当量加入，0℃下反应1小时。其中通用步骤A中加入10ml CH2Cl2和4g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/6作为洗脱剂，过柱得到产物369mg。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.29(d，J＝2.6Hz，1H)，7.55(dd，J＝8.4，2.6Hz，1H)，7.41(d，J＝8.4Hz，1H)，7.04(dd，J＝16.5，9.8Hz，2H)，6.31(d，J＝16.5Hz，2H)，6.20(d，J＝9.8Hz，2H)ppm.13C NMR(126MHz，CDCl3)δ153.33，151.28，140.70，135.76，130.91，129.93，125.31ppm.ESI-HRMS：m/z＝308.9785[M+H]+，330.9605[M+Na]+，(calcd.exact mass：308.9770[M+H]+，330.9590[M+Na]+，formula：C9H9ClN2O4S2).
实施例10
双乙烯磺酰胺连接子10的制备
Figure BDA0001337806160000112
使用通用步骤A，加入原料赖氨酸甲酯306mg，其它按当量加入，0℃下反应3小时。其中通用步骤A中加入5ml CH2Cl2和3g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/4作为洗脱剂，过柱得到产物242mg。
1H NMR(500MHz，MeOD)δ6.63(ddd，J＝16.5，10.0，2.1Hz，2H)，6.13(dd，J＝16.5，6.6Hz，2H)，5.95(dd，J＝22.2，10.0Hz，2H)，3.86(dd，J＝8.7，5.2Hz，1H)，3.72(s，3H)，2.94(t，J＝6.9Hz，2H)，1.88-1.73(m，1H)，1.67(dt，J＝9.4，4.3Hz，1H)，1.61-1.36(m，4H)ppm.13C NMR(126MHz，MeOD)δ174.02，138.19，137.63，126.45，126.27，56.85，52.74，43.49，33.20，30.19，23.59ppm.
实施例11
双乙烯磺酰胺连接子11的制备
Figure BDA0001337806160000121
将哌嗪(1mmol，86.1mg.)溶于CH2Cl2(15ml)中，冰浴下加入Et3N(6mmol，0.83ml.)，充分冷却后缓慢滴加2-氯乙烷磺酰氯(2.4mmol，0.25ml)到上述体系中。自然升至室温搅拌2h，TLC说明反应完全(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1∶1)。加入水淬灭反应。加入CH2Cl2萃取3次。有机层合并后，用饱和氯化钠洗2次后，无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋蒸除去溶剂，加入5ml CH2Cl2和1g60-100目硅胶，拌匀旋干。采用纯乙酸乙酯作洗脱剂，快速柱层析得到产物。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.42(dd，J＝16.6，9.9Hz，2H)，6.28(d，J＝16.6Hz，2H)，6.11(d，J＝9.9Hz，2H)，3.27(s，8H)ppm.13C NMR(126MHz，CDCl3)δ132.14，129.97，45.41ppm.ESI-HRMS：m/z＝267.0478[M+H]+，289.0300[M+Na]+，(calcd.exact mass：267.0473[M+H]+，289.0293[M+Na]+，formula：C8H14N2O4S2).
实施例12
功能性双乙烯磺酰胺连接子16的制备，路线如图2所示：
将4-氨基苯酚(2.0g，18.3mmol)、Boc酸酐(5ml，22mmol)和Et3N(36.6mmol，5ml.)溶于THF(50ml)中，室温反应过夜。减压旋蒸除去溶剂，加入30ml CH2Cl2和8g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/10作洗脱剂，快速柱层析，得到产物13(白色固体，产率96％)。
1H NMR(500MHz，DMSO)δ9.04(s，1H)，8.99(br，1H)，7.22(d，J＝7.1Hz，2H)，6.71-6.58(m，2H)，1.45(s，9H).13C NMR(126MHz，DMSO)δ153.06，152.56，131.08，119.99，115.07，78.45，28.24ppm.
将化合物13(1.7g，8.1mmol)、3-溴丙炔(0.84ml，9.7mmol)和K2CO3(3.3g，24.3mmol)溶于DMF(30ml)中，室温下反应过夜。然后用水(600ml)和乙酸乙酯(3X 50ml)萃取产物，合并后的有机相依次用饱和NaHCO3(20ml)、NH4Cl(20ml)和NaCl(20ml)洗，再用无水Na2SO4干燥。减压旋蒸除去溶剂后得到的化合物14的粗产物用DCM(30ml)溶解，在冰浴下冷却至0℃后加入三氟乙酸(12ml)，冰浴下反应1h后减压旋蒸除去溶剂，加入20ml CH2Cl2和3g60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/8作洗脱剂，快速柱层析，得到产物15(红色油状物，两步总产率84％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.80(dd，J＝8.7，1.6Hz，2H)，6.60(dd，J＝8.8，3.1Hz，2H)，4.58(t，J＝2.4Hz，2H)，3.49(s，2H)，2.51(d，J＝2.3Hz，1H)ppm.13C NMR(126MHz，CDCl3)δ150.38，140.99，116.23，116.09，79.15，75.27，56.57ppm.ESI-HRMS calcd forC9H10NO[(M+H)+]：148.0762，found：148.0815
化合物15(1.0g，6.8mmol)和Et3N(40.8mmol，5.66ml.)溶于DCM(50ml)中，冰浴下冷却至0℃后缓慢加入2-氯乙烷磺酰氯(1.6ml，15.0mmol)，反应液45℃下冷凝回流2h。冷却至室温后加入水(10ml)，产物用DCM(3X 50ml)萃取，合并后的有机相用饱和NaCl(20ml)洗后用无水Na2SO4干燥。减压旋蒸除去溶剂，加入15ml CH2Cl2和4g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/6作洗脱剂，快速柱层析得到双乙烯磺酰胺连接子16(淡黄色固体，产率35％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.23-7.17(m，2H)，7.09-6.96(m，4H)，6.28(d，J＝16.6Hz，2H)，6.14(d，J＝9.9Hz，2H)，4.70(d，J＝2.4Hz，2H)，2.56(t，J＝2.4Hz，1H)ppm.13C NMR(126MHz，CDCl3)δ159.16，136.18，132.24，129.79，126.81，115.76，77.97，76.37，56.17ppm.ESI-HRMS calcd for C13H14NO5S2[(M+H)+]：328.0313，found：328.1552
实施例13
功能性双乙烯磺酰胺连接子19的制备，制备路线如图3所示：
将Biotin(100mg，0.41mmol)、2-叠氮乙胺(70mg，0.82mmol)、HATU(171mg，0.45mmol)和HOBt(69mg，0.45mmol)溶于DMF(2ml)中，然后加入DIPEA(0.35ml)。室温下反应4h后用湿法上样过柱，用CH3OH/DCM＝1/20作洗脱剂，快速柱层析得到化合物18(白色固体，产率36％)。
1H NMR(500MHz，DMSO)δ8.07(t，J＝5.4Hz，1H)，6.44(s，1H)，6.38(s，1H)，4.30(dd，J＝7.5，5.3Hz，1H)，4.15-4.08(m，1H)，3.33(t，J＝5.8Hz，2H)，3.22(dd，J＝11.5，5.7Hz，2H)，3.11-3.05(m，1H)，2.81(dd，J＝12.5，5.1Hz，1H)，2.57(d，J＝12.4Hz，1H)，2.07(t，J＝7.4Hz，2H)，1.30-1.20(m，6H)ppm.13C NMR(126MHz，DMSO)δ172.42，162.73，61.02，59.19，55.43，53.42，49.99，38.15，35.14，28.21，28.05，25.17ppm.ESI-HRMS calcd forC12H21N6O2S[(M+H)+]：313.1447，found：313.1473
化合物18(46mg，0.147mmol)、化合物16(58mg，0.177mmol)、抗坏血酸钠(29.2mg，0.147mmol)和硫酸铜(23.5mg，0.147mmol)溶于tBuOH/H2O(1/1)(2ml)中。室温下反应过夜后用制备HPLC分离(固定相为C-18硅胶柱，流动相为CH3CN/H2O＝10～100％，21分钟)，得到双乙烯磺酰胺连接子19(淡黄色固体，产率33％)。
1H NMR(500MHz，MeOD)δ8.07(s，1H)，7.22(d，J＝8.8Hz，2H)，7.14-7.03(m，4H)，6.23(d，J＝4.1Hz，2H)，6.21(d，J＝1.9Hz，2H)，5.18(s，2H)，4.53(t，J＝5.6Hz，2H)，4.42(dd，J＝7.7，4.8Hz，1H)，4.25(dd，J＝7.8，4.4Hz，1H)，3.65(d，J＝3.2Hz，2H)，3.34(s，1H)，3.19-3.11(m，1H)，2.86(dd，J＝12.7，4.9Hz，1H)，2.64(d，J＝12.7Hz，1H)，2.14(td，J＝7.1，2.0Hz，2H)，1.68(dt，J＝13.4，7.2Hz，1H)，1.62-1.47(m，4H)，1.34(dt，J＝15.0，7.5Hz，3H)ppm.13C NMR(126MHz，MeOD)δ176.46，166.05，161.11，144.49，137.52，133.61，130.76，128.13，125.88，116.42，63.25，62.68，61.56，56.89，50.61，41.07，40.36，36.57，29.60，29.42，26.69ppm.ESI-HRMS calcd for C25H34N7O7S3[(M+H)+]：640.1682，found：640.1714
实施例14
功能性双乙烯磺酰胺连接子22的制备，制备路线如图4所示：
将3-羧酸香豆素(380.3mg，2mmol)、2-叠氮乙胺(206mg，2.4mmol)、Et3N(6mmol，0.83ml.)、EDC(1.15g，6mmol)和HOBt(810.7mg，6mmol)溶于DMF(30ml)中，室温下反应3h后加入水(10ml)，用DCM(3X 30ml)萃取产物，合并后的有机相依次用饱和NaHCO3(20ml)、NH4Cl(20ml)和NaCl(20ml)洗，再用无水Na2SO4干燥。减压旋蒸除去溶剂，加入10ml CH2Cl2和2g60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/4作洗脱剂，快速柱层析得到化合物21(白色固体，产率65％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ9.07(s，1H)，8.91(s，1H)，7.69(ddd，J＝15.8，8.2，1.3Hz，2H)，7.40(dd，J＝16.4，8.0Hz，2H)，3.66(dd，J＝11.7，5.8Hz，2H)，3.55(t，J＝5.8Hz，2H)ppm.13C NMR(126MHz，CDCl3)δ162.15，161.57，154.65，148.86，134.45，130.05，125.55，118.71，118.22，116.88，50.68，39.38ppm.ESI-HRMS calcd for C12H11N4O3[(M+H)+]：259.0831，found：259.0451
化合物21(45mg，0.174mmol)、化合物16(68.5mg，0.2mmol)、抗坏血酸钠(34.6mg，0.174mmol)和硫酸铜(27.8mg，0.174mmol)溶于tBuOH/H2O/DMF(1/1/1)(6ml)中。室温下反应3h后用制备HPLC(固定相为C-18硅胶柱，流动相为CH3CN/H2O＝10～100％，21分钟)分离得到双乙烯磺酰胺连接子22(白色固体，产率29％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ9.03(s，1H)，8.89(s，1H)，7.73-7.69(m，2H)，7.68(s，1H)，7.40(t，J＝8.6Hz，2H)，7.17(d，J＝8.8Hz，2H)，7.08-6.94(m，4H)，6.27(d，J＝16.6Hz，2H)，6.13(d，J＝9.8Hz，2H)，5.21(s，2H)，4.65(t，J＝6.0Hz，2H)，3.97(dd，J＝11.9，5.9Hz，2H)ppm.13C NMR(126MHz，CDCl3)δ162.48，161.48，159.84，154.67，149.07，143.86，136.19，134.68，132.28，130.12，129.78，126.49，125.64，123.60，118.62，117.92，116.92，115.73，62.36，49.55，40.13ppm.ESI-HRMS calcd for C25H24N5O8S2[(M+H)+]：586.1066，found：586.0504
实施例15
功能性双乙烯磺酰胺连接子26的制备，制备路线如图4所示：
将3-羧酸香豆素(0.762g，4mmol)，HOBt(1.62g，12mmol)，EDC·HCl(2.30g，12mmol)混合后，加入DCM(40ml)充分溶解后加入单Boc-乙二胺(0.769g，4.8mmol)，最后加入Et3N(1.21g，12mmol)，室温持续搅拌24h。加入适量的水淬灭反应，用DCM和水萃取，除去水溶性盐，分出有机相，无水Na2SO4干燥。减压旋蒸除去溶剂后，加入10ml CH2Cl2和3g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/4作洗脱剂，快速柱层析得到化合物23(白色固体，产率38％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.91(s，1H)，7.68(ddd，J＝8.8，8.2，1.5Hz，2H)，7.45-7.34(m，2H)，3.59(dd，J＝11.9，6.0Hz，2H)，3.38(d，J＝5.3Hz，2H)，1.64(s，2H)，1.44(s，9H)ppm.13C NMR(126MHz，DMSO)δ162.01，160.10，153.92，147.75，137.34，134.28，130.36，128.89，128.20，125.23，118.70，118.36，116.16，99.53，38.48，37.11，21.03ppm.ESI-HRMS：m/z＝333.1444[M+H]+，355.1266[M+Na]+，371.0996[M+K]+(calcd.exact mass：333.1450[M+H]+，355.1270[M+Na]+，371.1009[M+K]+，formula：C17H20N2O5).
化合物23用DCM(30ml)溶解，冰浴下加入三氟乙酸(7.7g，67mmol)，1h后反应完全，直接减压旋蒸掉低沸点的副产物及过量的三氟乙酸，即得到了化合物24(白色固体，产率100％)。
1H NMR(500MHz，DMSO)δ8.97-8.87(m，2H)，8.02(dd，J＝7.8，1.3Hz，1H)，7.54(d，J＝8.3Hz，1H)，7.47(t，J＝7.5Hz，1H)，3.58(q，J＝6.1Hz，2H)，3.01(dd，J＝11.8，6.0Hz，2H)ppm.ESI-HRMS：m/z＝233.0940[M+H]+，255.0759[M+Na]+，(calcd.exact mass：233.0926[M+H]+，255.0746[M+Na]+，formula：C12H12N2O3).
3-氨基吡啶-2-羧酸(0.53g，3.85mmol)，HOBt(1.42g，10.5mmol)，EDC.HCl(2.01g，10.5mmol)与化合物24混合后，加入DCM(40ml)充分溶解后加入Et3N(1.41g，14mmol)，室温持续搅拌24h。加入适量的水淬灭反应，用DCM和水萃取，除去水溶性盐，分出有机相，无水Na2SO4干燥。减压旋蒸除去溶剂后，加入10ml CH2Cl2和3g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/4作洗脱剂，快速柱层析得到化合物25(白色固体，产率28％)。
1H NMR(500MHz，DMSO)δ8.90-8.80(m，2H)，8.76(t，J＝5.7Hz，1H)，7.98(dd，J＝7.8，1.3Hz，1H)，7.79(dd，J＝4.2，1.3Hz，1H)，7.77-7.72(m，1H)，7.50(d，J＝8.3Hz，1H)，7.46-7.40(m，1H)，7.23(dd，J＝8.4，4.2Hz，1H)，7.14(dd，J＝8.4，1.3Hz，1H)，6.83(s，2H)，3.53(dd，J＝11.7，5.8Hz，2H)，3.46(dd，J＝11.7，5.7Hz，2H)ppm.13C NMR(126MHz，DMSO)δ167.90，161.47，160.19，153.88，147.43，146.30，135.47，134.08，130.27，128.79，127.24，125.13，124.45，120.11，119.03，118.45，116.13，38.22ppm.ESI-HRMS：m/z＝353.1240[M+H]+，375.1055[M+Na]+，(calcd.exact mass：353.1250[M+H]+，375.1070[M+Na]+，formula：C18H16N4O4).
化合物25(35mg，0.1mmol)用DCM(20ml)溶解后，冰浴下加入Et3N(31mg，0.3mmol)，充分冷却后缓慢滴加2-氯乙烷磺酰氯(36mg，0.22mmol)到上述体系中，冰浴下反应30min。加入适量的水淬灭反应，用DCM和水萃取，除去水溶性盐，分出有机相，无水Na2SO4干燥。减压旋蒸除去溶剂后，加入5ml CH2Cl2和2g 60-100目硅胶，拌匀旋干。采用乙酸乙酯/石油醚＝1/2作洗脱剂，快速柱层析得到双乙烯磺酰胺连接子26(淡黄色固体，产率56％)。
1H NMR(500MHz，DMSO)δ8.92(t，J＝5.6Hz，1H)，8.86(s，1H)，8.84(t，J＝5.7Hz，1H)，8.72(dd，J＝4.6，1.4Hz，1H)，7.98(dd，J＝7.8，1.3Hz，1H)，7.86(dd，J＝8.1，1.4Hz，1H)，7.77-7.71(m，1H)，7.70(dd，J＝8.1，4.7Hz，1H)，7.49(d，J＝8.3Hz，1H)，7.43(dd，J＝11.5，4.3Hz，1H)，7.23(dd，J＝16.5，9.9Hz，2H)，6.32(d，J＝9.4Hz，2H)，6.17(d，J＝16.4Hz，2H)，3.53(dd，J＝11.6，5.8Hz，2H)，3.46(dd，J＝11.5，5.6Hz，2H)ppm.13C NMR(126MHz，DMSO)δ172.12，163.93，161.53，160.15，153.88，150.52，149.86，147.43，143.00，141.97，135.97，134.06，130.73，130.26，128.86，127.65，126.63，125.11，119.06，118.46，116.11，38.87，38.75ppm.ESI-HRMS：m/z＝533.0831[M+H]+，555.0657[M+Na]+，571.0394[M+K]+(calcd.exact mass：533.0801[M+H]+，555.0621[M+Na]+，571.0360[M+K]+，formula：C22H20N4O8S2).
实施例16
功能性双乙烯磺酰胺连接子30的制备，制备路线如图5所示：
将喜树碱(174.2mg，0.5mmol)和丁二酸酐(150mg，1.5mmol)溶于DCM(15ml)中，冰浴下冷却至0℃后缓慢加入DBU(0.23ml，1.5mmol)，反应液室温反应过夜后加入水(10ml)，用DCM(3X 20ml)萃取产物，合并后的有机相用饱和NaCl(10ml)洗后用无水Na2SO4干燥。减压旋蒸浓缩后得到化合物28的粗产物溶液，然后加入2-叠氮乙胺(51.6mg，0.6mmol)、Et3N(1.5mmol，0.21ml.)、EDC(287.6mg，1.5mmol)和HOBt(202.7mg，1.5mmol)，室温下反应5h后加入水(10ml)，用DCM(3X 15ml)萃取产物，合并后的有机相依次用饱和NaHCO3(10ml)、NH4Cl(10ml)和NaCl(10ml)洗，再用无水Na2SO4干燥。减压旋蒸除去溶剂，加入10ml CH2Cl2和2g60-100目硅胶，拌匀旋干。采用CH3OH/DCM＝1/40作洗脱剂，快速柱层析得到化合物29(淡黄色固体，两步总产率81％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.44(s，1H)，8.26(d，J＝8.3Hz，1H)，7.95(d，J＝8.1Hz，1H)，7.85(t，J＝7.5Hz，1H)，7.68(t，J＝7.4Hz，1H)，7.35(s，1H)，6.38(s，1H)，5.66(d，J＝17.0Hz，1H)，5.36(d，J＝17.0Hz，1H)，5.33-5.19(m，2H)，3.31(s，4H)，2.98-2.88(m，1H)，2.87-2.76(m，1H)，2.61-2.46(m，2H)，2.22(td，J＝14.4，7.2Hz，1H)，2.11(dq，J＝14.4，7.1Hz，1H)，0.99(t，J＝7.3Hz，3H)ppm.13C NMR(126MHz，CDCl3)δ172.09，167.75，157.52，151.88，148.25，146.72，145.87，132.16，131.34，129.05，128.71，128.50，128.44，128.38，119.98，97.43，77.40，76.50，66.97，50.62，50.29，39.20，31.66，30.85，29.53，7.74ppm.ESI-HRMS calcd for C26H25N6O6[(M+H)+]：517.1836，found：517.1914
化合物29(176mg，0.34mmol)、化合物16(133.8mg，0.4mmol)、抗坏血酸钠(67.4mg，0.34mmol)和硫酸铜(54.3mg，0.34mmol)溶于tBuOH/H2O/DMF(1/1/1)(9ml)中。室温下反应2h后用制备HPLC(固定相为C-18硅胶柱，流动相为CH3CN/H2O＝10～100％，21.5分钟)分离得到双乙烯磺酰胺连接子30(淡黄色固体，产率49％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.38(s，1H)，8.22(d，J＝7.8Hz，1H)，7.91(d，J＝7.9Hz，1H)，7.82(t，J＝7.1Hz，1H)，7.65(t，J＝7.2Hz，1H)，7.53(s，1H)，7.30(s，1H)，7.11(d，J＝8.1Hz，2H)，6.98(dd，J＝16.2，9.9Hz，2H)，6.91(d，J＝7.9Hz，2H)，6.64(s，1H)，6.23(d，J＝16.5Hz，2H)，6.10(d，J＝9.7Hz，2H)，5.58(d，J＝16.9Hz，1H)，5.31(d，J＝16.9Hz，1H)，5.17(dd，J＝37.5，18.8Hz，2H)，5.04(s，2H)，4.27(s，2H)，3.56(d，J＝30.6Hz，2H)，2.95-2.70(m，2H)，2.43(s，2H)，2.14(ddd，J＝49.5，13.7，7.1Hz，2H)，0.97(t，J＝6.9Hz，3H)ppm.13CNMR(126MHz，CDCl3)δ172.20，172.14，167.67，159.49，157.27，151.91，148.35，146.47，146.00，135.95，132.10，131.83，131.03，129.81，129.73，129.13，128.61，128.37，128.26，128.22，126.39，124.29，119.61，115.64，96.70，76.47，66.80，61.70，50.07，49.22，39.76，31.42，30.43，29.24，7.66ppm.ESI-HRMS calcd for C39H38N7O11S2[(M+H)+]：844.2071，found：844.2049
实施例17
双乙烯磺酰胺连接子3对-SH和N-NH2的选择性研究，如图6所示：
在微孔板(330ul LABTIDE 96 Round Well)的一个孔中加入12ul的四肽，即化合物31(1mM的水溶液)、12ul双乙烯磺酰胺连接子3(1mM的CH3CN溶液)、120ul PBS缓冲液(商品号Cat.NO.SH30256.0)以及80ul的CH3CN，然后放在微孔板振荡器上室温反应2小时后用HPLC(型号Waters 1525，固定相为C-18硅胶柱，流动相为CH3CN/H2O＝10～100％，0～10分钟)分析知还是原料，没有发生反应。用HRMS-ESI(型号Agilent Technologies 6230，流动相为CH3OH/H2O＝7∶3)分析也是得到相同的结果。
在微孔板(330ul LABTIDE 96 Round Well)的一个孔中加入12ul的四肽，即化合物32(1mM的水溶液)、12ul双乙烯磺酰胺连接子3(1mM的CH3CN溶液)、120ul PBS缓冲液(商品号Cat.NO.SH30256.0)以及80ul的CH3CN，然后放在微孔板振荡器上室温反应2小时后用HPLC(型号Waters 1525，固定相为C-18硅胶柱，流动相为CH3CN/H2O＝10～100％，0～10分钟)分析得知发生反应得到了化合物33。ESI-HRMS calcd for C32H47N6O11S3[(M+H)+]：787.2465，found：787.2420。
实施例18
功能性双乙烯磺酰胺连接子与还原后Oxytocin上两个-SH成环，如图7所示：
化合物34的制备：使用通用步骤B，双乙烯磺酰胺连接子溶液为双乙烯磺酰胺连接子3溶液(1mM的CH3CN溶液)。HPLC产率74％，ESI-HRMS calcd for C54H82N13O17S4[(M+H)+]：1312.4834，found：1312.4793。化合物35的制备：使用通用步骤B，双乙烯磺酰胺连接子溶液为双乙烯磺酰胺连接子16溶液(1mM的CH3CN溶液)。HPLC产率76％，ESI-HRMS calcd forC56H82N13O17S4[(M+H)+]：1336.4834.found：1336.4791。
化合物36的制备：使用通用步骤B，双乙烯磺酰胺连接子溶液为双乙烯磺酰胺连接子19溶液(1mM的DMF溶液)。HPLC产率79％，ESI-HRMS calcd for (C68H103N19O19S5)/2[(M/2+H)+]：824.8140，found：824.8125。
化合物37的制备：使用通用步骤B，双乙烯磺酰胺连接子溶液为双乙烯磺酰胺连接子22溶液(1mM的DMF溶液)。HPLC产率54％，ESI-HRMS calcd for (C68H93N17O20S4)/2[(M/2+H)+]：797.7833，found：797.7820。双乙烯磺酰胺连接子同时偶联踪荧光物质香豆素和多肽Oxytocin的荧光测定结果如图9所示。
化合物38的制备：使用通用步骤B，双乙烯磺酰胺连接子溶液为双乙烯磺酰胺连接子30溶液(1mM的DMF溶液)。HPLC产率70％，ESI-HRMS calcd for (C82H107N19O23S4)/2[(M/2+H)+]：926.8335，found：927.3335。
实施例19
基于双乙烯磺酰胺连接子往Oxytocin上引入炔基的进一步应用，如图8所示：
化合物37的制备：使用通用步骤C，功能性叠氮化物为香豆素-N3，即化合物21(2.8mg)。HPLC产率56％，ESI-HRMS calcd for(C68H93N17O20S4)/2[(M/2+H)+]：797.7833，found：797.7820。
化合物38的制备：使用通用步骤C，功能性叠氮化物为喜树碱-N3，即化合物29(2.8mg)。HPLC产率62％，ESI-HRMS calcd for(C82H107N19O23S4)/2[(M/2+H)+]：926.8335，found：927.3335。
化合物40的制备：使用通用步骤C，功能性叠氮化物为罗丹明-N3，即化合物39(2.8mg)。HPLC产率42％，ESI-HRMS calcd for(C85H117N19O23S6)/2[(M/2+H)+]：981.8447，found：982.1964。
实施例20
双乙烯磺酰胺连接子与还原后sCT上两个-SH成环，如图10所示：
化合物42的制备：使用通用步骤D，双乙烯磺酰胺连接子溶液为双乙烯磺酰胺连接子3溶液(1mM的CH3CN溶液)。HPLC产率81％，ESI-HRMS calcd for (C156H259N45O53S4)/4[(M/4+H)+]：934.6960，found：935.1928。
化合物43的制备：使用通用步骤D，双乙烯磺酰胺连接子溶液为双乙烯磺酰胺连接子16溶液(1mM的CH3CN溶液)。HPLC产率83％，ESI-HRMS calcd for(C158H259N45O53S4)/4[(M/4+H)+]：940.6960，found：941.1922。
化合物44的制备：使用通用步骤D，双乙烯磺酰胺连接子溶液为双乙烯磺酰胺连接子19溶液(1mM的DMF溶液)。HPLC产率60％，ESI-HRMS calcd for(C170H279N51O55S5)/4[(M/4+H)+]：1018.7302，found：1019.2246。

Claims (4)

1.一种所述的双乙烯磺酰胺连接子的应用方法，其特征在于，包括如式Ⅰ所述的双乙烯磺酰胺连接子与还原后Oxytocin上两个-SH成环：
Figure 194236DEST_PATH_IMAGE001
；
式Ⅰ中，R为
Figure 177236DEST_PATH_IMAGE002
；
所述双乙烯磺酰胺连接子往Oxytocin上引入炔基后进一步进行如下偶联：
Figure 838024DEST_PATH_IMAGE003
。
2.如权利要求1所述的双乙烯磺酰胺连接子的应用方法，其特征在于，所述的双乙烯磺酰胺连接子的制备方法包括：以胺基化合物为起始物，在氯乙烷基磺酰氯和碱的作用下，反应得到双乙烯磺酰胺连接子。
3.如权利要求2所述的双乙烯磺酰胺连接子的应用方法，其特征在于，所述的碱包括有机碱，无机碱。
4.如权利要求2所述的双乙烯磺酰胺连接子的应用方法，其特征在于，具体步骤包括：将胺基化合物溶于溶剂中，冰浴下加入碱，充分冷却后加入氯乙烷基磺酰氯，在0℃-45℃进行反应，得到双乙烯磺酰胺连接子。
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