JP6670502B2 - 神経伝達物質受容体のリガンドスクリーニングシステムの開発 - Google Patents
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Description
例えばグルタミン酸受容体の部分配列であるリガンド結合部位を用いて、グルタミン酸に対する蛍光応答の検出が報告されている(非特許文献1)が、全長のグルタミン酸受容体を用いた蛍光応答システムは皆無である。全長のグルタミン酸受容体を用いての薬剤アッセイは、AMPA受容体の活性(イオンチャネル特性)評価が一般的であるが、その評価方法は煩雑であるため、ハイスループットな評価方法へは展開できていない。
項1. 下記式(II)
で表される基本構造を有し、アンタゴニストが結合したときとアゴニストが結合したときとで蛍光のパターンが変化する、標識された神経伝達物質受容体に前記受容体との相互作用が期待される候補物質を作用させて、前記候補物質と前記受容体の結合様式を標識が発するシグナルの変化により検出し、その結果に基づいて行うことを特徴とする、当該神経伝達物質受容体に結合する物質のスクリーニング方法。
項2. 標識された神経伝達物質受容体を有する細胞に前記候補物質を作用させる、項1に記載のスクリーニング方法。
項3. 前記受容体がAMPA受容体である、項1又は2に記載のスクリーニング方法。
項4. 下記式(I)
で表される化合物。
項5. 下記式(I)
で表される当該神経伝達物質受容体の標識剤。
項6. 下記式(I)
で表される化合物と当該神経伝達物質受容体(Rec-Nu-H)を反応させて下記式(II)
で表される基本構造を有し、アンタゴニストが結合したときとアゴニストが結合したときとで標識の発するシグナルのパターンが変化する、標識された神経伝達物質受容体を得ることを特徴とする、標識受容体の製造方法。
AMPA受容体以外の神経伝達物質受容体のリガンドでも、受容体を活性化するアゴニストと不活性化するアンタゴニストでは例えば蛍光応答等の標識の発するシグナルが異なり、任意の神経伝達物質受容体のアゴニストとアンタゴニストを例えば蛍光変化等として見分けることが可能となり、選択的な作用薬をハイスループットにスクリーニングすることが可能になった。
アシルイミダゾール部分を有する本発明の標識試薬(ラベル化剤)は、リガンド(Lg)の部分で神経伝達物質受容体(Rec-Nu-H)に結合し、受容体(Rec-Nu-H)中の求核基(Nu-H)がアシルイミダゾールのカルボニルのC原子を攻撃し、N−CO結合が切断されて、イミダゾール基を有するリガンドは受容体から離れ、標識基(Fl)が受容体のNuと-CO-O-(L2)n2基を介して連結されて標識受容体:Rec-Nu-CO-O-(L2)n2-Fl
(式中、Rec-Nuは神経伝達物質受容体(Rec-Nu-H)からHが脱離した基を示し、Nuは受容体の求核基(Nu-H)からHが脱離した基を示し、L2、n2、Flは前記に定義されるとおりである。)
が得られる。なお、複数の標識基(Fl)が受容体の複数のNuと-CO-O-(L2)n2基を介して連結されてもよい。
水溶性高分子としてはポリエチレングリコール(PEG)などが挙げられる。
ペプチドとしては、tatペプチドなどの膜透過性ペプチド、各種ホーミングペプチド、各種ペプチドリガンド等が挙げられる。
・グルタミン酸受容体:神経伝達物質としてのグルタミン酸を結合する。結合する薬物によりNMDA受容体、AMPA受容体、カイニン酸受容体に分けられる。
・ムスカリン性アセチルコリン受容体:アセチルコリン、ムスカリン
・アデノシン受容体:アデノシン、カフェイン
・アドレナリン受容体:アドレナリン、ノルアドレナリン
・GABA受容体:GABA
・カンナビノイド受容体:大麻成分およびアナンダミド
・コレシストキニン受容体:コレシストキニン
・ドーパミン受容体:ドーパミン
・ヒスタミン受容体:ヒスタミン
・オピオイド受容体:コカイン、モルヒネ、ヘロインなどのアヘン成分および内在性ペプチド性リガンド(エンケファリン、エンドルフィン等)
・セロトニン受容体:セロトニン
・ソマトスタチン受容体:ソマトスタチン
・ニコチン性アセチルコリン受容体:アセチルコリン、ニコチン
・グリシン受容体:神経伝達物質としてのグリシン、ストリキニン
L1、L2は同一であっても異なっていてもよく、2価の連結基が挙げられる。2価の連結基としては、−O−、−CO−、−COO−、−O−CO−、−NHCO−、−CONH−、−(CH2)m1−(m1は1〜6の整数を示す)、アリーレン基(特に、オルト、メタ、パラなどのフェニレン)、ヘテロアリーレン基、−NH−、−(CH2CH2O)m2−(m2は1〜10の整数を示す。)、−(CH2CH(CH3)O)m2−(m2は1〜10の整数を示す。)などが挙げられ、これらは1種のみでもよく、同一又は異なる2種以上を組み合わせて1つの二価の連結基を構成してもよい。また、2価の連結基の(末端の)CO、COO、O−CO−、CONH、NHCO、NHなどは、Lg、FlなどのCOOH、NH2などと結合して、アミド、ウレタン、ウレアなどの結合を形成することができる。
Lg、Flの導入は、これらが末端にカルボン酸(COOH)、又はそのエステルもしくは活性エステル、NH2、SH、OHなどの官能基を有する場合にはそれらを利用して行うことができる。Lg、Flが適当な官能基を有しない場合には、カルボン酸(COOH)、又はそのエステルもしくは活性エステル、NH2、SH、OHなどの連結用官能基を末端に導入し、この官能基を利用して連結することができる。Lg、Flの導入は例えば以下のスキーム1,2に従いようにして行うことができる。スキーム(Scheme)1,2はアミド結合(CONH,NHCO)を用いてLg、Flを導入する方法であるが、エーテル結合、チオエーテル結合、アミノ結合などを用いて公知の方法に従いLg、Flを導入することができる。
NMDA受容体リガンドは、末端のα、β不飽和カルボキシル基を用いてアミド結合、エステル結合などによりL1と結合させることができる。
GABA受容体リガンドは、7員環の二級アミノ基(NH)をアルキル化し、N-C結合によりL1と結合させることができる。
これら4つの受容体のリガンド以外にも、同様にリガンドの機能を失わない位置においてL1と結合させることができる。
2価の連結基の2種以上の組み合わせとしては、例えば以下のものが挙げられる:
アルコキシとしては、メトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、イソプロポキシ、n−ブトキシ、イソブトキシ、tert−ブトキシ、n−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ポリエチレングリコール誘導体などの直鎖状又は分枝鎖状のC1−18アルコキシ、好ましくはC1−6アルコキシ、より好ましくはC1−4アルコキシが挙げられる。
R1、R2は水素原子が好ましい。
反応は、化合物(1)1モルに対し、化合物(2)を1モルから過剰量、塩基(Base)を1モルから過剰量使用し、溶媒中で室温から溶媒の沸騰する温度下に1〜24時間反応させることにより有利に進行する。溶媒としては、塩化メチレン、クロロホルム、ジクロルエタンなどの塩素化炭化水素、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素、酢酸エチルなどのエステル、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン類、エーテル、ジイソプルイピルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ヘキサン、シクロヘキサンなどの脂肪族または脂環式炭化水素、DMF、DMSO、ジオキサン、N-メチルピロリドンなどが挙げられる。塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、DBUなどが挙げられる。
神経伝達物質受容体は、単離した受容体であってもよいが、膜結合型の受容体に直接化合物(I)を反応させてもよく、受容体を発現した細胞を化合物(I)と反応させてもよい。本明細書において、「受容体」とは、受容体タンパク質あるいはリガンド結合部位と求核基を有するその断片、受容体を含む細胞膜の断片、受容体を発現した細胞を全て含む場合がある。細胞は、受容体の遺伝子を導入して受容体を高発現させた細胞が好ましく使用できる。受容体が複数のタンパク質から構成されるとき、リガンド結合部位を含むタンパク質だけでなく受容体を構成する全てのタンパク質の遺伝子を導入して高発現させた細胞を使用することができる。受容体を高発現させた細胞は、リガンドスクリーニングの際にシグナル(蛍光強度あるいはその変化)が大きくなるので好ましい。
標識された受容体と受容体のリガンド(アゴニスト、アンタゴニスト、部分アゴニスト)を水などの溶媒あるいは細胞培養用の培地中に受容体に結合する候補物質を混合し、蛍光の変化を見ることで、候補物質が受容体とどのような様式で結合するかを評価することができる。
実施例1
材料と方法
全ての化学物質及び生物化学的試薬は、市販品を購入し、さらに精製することなく使用した。薄層クロマトグラフィー(TLC)はシリカ ゲル 60 F254 をプレコートしたアルミニウムシート(Merck社)を用いて行い、蛍光クエンチング又はニンヒドリン染色により可視化した。クロマトグラフィーによる精製は、シリカゲル60 N (neutral, 40-50 μm, 関東化学社)上のフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて行った。
窒素雰囲気下で、2-ニトロ-4-トリフルオロメチルアニリン (10.5 g, 50 mmol)、トリエチルアミン (9 ml, 64 mmol)、ジメチルアミノピリジン (20 mg)を乾燥THF 100mlに溶かした。氷浴下で、エチルオキサリルクロリド 8.88g (64 mmol)を滴下して、室温で5時間撹拌した。溶媒を留去後、残渣を酢酸エチルに溶かし、水で洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒留去した。エタノールで再結晶を行い、12.6 g(41.1 mmol, 82%)の薄黄色結晶の化合物4を得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.0 (s, 1H), 9.03 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.58 (s, 1H), 7.96 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.49 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 1.47 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
窒素雰囲気下で、化合物4 (5.2 g, 17 mmol)を乾燥THF 75 mlに溶かした。tert-ブトキシカリウム 2.6 g (23 mmol)を少量ずつ加えて、室温で30分間撹拌した。その後に、ブロモ酢酸エチル 3.1g (25 mmol)を滴下し、室温で5時間撹拌し、さらに3時間加熱還流した。溶媒を留去後、残渣を酢酸エチルに溶かし、水で洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒留去した。カラムクロマトグラフィー(シリカ、ヘキサン / 酢酸エチル=6/1-5/1-4/1)で精製を行い、2.6 g (6.6 mmol 39%)の黄色油状の化合物5を得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.31 (s, 1H), 7.96-7.91 (m, 2H), 4.48 (d, , J = 17.6 Hz 1H), 4.27 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.08 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 1.32 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.13 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
化合物5 (0.2 g, 0.51 mmol)を酢酸 3 mlに溶かした。鉄粉末 0.17 g を加えて、1時間加熱還流した。反応溶液を空冷した後に溶媒を留去し、残渣に水を加えて固液洗浄を行い、得られた固体を回収した後に、エタノールから再結晶し、82.4 mg (0.26 mmol, 51%)の白色結晶の化合物6を得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.4 (s, 1H), 7.45 (s, 3H), 5.00 (s, 2H), 4.16 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
化合物6 (82.4 mg, 0.26 mmol)を濃硫酸 1 mlに溶かした。氷浴下で硝酸カリウム 26.3 mg (0.26 mmol)を加えて、1時間撹拌した。反応溶液を氷水に加え、析出した固体を酢酸エチルで抽出した。得られた有機層の溶媒を留去し、88.0 mg (0.21 mmol)の白色固体の粗化合物7を得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.7 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 5.02 (s, 2H), 4.17 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
粗化合物7 (88 mg, 0.21 mmol)をDMF 0.6 mlに溶かした。10% パラジウム炭素 9 mgを加えて、水素雰囲気下で1時間撹拌した。パラジウム炭素を濾別で除いた後に、溶媒を留去した。残渣をエタノールで洗浄し、87.2 mg(0.22 mmol, 100%)の白色固体の粗化合物8を得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.0 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 6.64 (s, 1H), 5.47 (s, 2H), 4.81 (s, 2H), 4.17 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.22 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
粗化合物8 (87.2 mg, 0.22 mmol)と2,5-ジメトキシ-3-テトラヒドロフランカルバルデヒド35.2 mg (0.22 mol)を酢酸 1.5 mlに溶かした。20分間加熱還流を行った後に放冷し、溶媒留去した。メタノール0.5 mlに溶かした後に、クロロホルム 20 mlを加えて再沈殿させた。固体を濾過にて回収し、減圧乾燥後に、80.9 mg (0.17 mmol, 77%)の白色固体の化合物9を得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.5 (s, 1H), 9.76 (s, 1H), 7.8-7.6 (m, 2H), 7.64 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.63 (s, 1H), 4.98 (s, 2H), 4.14 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
化合物9 (100 mg, 0.24 mmol)をエタノール 3 mlに溶かした。ヒドロキシアミン塩酸塩 34 mg (0.49 mmol)、酢酸ナトリウム 40 mg (0.48 mmol)を加えた後に、1.5時間加熱還流を行った。水で固液洗浄を行い、固体を濾過にて回収し、減圧乾燥後に、92 mg (0.22 mmol, 89%)の白色固体の化合物10を得た。1H-NMRより、シス体とトランス体の存在比は、22:78であった。
化合物10 (32 mg, 0.075 mmol)をエタノール 1 mlと濃塩酸 0.1 mlとの混合溶液に溶かした。10% パラジウム炭素 15 mgを加えて、水素雰囲気下で終夜撹拌した。パラジウム炭素を濾別で除いた後に、溶媒を留去し、26 mg(0.64 mmol, 85%)の化合物11を得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.64 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.41 (s, 1H), 5.03 (s, 2H), 4.25 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.05 (s, 2H), 1.27 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
イミダゾール酢酸塩酸塩 31 mg ( 0.19 mmol)を乾燥DMF 2 mlに溶解させた。WSC-HCl 45 mg (0.24 mmol)、HOBt-H2O 32 mg (0.24 mmol)、化合物 12 (70 mg, 0.16 mmol)、DIEA 164 μl (0.94 mmol)を加えて、室温で5時間撹拌した。溶媒を留去した後に、カラムクロマトグラフィー(シリカ、CHCl3 / MeOH =5/1(NH3 1%))で精製を行い、31 mg (61 μmol)の化合物12を得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.60 (s, 2H), 7.23 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 6.80-6.77 (s, 2H), 6.21 (s, 1H), 5.03 (s, 1H), 4.27-4.18 (m, 4H), 3.51 (s, 2H), 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
化合物12 (20 mg, 33 μmol)をメタノール 0.5 mlに溶解させ、0.5 M 水酸化リチウム水溶液 284 μl (142 μmol)を加えて室温で3時間撹拌した。1N 塩酸を加えて中和した後に減圧乾固し、得られた粗生成物をそのまま次の反応に用いた。次の反応に用いた。
オレゴングリーン (300 mg, 0.73 mmol)を乾燥DMF 5 mlに溶解させ、HATU 540 mg (1.31 mmol)、DIEA 0.36 ml (2.2 mmol)を加えて、室温で4時間撹拌した。溶媒留去後、カラムクロマトグラフィー(シリカ、CHCl3/MeOH/AcOH = 100/10/1 → 100/25/1)で精製を行い、173 mg (0.35 mmol)の化合物14を得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.78 (m, 1H), 8.58 (m, 1H), 8.58 (m, 1H),8.06 (m, 1H), 7.36 (m, 1H), 6.32 (m, 4H),4.60 (m, 1H), 3.62-3.30 (m, 8H).
化合物 14 (55 mg, 0.11 mmol)を乾燥DMF 1.5 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、ジスクシンイミジルカルバメート71 mg (0.28 mmol)、トリエチルアミン 38.6 μl (0.28 mmol)を加えて、室温で6時間撹拌した。溶媒留去した後に、ジクロロメタン 2 mlに溶解させ、ジエチルエーテル 2 mlを加えて再沈殿させた。得られた固体を減圧乾燥し、40 mgの粗化合物 15を得た。得られた粗生成物をそのまま次の反応に用いた。
化合物 13 (36 μmol)を乾燥DMF 1.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、化合物15 (25 mg, 39 μmol)、ピリジン 11.4 μl (0.14 mmol)を加えて、室温で6時間撹拌した。反応溶液にアセトニトリルを加えることで、再沈殿させ、得られた固体をHPLC(アセトニトリル/10 mM 酢酸アンモニウム水溶液)で精製し、凍結乾燥して、目的化合物1(Oregon Green)を得た。MALDI-TOF-Mass ([M+H]=1014.38(obs.), 1015.21(calc.))
化合物 11 (166 mg, 0.37 mmol)を乾燥DMF 1.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、無水コハク酸 (45 mg, 0.45 mmol)、DIEA 130 μl (0.74 mmol)を加えて、室温で2.5時間撹拌した。溶媒を留去した後に、残渣を水で洗浄し、92 mg (0.18 mmol)の化合物16を得た。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.60 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 6.81 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 6.23 (s, 1H), 5.01 (s, 1H), 4.25-4.20 (m, 4H), 2.59-2.42 (m, 4H), 1.24 (t, J = 5.2 Hz, 3H).
化合物 16 (92 mg, 0.18 mmol)を乾燥DMF 5 mlに溶解させた。WSC-HCl 45 mg (0.24 mmol)、HOBt-H2O 32 mg (0.24 mmol)、ヒスタミン塩酸塩 43mg (0.24 mmol)、DIEA 158 μl (0.91 mmol)を加えて、室温で3時間撹拌した。溶媒を留去した後に、カラムクロマトグラフィー(シリカ、CHCl3 / MeOH =5/1(NH3 1%))で精製を行い、72 mg (0.12 mmol)の化合物17を得た。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.59 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.85-6.77 (m, 3H), 6.21 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 5.02 (s, 1H), 4.29-4.20 (m, 4H), 2.77-2.42 (m, 8H), 1.25 (t, J = 5.4 Hz, 3H).
化合物17 (20 mg, 33 μmol)をメタノール 0.5 mlに溶解させ、0.5 M 水酸化リチウム水溶液 284 μl (142 μmol)を加えて室温で3時間撹拌した。1N 塩酸を加えて中和した後に減圧乾固し、得られた粗生成物をそのまま次の反応に用いた。次の反応に用いた。
化合物 2(Oregon Green)
化合物 18 (33 μmol)を乾燥DMF 1.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、化合物15 (21 mg, 33 μmol)、ピリジン 10.6 μl (0.13 mmol)を加えて、室温で6時間撹拌した。反応溶液にアセトニトリルを加えることで、再沈殿させ、得られた固体をHPLC(アセトニトリル/10 mM 酢酸アンモニウム水溶液)で精製し、凍結乾燥して、目的化合物2(Oregon Green)を得た。ESI-Mass ([M+Na]=1123.2507(obs.), 1123.2504(calc.))
化合物 11 (130 mg, 0.29 mmol)を乾燥DMF 1.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、無水アジピン酸 (45 mg, 0.45 mmol)(ref.1)、DIEA 102 μl (0.58 mmol)を加えて、室温で3時間撹拌した。溶媒を留去した後に、カラムクロマトグラフィー(シリカ、CHCl3 / MeOH =5/1(NH3 1%))で精製を行い、137 mg (0.25 mmol)の化合物19を得た。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.90 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 6.82-6.73 (m, 2H), 6.20 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.03 (s, 2H), 4.24-4.19 (m, 4H), 2.32-2.28 (m, 4H), 1.71-1.56 (m, 4H), 1.24 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
化合物 19 (137 mg, 0.25 mmol)を乾燥DMF 5 mlに溶解させた。WSC-HCl 63 mg (0.33 mmol)、HOBt-H2O 45 mg (0.33 mmol)、ヒスタミン塩酸塩 61 mg (0.33 mmol)、DIEA 221 μl (1.27 mmol)を加えて、室温で2時間撹拌した。溶媒を留去した後に、カラムクロマトグラフィー(シリカ、CHCl3 / MeOH =5/1(NH3 1%))で精製を行い、72 mg (0.12 mmol)の粗化合物20を得た。得られた粗生成物をそのまま次の反応に用いた。
粗化合物20 (33 mg)をメタノール 0.5 mlに溶解させ、0.5 M 水酸化リチウム水溶液 210 μl (105 μmol)を加えて室温で5時間撹拌した。1N 塩酸を加えて中和した後に減圧乾固した。得られた固体をHPLC(アセトニトリル(0.1% TFA)/水(0.1% TFA))で精製し、凍結乾燥して、化合物21を得た。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.80 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.82-6.78 (m, 2H), 6.21 (s, 1H), 5.01 (s, 2H), 4.24 (s, 2H), 3.47 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.90 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.22-2.14 (m, 4H), 1.62-1.55 (m, 4H).
化合物 21 (18 mg, 26 μmol)を乾燥DMF 0.5 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、化合物15 (17 mg, 26 μmol)、ピリジン 10.6 μl (0.13 mmol)を加えて、室温で6時間撹拌した。反応溶液にアセトニトリルを加えることで、再沈殿させ、得られた固体をHPLC(アセトニトリル/10 mM 酢酸アンモニウム水溶液)で精製し、凍結乾燥して、目的化合物3(Oregon Green)を得た。ESI-Mass ([M+Na]=1129.3009(obs.), 1129.2997(calc.))
化合物 17 (18 mg, 26 μmol)を乾燥DMF 0.5 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、化合物22 (15.6 mg, 45 μmol) (ref.2)、ピリジン 10 μl (0.12 mmol)を加えて、室温で6時間撹拌した。反応溶液をHPLC(アセトニトリル/10 mM 酢酸アンモニウム水溶液)で精製し、凍結乾燥して、目的化合物23(5.73 mg, 7μmol)を得た。MALDI-TOF-Mass ([M+H]=807.326(obs.), 807.292(calc.))
化合物 23 (5.738 mg, 7 μmol)を乾燥ジクロロメタン 1.0 mlに懸濁させた。窒素雰囲気下で、TFA 0.5 mlを加えて、室温で1時間撹拌した。溶媒を留去した後に、トルエンとの共沸により念入りにTFAを除いて、粗化合物24を得た。得られた生成物は、そのまま次の反応に用いた。
粗化合物 24 (1.8 mg, 2 μmol)を乾燥DMF 1.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、Alexa fluor(登録商標)488-NHS-ester (1 mg)、DIEA 1 μl (6 μmol)を加えて、室温で2時間撹拌した。反応溶液をHPLC(アセトニトリル/10 mM 酢酸アンモニウム水溶液)で精製し、凍結乾燥して、目的化合物2(Alexa fluor(登録商標)488)(1.0 mg)を得た。MALDI-TOF-Mass ([M-H]=1221.619(obs.), 1221.217(calc.))
粗化合物 24 (1.8 mg, 2 μmol)を乾燥DMF 1.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、ATTO(登録商標)655-NHS-ester (1 mg, 1 μmol)、DIEA 1 μl (6 μmol)を加えて、室温で2時間撹拌した。反応溶液をHPLC(アセトニトリル/10 mM 酢酸アンモニウム水溶液)で精製し、凍結乾燥して、目的化合物2(ATTO(登録商標)655) (1.0 mg)を得た。ESI-Mass ([M+H]=1216.4352(obs.), 1216.4380(calc.))
粗化合物 24 (1.8 mg, 2 μmol)を乾燥DMF 1.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、Alexa fluor(登録商標)546-NHS-ester (1 mg, 1 μmol)、DIEA 1 μl (6 μmol)を加えて、室温で2時間撹拌した。反応溶液をHPLC(アセトニトリル/10 mM 酢酸アンモニウム水溶液)で精製し、凍結乾燥して、目的化合物2(Alexa fluor(登録商標)546) (0.92 mg)を得た。
粗化合物 24 (0.88 mg, 1.24 μmol)を乾燥DMF 1.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、Alexa fluor(登録商標)568-NHS-ester (0.98 mg, 1.24 μmol)、DIEA 0.65 μl (3.72 μmol)を加えて、室温で5時間撹拌した。反応溶液をHPLC(アセトニトリル/10 mM 酢酸アンモニウム水溶液)で精製し、凍結乾燥して、目的化合物2(Alexa fluor(登録商標)568)を得た。MALDI-TOF-Mass ([M+H]=1383.7(obs.), 1383.4(calc.))
粗化合物 24 (0.88 mg, 1.24 μmol)を乾燥DMF 1.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、CypHer5E-NHS-ester (2.0 mg, 2.0 μmol)、DIEA 2 μl (12 μmol)を加えて、室温で終夜撹拌した。反応溶液をHPLC(アセトニトリル/10 mM 酢酸アンモニウム水溶液)で精製し、凍結乾燥して、目的化合物2(CypHer5E)を得た。ESI-Mass ([M+H]=1439.4249(obs.), 1439.4240(calc.))
AMPARリガンド結合ドメインS1S2 (3 μM) (ref.3)をHEPES バッファー (50 mM, pH 7.4, 100mM NaCl)中のNBQX (150 μM)の存在下又は非存在下にラベル化剤 (6 μM)を添加し、37 °Cでインキュベートした。任意の時間で採取し、その標識率をSDS-PAGEで決定した。
HEK293T細胞は10% FBS、ペニシリン (100 units/mL) 及び ストレプトマイシン(100 μg/mL)を添加したDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, グルコース4.5 g/L)培地中で、5% CO2 の湿潤雰囲気下に培養した全ての実験について、細胞はサブコンフルエント(< 80%)からトリプシン-EDTA 溶液または細胞スクレーパー法で回収し、新鮮な培地に再懸濁した。継代培養は2-3日毎に行った。グルタミン酸受容体(GluR2)の遺伝子導入は、lipofectamine 2000(Invitrogen)を用い、添付のマニュアルに従って遺伝子導入した。ラベル化には、遺伝子導入36-48時間後の細胞を用いた。
上記の遺伝子導入したHEK293T細胞に、DMEM培地(glutamax, 25mM HEPES, FBS(-))中のNBQX (50 μM)の存在下又は非存在下にラベル化剤(2 μM)を添加し、17℃で4時間インキュベートした。細胞をHBSで2回洗浄し、氷上で1%プロテアーゼ阻害剤カクテルセット III (Calbiochem(登録商標))を含有するRIPA (放射免疫沈降アッセイ) バッファーを用いて溶解した。得られた溶液を2 × SDS-PAGEバッファー (pH 6.8, 125 mM トリス・HCl, 20% グリセロール, 4% SDS 及び 0.01% ブロモフェノールブルー, 100mM DTT) と混合し、室温で30分間ボルテックスした。得られたサンプルをSDS-PAGEで展開し、Immun-Blot PVDF 膜 (Bio-Rad)に転写した。標識生成物をanti-Fluorescein抗体 (Invitrogen社, ×2000) 及び 抗-ウサギIgG抗体-HRP複合体(GE Healthcare社, ×3000)で検出した。GluR2の免疫検出を抗-HA 抗体 (Abcam社) 及び 抗-ウサギIgG抗体-HRP複合体(GE Healthcare社, ×5000)を用いて行った。HRPシグナルを、ECLプライムウェスタンブロッティング検出試薬(GE Healthcare)を用いてLAS 4000 imaging system (FujiFilm社)で検出した。
生後7日目のラットから単離し11日間培養した小脳顆粒細胞由来の培養神経細胞(ref.4)に対して、Neurobasal培地(glutamax, 10 mM HEPES, FBS(-), 25 mM KCl)中のNBQX (50 μM)の存在下又は非存在下にラベル化剤(0.3 μM)を添加し、17℃で4時間インキュベートした。細胞をHBSで2回洗浄し、氷上で1%プロテアーゼ阻害剤カクテルセット III (Calbiochem(登録商標))を含有するRIPA (放射免疫沈降アッセイ) バッファーを用いて溶解した。得られた溶液を2 × SDS-PAGEバッファー (pH 6.8, 125 mM トリス・HCl, 20% グリセロール, 4% SDS 及び 0.01% ブロモフェノールブルー, 100mM DTT) と混合し、室温で30分間ボルテックスした。得られたサンプルをSDS-PAGEで展開し、Immun-Blot PVDF 膜 (Bio-Rad)に転写した。標識生成物をanti-Fluorescein抗体 (Invitrogen社, ×2000)あるいはanti-Alexa fluor(登録商標)488抗体 (Invitrogen社, ×1000) 及び 抗-ウサギIgG抗体-HRP複合体(GE Healthcare社, ×3000)で検出した。GluR1の免疫検出を抗-GluR1 抗体 (millipore社) 及び 抗-マウスIgG抗体-HRP複合体(GE Healthcare社, ×3000)を用いて行った。HRPシグナルを、ECLプライムウェスタンブロッティング検出試薬(GE Healthcare)を用いてLAS 4000 imaging system (FujiFilm社)で検出した。
胎生18日目のラットから単離し18日間培養した海馬錐体細胞由来の培養神経細胞(ref.4)に対して、Neurobasal培地(glutamax, 10 mM HEPES, FBS(-), 25 mM KCl)中のNBQX (50 μM)の存在下又は非存在下にラベル化剤(1 μM)を添加し、17℃で4時間インキュベートした。細胞をHESで2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド水溶液で固定化した。Normal goat serumでブロッキングした後に、anti-GluR2抗体 (millipore社, ×1000) 及び 抗-マウスIgG抗体-Alexa fluor(登録商標)546修飾(GE Healthcare社, ×3000)で免疫染色した。封入剤を用いて封入した後に、共焦点レーザー顕微鏡にて、ラベル化蛍光および免疫染色を観察した。
前述したGluR2遺伝子導入済のHEK293T細胞に、DMEM培地(glutamax, 25mM HEPES, FBS(-))中のNBQX (50 μM)の存在下又は非存在下にラベル化剤(2 μM)を添加し、17℃で4時間インキュベートした。細胞をHBSで2回洗浄し、蛍光顕微鏡観察もしくは共焦点顕微鏡観察を行った。蛍光検出の際には、CCDカメラ(ORCA-Flash)が接続された蛍光顕微鏡(IX-71)を用い、HBS溶液、アゴニスト、アンタゴニスト溶液を還流することで液交換を行った。
1.Napoli, A. et al, Anal. Chem., 82, 5552-5560 (2010)
2.Armstrong, N. et al, Neuron, 28, 165-181 (2000)
3.Kiyonaka, S. et al, Nat. Neurosci., 10, 691-701 (2007)
4.Beaudoin III, G.M.J. et al, Nat. Protoc., 7, 1741-1754 (2012)
LDAI試薬4aの合成
NaNO2 (3.2 g, 43 mmol)の氷冷溶液を3,5-ジクロロアニリン (7.0 g, 43 mmol)の濃塩酸(80 mL)溶液に撹拌しながら0 °Cで10分間かけて滴下した。 反応混合物を0 °C で30分間撹拌した。SnCl2 (43 g, 225 mmol)の濃塩酸(40 mL) 溶液を反応混合物に0 °Cで滴下した。白色沈殿を集め、水(500 mL)に懸濁した。1N NaOHでpH 7.0に中和後、AcOEt (500 mL)を加えて生成物を有機層に抽出した。有機層を飽和食塩水(100 mL x2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。次いで、溶液を濾過し、溶媒を留去して化合物11a(2.65 g, 15 mmol, 35%)を橙色固体として得た。
1H NMR (400 MHz; CDCl3):δ 6.75 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 5.21 (br, 1H)
化合物11a(2.5g, 14 mmol)をピルビン酸エチル(1.56 mL, 14 mmol)のAcOH (80 mL)溶液に添加し、N2 雰囲気下に30分間100 °Cで撹拌した。反応をTLC (AcOEt: ヘキサン=1:3)でモニターし、反応混合物を室温に冷却した。溶媒を留去し、AcOEt (80 mL)を粗化合物に加えた。有機層を飽和NaHCO3水溶液 (80 mL x2)及び飽和食塩水(80 mL x2)で洗浄し、Na2SO4 で乾燥して化合物 12a (3.66 g, 13.3 mmol, 94% (E:Z = 5:2))を無色オイルとして得た。
1H NMR (400 MHz; CDCl3): δ 11.80 (s, 1H, Z), 10.10 (s, 1H, E), 7.30 (s, 1H, Z), 7.20 (s, 1H, E), 7.00-7.02 (m, 1H, Z, 1H, E), 4.16-4.27 (m, 1H, Z, 1H, E), 2.09 (s, 1H, Z), 2.04 (s, 1H, E), 1.23-1.29 (m, 3H, Z, 3H, E)
ポリホスホン酸(10 mL)を化合物12a (E:Z= 5:2 混合物, 3.6 g, 13 mmol)にゆっくり加えた。反応混合物を125 °Cで30分間撹拌した。反応混合物に冷水100 mLを加え、飽和NaHCO3 水溶液を加えてpHを7に調整した。生成物をAcOEt (60 mL x2)で抽出した。有機層を飽和食塩水 (60 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥して化合物13a (2.01 g, 7.8 mmol, 60 %)を得た。
1H NMR (400 MHz; CDCl3): δ 12.4 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 4.36 (q, J = 7.20 Hz, 2H), 1.33 (t, J = 7.20 Hz, 3H)
1,2-ジクロロエタン(30 mL)中の化合物 13a (2.01 g, 7.79 mmol)の撹拌溶液にN-メチルホルムアニリド(1.6 mL, 12.9 mmol) 及びオキシ塩化リン(1.1 mL, 12.1 mmol)を加え、N2 雰囲気下80 °C で9時間撹拌した。反応をTLC (AcOEt:ヘキサン=1:1)でモニターし、50% NaOAc水溶液80 mL及び氷5 gを反応溶液に加えた。この溶液を4 °Cで終夜維持して再結晶した。橙色沈殿を集め、水及び1,2-ジクロロエタンで洗浄して化合物 14a (1.62 g, 5.66 mmol, 73 %)を橙色粉末として得た。
1H NMR (400 MHz; CDCl3): δ 10.80 (s, 1H), 9,37 (br, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 4.52 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.50 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
化合物14a(57 mg, 0.199 mmol)をCH3CNとジオキサンの1:1 混合物(5 mL)中の酢酸及び2-(トリメチルホスホラニリデン)-,1,1-ジメチルエチルエステル(97 mg, 0.259 mmol)の溶液に加えた。反応混合物をN2 雰囲気下に70 °Cで 5時間撹拌した。反応をTLC (AcOEt: ヘキサン=1:3)でモニターし、反応混合物を室温に冷却した。溶媒を留去し、粗残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(AcOEt: ヘキサン=1:3)で精製して化合物 15a (44 mg, 0.115 mmol, 58 %)を白色固体として得た。
1H NMR (600 MHz; (CD3)2SO): δ 12.70 (br, 1H), 8.28 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.46 (d, J= 16.0, 1H), 4.35 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
CH2Cl2 (10 ml)中の化合物 15a (1.0 g, 2.60 mmol)の撹拌溶液にTFA (10 ml)を加えた。室温で5分間撹拌し、反応をTLC (AcOEt: ヘキサン=1:3)でモニターして反応の終了を確認した。TFA をトルエンと共沸除去した後、化合物 16a (828 mg, 2.52 mmol, 97 %)を白色粉末として得た。
1H NMR (600 MHz; (CD3)2SO): δ 8.25 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.42 (d, J = 16.0 Hz), 4.35 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.33 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
乾燥DMF(4 mL)中の化合物16a (36 mg, 110 μmol, 1.0 eq)の撹拌溶液にTEA (62 μL, 440 μmol, 4.0 eq), ヒスタミン・2HCl (24 mg, 110 μmol, 1.0 eq), HBTU (50 mg, 132 μmol, 1.2 eq) を添加し、N2 雰囲気下で2時間撹拌した。反応をTLC (CHCl3: MeOH=10:1+1 % NH3 aq)でモニターし、溶媒を留去した。粗残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3: MeOH=10:1+1% NH3 aq→2% NH3 aq)で精製して化合物17a(47 mg, 110 μmol, 100 %)を白色固体として得た。1H NMR (600 MHz; (CD3)2SO): δ 12.50 (br, 1H), 11.82 (br, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.33 (d, J = 16.0, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 6.86 (br, 1H), 6.50 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 4.33 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.38 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.67 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.32 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MeOH (2 mL)及び1N NaOH水溶液(1.1 mL, 1.1 mmol, 10 eq)中の化合物 17a (47 mg, 110 μmol)の溶液を60 °Cで終夜撹拌した。反応をTLC (CHCl3: MeOH=10:1+1 % NH3 aq)でモニターし、MeOHを留去した。溶液を1N HClでpH 5-6に中和後、水を留去した。DMF (3 mL)を加え、溶液を濾過してNaClを除去し、化合物18aを橙色オイルとして得た(47 mg, 119 μmol, 97%)。
1H NMR (600 MHz; (CD3)2SO): δ 8.84 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.28 (d, J = 14.6 Hz, 1H), 8.11 (s, 1H), 8.09 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.29 (s, 1H), 7.26 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.85 (d, J = 14.6 Hz, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.85 (d, J = 14.6 Hz, 1H), 6.69 (br, 2H), 6.45 (d, J = 11.4 Hz, 2H), 4.48 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.78 (t, J = 4.8 Hz. 2H), 3.66 (t. J = 6.0 Hz, 2H), 3.47-3.51 (m, 2H), 3.32-3.34 (m, 2H), 2.58 (t, J = 7.2 Hz, 2H)
HR-ESI MS m/z calcd for [M+H]+ 918.1387, found 918.1373
化合物2bの合成
tert-ブチル(2-(2-ヒドロキシエトキシ)エチル)カルバメート (500 mg, 2.44 mmol)のTHF(24 ml) 撹拌溶液にビス(パーフルオロフェニル) カーボネート (1.15 g, 2.93 mmol), TBAF (190 mg, 0.73 mmol)を加えた。反応混合物を24時間室温で撹拌した。溶液をCHCl3で希釈し、1N NaOHで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し, 留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン: AcOEt = 10:1 →ヘキサン : AcOEt = 2:1)で精製して化合物 2b (653 mg, 1.579 mmol, 64 %)を透明オイルとして得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.90 (s, 1H), 4.47 (m, 2H), 3.79 (m, 2H), 3.59 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.36 (m, 2H), 1.46 (s, 9H).
化合物1bの合成
7-クロロ-5-(2-フルオロフェニル)-1,3-ジヒドロ-2H-ベンゾ[e][1,4]ジアゼピン-2-オン(200 mg, 0.69 mmol)の乾燥 DMF (700 μl)中の撹拌溶液にNaH (38 mg, 1.0 mmol)を0 °Cで加えた。反応混合物を0 °Cで5分間撹拌した。次いで、tert-ブチル4-ブロモブタノエート (185 mg, 0.83 mmol)の 乾燥 DMF (700 μl)溶液を加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌した。溶液をCHCl3で希釈し、H2Oで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し, 留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン : AcOEt = 4:1 →ヘキサン : AcOEt = 2:1)で精製して化合物3b(125 mg, 0.29 mmol, 42 %)を透明固体として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.67 (t, 1H, J = 8.4 Hz), 7.49 (m, 2H), 7.40 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.29 (m, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.07 (t, 1H, J = 9.6 Hz), 4.87 (d, 1H, J = 10.4 Hz), 4.40 (m, 1H), 3.78 (d, 1H, J = 10.4 Hz), 3.67 (m, 1H), 2.15 (m, 2H), 1.86 (m, 1H), 1.72 (m, 1H), 1.39 (s, 9H).
乾燥CH2Cl2(1 ml)中の化合物 3b (18 mg, 0.042 mmol)の撹拌溶液にTFA (0.5 ml)を加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌した。TFAをトルエンと共沸除去した後、残渣を乾燥DMF (420 μl)に溶解した。次いで、tert-ブチル ((2-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)エトキシ)メチル)カルバメート (13 mg, 0.063 mmol), COMU (27 mg, 0.063 mmol), DIPEA (73 μl, 0.42 mmol)をこの溶液に加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌した。溶液をCHCl3 で希釈し、1N NaOHで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し, 留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン : AcOEt = 2:1 → CHCl3 : MeOH = 10:1)で精製して化合物4b (24 mg, 0.037 mmol, 88%)を透明固体として得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.56-7.67 (m, 4H), 7.34 (m, 1H), 7.18 (m, 1H), 7.14 (s, 1H), 4.69 (d, 1H, J = 10.8 Hz), 4.34 (m, 1H), 3.88 (d, 1H, J = 10.8 Hz), 3.79 (m, 1H), 3.18-3.67 (m, 16H), 2.14 (m, 2H), 1.85 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.42 (s, 9H).
乾燥 CH2Cl2 (1 ml)中の化合物4b (24 mg, 0.037 mmol)の撹拌溶液にTFA (0.5 ml)を加えた。 反応混合物を室温で1時間撹拌した。TFAをトルエンと共沸除去した後、残渣を乾燥DMF (370 μl)に溶解した。次いで、2-(1H-イミダゾール-4-イル)酢酸(6 mg, 0.055 mmol), EDC (10 mg, 0.055 mmol), HOBT (8 mg, 0.055 mmol), DIPEA (64 μl, 0.37 mmol) をこの溶液に加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌した。溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3 : MeOH : NH4OH aq. = 10:1:1)で精製して化合物 5b (18 mg, 0.027 mmol, 74%)を透明固体として得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.62 (t, 1H, J = 6.4 Hz), 7.53 (s, 1H), 7.41-7.49 (m, 4H), 7.12 (s, 1H), 7.06 (t, 1H, J = 9.2 Hz), 6.84 (s, 1H,), 4.81 (d, 1H, J = 10.4 Hz), 4.29 (m, 1H), 3.77 (d, 1H, J = 10.4 Hz), 3.67 (m, 1H), 3.51 (s, 1H), 2.05 (m, 2H), 1.91 (m, 1H), 1.65 (m, 1H).
乾燥 DMF (270μl)中の化合物 5b (18 mg, 0.027 mmol)の撹拌溶液に化合物 2b (17 mg, 0.04 mmol)を加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3 only →CHCl3 : MeOH= 10:1)で精製して化合物 6b (15 mg, 0.017 mmol, 63%)を透明固体として得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.10 (s, 1H), 7.62 (t, 1H, J = 7.6 Hz), 7.41-7.49 (m, 3H), 7.35 (s, 1H), 7.26 (m, 1H), 7.13 (s, 1H), 7.06 (t, 1H, J = 9.2 Hz), 4.82 (d, 1H, J = 10.8 Hz), 4.52 (m, 2H), 4.32 (m, 1H), 3.30-3.77 (m, 28H), 2.09 (m, 2H), 1.94 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.42 (s, 9H).
乾燥 CH2Cl2 (0.5 ml)中の化合物 6b (1 mg, 1.1 μmol)の撹拌溶液にTFA (0.5 ml)を加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌した。TFAをトルエンと共沸除去した後、残渣を乾燥DMF (100 μl)に溶解した。次いで、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 2',7'-ジフルオロ-3',6'-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン]-5-カルボキシレート (1 mg, 2.0 μmol), DIPEA (20 μl, 0.11 mmol)をこの溶液に加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌した。この溶液をHPLCで精製して化合物1b (0.8 mg, 0.7 μmol, 64%)を黄色固体として得た。HR-ESI MS: calcd for C58H55ClF3N7O15 [M+H]+ = 1182.3475: obsd 1182.3497.
ラベル化剤(Fl-AI-C4-PTMB)の合成
スペーサー2(化合物14c)の合成
Claims (11)
- 下記式(II)
で表される基本構造を有し、アゴニスト、競合的アンタゴニスト、非競合的アンタゴニストが結合したときとで蛍光のパターンが変化する、標識された神経伝達物質受容体に前記受容体との相互作用が期待される候補物質を作用させて、前記候補物質と前記受容体の結合様式を標識が発するシグナルの変化により検出することを特徴とし、前記神経伝達物質受容体がグルタミン酸受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、GABA受容体、カンナビノイド受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、ヒスタミン受容体、オピオイド受容体、セロトニン受容体、ソマトスタチン受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体又はグリシン受容体である、神経伝達物質受容体に結合する物質のスクリーニング方法。 - 標識された神経伝達物質受容体を有する細胞に前記候補物質を作用させる、請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 前記受容体がAMPA受容体である、請求項1又は2に記載のスクリーニング方法。
- 下記式(I)
で表される化合物であって、前記神経伝達物質受容体がグルタミン酸受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、GABA受容体、カンナビノイド受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、ヒスタミン受容体、オピオイド受容体、セロトニン受容体、ソマトスタチン受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体又はグリシン受容体である、化合物。 - 下記式(I)
で表される当該神経伝達物質受容体の標識剤。 - 下記式(I)
で表される化合物と当該神経伝達物質受容体(Rec-Nu-H)を反応させて下記式(II)
で表される基本構造を有し、アンタゴニストが結合したときとアゴニストが結合したときとで標識の発するシグナルのパターンが変化する、標識された神経伝達物質受容体を得ることを特徴とする、標識受容体の製造方法。 - FlがAlexa fluor(登録商標) 488、Alexa fluor(登録商標) 568又はATTO(登録商標)655である、請求項1に記載のスクリーニング方法。
- FlがAlexa fluor(登録商標) 568又はATTO(登録商標)655である、請求項1に記載のスクリーニング方法。
- FlがAlexa fluor(登録商標) 568又はATTO(登録商標)655である、請求項4に記載の化合物。
- FlがAlexa fluor(登録商標) 568又はATTO(登録商標)655である、請求項5に記載の当該神経伝達物質受容体の標識剤。
- FlがAlexa fluor(登録商標) 568又はATTO(登録商標)655である、請求項6に記載の標識受容体の製造方法。
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