JP5244596B2 - タンパク質の検出方法及びそれに用いる蛍光色素 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明のタンパク質の検出方法は、蛍光色素で標識したタンパク質を検出するタンパク質の検出方法であって、遊離状態で観測される第1の蛍光波長より短波長であって、タンパク質に結合した状態で観測される第2の蛍光波長に基づく蛍光を計測してタンパク質を検出することを特徴とする。
すなわち、遊離状態で観測される第1の蛍光波長より短波長であって、タンパク質に結合した状態で観測される第2の蛍光波長値及びその蛍光強度を測定することにより、従来に比べ、より高感度の検出が可能となる。また、タンパク質との結合量の増加に伴い第2の蛍光波長はより短波長にシフトするので、蛍光色素に段階的にタンパク質を添加し、第1の蛍光波長からの蛍光波長のシフト値からタンパク質を定量することもできる。また、試料が乾燥状態でも蛍光を発することができるので、タンパク質の検出を簡便且つ高精度な定量を行うことができる。更に、本発明に用いる蛍光色素は、Cy3やCy5、Alexa色素よりも熱安定性が高く、退光性も観測されないので、取り扱いは容易で、さらにCy3やCy5に比べ安価であるので、より低コストでタンパク質の検出を行うことができる。また、本発明の蛍光色素は乾燥したときに最大の量子収率を示すことから、電気泳動によりタンパク質を分割する場合に、ゲルを乾燥させることで極力厚みを薄くすることができるため従来よりも精度の高い定量を行うことができる。
本発明の検出方法は、蛍光色素で標識したタンパク質を検出するタンパク質の検出方法であって、遊離状態で観測される第1の蛍光波長より短波長であって、タンパク質に結合した状態で観測される第2の蛍光波長に基づく蛍光を計測してタンパク質を検出する。
本発明に用いるアニオン性蛍光色素の蛍光波長は、タンパク質との結合量の増加とともに、遊離状態の蛍光波長からより短波長に徐々にシフトし、それ以上蛍光波長がシフトせず、かつ蛍光強度も増加しない飽和状態に至る。従って、遊離状態から飽和状態に至る間の中間状態の蛍光波長値及びその蛍光強度を用いて、試料中のタンパク質の存在の有無の確認そしてその定量を行うことができる。また、アニオン性蛍光色素にタンパク質を段階的に添加し、添加したタンパク質の量と遊離状態の蛍光波長からのシフト値との関係から、タンパク質を定量することもできる。
溶液状態の試料の場合、例えば、所定濃度のアニオン性蛍光色素を溶解させた溶液にタンパク質を含む試料溶液を添加し、蛍光分光光度計等を用い、溶液の蛍光スペクトルを測定し、第2の蛍光波長の有無及びその蛍光強度もしくは蛍光波長のシフト値から試料濃度を検出する。あるいは、第2の蛍光波長が予めわかっている場合には、測定波長を第2の蛍光波長に固定し、蛍光強度から試料濃度を検出することもできる。また、タンパク質を含む試料溶液にアニオン性蛍光色素を溶解させた溶液を添加する方法を用いることもできる。
すなわち、連結部は、上記の群から選択された1種の官能基のみで構成しても良く、2種以上の官能基を含む構成とすることもできる。また、選択した一の官能基を2個以上含む構成とすることもできる。
(1)2種の官能基で構成する場合
以下の一般式(I)で表されるものを用いることができる。
-X1-X2- (I)
ここで、X1とX2は、それぞれ独立に、-(CH2)n-(nは1から4の整数)、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-(Rはアルキル基)、-(CH2-CH2-O)n-(nは1から10の整数)、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択される1種の官能基を用いることができる。好ましい組み合わせとしては、-CONH-COO-、-CH2-O-、-CH2-NR-、-CONH-(CH2)n-、-CONH-(CH2-CH2-O)n-である。
(2)3種以上の官能基で構成する場合
(i)以下の一般式(II)で表されるものを用いることが好ましい。
-(CHR1)p-X3-(CHR2)q- (II)
式中、X3は直接結合又は、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された少なくとも1種の官能基を用いることができ、好ましくは-COO-、-CONH-、-O-、-CH=CH-、-C≡C-又は-Ar-、より好ましくは-COO-、-CONH-、-O-又は-Ar-を用いることができる。また、R1とR2はそれぞれ独立に、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換されたものを用いることができる。また、Arはアリール基、好ましくは、フェニレン基又はナフチレンで基あり、必要に応じてスルホニル基で置換されたものを用いることができる。pとqはそれぞれ独立に0から20の整数、好ましくは0から10の整数、より好ましくは0から5の整数であり、p+q≧1である。
この連結部の具体例を挙げると、-(CH2)p-CONH-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(O-CH-)n-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-Ar-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COO)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-C≡C-(CH2)q-、-(CH2)p-C=C-(CH2)q-、-(CH2)p-NR-(CH2)q-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-S-(CH2)q-、-(CH2)p-HN-C(=NH)-NH- (CH2)q-、-(CH2)p-CO-Ar-NR-(CH2)q-等を挙げることができる。より好ましくは、-(CH2)p-CONH-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-(CH2)q- である。
(ii)以下の一般式(III)で表されるものを用いることが好ましい。
-X4-(CHR3)r-X5- (III)
ここで、X4及びX5は、それぞれ独立に、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-CH2NH-、-CH2NR-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された1種の官能基であり、好ましくは、-CONH-と-COO-、-COO-と-COO-、-COO-と-NR- 等の組み合わせである。また、R3は、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換されたものを用いることができる。また、Arはアリール基、好ましくは、フェニレン基又はナフチレンで基あり、必要に応じてスルホニル基で置換されたものを用いることができる。rは0から20の整数、好ましくは0から10の整数、より好ましくは0から5の整数である。このスペーサー部の具体例を挙げると、-CONH-(CH2)r-COO-、-CONH-CH(-R3-OH)-COO-、-CONH-CH(-R3-COOH)-COO-、-CONH-CH(R3-SO3H)-COO-、-COO-(CH2)r-COO- 等を挙げることができる。
以下の縮合多環化合物は、すべて本発明の検出方法に好適に使用することができるが、好ましくは、ジアゾール誘導体3,イミダゾール誘導体2、チアジアゾール誘導体、カルバゾール誘導体、チアゾール誘導体、であり、さらに好ましくは、オキサゾロピリジン誘導体(オキサジアゾロピリジン誘導体)である。
(モノアゾール誘導体1)
また、チオフェン誘導体の場合、非縮合系の化合物であり、以下の一般式で示される2,3,4,5-テトラフェニルチオフェン誘導体を用いることもできる。
また、以下の一般式で示される2,3,4,5-テトラフェニルチオフェン誘導体を用いることもできる。
ここで、上記のR2とR3に、置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基を用いることが好ましい。Cy3に対応する緑色蛍光色素を得ることができる。芳香族炭化水素基としてはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基、より好ましくはフェニル基又はトリル基である。
合成例1.
活性エステル系アニオン性蛍光色素の合成例を示す。
(1)発色部(3)の合成
発色部(3)は、以下のスキーム2に従い合成した。
有機EL色素として合成例1で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、連結部にシステイン酸を用い、反応性基には活性エステル化したカルボニル基とアニオン性基であるスルホニウム基の両方を導入した。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(3)をシステイン酸と反応させ、連結部を導入したカルボン酸体(5)を合成した。その後、カルボン酸体(5)をジオキサン中、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、連結部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)を合成した。以下に反応例を示す。
(1)カルボン酸体(5)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(3) 100 mg (0.21 mmol)とシステイン酸 39 mg (0.23 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=7:3)で単離精製し、カルボン酸体(5)を98 mg (収率88%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(5) 80 mg (0.15 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 19 mg (0.17 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 35 mg (0.17 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=10:1)で単離精製し、活性エステル体(6)を73 mg (収率 78%)得た。
合成例4.
有機EL色素として合成例1で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、連結部にセリンを用いた。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(3)をセリンと反応させ、連結部を導入したカルボン酸体(7)を合成した。以下に反応例を示す。
(1)カルボン酸体(7)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(3) 100 mg (0.21 mmol)とセリン26 mg (0.25 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=7:3)で単離精製し、カルボン酸体(7)を 79 mg (収率 81%)得た。
(実験方法)
活性エステルのスルホニル体(4)を純水に溶解し、0.1 M HEPES Buffer
(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid) (pH 7.3)を混合した後、BSA(Bovine Serum Albumin)を添加し、色調の変化をスペクトルで観察するため、スルホニル体4のUVスペクトルを測定し、次いで、蛍光スペクトルを測定してスルホニル体(4)とBSAの相互作用を観察した。UVスペクトルは、2000μLのセルに蛍光試薬13μM、26μMを調製して測定した。また、蛍光スペクトルは、セル中で26μMの溶液3000μLを調製し、これに所定濃度となるようにBSAを添加して測定した。
スルホニル体4を含むBuffer液の色調は、BSAを添加すると、黄色から黄緑色へ変化した(図1)。図2にスルホニル体4のUVスペクトルを示す。この結果より、スルホニル体(4)の最大吸収波長は397 nmであることが分かった。次に、励起波長に397 nmを用いて蛍光スペクトルを測定した。結果を図3に示す。ここで、BSAは1.6 μMの濃度になるよう添加している。蛍光スペクトルは、BSAの添加により18 nmのブルーシフトを示し、かつ蛍光強度は約5倍に増大した。これは、スルホニル体(4)がBSAのアミノ基と静電結合し、BSA表面とスルホニル体4との相互作用により、ブルーシフトが観測されたと考えられる。また、スルホニル体(4)がBSAの疎水場に位置することから、水との相互作用がある程度解消されて蛍光強度の増大を示したと考えられる。
(実験方法)
次に、タンパク質にインスリン(Inslin)を用いた以外は、実施例1と同様の方法で行った。スルホニル体(4) 26.7μMを蛍光セル中で2000μL調製し、そこへ、インスリン 0 〜 232μMを6回に分けて添加した。
インスリンを添加した時の蛍光スペクトルを図5に示す。BSAの場合と同様に19 nmのブルーシフトと、蛍光強度の増大が観測された。添加した際のセル中のインスリン濃度と各濃度におけるピーク波長FLmaxとの関係を図6に、インスリン濃度とピーク波長における蛍光強度ΔInt.(スルホニル体4のみの蛍光強度を差し引いた値)との関係を図7に示す。インスリン濃度の増加とともに、ピーク波長FLmaxが直線的に低波長にシフトした。また、インスリン濃度の増加とともに、蛍光強度ΔInt.が直線的に増加するという結果が得られた。これより、蛍光強度の変化から、あるいはピーク波長の変化からインスリンの濃度を算出することが可能であることがわかる。
(実験方法)
次に、タンパク質にリゾチームを用いた以外は、実施例1と同様の方法で行った。スルホニル体(4) 26.7μMを蛍光セル中で2000μL調製し、そこへ、リゾチーム 0 〜 46.6μMを4回に分けて添加した。
リゾチームを添加した時の蛍光スペクトルを図8に示す。リゾチームを添加しても、蛍光強度の増加も、ピーク波長のブルーシフトも観測されなかった。このことは、スルホニル体(4)が、リゾチームと結合しないことを示している。これは、タンパク質の表面に位置するアミノ基はタンパク質の種類によって異なる配座を取っていることから、スルホニル体4が、リゾチームのアミノ基とは結合しないことを意味しているものと考えられる。しかしながら、スルホニル体(4)はBSAやインスリンと結合することから、選択的にタンパク質を標識可能な蛍光試薬としてスルホニル体(4)を用いることが可能であると考えられる。
合成例2の活性エステル体(6)を用い、実施例1と同様の方法により、BSAを添加した時の色調の変化をスペクトルで観察した。
合成例3のカルボン酸体(7)を用い、実施例1と同様の方法により、BSAを添加した時の色調の変化をスペクトルで観察した。
従来使用されているメチルオレンジを用いた以外は、実施例1と同様の方法で行った。しかし、メチルオレンジを添加しても、蛍光強度の増加も、ピーク波長のブルーシフトも観測されなかった。
Claims (10)
- 蛍光色素で標識したタンパク質を検出するタンパク質の検出方法であって、
遊離状態の該蛍光色素で観測される第1の蛍光波長より短波長であって、該蛍光色素が
タンパク質に結合した状態で観測される第2の蛍光波長に基づく蛍光を計測してタンパク
質を検出する方法であり、
該第2の蛍光波長を発生する第1の蛍光色素に、タンパク質と結合するアニオン性基が連結部を介して結合した有機EL色素を含むアニオン性蛍光色素を用い、該有機EL色素が、以下の一般式(1)、(2)又は(3)のいずれか1種で示されるアゾール誘導体あるいは以下の一般式(4)、(5)、(6)、(7)又は(8)で示されるイミダゾール誘導体であり、該連結部が-(CH 2 ) n -(nは1から4の整数)、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO 2 NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-(Rはアルキル基)、-(CH 2 -CH 2 -O) n -(nは1から10の整数)、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択される官能基を1種以上含む、タンパク質の検出方法。
(式中、R1、R2、R3、R4は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ア
ルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、アミ
ノ基、芳香族炭化水素基、複素環基を置換基として有する又は無置換の芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、Xは置換基を有する又は無置換の窒素原子又は硫黄原子又は酸素原子又はセレン原子、ボロン原子を示し、R'は芳香環を置換基として含む又は無置換の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An-は、Cl-、Br-、I-、CF3SO3 -、BF4 -、PF6 -を示す。)
(式中、R1、R2、R3、R4、R5は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基
、アルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、
アミノ基、芳香族炭化水素基、複素環基を置換基として有する又は無置換の芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、R1、R2、R3、R4、R5は同じあるいは異なり、R'、R''は芳香環を置換基として含む又は無置換の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An-は、Cl-、Br-、I-、CF3SO3 -、BF4 -、PF6 -を示し、Hal - は、Cl - 、Br - 、I - を示す。) - 上記検出方法が、試料中のタンパク質を分離手段に供し、分離した画分を質量分析に供
する検出方法であって、
タンパク質を分離手段に供する前に、上記第2の蛍光波長を発生する第1の蛍光色素に
よりタンパク質を標識する請求項1記載の検出方法。 - 上記第1の蛍光色素によりタンパク質を標識するに先立って又は同時に、タンパク質に
結合した状態で第1の蛍光波長が短波長にシフトしない第2の蛍光色素によりタンパク質
を標識し、次いで分離手段に供する請求項2記載の検出方法。 - 上記タンパク質と上記第2の蛍光波長を発生する第1の蛍光色素とを溶液中で反応させ
、該溶液を測定基板に点着し、該測定基板からの第2の蛍光波長に基づく蛍光画像を計測
する請求項1記載の検出方法。 - 上記タンパク質と上記第1の蛍光色素とを溶液中で反応させるに先立って又は同時に、
タンパク質に結合した状態で第1の蛍光波長が短波長にシフトしない第2の蛍光色素をタ
ンパク質と溶液中で反応させる請求項4記載の検出方法。 - 上記第2の蛍光色素はタンパク質と結合する共有結合性基を有する請求項3又は4に記
載の検出方法。 - 上記の一般式(1)〜(7)のR2とR3が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン
誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チアゾール誘導体
、ピラゾール誘導体及びピリジン誘導体からなる群から選択された1種である請求項1記
載の検出方法。 - タンパク質と結合するアニオン性基が連結部を介して結合した有機EL色素を含むアニオン性蛍光色素から成り、該有機EL色素が、以下の一般式(1)、(2)又は(3)のいずれか1種で示されるアゾール誘導体あるいは以下の一般式(4)、(5)、(6)、(7)又は(8)で示されるイミダゾール誘導体であり、該連結部が-(CH 2 ) n -(nは1から4の整数)、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO 2 NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-(Rはアルキル基)、-(CH 2 -CH 2 -O) n -(nは1から10の整数)、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択される官能基を1種以上含む、タンパク質検出用の蛍光色素。
(式中、R1、R2、R3、R4は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ア
ルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、アミ
ノ基、芳香族炭化水素基、複素環基を置換基として有する又は無置換の芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、Xは置換基を有する又は無置換の窒素原子又は硫黄原子又は酸素原子又はセレン原子、ボロン原子を示し、R'は芳香環を置換基として含む又は無置換の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An-は、Cl-、Br-、I-、CF3SO3 -、BF4 -、PF6 -を示す。)
(式中、R1、R2、R3、R4、R5は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基
、アルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、
アミノ基、芳香族炭化水素基、複素環基を置換基として有する又は無置換の芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、R1、R2、R3、R4、R5は同じあるいは異なり、R'、R''は芳香環を置換基として含む又は無置換の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An-は、Cl-、Br-、I-、CF3SO3 -、BF4 -、PF6 -を示し、Hal - は、Cl - 、Br - 、I - を示す。) - 上記アニオン性基が、カルボキシル基、スルホニル基、硫酸塩基、リン酸塩基及びそれ
らの組み合わせのいずれかである請求項8記載の蛍光色素。 - 上記の一般式(1)〜(7)のR2とR3が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン
誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チアゾール誘導体
、ピラゾール誘導体及びピリジン誘導体からなる群から選択された1種である請求項8記
載の蛍光色素。
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