JP2003254909A - アニオン検出用蛍光センサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明の目的は、各種生物系の実験系におい
ても使用することができるような水溶液中におけるアニ
オンを定量的に測定することができるセンサー化合物を
提供することである。 【解決手段】 本発明は、環状ポリアミンの金属錯体か
ら成るアニオンホスト及び蛍光色素を有する化合物であ
って、該金属錯体の金属イオンとの配位結合において、
該蛍光色素上の置換基とアニオンとの間の配位子交換機
能によって蛍光色素のスペクトルに変化が生じることを
特徴とする、前記化合物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特に水溶液中のア
ニオンを検出することの出来るセンサー化合物、及び該
化合物を使用する各種測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】蛍光センサーは、生体系における生体分
子の役割を分析し、解明するのに有用であり、例えば、
蛍光Ca^ＩＩ指示薬を用いて、細胞内Ca^ＩＩのいくつかの
機能が解明されてきた^１。さらにその他に多数の金属セ
ンサー及びpHセンサーが開発されている^２。

【０００３】多数の有機アニオン及び無機アニオンが生
きている生物において重要な役割を担っているために、
今やアニオン認識^３及びアニオンセンサー検出^４に関心
が高まっている。アニオンセンサーの開発によって分子
内にアニオン基を持つ生体有機分子を検出することがで
きる新規のセンサーの開発にも繋がる。しかしながら、
従来知られているほとんどのセンサーは有機媒質の中で
しか機能せず、それらを生化学的又は生理学的な実験に
使用するのは困難である。一般にアニオンは、金属イオ
ンのような陽イオンよりも大型なので、陽イオンよりも
溶媒化の制約を受け易い。有機溶媒では、溶媒化エネル
ギーが比較的小さく、静電気の相互作用が効果的に働く
ので、アニオンを捕捉し、検出するのはさほど難しくは
ない。しかしながら、生体応用に適している水性溶媒で
は、強い水和のためにアニオンを認識するのは極めて困
難である。今のところ、有機環境では多数が知られてい
るけれども、水溶液中で作動する蛍光アニオンセンサー
はほとんど開発されていない。

【０００４】水溶液中で使用するための蛍光アニオンセ
ンサーは、２つの必要条件を満たさなければならない。
１つは、水中でのアニオンに対する十分に強い親和性で
あり、もう１1つは、アニオンの認識を蛍光シグナルに
変換する能力である。既知のアニオンセンサーはほとん
ど、後者の必要条件は満たすけれども、水中でのアニオ
ンに対して十分な親和性を持っていない。アニオンホス
トの中には、水性溶媒中でアニオンを捕捉することがで
きるものもあるが、それらは単にホスト分子であって、
センサー分子ではない。双方の必要条件を同時に満たす
のは困難である。

【０００５】Crazuik et alは、水溶液中で作動する蛍
光アニオンセンサーの開発に成功した^５。このようなセ
ンサーの検出メカニズムは、蛍光団に隣接したアミノ基
のpK _ａをアニオンが結合することによって変化させるこ
とに基づいている。しかしながら、このセンサーではあ
る特定のｐＨ領域でしか測定できず、ｐＨ変化に敏感で
ある。従って、このセンサー検出のメカニズムを生物実
験に応用するのは困難である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、各種生物系の実験系においても使用することができ
るような水溶液中におけるアニオンを定量的に測定する
ことができるセンサー化合物を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題を解
決すべく鋭意研究した結果、アニオンを検出するための
新規の手段を開発し、本発明を完成した。即ち、本発明
は、環状ポリアミンの金属錯体から成るアニオンホスト
及び蛍光色素を有する化合物であって、該金属錯体の金
属イオンとの配位結合において、該蛍光色素上の置換基
とアニオンとの間の配位子交換機能によって蛍光色素の
スペクトルに変化が生じることを特徴とする、前記化合
物に係る。より、具体的には、本発明は環状ポリアミン
の金属錯体から成るアニオンホスト及び蛍光色素を有す
る化合物であって、該金属錯体の金属イオンとの配位結
合に関与する該蛍光色素上の電子供与性置換基とアニオ
ンとの間の配位子交換機能によって該蛍光色素上の電子
供与性が増大し、その結果、蛍光色素のスペクトルに変
化が生じることを特徴とするものである。この蛍光色素
上の電子供与性置換基とアニオンとの間の配位子交換機
能とは、アニオンホスト（金属錯体）に対して配位力の
強いアニオン種が存在しない水溶液系では、蛍光色素上
の電子供与性置換基が金属イオンに配位しているが、配
位力の強いアニオン種がその系に添加されることによっ
て電子供与性置換基が金属イオンとの配位結合から外
れ、その結果電子供与性置換基に生じる電子状態の変化
が蛍光色素に伝わりその蛍光スペクトルに変化を及ぼ
す、より具体的には、蛍光色素の吸収（励起）スペクト
ルが長波長側にシフトするというものである。従って、
このような原理に基づき蛍光色素のスペクトルに変化が
生じる化合物である限り、本発明化合物の各構成部分で
ある環状ポリアミン、金属イオン、及び蛍光色素の構造
及び種類は特に制限はない。又、このような蛍光スペク
トルの変化を効率よく起こさせる為には、アニオンホス
ト及び蛍光色素がリンカーを介して結合していることが
好ましい。

【０００８】更に本発明は、このような化合物から成る
蛍光センサー、特に、水溶液中のアニオンを検出するこ
との出来る蛍光センサーに係る。本発明のセンサーによ
り定量的に測定することが可能なアニオンの例として
は、ピロリン酸イオン、リン酸イオン、及びハロゲンイ
オン等の無機アニオン、クエン酸イオン等の有機アニオ
ン、並びに各種ヌクレオチドから成る群から選択される
一種又は複数種のアニオンを挙げることが出来る。

【０００９】更に本発明は、本発明化合物をセンサーと
して使用し、その蛍光色素の吸収（励起）スペクトルの
長波長側へのシフトの度合いに基づき、例えば、水溶液
中のアニオン濃度を測定する方法に係る。更に本発明
は、本発明化合物をセンサーとして使用し、その蛍光色
素の吸収（励起）スペクトルの長波長側へのシフトの度
合いに基づき、例えば、水溶液中のアニオン性残基の増
減を測定する方法に係る。更に本発明は、本発明化合物
をセンサーとして使用し、蛍光強度の変化に基づき、ア
ニオン性残基の増減を伴う反応に関与する酵素の活性を
測定する方法に係る。このような酵素の例として、環状
モノヌクレオチド特異的ホスホジエステラーゼ（ホスホ
ジエステラーゼ3',5'-環状モノヌクレオチド）等のホス
ホジエステラーゼを挙げることが出来る。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明化合物において、環状ポリ
アミンを構成する窒素原子及び炭素原子の各個数及びそ
れらの総数に特に制限はないが、好ましくは）〜１２、
より好ましくは１２であり、窒素原子数は好ましくは３
又は４、より好ましくは４である。具体的には好適な環
状ポリアミンとして、１，４，７，１０−テトラアザシ
クロデカン（サイクレン）を挙げることが出来る。又、
本発明化合物の蛍光色素上の電子供与性置換基にも特に
制限はないが、蛍光色素、環状ポリアミン及び金属イオ
ンの種類等に応じて当業者が適宜選択することができる
が、好適例としてアミノ基を挙げ蛍光色素ることが出来
る。蛍光色素もその他の構成成分に応じて当業者が適宜
選択することができるが、好適例としてが７位置換クマ
リン誘導体、例えば、７−アミノ−トリフルオロメチル
クマリンを挙げることが出来る。リンカーとしては、例
えば、エチレン基及びメチレン基等のアルキレン基を使
用することが出来る。金属錯体を構成する金属の好適例
として、ＣｄII等の遷移金属を挙げることが出来る。

【００１１】本発明の化合物は、例えば、以下の実施例
に具体的に示すような合成方法によって、当業者であれ
ば容易に調製することが出来る。更に、各物質の入手方
法、各化合物の合成方法、及び、合成された化合物（PD
F)に関する性状分析データ等については、インターネッ
トhttp://pubs.acs.orgを介して無償で入手可能であ
る。

【００１２】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定される
ものではない。

【００１３】実施例１化合物の調製 以下の化学反応式に示した４工程で、7-アミノ-4-トリ
フルオロメチルクマリンを出発物質として、サイクレン
共役のクマリン（１）を合成し、ＮＨ−シリカゲル（フ
ジ・シリシア・ケミカル株式会社）カラムクロマトグラ
フィによって精製した。こうして合成された本発明に属
する化合物である、化合物（１）のＣｄII錯体、即ち、
錯体１−ＣｄIIは過塩素酸塩として得られ、2-プロパノ
ール/H_２Oから再結晶した。

【００１４】

【化１】

【００１５】上に示したサイクレン共役のクマリン
（１）及び錯体１−ＣｄIIの合成経路において使用する
反応試薬は次のとおりである。（a)TsCl ピリジン、
(b) BrCH_２CH_２Br、Cs_２CO_３、（c) 濃H_２SO_４、90℃
（d) サイクレン、(e) Cd(ClO_４)_２ 60℃。尚、本発
明に属するその他の化合物も、当業者であれば、上記合
成経路に準じて適宜合成することが出来る。こうして合
成された本発明化合物がアニオンを検出する蛍光センサ
ーとして機能し、アニオンを検出する機構を図１に示し
た。ここで、M^ｎ＋はサイクレンによって安定的にキレ
ートされうる金属イオンである。

【００１６】実施例２本発明化合物の吸収スペクトルと励起スペクトル どの金属が我々の設計概念に最も良く合致するかを見い
出すために、我々は化合物（１）のＺｎII、ＣｄII、及
びＣｕIIとの錯体、及び金属なしでの化合物（１）の吸
収スペクトル及び蛍光スペクトルを測定した。化合物
（１）の濃度は5mM、 金属はすべて化合物（１）を基に
して1.2当量加えた。溶液は100mMのHEPES（ｐH 7.4）
で緩衝した。尚、測定は、UV-1600 UV可視分光計（日
本、京都、島津）を用いて、25℃にて5mMの濃度で実施
した。更に、蛍光分光計はF-4500（日本、東京、日立）
を使用した。得られた吸収スペクトル及び励起スペクト
ルを図２に示す。これらの金属はサイクレンによって強
く配位されることが良く知られている。図１に示すよう
にアニオンのセンサー検出には7-アミノ基の金属への配
位が求められ、金属の配位における窒素の単独電子対の
関与がそのような波長のシフトを誘導するので、望まし
いスペクトルの変化は、吸収スペクトル及び励起スペク
トルの青色シフトであった。ＺｎII、ＣｄII、及びＣｕ
IIととの錯体の形成が極めて緩慢なために、十分な平衡
化（３時間を超える）の後スペクトルを測定した。化合
物（１）の吸収スペクトルのピークは382nmであり、錯
体１−ＺｎII、錯体１−ＣｄII及び錯体１−ＣｕIIのそ
れは、それぞれ388nm、342nm及び342nmであった。即
ち、ＣｄII、及びＣｕIIを化合物（１）の溶液に加えた
場合、それぞれの吸収スペクトルにおける青色シフトが
認められた。このことは、7-アミノ基がＣｄII及びＣｕ
IIに配位するという考えを支持している。錯体１−Ｚｎ
IIの吸収スペクトルはわずかに赤色シフトした。この赤
色シフトは、ＺｎIIと7-アミノ-4-トリフルオロメチル
クマリンとの間に何らかの相互作用があることを示して
いるが、上述の理由によって7-アミノ基は多分ＺｎIIに
は配位していないものと思われる。化合物（１）、錯体
１−ＺｎII、及び錯体１−ＣｄIIの励起スペクトルは、
錯体１−ＺｎIIの蛍光強度がやや増加したが、それらの
吸収スペクトルに類似していた。一方、これらに対し
て、ＣｕIIの性質（ＣｕIIイオンは種々の蛍光化合物の
蛍光を失活させることは一般に知られている）のために
錯体１−ＣｕIIの蛍光は顕著に低下した。図１に示すア
ニオンのセンサー検出の原理から、中心金属イオンは、
7-アミノ基を含む5つの窒素原子によって配位されるこ
とが必要である。従って、100ｍMのHEPESを含む中性水
溶液中にて化合物（１）の7-アミノ基によってＺｎIIが
配位されなければ、錯体１−ＺｎIIは、アニオンセンサ
ーとして作用することはできない。さらに、錯体１−Ｃ
ｕIIの蛍光は強く失活させられるので、これも蛍光セン
サーとしては適当ではない。従って、吸収スペクトル及
び励起スペクトルに基づいて、我々は、錯体１−ＣｄII
が、図１に示すような我々の設計概念に基づく最も良好
な蛍光アニオンセンサーであるという結論に達した。

【００１７】実施例３電位差ｐH滴定 次に、参考文献^１２に詳細に記載されている手順に従っ
て、1：1の金属-化合物（１）（0.17ｍMと0.5mM）錯体
システム（化合物（１）・4HCO_４、化合物（１）・4HCl
O_４+Zn(ClO_４)_２及び化合物（１）・4HClO_４+Cd(ClO_４)
_２）について、イオン強度I=0.1M（Et_４NClO_４)、25℃
にて電位差ｐH滴定実験を行った。配位子のプロトン化
定数、金属錯体形成定数及び分布ダイヤグラムは、コン
ピュータ・プログラム、SUPERQUAD^１３及びMINIQUAD
^１４を用いて算出した。その結果を表１に示す。化合物
（１）のプロトン化平衡定数は、9.67（logK_１=logb
_０１１) 及び8.39（logK_２ = logb_０１２- logb
_０１１)であった。他のさらに低いpK_ａは算出できなか
った。

【００１８】

【表１】

【００１９】表１においてlogb_１１０として示されるＺ
ｎII及びＣｄIIに対する化合物（１）の安定定数を算出
し、logK(錯体１−ＺｎII)及びlogK(錯体１−ＣｄII)は
それぞれ10.80及び11.38であった。報告されているlogK
(サイクレンＺｎII)及びlogK(サイクレンＣｄII)はそれ
ぞれ16.2及び14.3である。化合物（１）-金属の配位形
成が、サイクレンのそれと同じであるならば、logK(錯
体１−ＺｎII)はlogK(１−ＣｄII)よりも大きいことが
期待されるが、そうはならず、すなわち、化合物（１）
-金属錯体の相対的安定性の順序は、サイクレン金属錯
体に比べて逆であった。この結果は、錯体１−ＣｄIIの
配位形成は、錯体１−ＺｎIIのそれとは異なることを示
唆している。我々は、ＺｎIIに強く結合するアニオンが
存在していなくても芳香族アミノ基がＺｎIIに配位する
のを水分子が妨げる可能性があり、ＺｎIIは芳香族アミ
ノ基によって配位されないとみなしている。一方、その
結果は、ＣｄIIが5つの窒素原子、すなわち、サイクレ
ンの4つのアミノ基と芳香族アミノ基によってキレート
されるという考えに一致している。従って、ｐH滴定の
結果もまた、錯体１−ＣｄIIが図１における設計原理を
満たしていることを示唆している。

【００２０】実施例４1-Cd ^ＩＩ を用いたアニオンの蛍光検出 次に、種々のアニオンが励起スペクトルにどのような影
響を持つのかを調べるために、合成した錯体１−ＣｄII
溶液（5mM）に種々のアニオンを加えた。スペクトルは
すべて100mMのHEPES緩衝液（ｐH7.4）の存在下、25℃に
て測定した。錯体１−ＣｄII溶液にピロリン酸ナトリウ
ム（PPi)溶液を加えた場合、励起スペクトルは、 用量
依存性に長い波長の方にシフトした。図３に示すよう
に、10mMのPPiを加えた後、λ_ｍａｘは、342nmから383n
mにシフトした。錯体１−ＣｄII溶液+10mMのPPiの励起
スペクトルは、遊離の塩基（図２）のそれに類似してい
た（例えば、両者のピーク波長はおよそ380nmだっ
た）。設計概念の項目で記載したように、7-アミノクマ
リンの場合、励起スペクトルの深色シフトは、7-アミノ
基の電子密度が上昇したことを示す^７。このような結果
は、我々が期待したように、不安定な5番目の配位子
（芳香族アミノ基）が用量依存性にPPiアニオンに置き
換わったことを示している（図１）。要するに、中性の
水溶液において、アミノ基が分子内にあったとしても、
芳香族アミノ基よりもPPiの方がＣｄII-サイクレンに対
して大きな親和性を持っていることが示された。

【００２１】更に、同様な方法を用いてその他のアニオ
ンの効果を調べ、励起スペクトルのピークにおける蛍光
測定値をアニオンの濃度に対してプロットし、以下の式
に従って、各アニオンに対する錯体１−ＣｄIIから成る
センサーの見かけの解離定数（K_ｄ)を算出した。 式：F=(F_０ + F_ｍａｘ[A]/K_ｄ) / (1 + [A]/K_ｄ) 上式において、F_０はアニオンなしの最初のFの値、F
_ｍａｘはFの最大値、及び[A]は溶液に加えたアニオンの
最終濃度を示す。尚、アニオンはすべてナトリウム塩又
はカリウム塩として加えた。K_ｄはすべて、100mMのHEPE
S緩衝液（ｐH7.4）の条件下で算出した。その結果を以
下の表２に示す。＊K_ｄは大きすぎて計算できなかっ
た。

【００２２】

【表２】

【００２３】表２の結果から明らかなように、クエン酸
塩が強い親和性を示した。リン酸塩は、おそらくプロト
ン化形態のためにPPiよりも極めて低い親和性を持ち、H
PO_４ ^２−およびH_２PO_４ ⁻は、ｐH7.4の水溶液では優勢
な種であり、それらはPPiよりも負の荷電数が少ない。
過塩素酸塩は100mMでもいかなる変化も起こさなかっ
た。オキソ酸に関しては、多価のアニオンは一価又は二
価のアニオンよりも強く錯体１−ＣｄIIに結合した。こ
のようなデータは、アニオンが、複数点での認識を介し
て、おそらく金属とサイクレン環のNHプロトンの双方に
よって錯体１−ＣｄIIと相互作用していることを示唆し
ている。ハロゲンイオンについては、スペクトル変化
は、I⁻＞Br⁻＞Cl⁻＞＞F⁻の順で生じ、ソフト塩基度
の程度を反映していた。このことは、Cd^ＩＩがソフト酸
であり、ソフト塩基に対して高い親和性を持つという事
実に一致する。

【００２４】さて、一部のヌクレオチドが生物における
重要な役割を持つ負に荷電した有機化合物であり、特
に、cAMPやcGMPのような環状ヌクレオチドは細胞内セカ
ンドメッセンジャーとして作用するので、種々のヌクレ
オチドのセンサー検出は極めて重要である。そこで、次
にこれらのヌクレオチドについて検討した。第１に、４
種のヌクレオシド一リン酸、AMP、GMP、CMP及びUMPを5m
Mの錯体１−ＣｄII溶液に加えた。興味深いことに、GMP
だけが蛍光を失活させ、ほかの3種のヌクレオチドは無
機アニオンのように励起スペクトルの赤色シフトを誘発
した（図４[a]）。又、見かけの解離定数を表２に示
す。このような結果は、励起スペクトルの形状及び解離
定数がヌクレオチドの塩基に依存することを示唆してい
る。考えられる説明の１つは、クマリンが直接、ヌクレ
オチドの塩基と相互作用しているということである。２
つの環状ヌクレオチド、cAMPとcGMPは、それぞれその加
水分解産物であるAMPとGMPよりも錯体１−ＣｄIIに対し
て低い親和性を示した。cAMPとAMPのスペクトルデータ
を図４[b]に示す。10mMのcAMPを加えても錯体１−ＣｄI
Iに1の励起スペクトルの変化は小さかった。このスペク
トルは、100mMのAMPを加えた時のスペクトルに類似して
いた。1mM未満のcAMPの添加では錯体１−ＣｄIIの励起
スペクトルはほとんど変化しなかった。この結果を考慮
すると、AMPとcAMPの結合強度の差異はおそらくアニオ
ン部位の数に基づくものであった。

【００２５】実施例５アニオンのセンサー検出の可逆性 次に、アニオンのセンサー検出の可逆性について調べ
た。センサー検出システムが可逆的であれば、ＣｄIIに
配位するアニオンの減少が励起スペクトルの青色シフト
を生じ、それが元のスペクトルに回復するはずである。
PPiを結合し、PPiがＣｄIIに配位するのを妨げるため
に、PPiを含む溶液に過剰量のＭｇIIを加えた。1mMのPP
iを含む錯体１−ＣｄII（5mM）の溶液に10mgのMg(Cl
O_４)_２を加えた場合、励起スペクトルは実際に青色にシ
フトしてλmax 345nmであった（図５[a])。このスペク
トルはPPiを含んでいない錯体１−ＣｄIIのスペクトル
にほぼ正確に一致した。更に、ピロリン酸の加水分解の
影響を調べた。無機ピロホスファターゼは、1つのピロ
リン酸塩を２つのリン酸イオンに変換することが知られ
ている^９。リン酸塩はPPiよりも弱く錯体１−ＣｄIIに
配位するので、PPiの切断は、大量のＭｇIIイオンで見
られたのと同じようなスペクトル変化を誘発するはずで
ある。ｐH7.4にて1mMのピロリン酸塩を含む錯体１−Ｃ
ｄII溶液に0.33U/mlの無機ピロホスファターゼと0.5mM
のMg(ClO_４)_２を加えると、励起スペクトルのピークは
短い波長の方に迅速にシフトした（図５[b])。これらの
結果も、センサー検出メカニズムが可逆的であることを
示している。

【００２６】実施例６ホスホジエステラーゼの測定 生化学的応用へのこのシステムの可能性を調べるため
に、我々は、ホスホジエステラーゼ（PDE)の活性をモニ
ターすることを試みた。我々は、環状ヌクレオチドのホ
スホジエステルの開裂によって環状ヌクレオチドのヌク
レオシド一リン酸への変換、例えば、cAMPのAMPへの変
換（化２）を触媒するホスホジエステラーゼ3',5'-環状
モノヌクレオチド^１０を用いた。そのような酵素は細胞
内シグナル伝達に関与するので、その活性^１１を感度良
く検出するシステムを開発することは極めて重要であ
る。

【００２７】

【化２】

【００２８】実施例５で示されたように、錯体１−Ｃｄ
IIから成る本発明の蛍光センサーは、cAMPよりもはるか
に強くAMPを認識した。従って次に、AMPの上昇をモニタ
ーすることによってPDE活性をリアルタイムで検出する
ことを試みた。即ち、ｐH7.4にて、100mMのHEPES、10mM
のcAMP、10mMのCaCl_２及び0.02U/mlのPDEアクチベータ
を含む5mMの錯体１−ＣｄIIに2U/ml（最終濃度）のPDE
を加えた後、数回、励起スペクトル（放射波長は500nm)
を測定した。その結果、図６[a]及び[b]に示すように、
蛍光強度（励起波長：380nm/ 放射波長：500nm)は徐々
に増加した。このスペクトル変化は、cAMPからAMPへの
変換を示している。このような結果から、ホスホジエス
テラーゼ3',5'-環状ヌクレオチド活性のリアルタイム蛍
光測定に本発明化合物である錯体１−ＣｄIIが有用であ
ることが明らかにされた。又、このアプローチは、他の
酵素活性の測定に応用可能であると期待される。

【００２９】

【発明の効果】本発明者は、スペクトル及びｐH電位差
のデータに基づいて、ＣｄIIが７位置換クマリン誘導体
の7-アミノ基によって弱く配位されるので、アニオンの
一部がそれを置き換えることができ、その場所でＣｄII
イオンに配位することができ、下が手、このような化合
物から成るアニオン検出用の蛍光センサーが可逆的であ
ることを確認した。更に、本発明者は、本発明化合物で
ある錯体１−ＣｄIIを用いて、環状ヌクレオチドのホス
ホジエステル結合を加水分解するホスホジエステラーゼ
活性を水溶液中でモニターできることを証明した。この
ような特徴を持ったセンサーはこれまでに知られておら
ず、本発明化合物である錯体１−ＣｄIIは多数の生物学
的及び分析的応用で好ましいアニオンセンサーになり得
る。

【００３０】引用文献リスト (1) (a) Grynkiewicz, G.; Poenie, M.; Tsien, R. Y.
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48. (8) Kodama, M.; Kimura, E. J. Chem. Soc. Dalton Tr
ans., 1977, 2269. (9) (a) Moe, 0. A.; Butler, L. G. J. Biol. Chem. 1
972, 247, 7308. (b) Cooperman, B. S.; Chiu, N.Y.;
Bruckmann, R. H.; Bunick, G. J.; McKenna, G.P. Bio
chemistry, 1973, 12, 1665. (10) Ho, H. C.; Teo, T. S.; Desai, R.; Wang, J. H.
Biochim. Biophys. Acta, 1976, 429, 461. (11) (a) Rutten, W. J.; Schoot, B. M.; De Pont, J.
J. H. H. M. Biochim.Biophys. Acta, 1973, 315,378.
(b) Thompson, W. J.; Appleman, M. M. Biochemistr
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4, 21, 53.

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明化合物がアニオンを検出する蛍
光センサーとして機能し、アニオンを検出する機構を示
す。

【図２】図２は、（a)種々の金属と化合物（１）の(a)
吸収スペクトル及び（b)励起スペクトル（放射波長は50
0nm）を示す。ここで、縦軸：(a)蛍光強度、(b)吸収
度、横軸：波長である。

【図３】図３は、100mMのHEPES緩衝液（ｐH7.4)中で25
℃にてピロリン酸ナトリウム（0、0.003、0.01、0.03、
0.1、0.3、3、10ｍM)を加えた場合の5mMの錯体１−Ｃｄ
IIの励起スペクトルを示す。放射波長は500nmであり、
縦軸は「蛍光強度」、横軸は「波長」である。

【図４】図４は、（a)AMP、GMP、CMP及びUMP、並びに
（ｂ）AMP及びcAMPを加えた際の5mMの錯体１−ＣｄIIに
おける励起スペクトルの比較を示す。各ヌクレオチドの
濃度は10mMである。

【図５】図５は、（a)1mMのNa_４P_２O_７（記号なし)及び
1mMのNa_４P_２O_７+10ｍMのMg_２(ClO_４)_２（白抜きのマ
ル）を伴った錯体１−ＣｄIIの励起スペクトル、及び、
（b)無機ピロリン酸塩を添加する前（記号なし）及び添
加後20分（白抜きのマル）の1mMのNa_２P_４O_７を伴った
錯体１−ＣｄIIの励起スペクトルを示す。放射波長は50
0nmである。

【図６】図６は、ホスホジエステラーゼ活性の測定にお
ける、（a)錯体１−ＣｄIIの励起スペクトルの変化（放
射波長は500nm）、及び(b)蛍光強度-時間のプロット
（励起／放射波長は380nm／500nm）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 31/22 １２２ Ｇ０１Ｎ 31/22 １２２ // Ｇ０１Ｎ 31/00 31/00 Ｚ Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BE05 CA02 CB03 DA06 DA08 FA06 FA11 FB02 GA01 GA04 GA05 HA07 2G043 AA01 BA14 CA03 DA02 EA01 JA01 KA03 KA05 2G054 AA02 AB07 CA10 CB01 EA03 FB01 4B063 QA01 QR13 QR42 QR58 QX02

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 環状ポリアミンの金属錯体から成るアニ
   オンホスト及び蛍光色素を有する化合物であって、該金
   属錯体の金属イオンとの配位結合において、該蛍光色素
   上の置換基とアニオンとの間の配位子交換機能によって
   蛍光色素のスペクトルに変化が生じることを特徴とす
   る、前記化合物。
2. 【請求項２】 環状ポリアミンの金属錯体から成るアニ
   オンホスト及び蛍光色素を有する化合物であって、該金
   属錯体の金属イオンとの配位結合に関与する該蛍光色素
   上の電子供与性置換基とアニオンとの間の配位子交換機
   能によって該蛍光色素上の電子供与性が増大し、その結
   果、蛍光色素のスペクトルに変化が生じることを特徴と
   する、請求項１記載の化合物。
3. 【請求項３】 金属錯体の金属イオンに対する配位力が
   より強いアニオンの存在によって、該金属錯体の金属イ
   オンとの配位結合に関与する該蛍光色素上の電子供与性
   置換基が金属イオンとの配位結合からはずれることを特
   徴とする、請求項１又は２記載の化合物。
4. 【請求項４】 蛍光色素の吸収（励起）スペクトルが長
   波長側にシフトすることを特徴とする、請求項１ないし
   ３のいずれか一項に記載の化合物。
5. 【請求項５】 アニオンホスト及び蛍光色素がリンカー
   を介して結合していることを特徴とする、請求項１ない
   し４のいずれか一項に記載の化合物。
6. 【請求項６】 環状ポリアミンを構成する窒素原子及び
   炭素原子の総数が１２であり、窒素原子数が４であるこ
   とを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか一項に記
   載の化合物。
7. 【請求項７】 環状ポリアミンが１，４，７，１０−テ
   トラアザシクロデカンである、請求項６記載の化合物。
8. 【請求項８】 蛍光色素上の電子供与性置換基がアミノ
   基である、請求項２ないし７のいずれか一項に記載の化
   合物。
9. 【請求項９】 蛍光色素が７位置換クマリン誘導体であ
   る、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の化合物。
10. 【請求項１０】 蛍光色素が７−アミノ−トリフルオロ
    メチルクマリンである、請求項９に記載の化合物。
11. 【請求項１１】 リンカーがアルキレン基である、請求
    項５ないし１０のいずれか一項に記載の化合物。
12. 【請求項１２】 リンカーがエチレン基である、請求項
    １１に記載の化合物。
13. 【請求項１３】 金属錯体を構成する金属がＣｄであ
    る、請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の化合
    物。
14. 【請求項１４】 請求項１ないし１３のいずれか一項に
    記載の化合物から成る蛍光センサー。
15. 【請求項１５】 水溶液中のアニオンを検出することの
    出来る、請求項１４記載の蛍光センサー。
16. 【請求項１６】 アニオンが、ピロリン酸イオン、リン
    酸イオン、クエン酸イオン、ハロゲンイオン、及びヌク
    レオチドから成る群から選択される一種又は複数種のア
    ニオンである、請求項１５記載の蛍光センサー。
17. 【請求項１７】 請求項１ないし１３のいずれか一項に
    記載の化合物をセンサーとして使用し、その蛍光色素の
    吸収（励起）スペクトルの長波長側へのシフトの度合い
    に基づき、アニオン濃度を測定する方法。
18. 【請求項１８】 水溶液中におけるアニオン濃度を測定
    することを特徴とする、請求項１７に記載の測定方法。
19. 【請求項１９】 請求項１ないし１３のいずれか一項に
    記載の化合物をセンサーとして使用し、その蛍光色素の
    吸収（励起）スペクトルの長波長側へのシフトの度合い
    に基づき、アニオン性残基の増減を測定する方法。
20. 【請求項２０】 水溶液中におけるアニオン性残基の増
    減を測定することを特徴とする、請求項１９に記載の測
    定方法。
21. 【請求項２１】 請求項１ないし１３のいずれか一項に
    記載の化合物をセンサーとして使用し、蛍光強度の変化
    に基づき、アニオン性残基の増減を伴う反応に関与する
    酵素の活性を測定する方法。
22. 【請求項２２】 酵素がホスホジエステラーゼである、
    請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 酵素が環状モノヌクレオチド特異的ホ
    スホジエステラーゼである、請求項２２に記載の方法。