WO2010029735A1 - 構造解析装置、及び構造解析方法 - Google Patents

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spectrum
structural analysis
intensity
rare earth
line
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PCT/JP2009/004467
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長谷川靖哉
河合壯
湯浅順平
片岡幹雄
山田晃平
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国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"

Definitions

  • the present invention relates to a molecular structure analysis method and a structure analysis apparatus that can be used in the method.
  • fluorescent probe As such a fluorescent probe, (i) it is difficult to inhibit structural changes of biomolecules because of its relatively low molecular weight, (ii) fluorescence observation is easy because of high emission intensity, and (iii) fluorescence lifetime is long.
  • a number of fluorescent probes based on rare earth complexes have been reported for such reasons as being able to remove noise from long-lived (several milliseconds) luminescent biomolecules by long-time delayed measurement (for example, see Non-Patent Documents 1 and 2). .
  • the above method can provide information on the position of a biomolecule, but it is difficult to analyze a fine structural change in the biomolecule.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to realize a structural analysis apparatus and a structural analysis method capable of analyzing minute structural changes in molecules.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems. Specifically, the present inventor examined analyzing the structural change of the biomolecule by measuring the emission spectrum of the biomolecule on which the fluorescent probe was immobilized while changing the measurement conditions.
  • the inventor standardizes the intensity of the line spectrum based on the electric dipole transition in the spectrum by the intensity of the line spectrum at one wavelength in the emission line spectrum based on the magnetic dipole transition.
  • the structural analysis apparatus includes a light source that irradiates a measurement sample including molecules to be subjected to structural analysis, to which a rare earth complex is bonded, and the measurement sample.
  • the measurement unit that receives the light emitted from the light and measures the intensity of the spectrum of the light, and the intensity of the spectrum including the line spectrum based on the electric dipole transition is measured as the magnetic dipole transition.
  • an output unit for outputting the normalized spectrum, which is normalized by the intensity of the line spectrum at one wavelength in the line spectrum.
  • the emission spectrum obtained by normalizing the intensity of the emitted spectrum including the line spectrum based on the electric dipole transition with the intensity of the line spectrum at one wavelength in the line spectrum based on the magnetic dipole transition is obtained. can get.
  • the emission line spectrum based on the magnetic dipole transition has emission intensity specific to the rare earth element, and the emission line spectrum based on the electric dipole transition varies depending on the type of ligand around the rare earth element. In addition, it has a specific emission intensity depending on the type of rare earth complex.
  • the emission spectrum based on the magnetic dipole transition is not affected by the change in the structure of the molecule bound to the rare earth complex, and the emission spectrum based on the electric dipole transition is the structure change of the molecule bound to the rare earth complex. It is considered that the emission intensity changes due to the above.
  • the intensity of the emission line spectrum based on the electric dipole transition is changed to the magnetic dipole.
  • the intensity of the line spectrum normalized by the intensity of the line spectrum at one wavelength in the line spectrum based on the child transition influences other than the structural change of the molecule to which the rare earth complex is bonded are excluded. Therefore, by analyzing the normalized spectrum, it is possible to analyze in more detail the structural change of the molecule to which the rare earth complex is bound.
  • the measurement of the emission spectrum can be performed in a shorter time than the measurement of the CD spectrum conventionally used for analyzing the structural change of the molecule.
  • a structural analysis apparatus includes a light source that irradiates excitation light to a measurement sample including molecules to be subjected to structural analysis, to which a rare earth complex is bonded, and radiation from the measurement sample. Including a line spectrum based on an electric dipole transition out of the spectrum intensity with respect to the measured intensity of each spectrum, and a measurement unit that receives the emitted light multiple times and measures the spectrum intensity of each light A calculation unit that normalizes the intensity of the spectrum by the intensity of the line spectrum at one wavelength in the line spectrum based on the magnetic dipole transition; and an output unit that outputs each of the normalized spectra. It is a feature.
  • the emission line spectrum based on the magnetic dipole transition is not affected by the change in the structure of the molecule to which the rare earth complex is bonded, and the emission line spectrum based on the electric dipole transition is the structure of the molecule to which the rare earth complex is bonded. It is considered that the emission intensity changes due to the change.
  • the intensity of the emission line spectrum based on the electric dipole transition is changed to the magnetic dipole.
  • the intensity of the line spectrum normalized by the intensity of the line spectrum at one wavelength in the line spectrum based on the child transition influences other than the structural change of the molecule to which the rare earth complex is bonded are excluded. Therefore, by analyzing the normalized spectrum, it is possible to analyze in more detail the structural change of the molecule to which the rare earth complex is bound.
  • the measurement of the emission spectrum can be performed in a shorter time than the measurement of the CD spectrum conventionally used for analyzing the structural change of the molecule. For this reason, the structural change with progress of time can be analyzed in detail.
  • a plurality of types of rare earth complexes are bonded to the molecule to be subjected to structural analysis, and the calculation unit corresponds to each rare earth complex among the measured intensities of the spectrum. It is preferable to normalize the intensity of each spectrum including a line spectrum based on an electric dipole transition by the intensity of each line spectrum at one wavelength in the line spectrum based on a magnetic dipole transition corresponding to each rare earth complex.
  • the measurement unit measures a g value of circularly polarized light emission of light emitted from the measurement sample as the intensity of the spectrum.
  • numerator can be analyzed in detail by measuring g value of circularly polarized light emission of the light radiated
  • the one wavelength in the line spectrum based on the magnetic dipole transition is preferably the maximum absorption wavelength in the line spectrum based on the magnetic dipole transition.
  • the molecule to be subjected to the structural analysis is a protein.
  • the structural analysis apparatus further includes a structural analysis unit, wherein the calculation unit outputs the normalized spectrum to the structural analysis unit, and the structural analysis unit is based on the normalized spectrum. It is preferable to perform structural analysis.
  • the structural analysis method includes an irradiation step of irradiating a measurement sample containing molecules to be subjected to structural analysis, to which a rare earth complex is bonded, and excitation light from the measurement sample.
  • Receiving the emitted light and measuring the intensity of the spectrum of the light, and of the measured intensity of the spectrum the intensity of the spectrum including the line spectrum based on the electric dipole transition is converted into a magnetic dipole transition.
  • the intensity of the spectrum including the line spectrum based on the electric dipole transition is normalized by the intensity of the line spectrum at one wavelength in the line spectrum based on the magnetic dipole transition.
  • An emission spectrum is obtained.
  • the emission line spectrum based on the magnetic dipole transition has emission intensity specific to the rare earth element, and the emission line spectrum based on the electric dipole transition varies depending on the type of ligand around the rare earth element. In addition, it has a specific emission intensity depending on the type of rare earth complex.
  • the emission spectrum based on the magnetic dipole transition is not affected by the change in the structure of the molecule bound to the rare earth complex, and the emission spectrum based on the electric dipole transition is the structure change of the molecule bound to the rare earth complex. It is considered that the emission intensity changes due to the above.
  • the intensity of the emission line spectrum based on the electric dipole transition is changed to the magnetic dipole.
  • the intensity of the line spectrum normalized by the intensity of the line spectrum at one wavelength in the line spectrum based on the child transition influences other than the structural change of the molecule to which the rare earth complex is bonded are excluded. Therefore, by analyzing the normalized spectrum, it is possible to analyze in more detail the structural change of the molecule to which the rare earth complex is bound.
  • the measurement of the emission spectrum can be performed in a shorter time than the measurement of the CD spectrum conventionally used for analyzing the structural change of the molecule.
  • a plurality of types of rare earth complexes are bonded to the molecule to be subjected to structural analysis, and the calculation step corresponds to each rare earth complex in the measured spectrum intensity. It is preferable to normalize the intensity of each spectrum including a line spectrum based on an electric dipole transition by the intensity of each line spectrum at one wavelength in the line spectrum based on a magnetic dipole transition corresponding to each rare earth complex.
  • a plurality of electric dipoles corresponding to each rare earth complex wherein the emission intensity is normalized by the intensity of each line spectrum at a specific wavelength in the line spectrum based on the magnetic dipole transition, according to the calculation step.
  • a normalized spectrum including a line spectrum based on the transition is obtained.
  • the measurement step measures a g value of circularly polarized light emission of light emitted from the measurement sample as the intensity of the spectrum.
  • the fine structural change of the molecule itself can be analyzed in more detail by measuring the g value of circularly polarized light emitted from the rare earth complex bound to the molecule. There is an effect.
  • the one wavelength in the line spectrum based on the magnetic dipole transition is preferably the maximum absorption wavelength in the line spectrum based on the magnetic dipole transition.
  • the molecule to be subjected to the structure analysis is preferably a protein.
  • the structural analysis method according to the present invention is characterized in that structural change over time is analyzed using any one of the above-described structural analysis methods according to the present invention.
  • the structure analysis apparatus can provide an apparatus that can measure in a short time and can analyze a minute structural change of a molecule.
  • the structure analysis method according to the present invention has an effect that it can be measured in a short time and a minute structural change of a molecule can be analyzed.
  • the emission spectra measured in the range of 20 ° C. to 80 ° C. for the BSA bonded with the rare earth complex obtained in Example 1 are normalized by the intensity of the line spectrum at 593 nm.
  • 3 is a CD spectrum measured in the range of 20 ° C. to 80 ° C. for BSA bound with the rare earth complex obtained in Example 1. It is the spectrum which each normalized the emission spectrum measured about the various protein which the rare earth complex obtained in Example 1, 2 couple
  • a line spectrum refers to a spectrum specified by a transition between certain levels
  • a spectrum refers to the entire emitted light or a plurality of line spectra.
  • the molecule to be subjected to the structural analysis method according to the present embodiment may be any molecule, but can be suitably applied to a molecule having a particularly complicated structure, and more specifically It can be suitably applied to biomolecules such as proteins.
  • the fine structure change in the molecule that can be analyzed by the method of the present embodiment includes, for example, a change in the three-dimensional structure of the molecule due to a temperature change, a change in the association state between the molecules, and the like.
  • the structural analysis method according to the present embodiment includes an irradiation process, a measurement process, a calculation process, and a structural analysis process. Details will be described below.
  • the irradiation step is a step of irradiating excitation light to a molecule to be subjected to structural analysis (hereinafter, sometimes referred to as “structural analysis target molecule”) to which a rare earth complex is bonded.
  • Only one kind of the rare earth complex bonded to the molecule to be structurally analyzed may be used, or a plurality of kinds may be used.
  • By bonding a plurality of rare earth complexes to the structural analysis target molecule it is possible to analyze minute structural changes at a plurality of locations in the structural analysis target molecule almost simultaneously. Further, from the viewpoint of improving the analysis accuracy, it is preferable to select the plurality of rare earth complexes to be used so that the respective emission spectra do not overlap.
  • the method for bonding the rare earth complex to the molecule to be structurally analyzed is not particularly limited, and a conventionally known method can be employed.
  • a specific method for bonding the rare earth complex to the structural analysis target molecule for example, only the target molecule binding ligand in the rare earth complex is first bonded to the target molecule, and then a rare earth ion is added, A method of bonding the rare earth complex to a molecule is mentioned.
  • the said bond form is not limited to a covalent bond, For example, an ionic bond and a hydrogen bond may be sufficient.
  • the rare earth complex is a complex in which a ligand is coordinated to a rare earth ion.
  • the rare earth ions that can be used in the rare earth complex are not limited, and all rare earth ions can be used.
  • At least one of the ligands used in the rare earth complex binds to a molecule to be analyzed in addition to a group capable of coordinating to the rare earth ion (hereinafter referred to as “rare earth ion coordination group”).
  • Group hereinafter referred to as “target molecule binding group”
  • target molecule binding ligand the ligand is referred to as “target molecule binding ligand”.
  • rare earth ion coordination group examples include a bipyridine group, a phenanthryllone group, a diketone group, a carbamite group, an amine group, and a phosphine group.
  • ⁇ group means “a group having a skeleton of the compound or its derivative”, for example, “pipyridine group” means “a group having the skeleton of piperidine or its derivative”.
  • the target molecule binding group is not particularly limited as long as it is a group that reacts or associates with a portion to which the rare earth complex is to be bonded in the target molecule.
  • a rare earth complex is bound to a lysine moiety in a protein
  • a succinimide group can be used.
  • an iodomethyl group is exemplified.
  • the rare earth ion coordination group and the target molecule binding group may be directly bonded or may be bonded via a spacer molecule.
  • the wavelength of light irradiated on the rare earth complex (that is, the excitation wavelength) can be shifted to the longer wavelength side. This is preferable because it is possible. Thereby, an excitation wavelength can be made into the wavelength (about 450 nm) which can be excited with blue LED.
  • the spacer group examples include a biphenylene group (—C 6 H 4 —C 6 H 4 —), a terphenylene group (—C 6 H 4 —C 6 H 4 —C 6 H 4 —), and a naphthylene group (—C 10 H 6 -), anthrylene group (-C 14 H 18 -) having an aromatic molecular skeleton such as, is preferably a group having a easy rigid structure reflects the structural changes of the target molecule.
  • target molecule-binding ligand examples include compounds having the structure shown below.
  • the ligand other than the target molecule-binding ligand coordinated to the rare earth ion is not particularly limited, and a conventionally known ligand can be used.
  • a bipyridine ligand, a phenanthryllone ligand, a diketone ligand, a carbamite ligand, an amine ligand, a phosphine ligand, and the like can be given.
  • ⁇ -type ligand means “a ligand comprising a compound or derivative thereof”, for example, a “pipyridine-type ligand” means a coordination consisting of “pipyridine or a derivative thereof. Means "child”.
  • the measurement step is a step of receiving light emitted from the rare earth complex and measuring the intensity of the spectrum of the light.
  • the excitation is performed with the excitation light of each wavelength, and the intensity of the spectrum of the light emitted by the excitation light of each wavelength. May be measured respectively.
  • the intensity of the spectrum the intensity of the left circularly polarized light component and the right circularly polarized light component of the light emitted from the measurement sample are measured, that is, the g value of circularly polarized light emission is measured. Is preferred. Thereby, structural analysis can be performed in more detail.
  • the molecular chain constituting the protein can move freely, so that the g value of circularly polarized light emission is predicted to be almost zero, whereas in a folded protein, the protein is composed. It is predicted that the g value of circularly polarized light emission does not become zero because the movement of the molecular chain is limited. For this reason, it is considered that a more detailed analysis can be performed on the structural change of the protein by measuring the g value of circularly polarized light emission as the spectral intensity.
  • (C) Calculation step calculates the emission intensity of the spectrum including the line spectrum based on the electric dipole transition among the emission intensity of the measured spectrum at one wavelength in the line spectrum based on the magnetic dipole transition. This is a step of normalizing with the intensity of the line spectrum.
  • the arbitrary wavelength in the line spectrum based on the magnetic dipole transition is preferably the maximum absorption wavelength in the line spectrum based on the magnetic dipole transition.
  • the normalization may be performed on the entire obtained spectrum, may be performed only on the entire line spectrum based on the electric dipole transition, or may be performed on a part of the line spectrum based on the electric dipole transition. You may go only.
  • the structure of the target molecule can be analyzed not only by the intensity of the line spectrum based on the electric dipole transition, but also by the maximum emission wavelength and the shape of the line spectrum, the above normalization is required to at least It is preferable to carry out with respect to the whole.
  • the calculation step includes, for each spectrum including line spectra based on electric dipole transitions corresponding to each rare earth complex, of the measured spectrum intensities. Normalization can be achieved by dividing the intensity by the value of each intensity of the line spectrum at one wavelength in the line spectrum based on the magnetic dipole transition corresponding to each rare earth complex.
  • the structural analysis step is a step of analyzing the structure of the molecule to be analyzed based on the normalized spectrum including a line spectrum based on the electric dipole transition.
  • the intensity of the line spectrum based on the magnetic dipole transition does not change depending on the environment in which the ligand is placed, but the intensity and shape of the line spectrum based on the electric dipole transition change. . Specifically, the intensity and shape of the line spectrum based on the electric dipole transition is affected by a change in symmetry around the rare earth metal ion. That is, when the symmetry around the rare earth metal ion is lowered, the intensity of the line spectrum based on the electric dipole transition is increased, and the shape is considered to be broad.
  • the structural change of the target molecule can be observed. Can be analyzed.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of the structural analysis apparatus according to the present embodiment.
  • the structural analysis apparatus 10 receives a light source 1 that irradiates excitation light to a measurement sample 2 including a structural analysis target molecule to which a rare earth complex is bonded, and light emitted from the measurement sample 2. Then, the measurement unit 3 for measuring the intensity of the spectrum of the light, and the spectrum intensity including the line spectrum based on the electric dipole transition among the intensity of the measured spectrum is converted into one in the line spectrum based on the magnetic dipole transition. A calculation unit 4 that normalizes the intensity of a line spectrum at a wavelength and an output unit 7 that outputs the normalized spectrum are provided. In the present embodiment, the structural analysis apparatus 10 further includes a measurement chamber 5 for storing the measurement sample 2.
  • the light source 1 irradiates the measurement sample 2 installed in the measurement chamber 5 with excitation light having a wavelength corresponding to the absorption wavelength of the rare earth complex.
  • a light source capable of emitting light in the ultraviolet region such as an ultraviolet LED, a black light, a xenon lamp, or a short wavelength semiconductor laser is used.
  • the measuring unit 3 receives light emitted from the rare earth complex in the measurement sample 2 and measures the spectral intensity (light intensity) of this light. That is, when the measurement unit 3 receives light emitted from the rare earth complex bonded to the structure analysis target molecule, the measurement unit 3 measures the spectral intensity and transmits the spectral intensity data to the calculation unit 4.
  • the measurement unit 3 may measure at least the line spectrum intensity based on the electric dipole transition and the line spectrum intensity based on the magnetic dipole transition in the received light, but may measure the spectrum intensity of all wavelengths. Alternatively, only the light intensity of a predetermined wavelength may be measured.
  • the measuring unit 3 may be any unit that can measure the light intensity.
  • a photodiode, a photomultiplier tube, a CCD, a spectrum analyzer, or the like can be used.
  • the measurement unit 3 is more preferably an apparatus that can measure the intensity of the left circularly polarized light component and the right circularly polarized light component of light, and can measure the g value of circularly polarized light emission.
  • An example of such an apparatus is a circularly polarized fluorescence spectrometer such as JASCO CPL-200-spectrometer manufactured by JASCO Corporation.
  • the calculation unit 4 calculates the intensity of the spectrum including the line spectrum based on the electric dipole transition in the spectrum intensity data received from the measurement unit 3 as an intensity value at an arbitrary wavelength in the line spectrum based on the magnetic dipole transition. It will be standardized.
  • the output unit 7 outputs the normalized spectrum obtained by the calculation unit 4.
  • the output method is not particularly limited, and examples thereof include a method of displaying on a display, a method of printing on paper, and a method of outputting electronic data to a recording medium.
  • the irradiation process, the measurement process, and the calculation process in the method according to the present embodiment can be performed by using the structural analysis apparatus 10 according to the present embodiment.
  • the structure analysis process mentioned above in the method concerning this Embodiment can be performed using the normalized spectrum output by the output part 7. FIG.
  • the spectrum based on the electric dipole transition a database is created on what kind of structural change is specifically occurring due to changes in the intensity, the maximum emission wavelength, or the shape of the spectrum. Accordingly, it is possible to provide a structural analysis unit that accesses the database based on the normalized spectrum obtained by the calculation unit 4. In this case, the normalized spectrum data is output to the structural analysis unit.
  • the measurement unit 3 receives all the light emitted from the rare earth complex in the measurement sample 1 has been described.
  • the present invention is not limited to this.
  • a wavelength selection unit that transmits only a specific wavelength may be separately provided between the measurement sample 1 and the measurement unit 3, and the measurement unit 3 may be configured to receive and measure only light having a wavelength necessary for analysis. .
  • the wavelength selection unit is not particularly limited, and a conventionally known configuration can be adopted. For example, a configuration in which emitted light is transmitted, reflected, diffracted, or refracted to be dispersed can be used.
  • the measurement part 3 demonstrated on the assumption that all the intensity
  • the configuration may be such that only the intensity of the spectrum of some light is measured.
  • the measurement time can be shortened.
  • the interval of time that can be measured can be shortened, and the structural change can be performed with higher accuracy. Can be analyzed.
  • emission spectrum was measured using a fluorescence analyzer (HITACHI F-4500) with an excitation wavelength of 365 nm for a measurement sample in which protein molecules bound with a rare earth complex were dissolved in distilled water.
  • HITACHI F-4500 fluorescence analyzer
  • BioT which is the target molecule-binding ligand, was synthesized by commissioning Kobe Natural Products Chemical Co., Ltd. BioT is the following synthetic route
  • Example 1 5 mg of BSA and 5 mg of BioT were stirred in 4 mL of distilled water for about 16 hours at 4 ° C. to bind BioT to BSA. The solution was filtered and dried by freeze drying. By MALDI-TOFMS measurement, it was confirmed that in the BSA to which the obtained BioT was bound, four BiOTs were bound to BSA.
  • the emission spectrum of the obtained BSA bound with a rare earth complex (BSA + BioT + Eu (III)) was measured in the range of 20 ° C. to 80 ° C.
  • the obtained emission spectrum was normalized with the intensity of the line spectrum at 593 nm, which is one of the intensity of the line spectrum based on the magnetic dipole transition.
  • the normalized spectrum is shown in FIG.
  • FIG. 3 shows the result of CD spectrum measurement at 20 ° C. to 80 ° C. for BSA (BSA + BioT + Eu (III)) bonded with rare earth complexes.
  • FIGS. 2 and 3 shows the measurement results of the BSA bonded with the rare earth complex once heated to 80 ° C. and then cooled to 20 ° C.
  • the emission spectrum of the globulin obtained by binding the rare earth complex was measured at room temperature.
  • the obtained emission spectrum was normalized with the intensity of the line spectrum at 593 nm, which is one of the intensity of the line spectrum based on the magnetic dipole transition.
  • the intensity of the line spectrum based on the electric dipole transition and its maximum absorption wavelength differed greatly depending on the type of protein. From this, it was confirmed that according to the present invention, proteins having different structures can be discriminated and analyzed.
  • the structure analysis method and apparatus of the present invention can analyze minute dynamic structural changes of molecules themselves. For this reason, it can be suitably used for structural analysis of biomolecules such as proteins.

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Abstract

　本発明の分子構造解析装置（１０）は、希土類錯体が結合した、構造解析の対象となる分子を含む測定試料（２）に対して励起光を照射する光源（１）と、上記測定試料（２）から放射された光を受光し、当該光のスペクトルの強度を計測する計測部（３）と、計測した上記スペクトルの強度のうち、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化する演算部（４）と、規格化した上記スペクトルを出力する出力部（７）と、を備えている。これにより、微細な動的構造変化を解析することができる装置及び方法を実現する。

Description

構造解析装置、及び構造解析方法
　本発明は、分子の構造解析方法、並びに当該方法に用いることができる構造解析装置に関するものである。
　従来から、タンパク質等の生体分子の高次構造変化を観察及び解析する手法として、蛍光プローブを観察したい生体分子へ固定化する方法が知られている。
　このような蛍光プローブとして、（ｉ）比較的分子量が低いため、生体分子の構造変化を阻害し難いこと、（ii）発光強度が高いため蛍光観察が容易であること、（iii）蛍光寿命が長く（数ミリ秒）、発光性の生体分子からのノイズを長時間遅延測定により除去できること、等の理由により希土類錯体による蛍光プローブが多数報告されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
Jingli Yuan, Kazuko Matsumoto, Hiroko Kimura, Anal. Chem. 1998, 70, 596-601 Junhua Yu, David Parker, Robert Pal, Robert A. Poole, and Martin J. Cann, J. AM. CHEM. SOC. 2006, 128, 2294-2299
　しかしながら、上記方法では、生体分子の位置に関する情報を与えることができるが、生体分子における微細な構造変化を解析することが困難である。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、分子における微細な構造変化を解析することができる構造解析装置及び構造解析方法を実現することにある。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。具体的には、本発明者は、蛍光プローブを固定化した生体分子について、測定条件を変化させて発光スペクトルを測定することにより、生体分子の構造変化を解析することについて検討した。
　しかしながら、このような方法では、温度等の測定条件を変化させて発光スペクトルを測定すると、計測される発光スペクトルのベースラインや発光スペクトルの強度が大きく変化してしまうため、このような変化が、生体分子の構造変化に由来するものであるのか判断できず、発光スペクトルの変化から生体分子の構造変化を解析することは困難であった。
　本発明者は、更に検討を重ねた結果、上記スペクトルにおける電気双極子遷移に基づく線スペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく発光線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化することにより、希土類錯体が結合した分子の構造変化以外の影響を排除することができ、このような規格化したスペクトルにより、分子自身の微細な構造変化を解析することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明に係る構造解析装置は、上記課題を解決するために、希土類錯体が結合した、構造解析の対象となる分子を含む測定試料に対して励起光を照射する光源と、上記測定試料から放射された光を受光し、当該光のスペクトルの強度を計測する計測部と、計測した上記スペクトルの強度のうち、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化する演算部と、規格化した上記スペクトルを出力する出力部と、を備えていることを特徴としている。
　上記構成によれば、放射された、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化した発光スペクトルが得られる。
　ここで、磁気双極子遷移に基づく発光線スペクトルは希土類元素固有の発光強度を有しており、電気双極子遷移に基づく発光線スペクトルは希土類元素の周りの配位子の種類によって発光強度が変化し、かつ希土類錯体の種類によって固有の発光強度を有する。
　つまり、磁気双極子遷移に基づく発光線スペクトルは、希土類錯体が結合した分子の構造変化により発光強度が影響されず、電気双極子遷移に基づく発光線スペクトルは、希土類錯体が結合した分子の構造変化により発光強度が変化すると考えられる。
　従って、温度等の測定条件を変化させることによって、計測される発光スペクトルのベースラインや発光スペクトル強度が大きく変化する場合であっても、電気双極子遷移に基づく発光線スペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化した上記発光スペクトルでは、希土類錯体が結合した分子の構造変化以外の影響が排除される。このため、上記規格化されたスペクトルを解析することにより、希土類錯体を結合させた分子の構造変化をより詳細に解析することができる。
　更には、発光スペクトルの測定は、従来から分子の構造変化の解析に用いられているＣＤスペクトルの測定と比べて、短時間で行うことができる。
　よって、上記構成によれば、短時間で測定することができ、且つ分子の微細な構造変化を解析することができる装置を提供することができるという効果を奏する。
　本発明に係る構造解析装置は、上記課題を解決するために、希土類錯体が結合した、構造解析の対象となる分子を含む測定試料に対して励起光を照射する光源と、上記測定試料から放射された光を複数回受光し、当該各光のスペクトルの強度を計測する計測部と、計測した上記各スペクトルの強度に対して、スペクトルの強度のうち、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化する演算部と、規格化した上記各スペクトルを出力する出力部と、を備えていることを特徴としている。
　上記構成によれば、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化した、放射された複数の発光スペクトルが得られる。
　ここで、磁気双極子遷移に基づく発光線スペクトルは、希土類錯体が結合した分子の構造変化により発光強度が影響されず、電気双極子遷移に基づく発光線スペクトルは、希土類錯体が結合した分子の構造変化により発光強度が変化すると考えられる。
　従って、温度等の測定条件を変化させることによって、計測される発光スペクトルのベースラインや発光スペクトル強度が大きく変化する場合であっても、電気双極子遷移に基づく発光線スペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化した上記発光スペクトルでは、希土類錯体が結合した分子の構造変化以外の影響が排除される。このため、上記規格化されたスペクトルを解析することにより、希土類錯体を結合させた分子の構造変化をより詳細に解析することができる。
　更には、発光スペクトルの測定は、従来から分子の構造変化の解析に用いられているＣＤスペクトルの測定と比べて、短時間で行うことができる。このため、時間の経過による構造変化をより詳細に解析することができる。
　よって、上記構成によれば、短時間で測定することができ、且つ分子の微細な構造変化を解析することができる装置を提供することができるという効果を奏する。
　本発明に係る構造解析装置では、構造解析の対象となる上記分子には複数種類の希土類錯体が結合しており、上記演算部は、計測した上記スペクトルの強度のうち、各希土類錯体に対応する電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含む各スペクトルの強度を、各希土類錯体に対応する、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での各線スペクトルの強度でそれぞれ規格化することが好ましい。
　上記構成によれば、上記演算部により、発光強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける特定の波長での各線スペクトルの強度で規格化した、各希土類錯体に対応する、複数の電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含む規格化されたスペクトルが得られる。
　このため、同時に分子における複数箇所の微細な構造変化を解析することができるという更なる効果を奏する。
　本発明に係る構造解析装置では、上記計測部は、上記スペクトルの強度として、上記測定試料から放射された光の円偏光発光のｇ値を計測することが好ましい。
　上記構成によれば、分子に結合した上記希土類錯体から放射された光の円偏光発光のｇ値を計測することにより、分子の微細な構造変化をより詳細に解析することができるという更なる効果を奏する。
　本発明に係る構造解析装置では、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける上記１つの波長は、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける最大吸収波長であることが好ましい。
　上記構成によれば、分子の微細な構造変化をより詳細に解析することができる。
　本発明に係る構造解析装置では、構造解析の対象となる上記分子がタンパク質であることが好ましい。
　本発明に係る構造解析装置では、更に、構造解析部を備え、上記演算部は、規格化した上記スペクトルを上記構造解析部へ出力し、上記構造解析部は、規格化された上記スペクトルに基づいて構造解析を行うことが好ましい。
　本発明に係る構造解析方法は、上記課題を解決するために、希土類錯体が結合した、構造解析の対象となる分子を含む測定試料に対して励起光を照射する照射工程と、上記測定試料から放射された光を受光し、該光のスペクトルの強度を計測する計測工程と、計測した上記スペクトルの強度のうち、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化する演算工程と、規格化した上記スペクトルにより、構造解析の対象となる上記分子の構造を解析する構造解析工程と、を含むことを特徴としている。
　上記方法によれば、演算工程により、放射された、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルの強度を磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化した発光スペクトルが得られる。
　ここで、磁気双極子遷移に基づく発光線スペクトルは希土類元素固有の発光強度を有しており、電気双極子遷移に基づく発光線スペクトルは希土類元素の周りの配位子の種類によって発光強度が変化し、かつ希土類錯体の種類によって固有の発光強度を有する。
　つまり、磁気双極子遷移に基づく発光線スペクトルは、希土類錯体が結合した分子の構造変化により発光強度が影響されず、電気双極子遷移に基づく発光線スペクトルは、希土類錯体が結合した分子の構造変化により発光強度が変化すると考えられる。
　従って、温度等の測定条件を変化させることによって、計測される発光スペクトルのベースラインや発光スペクトル強度が大きく変化する場合であっても、電気双極子遷移に基づく発光線スペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化した上記発光スペクトルでは、希土類錯体が結合した分子の構造変化以外の影響が排除される。このため、上記規格化されたスペクトルを解析することにより、希土類錯体を結合させた分子の構造変化をより詳細に解析することができる。
　更には、発光スペクトルの測定は、従来から分子の構造変化の解析に用いられているＣＤスペクトルの測定と比べて、短時間で行うことができる。
　よって、上記方法によれば、短時間で測定することができ、且つ分子の微細な構造変化を解析することができるという効果を奏する。
　本発明に係る構造解析方法では、構造解析の対象となる上記分子には複数種類の希土類錯体が結合しており、上記演算工程では、計測した上記スペクトルの強度のうち、各希土類錯体に対応する電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含む各スペクトルの強度を、各希土類錯体に対応する、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での各線スペクトルの強度でそれぞれ規格化することが好ましい。
　上記方法によれば、上記演算工程により、発光強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける特定の波長での各線スペクトルの強度で規格化した、各希土類錯体に対応する、複数の電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含む規格化されたスペクトルが得られる。
　このため、同時に分子における複数箇所の微細な構造変化を解析することができるという更なる効果を奏する。
　本発明に係る構造解析方法では、上記計測工程は、上記スペクトルの強度として、上記測定試料から放射された光の円偏光発光のｇ値を計測することが好ましい。
　上記方法によれば、分子に結合した上記希土類錯体から放射された光の円偏光発光のｇ値を計測することにより、分子自身の微細な構造変化をより詳細に解析することができるという更なる効果を奏する。
　本発明に係る構造解析方法では、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける上記１つの波長は、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける最大吸収波長であることが好ましい。
　上記方法によれば、分子の微細な構造変化をより詳細に解析することができる。
　本発明に係る構造解析方法では、構造解析の対象となる上記分子がタンパク質であることが好ましい。
　本発明に係る構造解析方法は、上述した本発明に係る構造解析方法の何れか１つを用いて、時間の経過による構造変化を解析することを特徴としている。
　上記方法によれば、上述した本発明に係る構造解析方法の何れか１つを用いているため、短い時間の間隔で連続して構造解析を行うことができ、より高精度に構造変化を解析することができる。
　本発明に係る構造解析装置は、以上のように、短時間で測定することができ、且つ分子の微細な構造変化を解析することができる装置を提供することができるという効果を奏する。
　また、本発明に係る構造解析方法は、短時間で測定することができ、且つ分子の微細な構造変化を解析することができるという効果を奏する。
本実施の形態に係る構造解析装置の概略構成を示すブロック図である。 実施例１で得られた希土類錯体が結合したＢＳＡについての２０℃～８０℃の範囲で測定した発光スペクトルを、５９３ｎｍでの線スペクトルの強度でそれぞれ規格化したスペクトルである。 実施例１で得られた希土類錯体が結合したＢＳＡについての２０℃～８０℃の範囲で測定したＣＤスペクトルである。 実施例１、２で得られた希土類錯体が結合した各種タンパク質について測定した発光スペクトルを、５９３ｎｍでの線スペクトルの強度でそれぞれ規格化したスペクトルである。
　以下、本発明について詳しく説明する。
　尚、本明細書では、線スペクトル（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）とは、ある準位間の遷移に特定されるスペクトルを指し、スペクトル（ｓｐｅｃｔｒａ）とは、発光光全体又は複数の線スペクトルを指す。
　また、円偏光発光のｇ値とは、放射された光の右円偏光成分の強度をＩＲとし、左円偏光成分の強度をＩＬとしたときに、下記式
　ｇ＝（ＩＬ－ＩＲ）／（０．５×（ＩＬ＋ＩＲ））
で表される値である。
　（Ｉ）構造解析方法
　本実施の形態に係る構造解析方法の対象となる分子は、どのような分子であってもよいが、特に構造が複雑な分子に好適に適用でき、より具体的には、タンパク質等の生体分子に対して好適に適用できる。
　また、本実施の形態の方法により解析することができる、分子における微細な構造変化とは、例えば、温度変化による分子の立体構造の変化や、分子間の会合状態の変化等が挙げられる。
　本実施の形態に係る構造解析方法は、照射工程と、計測工程と、演算工程と、構造解析工程とを含む。以下、詳細に説明する。
　（ａ）照射工程
　照射工程とは、希土類錯体が結合した、構造解析の対象となる分子（以下、「構造解析対象分子」と記す場合がある）に対して励起光を照射する工程である。
　上記構造解析対象分子に結合する上記希土類錯体は、１種類のみ用いてもよいし、複数の種類用いてもよい。複数の希土類錯体を上記構造解析対象分子に結合させることにより、ほぼ同時に上記構造解析対象分子における複数箇所の微細な構造変化を解析することができる。また、解析精度を高める観点から、用いる複数の希土類錯体は、それぞれの発光スペクトルが重なり合わないように選択することが好ましい。
　希土類錯体を構造解析対象分子に結合させる方法は、特には限定されず、従来公知の方法を採用することができる。上記希土類錯体を上記構造解析対象分子に結合させる具体的な方法としては、例えば、先に上記希土類錯体における対象分子結合配位子のみを、対象分子と結合させ、その後、希土類イオンを加えて、上記希土類錯体を分子に結合させる方法が挙げられる。また、上記結合形式は、共有結合には限定されず、例えば、イオン結合、水素結合であってもよい。
　上記希土類錯体は、希土類イオンに配位子が配位した錯体である。尚、上記希土類錯体に用いることができる希土類イオンに限定はなく、全ての希土類元素のイオンを使用することが可能である。
　上記希土類錯体に用いられる配位子の少なくとも１つは、上記希土類イオンに配位することができる基（以下、「希土類イオン配位基」と記す）に加えて、構造解析対象分子と結合する基（以下、「対象分子結合基」と記す）とを有していることが必要である（以下、当該配位子を、「対象分子結合配位子」と記す）。この対象分子結合配位子により、希土類錯体を構造解析対象分子と結合させることができる。
　希土類イオン配位基としては、例えば、ビピリジン系基、フェナントリロン系基、ジケトン系基、カーバマイト系基、アミン系基、ホスフィン系基等が挙げられる。
　尚、上記「～系基」とは、「その化合物若しくはその誘導体の骨格を有する基」を意味し、例えば、「ピピリジン系」とは、「ピピリジン若しくはその誘導体の骨格を有する基」を意味する。
　また、対象分子結合基としては、対象分子において、希土類錯体を結合したい部分と反応若しくは会合する基であれば特には限定されない。例えば、タンパク質におけるリシン部分に希土類錯体を結合させる場合には、スクシンイミド系基を用いることができる。また、タンパク質におけるシステイン部分に希土類錯体を結合させる場合には、ヨードメチル基が挙げられる。
　上記対象分子結合配位子において、上記希土類イオン配位基と上記対象分子結合基とは直接結合していてもよく、スペーサー分子を介して結合していてもよい。
　上記希土類イオン配位基と上記対象分子結合基とがスペーサー基を介して結合している場合には、希土類錯体に照射する光の波長（つまり、励起波長）を長波長側にシフトさせることができるため好ましい。これにより、励起波長を、青色ＬＥＤで励起できる波長（約４５０ｎｍ）にすることができる。
　上記スペーサー基としては、ビフェニレン基（－Ｃ６Ｈ４－Ｃ６Ｈ４－）、ターフェニレン基（－Ｃ６Ｈ４－Ｃ６Ｈ４－Ｃ６Ｈ４－）、ナフチレン基（－Ｃ１０Ｈ６－）、アントリレン基（－Ｃ１４Ｈ１８－）等の芳香族分子骨格を有する、対象分子の構造変化を反映し易い剛直な構造を有する基であることが好ましい。
　上記対象分子結合配位子としては、具体的には、以下に示す構造を有する化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　尚、上記化合物は代表的な例であり、他の誘導体も使用可能である。更に、他の系列に属する化合物やその誘導体を用いてもよい。
　また、希土類イオンに配位する上記対象分子結合配位子以外の配位子としては、特には限定されず、従来公知の配位子を用いることができる。例えば、ビピリジン系配位子、フェナントリロン系配位子、ジケトン系配位子、カーバマイト系配位子、アミン系配位子、ホスフィン系配位子等が挙げられる。
　尚、上記「～系配位子」とは、「その化合物若しくはその誘導体からなる配位子」を意味し、例えば、「ピピリジン系配位子」とは、「ピピリジン若しくはその誘導体からなる配位子」を意味する。
　（ｂ）計測工程
　上記計測工程は、上記希土類錯体から放射された光を受光し、該光のスペクトルの強度を計測する工程である。
　尚、励起波長が異なる２種以上の希土類錯体を、構造解析対象分子に結合させた場合には、各波長の励起光でそれぞれ励起を行い、各波長の励起光により発光した光のスペクトルの強度をそれぞれ計測すればよい。
　上記計測工程では、上記スペクトルの強度として、上記測定試料から放射された光の左円偏光成分の強度と右の円偏光成分とを計測すること、つまり、円偏光発光のｇ値を計測することが好ましい。これにより、より詳細に構造解析を行うことができる。
　例えば、アンフォールディングした状態のタンパク質では、タンパク質を構成する分子鎖が自由に動くことができるので円偏光発光のｇ値がほぼ０になると予測され、一方、フォールディングした状態のタンパク質では、タンパク質を構成する分子鎖の動きが制限されているため円偏光発光のｇ値が０にはならないと予測される。このため、スペクトル強度として円偏光発光のｇ値を測定することにより、タンパク質の構造変化に関してより詳細な解析を行うことができると考えられる。
　（ｃ）演算工程
　上記演算工程は、上記計測したスペクトルの発光強度のうち、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルの発光強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化する工程である。
　具体的には、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルの強度の全ての値を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける任意の波長での線スペクトルの強度の値でそれぞれ割ることにより、規格化することができる。
　ここで、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける上記任意の波長は、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける最大吸収波長であることが好ましい。
　上記規格化は、得られるスペクトル全体に対して行ってもよいし、電気双極子遷移に基づく線スペクトル全体に対してのみ行ってもよいし、電気双極子遷移に基づく線スペクトルの一部に対してのみ行ってもよい。
　電気双極子遷移に基づく線スペクトルの強度のみならず、最大発光波長、線スペクトルの形状によっても対象分子の構造解析を行うことができるため、上記規格化は少なくとも電気双極子遷移に基づく線スペクトルの全体に対して行うことが好ましい。
　また、複数の種類の希土類錯体を分子に結合させた場合では、上記演算工程は、上記計測したスペクトルの強度のうち、各希土類錯体に対応する電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含む各スペクトルの強度を、各希土類錯体に対応する磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの各強度の値でそれぞれ割ることにより、規格化することができる。
　（ｄ）構造解析工程
　上記構造解析工程は、上記規格化した、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルにより、上記構造解析対象分子の構造を解析する工程である。
　本実施の形態で用いる希土類錯体は、その配位子が置かれる環境により、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルの強度は変化しないが、電気双極子遷移に基づく線スペクトルの強度や形状は変化する。具体的には、電気双極子遷移に基づく線スペクトルの強度や形状は、希土類金属イオンの周りの対称性の変化に影響される。つまり、希土類金属イオンの周りの対称性が低くなると、電気双極子遷移に基づく線スペクトルの強度は強くなり、その形状は、ブロードになると考えられる。
　このため、演算工程により得られる規格化された、電気双極子遷移に基づく線スペクトルについて、その強度や、その最大発光波長、又はそのスペクトルの形状等を観察することにより、対象分子の構造変化を解析することができる。
　例えば、後述する実施例に記載のように、温度変化に伴うスペクトルの強度や形状の変化を観察することにより、温度変化による対象分子の微細な構造変化を確認することができる。
　（II）構造解析装置
　上述した方法に使用することができる、本実施の形態に係る構造解析装置について図１に基づいて説明する。図１は、本実施の形態に係る構造解析装置の概略構成を示すブロック図である。
　図１に示すように、構造解析装置１０は、希土類錯体が結合した構造解析対象分子を含む測定試料２に対して励起光を照射する光源１と、上記測定試料２から放射された光を受光し、当該光のスペクトルの強度を計測する計測部３と、上記計測したスペクトルの強度のうち、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトル強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化する演算部４と、規格化した上記スペクトルを出力する出力部７とを備えている。本実施の形態では、構造解析装置１０は、測定試料２を格納するための測定室５を更に備える。
　光源１は、測定室５に設置された測定試料２に対して、希土類錯体の吸収波長に対応する波長の励起光を照射するものである。光源１としては、例えば、紫外線ＬＥＤ、ブラックライト、キセノンランプ、短波長半導体レーザ等の紫外領域において発光可能な光源が用いられる。
　計測部３は、測定試料２中の希土類錯体から発光された光を受光し、この光のスペクトル強度（光の強度）を計測するものである。即ち、計測部３は、構造解析対象分子に結合した希土類錯体から発光された光を受光すると、スペクトル強度を計測し、このスペクトル強度のデータを演算部４に送信する。
　計測部３は、受光した光のうち、少なくとも電気双極子遷移に基づく線スペクトル強度と磁気双極子遷移に基づく線スペクトル強度とを計測できればよいが、全ての波長のスペクトル強度を計測してもよく、また、予め定められた波長の光強度のみを計測してもよい。
　上記計測部３としては、光強度を計測することができるものであればよく、例えば、フォトダイオード、光電子倍増管、ＣＣＤ、スペクトルアナライザ等を用いることができる。また、上記計測部３は、光の左円偏光成分の強度と右の円偏光成分とを計測でき、円偏光発光のｇ値を計測できる装置であることがより好ましい。このような装置としては、例えば、日本分光（株）製のJASCO CPL-200 spectrometer等の円偏光蛍光分光計が挙げられる。
　演算部４は、計測部３から受信したスペクトル強度データのうち、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける任意の波長での強度の値で規格化するものである。
　出力部７は、演算部４により求められた、規格化した上記スペクトルを出力するものである。出力の方法としては、特には限定されず、例えば、ディスプレイに表示する方法、紙に印刷する方法、電子データを記録媒体等に出力する方法等が挙げられる。
　以上のように、本実施の形態に係る構造解析装置１０を用いることにより、本実施の形態に係る方法における照射工程、計測工程、及び演算工程を行うことができる。そして、出力部７により出力される規格化したスペクトルを用いて、本実施の形態に係る方法における上述した構造解析工程を行うことができる。
　更には、電気双極子遷移に基づく上記スペクトルに関して、その強度や、その最大発光波長、又はそのスペクトルの形状等の変化により、具体的にどのような構造変化が起こっているかについてのデータベースを作成することにより、演算部４により得られる規格化されたスペクトルに基づいて、当該データベースにアクセスする構造解析部を設けることも可能となる。この場合には、規格化した上記スペクトルのデータを上記構造解析部に出力することになる。
　尚、上述の説明では、計測部３が、測定試料１中の希土類錯体から放射された光を全て受光する場合について説明したが、これに限るものではない。例えば、測定試料１と計測部３との間に、特定の波長のみを透過させる波長選択部を別途設け、計測部３を、解析に必要な波長の光のみを受光し計測する構成としてもよい。
　上記波長選択部としては、特には限定されず従来公知の構成を採用することができ、例えば、放射された光を透過、反射、回折又は屈折させて分光させる構成が挙げられる。
　また、計測部３は、測定試料１中の希土類錯体から発光される光のスペクトルの強度を全て計測することを前提として説明したが、これに限るものではない。一部の光のスペクトルの強度のみを計測する構成であってもよい。これにより、測定時間を短縮することが可能となり、例えば、時間の経過による構造変化を解析する場合等では、測定することができる時間の間隔を短縮することができ、より高精度に構造変化を解析することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　〔発光スペクトル〕
　本実施例において、発光スペクトルは、希土類錯体を結合したタンパク質分子を蒸留水に溶解させた測定試料を、蛍光分析装置（ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｆ－４５００）を用い、励起波長を３６５ｎｍとして測定した。
　〔ＢｉｏＴ〕
　対象分子結合配位子であるＢｉｏＴは、神戸天然物化学株式会社に依頼して合成されたものを使用した。尚、ＢｉｏＴは、下記合成経路
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
により合成された。
　〔実施例１〕
　ＢＳＡ５ｍｇとＢｉｏＴ５ｍｇとを蒸留水５ｍＬ中で約１６時間４℃で攪拌して、ＢＳＡにＢｉｏＴを結合させた。当該溶液を濾過後、フリーズドライにより乾燥させた。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ測定により、得られたＢｉｏＴが結合したＢＳＡでは、ＢＳＡに４つのＢｉＯＴが結合していることが確認された。
　その後、水中で、塩化ユーロピウム水和物と室温で２４時間反応させることにより、Ｅｕ（III）を配位させ、希土類錯体が結合したＢＳＡ（ＢＳＡ＋ＢｉｏＴ＋Ｅｕ（III））を得た。尚、ＢＳＡに希土類錯体が結合していることは電気泳動により確認した。
　得られた、希土類錯体が結合したＢＳＡ（ＢＳＡ＋ＢｉｏＴ＋Ｅｕ（III））について、２０℃～８０℃の範囲で発光スペクトルを測定した。そして、得られた発光スペクトルを、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルの強度の１つである、５９３ｎｍでの線スペクトルの強度で規格化した。規格化したスペクトルを図２に示す。尚、参照用として、希土類錯体が結合したＢＳＡ（ＢＳＡ＋ＢｉｏＴ＋Ｅｕ（III））について、２０℃～８０℃でＣＤスペクトルを測定した結果を図３に示す。
　尚、図２，３における「８０℃→２０℃」は、希土類錯体が結合したＢＳＡを一度８０℃に加熱した後、２０℃に冷却したものの測定結果を示す。
　図２、３により示されるように、２０℃～４０℃の範囲での温度変化において、図３に示すＣＤスペクトルに顕著な変化が現れていないのに対して、図２に示す、規格化されたスペクトルでは、電気双極子遷移に基づく線スペクトルの強度が顕著に変化し、また最大吸収波長も変化していた。
　このことから、本発明に係る方法により、ＣＤスペクトルでは観察することが困難である分子の微細構造の変化を観察できることが確認できた。
　〔実施例２〕
　グロブリン５ｍｇとＢｉｏＴ５ｍｇとを蒸留水５ｍＬ中で約１６時間４℃で攪拌して、ＢＳＡにＢｉｏＴを結合させた。得られた溶液を濾過後、フリーズドライにより乾燥させた。その後、水中で、塩化ユーロピウム水和物と室温で２４時間反応させることにより、Ｅｕ（III）を配位させ、希土類錯体が結合したグロブリン（グロブリン＋ＢｉｏＴ＋Ｅｕ（III））を得た。
　得られた、希土類錯体が結合したグロブリンについて、室温で発光スペクトルを測定した。そして、得られた発光スペクトルを、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルの強度の１つである、５９３ｎｍでの線スペクトルの強度で規格化した。
　また、グロブリンの代わりに、フィブリン、トリプシン、インシュリンをそれぞれ用いたこと以外は上記と同様の操作を行い、各タンパク質について規格化した発光スペクトルをそれぞれ得た。その結果を図４に示す。
　図４に示されるように、タンパク質の種類によって、規格された、電気双極子遷移に基づく線スペクトルの強度及びその最大吸収波長が大きく異なっていた。このことから、本発明により、異なった構造を有するタンパク質を判別及び解析できることが確認できた。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　本発明の構造解析方法及び装置は、分子自身の微細な動的構造変化を解析することができる。このため、タンパク質等の生体分子の構造解析に好適に用いることができる。
　１　　光源
　２　　測定試料
　３　　計測部
　４　　演算部
　７　　出力部
１０　　構造解析装置

Claims (13)

  1. 　希土類錯体が結合した、構造解析の対象となる分子を含む測定試料に対して励起光を照射する光源と、
    　上記測定試料から放射された光を受光し、当該光のスペクトルの強度を計測する計測部と、
    　計測した上記スペクトルの強度のうち、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化する演算部と、
    　規格化した上記スペクトルを出力する出力部と、
    を備えていることを特徴とする構造解析装置。
  2. 　希土類錯体が結合した、構造解析の対象となる分子を含む測定試料に対して励起光を照射する光源と、
    　上記測定試料から放射された光を複数回受光し、当該各光のスペクトルの強度を計測する計測部と、
    　計測した上記各スペクトルの強度に対して、スペクトルの強度のうち、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化する演算部と、
    　規格化した上記各スペクトルを出力する出力部と、
    を備えていることを特徴とする構造解析装置。
  3. 　構造解析の対象となる上記分子には複数種類の希土類錯体が結合しており、
    　上記演算部は、計測した上記スペクトルの強度のうち、各希土類錯体に対応する電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含む各スペクトルの強度を、各希土類錯体に対応する、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での各線スペクトルの強度でそれぞれ規格化することを特徴とする請求項１又は２に記載の構造解析装置。
  4. 　上記計測部は、上記スペクトルの強度として、上記測定試料から放射された光の円偏光発光のｇ値を計測することを特徴とする請求項１～３の何れか１項に記載の構造解析装置。
  5. 　磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける上記１つの波長は、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける最大吸収波長であることを特徴とする請求項１～４の何れか１項に記載の構造解析装置。
  6. 　構造解析の対象となる上記分子がタンパク質であることを特徴とする請求項１～５の何れか１項に記載の構造解析装置。
  7. 　更に、構造解析部を備え、
    　上記演算部は、規格化した上記スペクトルを上記構造解析部へ出力し、
    　上記構造解析部は、規格化された上記スペクトルに基づいて構造解析を行うことを特徴とする請求項１～６の何れか１項に記載の構造解析装置。
  8. 　希土類錯体が結合した、構造解析の対象となる分子を含む測定試料に対して励起光を照射する照射工程と、
    　上記測定試料から放射された光を受光し、該光のスペクトルの強度を計測する計測工程と、
    　計測した上記スペクトルの強度のうち、電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含むスペクトルの強度を、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での線スペクトルの強度で規格化する演算工程と、
    　規格化した上記スペクトルにより、構造解析の対象となる上記分子の構造を解析する構造解析工程と、
    を含むことを特徴とする構造解析方法。
  9. 　構造解析の対象となる上記分子には複数種類の希土類錯体が結合しており、
    　上記演算工程では、計測した上記スペクトルの強度のうち、各希土類錯体に対応する電気双極子遷移に基づく線スペクトルを含む各スペクトルの強度を、各希土類錯体に対応する、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける１つの波長での各線スペクトルの強度でそれぞれ規格化することを特徴とする請求項８に記載の構造解析方法。
  10. 　上記計測工程では、上記スペクトルの強度として、上記測定試料から放射された光の円偏光発光のｇ値を計測することを特徴とする請求項８又は９に記載の構造解析方法。
  11. 　磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける上記１つの波長は、磁気双極子遷移に基づく線スペクトルにおける最大吸収波長であることを特徴とする請求項８～１０の何れか１項に記載の構造解析方法。
  12. 　構造解析の対象となる上記分子がタンパク質であることを特徴とする請求項８～１１の何れか１項に記載の構造解析方法。
  13. 　請求項８～１２の何れか１項に記載の構造解析方法を用いて、時間の経過による構造変化を解析することを特徴とする構造解析方法。
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