JP2002506973A - 被分析物の蛍光ランタニドキレートによる検出 - Google Patents

被分析物の蛍光ランタニドキレートによる検出

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料を蛍光ランタニド金属キレート錯体を含む指示薬分子に曝露することにより試料中の被分析物の存在、または、濃度を決定する組成物、及び、方法。 【解決手段】 試料中の被分析物の存在、または、濃度を、ランタニド金属キレート錯体中の1個若しくはそれ以上の認識要素への被分析物の結合により、錯体により放射される蛍光強度の変化を観察、及び／または、測定することにより決定する。蛍光指示薬分子は、種々の型の蛍光検出装置で使用し得、そして、エネルギー、医学及び農学を含む種々の分野で有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願についての相互参照 この出願は、1998年3月11日に出願された米国特許出願番号09/037,960号の部 分継続出願である。
【０００２】 連邦政府により後援される研究、または、開発に関する申告 適用されていない。
【０００３】 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、液体等の媒質中の被分析物(analyte)の存在、または、濃度を検出 するための指示薬分子(indicator molecule)として有用な蛍光化合物、及び、そ
のような検出を成し遂げるための方法に関する。特に、本発明は、置換された配
位子を含む蛍光ランタニド金属キレート錯体、及び、生物学的体液等の液体媒質
を含む媒質中のグルコース、若しくは、シス-ジオール化合物等の被分析物の存 在、または、濃度を検出するための指示薬分子としてのその使用に関する。
【０００４】 ２．関連技術の説明 ある種の希土類金属キレートはＵＶ光、及び、種々の形体の可視光(例えば、 青紫または青の光)の照射により、キレート化されたカチオンにより特性付られ る放射である可視光を放射する。ユーロピウム(Ｅｕ3+)、サマリウム(Ｓｍ3+)、
テルビウム(Ｔｂ3+)、及び、より少ない割合でジスプロシウム(Ｄｙ3+)及びネオ
ジム(Ｎｄ3+)等である幾つかのランタニドイオンは、特に適当な励起エネルギー
媒介有機配位子にキレート化されている場合に、イオンにより特性付けられる独
特の蛍光を示す。これら化合物の蛍光特性、即ち、長いストークス遷移、狭帯域
型の輝線、及び、非常に長い蛍光寿命は、これらの化合物を蛍光免疫、並びに、
時間分解蛍光測定技術における魅力的な候補としている。
【０００５】 これらの蛍光ランタニドキレートの主要輝線は、超高感度遷移(hypersensitiv
e transition)と呼ばれる遷移により形成され、Ｅｕ3+では約613〜615ｎｍ、Ｔ ｂ3+では545(及び490)ｎｍ、Ｓｍ3+では590及び643ｎｍ、そして、Ｄｙ3+では57
3ｎｍである(Hemmila,Application of Fluorescence in Immunoassay,140〜42(1
991年)、及び、Spectroscopy in Inorganic Chemistry,第2巻,第255〜85頁(Acad
mic Press 1971年)参照)。配位子から中央の金属イオンへの分子内エネルギー遷
移のため、有機配位子に特有の波長で放射はキレートにより一般的に吸収され、
金属イオンに特有の線スペクトルとして放射される。有機配位子はエネルギーを
吸収し、その一重項基底状態Ｓ0から、最初の一重項励起状態Ｓ1の振幅多重項の
いずれかに高められるか、または、励起され、過剰な振幅エネルギーを迅速に失
う。これについては、2つの可能性が存在する：Ｓ1〜Ｓ0遷移(配位子蛍光)によ る減退、または、三重項状態Ｔ1の1つへの項間交差である(E.P.Diamandisら、An alytical Chemistry ,62(22)1149A(1990年)；及び、Spectroscopy in Inorganic Chemistry ,第2巻,第255〜85頁(Academic Press,1971年)。
【０００６】 蛍光ユーロピウムキレートは、励起及び放射スペクトルの間で重複を生じるこ
となく、大ストークス遷移(〜290ｎｍ)を615ｎｍにおける非常に狭い(10〜ｎｍ バンド幅)放射スペクトルと共に示す。さらに、キレートの長い蛍光寿命(慣用の
発色光団についてはナノセカンドの寿命が測定されるのに対し、マイクロセカン
ドで測定可能)はノイズ、及び、他の短い蛍光寿命を有する干渉を取り除くこと を可能にする。従って、長い蛍光寿命は、キレートをマイクロセカンド時間-分 解蛍光測定で使用することを可能にし、さらに、観察されるバックグラウンドシ
グナルを減少させる。ユーロピウムキレートを用いるさらなる利点には、ユーロ
ピウムキレートが酸素により消光されないことが含まれる。
【０００７】 Ｅｕ-ジベンゾイルメチド、及び、Ｅｕ-ベンゾイルアセトネートの2つのユー ロピウム(Ｅｕ)キレートの線放射は、キレートをレーザーで用いる魅力的な候補
とした(H.Samuelsonら、J.Chem.Physics,39(1):110〜12(1963年)参照)。Samuels
onらは、上記2つのユローピウムキレートの固体として、及び、液体中の、蛍光 及び吸収について研究した。Samuelsonらは、種々の条件下におけるユーロピウ ムキレートの蛍光寿命を、他の化合物中のユローピウムの蛍光寿命と比較した。
この比較に基づいて、Samuelsonらは、ユーロピウム化合物の2つのグループ間に
おける寿命の違いは、ユーロピウムキレート内の配位子Ｅｕ相互作用の結果であ
ると示唆している。特に、Samuelsonらは、Ｅｕ-ジベンゾイルメチドからの種々
の放射線が、他のユーロピウム化合物中の蛍光寿命よりも明らかに大きい、480 ＋/−50μｓの蛍光寿命を示すことを測定した。
【０００８】 Crosbyら(J.Chem.Physics,34:743(1961年))は、ユーロピウムジベンゾイルメ チド及びユーロピウムベンゾイルアセトネートキレートを含む、希土類金属キレ
ートからのイオン放射の感光における分子内エネルギー遷移の役割について、以
前研究した。Whanら(J.Mol.Spectroscopy,8:315〜27(1962年))は、ランタニド金
属イオン(Ｅｕ3+、Ｔｂ3+、Ｄｙ3+及びＳｍ3+)グループのキレートからの放射は
、個々の希土類金属イオンに特有の輝線スペクトルにより占められていると報告
している。Whanらは、Ｅｕ3+及びＴｂ3+のベンゾイルアセトネート、並びに、ジ
ベンゾイルメチドの両方が特に明るいエミッターであり、これらのキレートの輝
線放射、及び、低収量の燐光は、これらのキレートの配位子からＥｕ3+及びＴｂ 3+ イオンへの分子内エネルギー遷移が効率的に起こることを示唆することを発見
した(Whanら、第324頁)。
【０００９】 N.Filipescuら(J.Physical.Chem.,68(11):3324(1964年))は、ユーロピウム及 びテルビウムβ-ジケトンキレートの蛍光スペクトルが、キレート内の有機配位 子部分の置換基が変えられると変化することを報告している。Filipescueらは、
置換基の性質、その位置、分子配置、及び、全体の分子内エネルギー遷移に関す
る、ユーロピウム及びテルビウムキレートの相対強度、分光分布、遷移、及び、
蛍光線の分裂について議論している。Filipescuらは、イオンの全体的な蛍光強 度特性は2つの要因に依存することを発見した：1)有機三重項において利用可能 なエネルギー量、及び、2)イオンへのエネルギー遷移の効率。
【００１０】 Filipescuらはまた、上記2つの要因が異なる置換基により変化することを見つ
けた。例えば、ユーロピウムジベンゾイルメチドキレートの、キレートのメタ位
における電子供与メトキシ基による置換は、ユーロピウムイオンによる蛍光放射
を増幅し、パラメトキシ置換は、ユーロピウム蛍光を減少させることが見つけら
れた。さらに、モノメトキシ置換ジベンゾイルメチドに比べて、ジメトキシ置換
の効果の方がより著しいものであった。それに対して、ユーロピウムのニトロ置
換ジベンゾイルメチドでは、逆の効果が観察された。パラまたはメタ位に結合さ
れた電子求引ニトロ基は、ユーロピウムの全体的なイオン放射を減少させること
が見つけられた。さらに、モノ置換ジベンゾイルメチドよりもジ置換で効果はよ
り著しかった。
【００１１】 Filipescuらはさらに、ユーロピウム パラ-フェニルジベンゾイルメチドによ り放射される強いイオン性の蛍光が、芳香系の大きさを増すことにより、ユーロ
ピウムイオンへ遷移されるエネルギー量が増幅されることを示唆することを見つ
けた。この事実は、ジベンゾイルメチドキレートよりも実質的に高いイオン放射
を有することが見つけられたナフチル置換ジケトンについて得られた放射結果に
より確認された(Filipescuら、第3328〜29頁)。
【００１２】 F.Diamandisら(Analytical Chemistry,62(22):1149A(1990年))は、ユーロピウ
ムキレートをどのように蛍光免疫分析、及び、ＤＮＡハイブリダイゼーション分
析で標識として用いることができるかを記載する。蛍光免疫分析については、著
者らは、ユーロピウムキレートを免疫学的標識として、競合または非競合分析の
両方を含む、種々の分析の設定において用いることができることを記載する。
【００１３】 米国特許第4,374,120号(Soiniら)には、蛍光ランタニドキレート錯体をマーカ
ーとして用いた物質の検出方法が記載される。米国特許第4,374,120号にはまた 、特にユーロピウム及びテルビウムのキレートである、ある種のランタニドキレ
ートの強い蛍光特性を増進させる増幅配位子としてのβ-ジケトンの使用が記載 される。
【００１４】 Wallac(Turku,Finland)は、免疫分析を行うための放射タグの代わりとなる、 以下の構造を有するランタニド金属キレートを開発した：
【化１９】 Wallac分子は、希釈溶液中で非常に効率良く振舞うことが示された(Hemmila,App lications of Fluorescence in Immunoassay ,第149頁(1991年)参照)。
【００１５】 生物学的体液等の水溶液中でランタニド金属キレートを用いるには、特定の条
件が必要とされる。例えば、キレートは、まず水溶液に溶解され、次にランタニ
ドイオンの空の配位部位を満たす傾向がある水分子で消光されないようにしなけ
ればならない。しかしながら、ホスフィン、ホスフィンオキシド、若しくは、窒
素複素環等の種々の付加物、または、ルイス酸が配位子構造に加えて、ランタニ
ドイオンの周りに「絶縁シート」を形成し、錯体の内域に水分子が浸透するのを
防ぐことにより蛍光を増幅するのに用いられてきた。例えば、水系中でのランタ
ニドの蛍光測定決定のために開発された溶液(例えば、免疫分析)は、共力作用剤
(synergistic agent)を形成する付加物としてβ-ジケトン、及び、酸化トリオク
チルホスフィン(「ＴＯＰＯ」)、並びに、ミセルを形成し対応する錯体を可溶化
するのを助ける界面活性剤(例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ１００)を含む(Application s of Fluorescence in Immunoassay ,第146〜47頁参照)。
【００１６】 ランタニド金属キレート錯体は、グルコース及び他のシス-ジオールを、キレ ート錯体中に含まれる1個若しくはそれ以上の配位子を介して検出するボロネー ト基等の独立した、特異的な認識要素の形体を用いることによる被分析物の敏活
な検出を目的として試験、または、構築されたことはない。先に議論したように
、ランタニド金属キレートは、レーザー色素、放射性同位体に代わる標識、及び
、免疫分析における標識としての抗体付着物として用いるために主として研究さ
れてきた。ランタニド金属キレートはまた、テトラサイクリンを検出する定性分
析的手法で用いられてきた。
【００１７】 グルコースは、生きた生物に不可欠の有機化合物であり、このような生物にお
ける情報伝達、エネルギー代謝、及び、構造形成に重要な役割を果たす。例えば
、グルコース、そして中でもＤ-グルコースは、種々の器官を構成する多様な細 胞において非常に重要なエネルギー源である。グルコースは肝臓では、エネルギ
ー消費により必要に応じて体液中に放出されるグリコーゲンとして蓄えられる。
グルコースの産生及び消費は、正常または健康な人間の体液中ではうまくバラン
スが取れており、体液中でのグルコース濃度は一定に保たれる。従って、血液中
または尿中のグルコースのより低いレベル、若しくは、より高いレベルの検出は
、糖尿病及び副腎機能不全等の病気の診断のための有用な情報を提供する。
【００１８】 酵素(例えば、Yellow Springs Instruments(YSI),Ohio製造)を用いたグルコー
スセンサーは、グルコースを検出するのに最も良く知られた実用的な測定器とし
て知られる。この技術は、グルコースを酵素(グルコースオキシダーゼ)で分解し
て、適当な手段(電極等により)を介して分解により産生された過酸化水素の量を
測定することを含む。この方法はよく確立されているが、生体に由来する酵素の
質は、時間と共に不可逆的に変化し、再利用のために再生することができない。
さらに、グルコースは実際に検出反応において消費されるので、低レベルの被分
析物の測定におけるグルコースセンサーの本来の能力は限られたものである。
【００１９】 ホウ素酸含有化合物が、グルコースに結合することは周知である。以下のよう
に、その機構はグルコース上の隣接した水酸基の、ボロネート部分の水酸基への
結合により起こると考えられている：
【化２０】 グルコースを含む炭水化物のフェニルホウ素酸との錯体形成は、昔から知られて
おり、その相互作用の可逆性は、糖のクロマトグラフィーによる分離の基本原理
となってきた。特に、1959年にLorand及びEdwardsは、フェニルホウ素酸の多く の飽和ポリオールとの水性会合の会合定数について報告しており、結合相互作用
は非常に弱い(例えば、エチレングリコール、Ｋd＝360ｍＭ)範囲から、中程度の
強さ(例えば、グルコース、Ｋd＝9.1ｍＭ)の範囲にわたった(J.Yoonら、Bioorga nic and Medicinal Chemistry ,1(4):267〜71(1993年)参照)。
【００２０】 米国特許第5,503,770号(Jamesら)には、グルコースを含む糖類への結合により
強い強度の蛍光を放射する蛍光ホウ素酸含有化合物が記載される。蛍光化合物は
発色光団、少なくとも1つのフェニルホウ素酸部分、及び、ホウ素酸と分子内相 互作用するよう窒素原子がフェニルホウ素酸分の付近に配置された、少なくとも
1つのアミン供与窒素原子を含む分子構造を有する。このような相互作用はそれ により、化合物が糖類の結合により蛍光を放射するようにする。米国特許第5,50
3,770号には、該化合物が糖類を検出するのに適当であると記載される(また、T.
Jamesら、J.Am.Chem.Soc.,117(35):8982〜87(1995年)も参照)。
【００２１】 さらに、アントリルホウ素酸含有化合物を用いた、血中グルコースを検出する
ための蛍光センサーが公知である。例えば、J.Yoonら(J.Am.Chem.Soc.,114:5874
〜5875(1992年))は、アントリルホウ素酸を、グルコースとフルクトースの結合 を含む炭水化物の結合を示す蛍光化学センサーとして用い得ることを記載する。
【００２２】 本発明の目的は、液体または気体等の媒質中の被分析物の存在、または、濃度
を、キレート錯体の1個またはそれ以上のキレーターへの被分析物特異的認識要 素を介した被分析物の結合により、ランタニド金属キレート錯体により放射され
る蛍光のいずれかの変化を測定することにより検出することである。
【００２３】 本発明の別の目的は、被分析物特異的認識要素含有ランタニド金属キレート錯
体を、液体等の媒質中のグルコース、若しくは、他のシス-ジオール化合物等の 被分析物の存在、または、濃度を検出するための指示薬分子として提供すること
である。
【００２４】 発明の簡単な説明 本発明は、式： Ｍ(――Ｃｈ(−ＲX))Y を有する蛍光ランタニド金属キレート錯体を含む、被分析物の存在または濃度を
検出するための指示薬分子に関する。式中、Ｍはランタニド金属イオンを表し；
Ｃｈは、配位子を含むキレーター、好ましくはβ-ジケトン、若しくは、その窒 素体アナログ、ジヒドロキシ、カルボキシ配位性複素環、エノール、大二環状ク
リプタイド(即ち、ケージ型配位子)、フェニルホスホン酸、または、ポリアミノ
-ポリカルボキシル酸のいずれか1個、若しくは、それ以上を含み得る有機配位子
を表す。Ｃｈの有機配位子はまた、窒素、硫黄の複素環、及び、結合されたカル
ボキシル基のいずれか1個またはそれ以上を含み得る。Ｃｈの有機配位子はさら に、好ましくは1〜10個の炭素原子を含むアルカン、またはアルケン基、同様に 、ベンジル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、若しくは、テトラシル基
を含む芳香族、炭素環式、または、複素環式部分のいずれか1個、若しくは、そ れ以上を含み得る。さらに、Ｍと結合された、1個またはそれ以上のキレーター は、同じもの、または、異なるキレーターの混合物(所謂、「混合配位子、また は、三成分キレート(ternary chelates)」)であってもよい。
【００２５】 Ｒは、被分析物特異的認識要素を表し、その1個またはそれ以上が、キレート 錯体の1個またはそれ以上の配位子に結合するが、キレート錯体の全ての配位子 に結合している必要はない。本発明の好ましい態様においては、Ｒは、グルコー
ス若しくは他のシス-ジオール化合物を検出するためのボロネート(boronate)基 、または、ボロネート基を含む化合物であり得る。
【００２６】 Ｘは、1以上のキレーター各々に結合した認識要素Ｒの数を表す。Ｘは0〜8ま での整数であり得、そして本発明の或る好ましい態様では、Ｘ＝0〜4、または、
Ｘ＝0〜2である。さらに、1個またはそれ以上のキレーターについてＸ＞0である
なら、1個またはそれ以上のキレーターの各々に結合した認識要素Ｒの数は同じ であっても異なっていてもよい。Ｙは、Ｍと結合したキレーターの数を表し、1 〜4までの整数であり得る。本発明の或る好ましい態様では、Ｙ＝1、Ｙ＝３また
はＹ＝４である。
【００２７】 本発明はまた、上述のように、蛍光ランタニド金属キレート錯体に関する。
【００２８】 本発明はさらに、上述の指示薬分子、及び、蛍光ランタニド金属キレート錯体
を利用した、被分析物の存在または濃度の検出方法に関する。該方法は、上で定
義した構造式を有する蛍光ランタニド金属キレート錯体を含む指示薬分子に試料
を曝露し、ランタニド金属キレート錯体により放射される蛍光のいずれかの変化
を測定し、そしてそれにより被分析物の存在または濃度を検出する工程を含む。
【００２９】 本発明では、被分析物の存在または濃度は、1個またはそれ以上の被分析物特 異的認識要素を介してのキレート錯体の1個またはそれ以上のキレーターへの被 分析物の結合によりランタニド金属キレート錯体により放射される蛍光のいずれ
かの変化を測定することにより検出される。特に、グルコース若しくは他のシス
-ジオール化合物等の被分析物の存在、または、濃度は、グルコース若しくは他 のシス-ジオール化合物の検出の場合にはボロネート含有認識要素であるキレー トの被分析物特異的認識要素への被分析物の結合により、蛍光金属イオンにより
放射される蛍光の強度または寿命の変化(即ち、蛍光の減衰、増幅、または、波 長の遷移)を観察、及び／または、測定することによる決定される。
【００３０】 本発明は、十分な長さの蛍光寿命(ナノセカンドではなくマイクロセカンドで 測定可能)、同じく長いストークス遷移を有することにより、被分析物検出の感 度を減ずる全てのバックグラウンドノイズ、及び、他の干渉をも減らし、濃度に
より消光されない蛍光指示薬分子を用いることにより、被分析物特異的方法によ
り液体若しくは気体等の媒質中で、グルコースまたは他のシス-ジオール化合物 等の被分析物を検出できるという利点を提供する。
【００３１】 図面の簡単な説明 本発明の指示薬分子の好ましい態様は、添付の図面を参照として説明する。こ
こで： 図１は、本発明のホウ素酸(boronic acid)含有ユーロピウムキレートを示す( 判りやすくするため、1つの配位子のみを示す)。 図２もまた、本発明のホウ素酸含有ユーロピウムキレートを示す。 図３は、多数のホウ素酸含有配位子を含むユーロピウムキレート錯体の、トリ
オクチルホスフィン酸(「ＴＯＰＯ」)存在下の水溶液を示す。 図４は、本発明のホウ素酸含有ユーロピウムキレートを含むエタノール溶液に
カテコールを添加した効果を示す。 図５は、ユーロピウムβ-ナフトイルトリフルオロアセテート(Ｅｕ-ｂＮＴＡ)
を含むエタノール溶液へのカテコール添加の効果を示す。 図６〜８は、Ｅｕ-ＮＴＡ-ボロネートのメタノール中のグルコースによる滴定
を示す。 図９は、ユーロピウムジベンゾイルメタン(Ｅｕ(ＤＢＭ))、及び、Ｅｕ(ホウ 素酸化ＤＢＭ)の、メタノール中のグルコース及びフルクトースによる滴定の比 較を示す。 図１０は、Ｅｕ-ＮＴＡホウ酸塩の、メタノール中のグルコースによる滴定を 示す。 図１１は、Ｅｕ-ＤＢＭホウ酸塩の、メタノール中のグルコース及びフルクト ースによる滴定を示す。 図１２は、Ｅｕ(テオニル-４-ベンゾイルメタンホウ酸)の、メタノール中のグ
ルコースおよびフルクトースによる滴定を示す。 図１３は、Ｅｕ(ベンゾイル-トリフルオロメチルアセトンホウ酸)の、メタノ ール中のグルコース及びフルクトースによる滴定を示す。
【００３２】 発明の詳細な説明 上述したように、本発明では、被分析物の存在または濃度が、指示薬分子中の
1個またはそれ以上の被分析物特異的認識要素を介して被分析物に結合した後、 蛍光指示薬分子により放射される蛍光の強度、若しくは、寿命の変化を観察、及
び／または、測定することにより決定される。蛍光指示薬分子は、式： Ｍ(――Ｃｈ(−ＲX))Y を有するランタニド金属キレート錯体を含む。式中、Ｍはランタニド金属イオン
を表し；Ｃｈは、β-ジケトン若しくはその窒素アナログ、ジヒドロキシ、カル ボキシル配位性複素環、エノール、大二環状クリプタンド(即ち、ケージ型配位 子)、フェニルホスフィン酸、シクレン(cyclen)(１,４,７,１０-テトラアザシク
ロドデカンのテトラ脂肪族カルボン酸塩またはホスホン酸塩)、または、ポリア ミノ-ポリカルボキシル酸のいずれかを1個、若しくは、それ以上含む、好ましく
は有機配位子である配位子を含むキレーターを表す。Ｃｈの有機配位子はまた、
窒素、硫黄の複素環、及び、結合されたカルボキシル基のいずれかを1個若しく はそれ以上含んでもよい。
【００３３】 Ｒは、被分析物特異的認識要素を表し、その1個またはそれ以上が、キレート 錯体の1個またはそれ以上の配位子に結合しているが、キレート錯体の全ての配 位子に結合している必要はない。本発明の好ましい態様においては、Ｒは、グル
コース、または、他のシス-ジオール、または、シス-ジオール作用性化合物を検
出するための基であり得る。このような基には、ボロネート、亜砒酸塩、及び、
ゲルマニウム酸塩、並びに、これらの基を含む化合物が含まれる。代表的なボロ
ネート含有化合物には、以下の一般的な構造を有するものが含まれる(各構造式 において、Ｒ'及びＲ''は、各々独立して、融合されたアリール、脂肪族、第一 級、第二級若しくは第三級アミン、アミド、カルボキシル、ケトン、エステル、
アルコール、または、アルデヒドであり；Ｙ及びＺは、各々、独立して脂肪族、
アルコキシ、または、アリールである)：
【化２１】 (式中、左側の構造式においてｎは0または1であり、右側の構造式において0、1 または2である)；
【化２２】 (式中、ｎは1である)；
【化２３】 (式中、ｎは0または1である)；
【化２４】 (式中、ｎは2である)；
【化２５】 (式中、ｍは0〜5であり、ｎは1または2である)；及び、
【化２６】 (式中、ｎは0または1であり、ホウ素酸及びアミン置換基は、1対として位置１及
び１０、３及び４、６及び７、７及び８、または、９及び１０に位置される)。
【００３４】 幾つかの特定のボロネート含有化合物には：
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【化３２】 が含まれる。グルコース以外のシス-ジオール被分析物化合物の例には、フルク トース及びグリセロール等の他の糖が含まれる。ドパミン、エピネフリン及びノ
ルエピネフリンなどのホルモンを含むカテコール(ｏ-ジヒドロキシベンゼン)及 びカテコールアミンは、ボロネート認識要素との反応性に関して、シス-ジオー ルに良く似た隣接した(オルト)ヒドロキシル基を含む。
【００３５】 ランタニド金属イオンＭは、ユーロピウム(Ｅｕ3+)、サマリウム(Ｓｍ3+)、テ
ルビウム(Ｔｂ3+)、ジスプロシウム(Ｄｙ3+)、またはネオジミウム(Ｎｄ3+)のも
のであり得、好ましく、ユーロピウム(Ｅｕ3+)、またはテルビウム(Ｔｂ3+)のイ
オンである。
【００３６】 キレーターＣｈの配位子はまた、好ましくは1〜10個の炭素原子を含むアルカ ンまたはアルケンの何れか1つ、または、それ以上を含む有機配位子であり得、 そして同じように、ベンジル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、若しく
は、テトラシル基を含む芳香族、炭素環式、または、複素環式部分であり得る。
配位子はまた、配位子がさらに被分析物特異的認識要素Ｒが結合され得る部分を
含む限り、望ましければ−ＣＦ3及びＣ2Ｆ5等の基を含んでもよい。さらに、キ レート錯体のいずれかの配位子は、有機でなく無機であってもよい。
【００３７】 Ｘは、1個またはそれ以上の各キレーターに結合した認識要素Ｒの数を表す。 Ｘは0〜8までの整数であり得、そして本発明の或る好ましい態様では、Ｘ＝0〜4
、または、Ｘ＝0〜2である。さらに、1個またはそれ以上のキレーターについて Ｘ＞0であるなら、1個またはそれ以上のキレーターの各々に結合した認識要素Ｒ
の数は同じであっても異なっていてもよい。Ｙは、Ｍと結合したキレーターの数
を表し、1〜4までの整数であり得る。本発明の或る好ましい態様では、Ｙ＝1、 Ｙ＝３またはＹ＝４である。
【００３８】 本発明の或る種の態様においては、キレーターの1個またはそれ以上が被分析 物特異的認識要素Ｒを含まない場合、ランタニド金属キレート錯体は異なるキレ
ーターの混合物を含んでもよい。このような、三成分配位子キレートとしても知
られる混合配位子キレートを用いる利点には、ポリアミノ-ポリカルボキシル酸 等の有機配位子が、β-ジケトン等の他の配位子と比べて水溶性であることが含 まれる。そのため、本発明の少なくとも1つの態様では、ランタニド金属キレー ト錯体は、第1に、1個またはそれ以上の被分析物特異的認識要素を含む1個また はそれ以上のβ-ジケトン、及び、第2に、ポリアミノ-ポリカルボン酸等のキレ ート錯体の水溶性を促進する、1個またはそれ以上の他の配位子を含み得る。
【００３９】 本発明の他の態様では、キレート錯体の1個またはそれ以上のキレーターはさ らに、−ＮＨ2基若しくは−ＯＨ基、または、キレート錯体がポリリシン若しく は他の固体担体等のリンカー若しくはポリマーに共有結合できるその他のいずれ
かの置換基を含み得る。
【００４０】 錯体の光吸収部分からランタニド金属イオンへのエネルギー遷移を達成するた
めに、光吸収部分の三重項エネルギーは好ましくは約230ｋJ/ｍｏｌより大きい 。好ましい光吸収部分には、フェナントリジン(258ｋＪ/ｍｏｌ)、ソラレン(262
ｋＪ/ｍｏｌ)、フェノキサジン(261ｋＪ/ｍｏｌ)、フェナントレン(258ｋＪ/ｍ ｏｌ)、トリフェニレン(280ｋＪ/ｍｏｌ)、ベンゾフェノン(287ｋＪ/ｍｏｌ)、 カルバゾール(293ｋＪ/ｍｏｌ)、及びクマリン(258ｋＪ/ｍｏｌ)が含まれる。
【００４１】 本発明のランタニド金属キレート錯体の蛍光は、1個またはそれ以上の認識要 素Ｒを介した、1個またはそれ以上のキレート錯体のキレーターへの被分析物の 結合により、被分析物特異的に変化する。
【００４２】 本発明の蛍光指示薬分子は、被分析物特異的認識要素と反応性で、それにより
特異的に検出され得る、種々の異なる可能な化学的被分析物を検出するのに用い
ることができる。本発明を用いて検出される好ましい被分析物は、グルコース、
フルクトース、及び、その他のシス-ジオール化合物等の被分析物である。しか しながら、選択する認識要素に依存し、本発明の指示薬分子はその他多くの被分
析物を検出においても有用である。例えば、以下の分子はｐＨ指示薬として有用
となる認識要素を有する(Lippitschら、Sensors and Actuators,B 38〜39(1997 年)96〜102参照)：
【化３３】 さらに次のものは、亜鉛被分析物を結合するのに使用し得る認識要素を含む、多
くの可能な化合物の1つである(例えば、Hustonら,JACS,110,4460(1988年)参照) ：
【化３４】 示されるように、亜鉛の結合はこの指示薬分子、及び、他のこれと同様に類似の
認識要素を含む指示薬分子の蛍光を増加させる。さらに次のものは、カリウム被
分析物を検出するのに使用し得る認識要素を含む、多くの可能な化合物の1つで ある(例えば、Sousaら、ACS Symposium Series,538(1992年)第10〜24頁参照)：
【化３５】 この化合物では、カリウムイオンはクラウンエーテル部分内に配位され、分子の
アニリン部分がフェナントリジン部分へと折り重なるような立体構造変化が起こ
り、蛍光が消光される。
【００４３】 本発明の指示薬分子を用いて検出可能な化学的被分析物は、種々の異なる固体
、気体、及び、液体形体で存在し得る。さらに、液体及び気体媒質の両方を含む
種々の媒質中で、本発明の指示薬分子を用いて被分析物を検出し得る。
【００４４】 本発明の蛍光化合物には、エネルギー、医薬、及び、農業の分野での指示薬分
子としての使用を含む、多数の可能な有用性が存在する。例えば、蛍光化合物は
血中または尿中のグルコースの、より低いレベル、または、より高いレベルを検
出するのに使用でき、従って、糖尿病及び副腎機能不全等の病気の診断において
有用な情報を提供する。医用／医薬のヒト治療へ適用するグルコースの産出は、
モニタリング及び管理を必要とする。本発明の農業における可能な使用には、大
豆、及び、他の農産物中のグルコース等の被分析物の量の検出が含まれる。ワイ
ン用ブドウ等の高価な産物についての重大な収穫決定では、グルコースは注意深
くモニターされなければならない。グルコースは、発酵工程で最も高価な炭素源
及び供給原料であるので、最適の反応器への供給速度調整におけるグルコースの
モニタリングは、大量アルコール生産では重要である。その製造に、国際的に最
も大量のグルコース、及び、発酵可能な(シス-ジオール)糖が消費される清涼飲 料、及び、発酵飲料の生産でも、反応器での混合、及び、グルコース濃度の調整
が品質調整に重要である。
【００４５】 本発明の蛍光化合物を使用し得る、種々の検出技術もまた公知である。例えば
、本発明の蛍光化合物は蛍光検出装置(例えば、米国特許第5,517,313号)で用い ることができ、また、視覚検査のための試験紙等のポリマー性材料に結合させ得
る。この後者の技術により、例えば、リトマス紙の一片によるｐＨの決定に類似
の方法によるグルコース測定が可能となる。本明細書中に記載される蛍光分子は
また、島津、日立、Jasco、Beckman及び、その他により製作される分光蛍光計、
または、臨床分析器等の標準的な机上分析用機器類で用いる単純な試薬として使
用され得る。これらの分子はまた、Ocean Optics(Clearwater,Florida)、または
、Oriel Opticsにより製造されるファイバーオプティックを用いたセンサー、及
び、分析蛍光器での被分析物特異的な化学的／光学シグナル変換を可能にする。
【００４６】 本発明の好ましい態様においては、その1個またはそれ以上がランタニド金属 イオンに錯体化され得る、種々の可能なキレーターは有機配位子を含み、それに
1個またはそれ以上のボロネート基が被分析物特異的認識基Ｒとして結合されて いる。それらの例が以下に示される。
【００４７】 Ａ．β-ジケトン 本発明のランタニド金属キレート錯体のキレーターＣｈは、β-ジケトンをベ ースとする配位子であり得、その例が以下に示される。
【化３６】
【００４８】 Ｂ．大二環状クリプタンド(ケージ型(cage-type)配位子) 本発明の他の態様におけるキレーターＣｈは、大二環状クリプタンド(または ケージ型配位子)であり得、その例が以下に示され、次のような形体を有する：
【化３７】
【００４９】 本発明の別の態様におけるキレーターＣｈは、以下の構造を有する大二環状(m
acrobicyclic)クリプタンドであり得る。
【化３８】
【００５０】 Ｃ．窒素複素環、及び、カルボン酸配位配位子 本発明のランタニド金属キレート錯体のキレーターＣｈの態様にはまた、以下
の窒素複素環、及び、カルボン酸配位配位子が含まれる。
【化３９】
【化４０】
【００５１】 本発明の最も好ましい蛍光であるボロネート認識要素含有ランタニドキレート
のいくつかは、以下の構造を含むユーロピウムキレート(判りやすくするため、1
個の配位子のみを持つものを示す)を含む：ユーロピウム-ｐ-ボロネートジベンゾイルメタン(II)
【化４１】 ユーロピウム ジ-ｐ-ボロネートジベンゾイルメタン(III)
【化４２】 ユーロピウム ベンゾイルエチレン メタン-２-ボロネート(IV)
【化４３】
【００５２】 本発明の好ましい態様では、グルコースまたは他のシス-ジオール化合物に被 分析物特異的であるホウ酸酸塩含有認識要素を、蛍光ユーロピウム(テトラキス)
β-ナフトイルトリフルオロアセテート(Ｅｕ-ｂＮＴＡ)キレートに結合した。キ
レートの有機配位子部分は、以下に描かれるようにランタニド金属イオン(例え ば、ユーロピウム)の周りに殻を形成することが公知であった：
【化４４】
【００５３】 さらに、ランタニド金属イオンの蛍光消失時間に種々の溶媒が影響する(例え ば、水はユーロピウムイオンの蛍光を消失させる)ことがまた公知であった。従 って、外殻の有機配位子の被分析物特異的認識要素(例えば、ボロネート含有認 識要素)による変更が、ユーロピウムイオンの消失時間を、著しく不安定にする かどうかが研究された。以下のユーロピウムキレートである、ユーロピウム(テ トラキス)ナフトイルトリフルオロメタン(Ｅｕ-ｂＮＴＡ)ボロネートを合成し、
試験した。
【化４５】
【００５４】 Ｅｕ-ｂＮＴＡは、約340ｎｍの励起波長、及び、他のユーロピウムキレートと
同じ約613ｎｍの放射波長を有することが見つけられた。
【００５５】 グルコースを含むシス-ジオールの検出に好ましい他の化合物には、以下のも のが含まれる。
【化４６】
【化４７】
【化４８】
【化４９】
【化５０】
【化５１】
【化５２】
【化５３】
【００５６】 図４〜５に示されるように、本発明の利点をカテコール(ｏ-ジヒドロキシベン
ゼン)の、エタノール溶液中のＥｕ-ｂＮＴＡの蛍光強度、及び、寿命の両方に対
する効果を測定する好ましい態様により明らかにした。カテコールをＥｕ-ｂＮ ＴＡの存在下でエタノール溶液に添加した後で検出、及び、測定された蛍光強度
の変化を図５に示す。ボロネート含有認識要素を含まないＥｕ-ｂＮＴＡの蛍光 寿命は362μｓ±1μｓであったのに対し、Ｅｕ-ｂＮＴＡボロネートの蛍光寿命 は270μｓ±4μｓに減った。Ｅｕ-ｂＮＴＡボロネートをカテコールに曝露した 後、分子の蛍光寿命はさらに209μｓ±15μｓに減った。
【００５７】 カテコールのＥｕ-ｂＮＴＡボロネートの蛍光強度、及び、寿命への影響も水 中で測定し、キレートのユーロピウムイオンの蛍光を消光することが示された。
その後、トリオクチルホスフィン(「ＴＯＰＯ」)を、ユーロピウムキレート錯体
の内殻上に位置する配位部位を水の消光効果から保護するために添加した。ＴＯ
ＰＯのＥｕ-ｂＮＴＡボロネートを含む水溶液への添加を図３に示す。
【００５８】 Ｅｕ-ＮＴＡボロネートはまた、メタノール中のグルコースの存在を検出する 能力も有していた。特に、Ｅｕ-ＮＴＡボロネートによるグルコース滴定をメタ ノール中で行った。グルコース滴定により得られたデータを図６〜８に示す。図
６には、グルコースを濃度の増加に対するＥｕ-ＮＴＡボロネート滴定を示す。 図７には、図６に示される低い範囲のデータの拡大を示す。図７に示される結果
は、Ｅｕ-ＮＴＡボロネートが、およそ4.7ｍＭｏｌの通常の生理的レベル以下の
濃度におけるグルコースの存在を検出できることを明らかにする。図７中に表示
されるデータより、グルコース濃度の違いは、約0.5ｍＭｏｌより少ない生理的 範囲内で区別できることが示される。図７には、その.001ｍＭｏｌグルコースよ
り下のデータ点がきわめて接近しているため、Ｅｕ-ｂＮＴＡボロネートのグル コース濃度変化に対する低い方の側の感度が示されないが、図８には、図７の低
範囲部分が、グルコース濃度対Ｉ／Ｉの半対数プロットとして表示される。
【００５９】 図９には、ユーロピウムジベンゾイルメタン(Ｅｕ(ＤＢＭ))及びＥｕ(ホウ素 酸塩化ＤＢＭ)を別々に、メタノール中のグルコース、及び、フルクトースで滴 定した結果を示す。特に、グルコース及びフルクトースの濃度は、.0005、.005 、.05、1、5、10及び20ｍＭとした。図９中のグルコースＢ及びフルクトースＢ について表示されたデータは、Ｅｕ(ホウ素酸塩化ＤＢＭ)についてのグルコース
、及び、フルクトースの滴定を表す。図９の結果から、ホウ素酸塩化されたユー
ロピウムジベンゾイルメタンの蛍光強度が、約0.01ｍＭより多い濃度のグルコー
ス及びフルクトースに曝された場合、明らかに増加するのに対し、非ホウ素酸塩
化Ｅｕ(ＤＢＭ)では、グルコース及びフルクトースの添加により明らかな程には
変化しないことが明らかである。特異的な認識要素(例えば、ボロネート)なしで
は、ランタニド金属キレート錯体は、グルコース、フルクトースまたはその他の
シス-ジオール化合物に対して反応しない。よって、本実施例ではボロネート基 である被分析物特異的認識要素を含む本発明のランタニド金属錯体は、グルコー
ス、フルクトース及びその他のシス-ジオール化合物の存在に対して感度を有し 、従って、このような及び他の被分析物の存在、または、濃度を検出するのに利
用され得る。
【００６０】 図１０〜１３はさらに、本発明のランタニド金属キレート錯体の、試料中のグ
ルコース及び／若しくはフルクトースの存在または濃度を検出する能力を明らか
にする。
【００６１】 上述のように、本発明の蛍光指示薬分子は、多くの異なる型の蛍光センサーで
用いることができる。蛍光指示薬分子は、センサー中で、生物学的体液、特には
ヒトの体液である液体試料を含む液体試料等の中の、グルコースまたは他のシス
-ジオール化合物の存在、または、濃度を検出するのに用いることができる。例 えば、本発明に関する蛍光指示薬分子は、グルコースまたは他のシス-ジオール 化合物を透過できるポリマーマトリックスに分散され得る。液体媒質等の媒質中
のグルコース、若しくは、他のシス-ジオール化合物の存在または濃度は、その 後、グルコース若しくは他のシス-ジオール化合物への、1個若しくはそれ以上の
ボロネート含有認識要素を介した結合後、指示薬分子から放射される蛍光の強度
または寿命の変化を測定することにより決定され得る。
【００６２】 米国特許第5,517,313号には、本発明の蛍光指示薬分子を、液体媒質中のグル コース、または、他のシス-ジオール化合物等の被分析物の存在または濃度を決 定するのに用い得る蛍光検出装置が記載されている。該特許の開示は、本明細書
の一部を構成する。検出装置は、蛍光指示薬分子含有マトリックス(以下、「蛍 光マトリックス」と呼ぶ)の層状アレイ、高域濾波器、及び、光検出器を含む。 この装置では、好ましくは光放射ダイオード(「ＬＥＤ」)である光源が、少なく
とも部分的に指示薬材料内に位置され、光源からの入射光により指示薬分子が蛍
光を発するようにされる。高域濾波器は、放射された光が光検出器に達し、光源
からの散乱された入射光を除くようにする。
【００６３】 米国特許第5,517,313号に記載される装置で採用されている指示薬分子の蛍光 は、グルコースまたは他のシス-ジオール化合物等の被分析物の局在により、例 えば、減衰または増幅等の変調を受ける。
【００６４】 米国特許第5,517,313号に記載のセンサーでは、指示薬分子を含む材料は、被 分析物を透過できるものである。従って、被分析物は周りの試験媒質から材料中
に拡散することができ、それにより指示薬分子より放射される蛍光に影響する。
光源、指示薬分子含有材料、高域濾波器、及び、光検出器は、指示薬分子から放
射された蛍光の少なくとも一部分が光検出器に影響を与え、取り巻く媒質中の被
分析物(例えば、グルコース)の濃度を示す電気的シグナルを生じるように、作ら
れている。
【００６５】 本発明の蛍光指示薬分子を用いた他の態様に関して、共に出願中の米国特許出
願第08/855,234号、第08/855,235号、及び、第08/855,236号にも蛍光検出装置が
記載される。これら全てが、本明細書中の一部を構成する。
【００６６】 本発明の蛍光指示薬分子は、当業者により、過度な実験をすることなく、以下
に記載の一般的製造法と整合する、公知の反応機構及び試薬を用いて製造され得
る。
【００６７】 ホウ素酸塩化ユーロピウム テトラキス β-ジケトン錯体の製造法 １．Frontier Scientific(Logan,Utah)から入手可能なナフタレン-１-ホウ素酸 をトルエンに溶解する。
【００６８】 ２．以下に示されるように、ホウ素酸を最初に２,２-ジメチル-１,３-プロパン ジオール(Aldrich Chemical Company)と反応させることにより保護(キャップ化)
し、Dean-Starkトラップを用いて共沸により水を除き、２,２-ジメチルプロパン
-１,３-ジイル １-ナフチルボロネートを得る：
【化５４】
【００６９】 ３．キャップ化されたホウ素酸を、その後フリーデル-クラフツ反応により、ホ ウ素酸を、無水酢酸及び三塩化アルミニウムと無水二硫化炭素と反応させること
によりアシル化し、２,２-ジメチルプロパン-１,３-ジイル ５-アセチル-１-ナ フチルボロネートを製造する。典型的には、およそ70％収量の反応生成物が、粘
性の液体として以下のように得られる：
【化５５】
【００７０】 ４．以下のように、その後β-ジケトンを形成し得、ボロネートを、(３)トリフ ルオロ酢酸エチル(Aldrich)との間で、ナトリウムメトキシド(乾燥エーテル中) を縮合剤として用いて、クライゼン縮合により脱キャップ化することができる：
【化５６】
【００７１】 ５．その後、中間生成物(４)である５-ナフトイル-トリフルオロアセトンホウ素
酸を塩化メチレンに溶出することにより、予備シリカゲルＴＬＣにより精製する
ことができる。少なくとも1つの調製において、第3の溶出バンド(Ｒｆ＝0.70〜0
.85)をプレートから回収し、400ＭＨｚのプロトンＮＭＲにより分析した。ＮＭ Ｒスペクトルは、β-ジケトンのエノール形体に特有のパターンを示し、特に、 シグマ6.69(単一)、及び、シグマ15.28(単一の広がった)にピークを示した。
【００７２】 ６．以下のように、被分析物特異的認識要素としてボロネート基を含む最終ユー
ロピウムテトラキス指示薬錯体を、β-ジケトン(４)を、ユーロピウムトリクロ ライドヘキサハイドレート(Aldrich)、及び、ピペリジンと無水エタノール中で 反応させることにより製造した：
【化５７】
【００７３】 その後、溶液を70℃に3時間加熱する。加熱後、得られた溶液は、手持ち長波 ＵＶ源の照射により、特有のオレンジ-赤の放射を示した。さらに、島津製蛍光 計による蛍光走査により、340ナノメーターの波長におけるピーク励起、及び、 ユーロピウム錯体に特有の613ナノメーターのピーク放射波長が見られた。
【００７４】 本発明で有用な化合物を製造するその他の合成方法が以下に示される。
【化５８】
【化５９】
【化６０】
【化６１】
【化６２】
【化６３】
【化６４】
【化６５】
【化６６】
【化６７】
【化６８】
【００７５】 上述の合成反応式の局面に関するその他の詳細については以下の文献を参照。
これらの文献の内容は、本明細書の一部を構成する： １． Walls,L.P.、JCS(1934年)104〜109 ２． Reese,C.B.、JCS(1958年)895〜901 ３． Muth,C.W.ら、J.Medicinal Chem.(1973年)第16巻第3号、1973 ４． Badger,G.M.ら、J.C.S.(1951年)3207〜3211 ５． Ishiyama,T.ら、J.Org.Chem.(1995年)60,7508〜7510 ６． Forrester,A.R.ら、J.C.S.Perlin I,612〜615 ７． Petterson,R.C.ら、J.Org.Chem.(1974年)第39巻第13号,1841〜1845 ８． Nagarajan,K.ら、Indian Journal of Chemistry,第11巻(1974年2月)112〜
114 ９． Hollingsworth,B.L.ら、J.Chem.Soc.(1961年)3771〜3773 １０．Finkelstein,J.ら、J.Amer.Chem.Soc.(1951年)第73巻,302〜304 １１．Parker,D.ら、J.Chem.Soc.,Chem.Commun.(1997年)1777〜78 １２．Stille,J.K.ら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(1986年)第25巻,508〜524 １３．Sherry,A.D.ら、Inorganica Chimica Acta(1987年)第139巻,137〜139 １４．Bansal,N.ら、J.Magnetic resonance Imaging(1992年)第2巻,385〜391 １５．Sherry,A.D.ら、J.Magnetic Resonance(1988年)第76巻,528〜533
【００７６】 本発明は、さらなる理解のため、以下の実施例により説明される。
【００７７】 実施例Ｉ グルコース及びフルクトースのＥｕ(４-ジベンゾイルメタンホウ素酸) による検出 25μｌの6.5ｍＭ Ｅｕ(４-ジベンゾイルメタンホウ素酸)4ＰｙＣｌを、525μ ｌのメタノールに添加し、ヴォルテックスにかけた。メタノール中の貯蔵液(4μ
Ｍ、400μＭ、4ｍＭ及び40ｍＭ)から、グルコース及びフルクトースの試料を別 々に、2つの糖各々について、0.5μＭ、5μＭ、50μＭ、1ｍＭ、5ｍＭ、10ｍＭ 、及び、20ｍＭの濃度で調製した。図９に示される結果は、Ｅｕキレート錯体を
必要とされる365ｎｍの励起波長で励起した後に、Ｅｕキレート錯体の613ｎｍの
蛍光放射強度が、別々のグルコース及びフルクトースの試料各々についてモニタ
ーされた。
【００７８】 実施例II ユーロピウム テトラキス-５-ナフトイル- トリフルオロアセトンホウ素酸の合成 Ｉ．２,２-ジメチルプロパン-１,３-ジイル-１-ナフチルボロネート(１)の製造 前駆物質のボロネート基は、ユーロピウムキレート錯体の合成に伴う反応条件
により起こる、いずれかの潜在的な逆効果からも、以下の方法によって保護され
る： Dean-Starkトラップを28時間用いて水を共沸により除きながら、ナフタレン- １-ホウ素酸(15.2グラム、0.0884モル)、及び、２,２-ジメチル-１,３-プロパン
ジオール(10.0グラム、0.0960モル、1.1当量)を、トルエン(200ｍｌ)中で還流し
た。その後、トルエンを単純に蒸留により蒸発させ、続いて、吸引加圧蒸留しな
がら、約80℃の温度に達するまで2時間加熱した。その後、未反応２,２-ジメチ ル-１,３-プロパンジオールを真空下(0.5ｍｍ)で除去しながら、60℃で1時間加 熱する。２,２-ジメチルプロパン-１,３-ジイル-１-ナフチルボロネートの白色 固体(20.94グラム、純度99％)を得た。 生成物を1Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3,400ＭＨｚ)で確認した。
【００７９】 II．フリーデル-クラフツアシル化：２,２-ジメチルプロパン-１,３-ジイル-５-
アセチル-１-ナフチルボロネート(２)の製造 以下の工程に従って、前駆物質の芳香族構造にアセチル基を、ジケトンを形成
するために導入した： ２,２-ジメチルプロパン-１,３-ジイル-１-ナフチルボロネート(１)(21.0グラ
ム,0.0878モル)を、氷水浴中の250ｍｌの丸底フラスコ中で攪拌しながら、150ｍ
ｌの乾燥二硫化炭素に溶解した。アルミニウムトリクロライド(28.7グラム,0.21
5モル)を分けて、2時間にわたって添加した。その後、混合物を攪拌し、1時間に
わたって、ゆっくりと室温まで温めた。粘着性の、濃い色の半固体がフラスコの
内部に沈澱しているのが見られた。混合物を再び氷水浴中で冷却した後、フラス
コに還流凝縮器を加えた。その後、無水酢酸(8.93グラム、0.0875モル)を2時間 にわたって添加した。その後、反応を開始するために、混合物を40℃に温めた。
無水酢酸の添加時、反応の間に起こり得るいずれかの発熱反応を調節するため、
反応混合物を時折かきまわす(手回しにより)必要があった。
【００８０】 2時間、反応混合物を室温で放置した後、混合物を1時間かけてゆっくりと50℃
に加熱し、その温度で3時間保った。濃い色の固体が反応混合物中で形成するの が観察された。
【００８１】 その後、800ｍｌの氷水、15ｍｌの濃塩酸、及び、250ｍｌの塩化メチレンを、
反応混合物をはっきりとした2層に分解、及び、抽出するために用いた。その後 、底部の有機層を回収し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で80℃で3時間蒸 発させ、19.39ｇのジメチルプロパン-１,３-ジイル-５-アセチル-１-ナフチルボ
ロネート(2)を半固体形体の、78％の収量で得た。
【００８２】 III．クライゼン縮合：５-ナフトイル-トリフルオロアセトンホウ素酸(３)の製 造 以下のように、β-ジケトン配位子を形成した： 水素化ナトリウムの混合物を、10ｍｌの乾燥エーテル中の2ｍｌのメタノール(
0.313グラム、0.01302モル)と反応させた。得られた溶液を減圧下、100℃で2時 間乾燥し、固体形体のナトリウムメトキシドを得た。その後、ナトリウムメトキ
シドを45ｍｌの乾燥エーテルで処置し、氷水浴中で冷却した。その後、トリフル
オロ酢酸エチル(1.763グラム、0.0124モル)を添加し、10分後に、20ｍｌの乾燥 エーテル中のジメチルプロパン-１,３-ジイル-５-アセチル-１-ナフチルボロネ ート(２)(3.50グラム、0.0124モル)の溶液を、さらに10分間かけて適下により添
加した。その後、混合物を室温で30分間攪拌し、70時間還流するまで加熱した。
混合物を氷水浴中で攪拌しながら、25ｍｌの水、及び、8ｍｌの10％塩酸を、水 層をｐＨ1まで酸性化するために添加した。フラスコ内にはっきりとした2層が生
じた。
【００８３】 その後、エーテルを含んだ最上層を回収し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そし
て、減圧下、60℃で1時間蒸発させ、β-ジケトンを濃い色の液体形体(4.36グラ ム)として得た。得られたβ-ジケトンを、予備(preparative)シリカゲルＴＬＣ で塩化メチレンにより抽出することにより精製した。3番目のバンド(Ｒｆ＝0.70
〜0.85)をＴＬＣプレートから、収量25％の５-ナフトイル-トリフルオロアセト ンホウ素酸(３)(1.20グラム)を回収した。
【００８４】 生成物をプロトンＮＭＲ(400ＭＨｚ)スペクトルで、シグマ6.69(単一)及びシ グマ15.28(単一で広がっている)にピークを有するβ-ジケトンのエノール形体に
特有のパターンを持つことにより確認した。
【００８５】 IV．キレート化／錯体化：ユーロピウム-(β-ジケトンホウ素酸)テトラキス錯体
(４)の形成 その後、以下のように、蛍光指示薬分子として用いるランタニドキレート錯体
を製造した： 0.5ｍｌの無水エタノール中のユーロピウムトリクロライドヘキサハイドレー ト(0.7ｍｇ、0.0019ミリモル)の溶液を、0.5ｍｌの無水エタノール中の５-ナフ トイル-トリフルオロアセトンホウ素酸(３)(2.2ｍｇ、.0058ミリモル)、及び、 ピペリジン(130ｍｇ)に添加した。この混合物を2時間にわたって、ゆっくりと70
℃に加熱し、その温度にさらに3時間保ち、ユーロピウムテトラキス錯体(４)を 形成した。
【００８６】 得られた溶液は、手持ち長波ＵＶ源の照射により特有のオレンジ-赤の放射を 示した。さらに、島津製蛍光計により測定された蛍光スペクトルは、340ナノメ ーターの波長でピーク励起を示し、613ｎｍのユーロピウムキレート錯体に特有 の放射パターンを示した。
【００８７】 本発明を、或る好ましい態様に関連して説明してきた。当業者であれば、本発
明の範囲内で変更、及び、改良し得ることを認識する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のホウ素酸含有ユーロピウムキレートを示す(判りやすく するため1つの配位子のみを示す)。
【図２】 本発明のホウ素酸含有ユーロピウムキレートを示す。
【図３】 多数のホウ素酸含有配位子を含むユーロピウムキレート錯体の、
トリオクチルホスフィン酸(「ＴＯＰＯ」)存在下の水溶液を示す。
【図４】 カテコールを本発明のホウ素酸含有ユーロピウムキレートを含む
エタノール溶液に添加した効果を示す。
【図５】 ユーロピウムβ-ナフトイルトリフルオロアセテート(Ｅｕ-ｂＮ ＴＡ)を含むエタノール溶液へのカテコール添加の効果を示す。
【図６】 Ｅｕ-ＮＴＡ-ボロネートのメタノール中のグルコースによる滴定
を示す。
【図７】 Ｅｕ-ＮＴＡ-ボロネートのメタノール中のグルコースによる滴定
を示す。
【図８】 Ｅｕ-ＮＴＡ-ボロネートのメタノール中のグルコースによる滴定
を示す。
【図９】 ユーロピウムジベンゾイルメタン(Ｅｕ(ＤＢＭ))、及び、Ｅｕ( ホウ素酸化の、メタノール中のグルコース及びフルクトースによる滴定の比較を
示す。
【図１０】 Ｅｕ-ＮＴＡホウ酸塩の、メタノール中のグルコースによる滴 定を示す。
【図１１】 Ｅｕ-ＤＢＭホウ酸塩の、メタノール中のグルコース及びフル クトースによる滴定を示す。
【図１２】 Ｅｕ(テオニル-４-ベンゾイルメタンホウ酸)の、メタノール中
のグルコースおよびフルクトースによる滴定を示す。
【図１３】 Ｅｕ(ベンゾイル-トリフルオロメチルアセトンホウ酸)の、メ タノール中のグルコース及びフルクトースによる滴定を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ジョージ・ワイ・ダニロフ アメリカ合衆国20878メリーランド州ノー ス・ポトマック、ボニー・デイル・ドライ ブ13401番 (72)発明者 デイビッド・パーカー イギリス、ディエイチ１・４キューエル、 ダーラム、クレイ・レイン、ビーチ・ハウ ス (72)発明者 アーサー・イー・コルビン アメリカ合衆国21771メリーランド州マウ ント・エアリー、ボルチモア・ナショナ ル・パイク4155番 (72)発明者 アリストル・ジー・カリブレテノス アメリカ合衆国21045メリーランド州コロ ンビア、ラスティング・ライト・ウェイ 7106番 Ｆターム(参考） 2G045 DA30 DA31 FB08 FB11 2G054 AA10 CA25 CE02 EA03 GA04 4H048 AA03 AB81 VA20 VA30 VA32 VA75 VB10

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 被分析物の存在、または、濃度を検出するための指示薬分子
    であって、式： Ｍ(――Ｃｈ(−ＲX))Y (式中、Ｍはランタニド金属イオンであり；Ｃｈは配位子を含むキレーターであ り；Ｒは、被分析物特異的認識要素であり；そして、Ｘは、各キレーターに結合
    した認識要素Ｒの数を表し；Ｘ＝0〜4であり、Ｙ＝1〜4であり；1個またはそれ 以上のキレーターにつちえＸ＞0であるなら、認識要素Ｒの数は同じか、または 、異なる) を有し、被分析物の存在または濃度が、錯体の1個若しくはそれ以上のキレータ ーへの認識要素を介した被分析物の結合により、ランタニド金属キレート錯体か
    ら放射される蛍光のいずれかの変化を測定することにより検出される、蛍光ラン
    タニド金属キレート錯体を含む指示薬分子。
  2. 【請求項２】 ランタニド金属キレート錯体のＭが、ユーロピウムイオンま
    たはテルビウムイオンである、請求項１に記載の指示薬分子。
  3. 【請求項３】 1個若しくはそれ以上のキレーターの配位子が、β-ジケトン
    またはその窒素体アナログ、ジヒドロキシ、カルボキシル配位性複素環、エノー
    ル、大二環状クリプタンド、ポリアミノ-ポリカルボキシル酸、フェニルホスホ ン酸、1〜10個の炭素原子を含むアルカンまたはアルケン基、芳香族部分、炭素 環式部分、及び、複素環式部分のいずれか1個、若しくは、それ以上を含む有機 配位子である、請求項２に記載の指示薬分子。
  4. 【請求項４】 1個またはそれ以上のキレーターの配位子が、β-ジケトン及
    びシクレン(cyclen)からなる群より選択される部分を含む、請求項３に記載の指
    示薬分子。
  5. 【請求項５】 ランタニド金属キレート錯体の認識要素Ｒが、ボロネート、
    亜砒酸塩、または、ゲルマニウム酸塩の基を含み、被分析物がグルコースである
    、請求項４に記載の指示薬分子。
  6. 【請求項６】 1個またはそれ以上のキレーターがさらに、キレート錯体を 固体担体に結合されるための置換基を含む、請求項１に記載の指示薬分子。
  7. 【請求項７】 キレート錯体を固体担体に結合させるための置換基が、カル
    ボキシル基、−ＮＨ2基、または−ＯＨ基である、請求項６に記載の指示薬分子 。
  8. 【請求項８】 認識要素が、 【化１】 (式中、ｎは、右の構造式中で0、1または2であり、左の構造式中で0または1であ
    る)； 【化２】 (式中、ｎは1である)； 【化３】 (式中、ｎは0または1である)； 【化４】 (式中、ｎは2である)； 【化５】 (式中、ｍは0〜5であり、ｎは1または2である)；及び、 【化６】 (式中、ｎは0または1であり、ホウ素酸及びアミン置換基が、一対として位置1及
    び10、3及び4、6及び7、7及び8、または、9及び10に位置する) からなる群、または、その誘導体より選択され、全ての構造式において、当ては
    まる場合には、Ｒ'及びＲ''が各々、独立して融合されたアリール、脂肪族、第 一級、第二級若しくは第三級アミン、アミド、カルボキシル、ケトン、エステル
    、アルコール、または、アルデヒドであり、そして、Ｙ及びＺは、各々独立して
    脂肪族、アルコキシまたはアリールである、請求項１に記載の指示薬分子。
  9. 【請求項９】 被分析物の存在、または、濃度を検出するための蛍光ランタ
    ニド金属キレート錯体であって、式： Ｍ(――Ｃｈ(−ＲX))Y (式中、Ｍはランタニド金属イオンであり；Ｃｈは配位子を含むキレーターであ り；Ｒは、被分析物特異的認識要素であり；そして、Ｘは、各キレーターに結合
    した認識要素Ｒの数を表し；Ｘ＝0〜4であり、Ｙ＝1〜4であり；1個またはそれ 以上のキレーターについてＸ＞0であるなら、認識要素Ｒの数は同じか、または 、異なる) そして、被分析物の存在または濃度が、錯体の1個若しくはそれ以上のキレータ ーへの認識要素を介した被分析物の結合により、ランタニド金属キレート錯体か
    ら放射される蛍光のいずれかの変化を測定することにより検出される錯体。
  10. 【請求項１０】 Ｍがユーロピウムイオン、または、テルビウムイオンであ
    る、請求項９に記載の蛍光ランタニド金属キレート錯体。
  11. 【請求項１１】 1個若しくはそれ以上のキレーターの配位子が、β-ジケト
    ンまたはその窒素体アナログ、ジヒドロキシ、カルボキシル配位性複素環、エノ
    ール、大二環状クリプタンド、ポリアミノ-ポリカルボキシル酸、フェニルホス ホン酸、1〜10個の炭素を含むアルカンまたはアルケン基、芳香族部分、炭素環 式部分、及び、複素環式部分のいずれか1個、若しくは、それ以上を含む有機配 位子である、請求項１０に記載の蛍光ランタニド金属キレート錯体。
  12. 【請求項１２】 1個若しくはそれ以上のキレーターの配位子が、β-ジケト
    ン、または、シクレンを含む、請求項１１に記載の蛍光ランタニド金属キレート
    錯体。
  13. 【請求項１３】 ランタニド金属キレート錯体の認識要素Ｒが、ボロネート
    、亜砒酸塩、または、ゲルマニウム酸塩の基を含み、被分析物がグルコースであ
    る、請求項１２に記載の蛍光ランタニド金属キレート錯体。
  14. 【請求項１４】 認識要素が： 【化７】 (式中、ｎは、右の構造式中で0、1または2であり、左の構造式中で0または1であ
    る)； 【化８】 (式中、ｎは1である)； 【化９】 (式中、ｎは0または1である)； 【化１０】 (式中、ｎは2である)； 【化１１】 (式中、ｍは0〜5であり、ｎは1または2である)；及び、 【化１２】 (式中、ｎは0または1であり、ホウ素酸及びアミン置換基が、一対として位置1及
    び10、3及び4、6及び7、7及び8、または、9及び10に位置する) からなる群、または、その誘導体より選択され、全ての構造式において、当ては
    まる場合には、Ｒ'及びＲ''が各々、独立して融合されたアリール、脂肪族、第 一級、第二級若しくは第三級アミン、アミド、カルボキシル、ケトン、エステル
    、アルコール、またはアルデヒドであり、Ｙ及びＺは、各々独立して脂肪族、ア
    ルコキシまたはアリールである、請求項９に記載の蛍光ランタニド金属キレート
    錯体。
  15. 【請求項１５】 以下の工程を含む、試料中の被分析物の存在、または、濃
    度を検出するための方法： ａ)試料を式： Ｍ(――Ｃｈ(−ＲX))Y (式中、Ｍはランタニド金属イオンであり；Ｃｈは配位子を含むキレーターであ り；Ｒは、被分析物特異的認識要素であり；そして、Ｘは、各キレーターに結合
    した認識要素Ｒの数を表し；Ｘ＝0〜4であり、Ｙ＝1〜4であり；1またはそれ以 上のキレーターについてＸ＞0であるなら、認識要素Ｒの数は同じか、または、 異なる) の蛍光ランタニド金属キレート錯体を含む指示薬分子に暴露する工程、 ｂ)錯体の1個若しくはそれ以上のキレーターへの、被分析物特異的認識要素を
    介した被分析物の結合により、ランタニド金属キレート錯体より放出される蛍光
    のいずれかの変化を測定し、それにより被分析物の存在、または、濃度を検出す
    る工程。
  16. 【請求項１６】 ランタニド金属キレート錯体のＭが、ユーロピウムイオン
    、または、テルビウムイオンである、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ランタニド金属キレート錯体の1個若しくはそれ以上のキ レーターの配位子が、β-ジケトンまたはその窒素体アナログ、ジヒドロキシ、 カルボキシル配位性複素環、大二環状クリプタンド、ポリアミノ-ポリカルボキ シル酸、エノール、フェニルホスホン酸、1〜10個の炭素を含むアルカンまたは アルケン基、芳香族部分、炭素環式部分、及び、複素環式部分のいずれか1個、 若しくは、それ以上を含む有機配位子である、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 1個またはそれ以上のキレーターの配位子が、β-ジケトン
    またはシクレンを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ランタニド金属キレート錯体の認識要素Ｒが、ボロネート
    基、亜砒酸塩基、または、ゲルマニウム酸塩の基を含み、被分析物がグルコース
    である、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 認識要素が： 【化１３】 (式中、ｎは、右の構造式中で0、1または2であり、左の構造式中で0または1であ
    る)； 【化１４】 (式中、ｎは1である)； 【化１５】 (式中、ｎは0または1である)； 【化１６】 (式中、ｎは2である)； 【化１７】 (式中、ｍは0〜5であり、ｎは1または2である)；及び、 【化１８】 (式中、ｎは0または1であり、ホウ素酸及びアミン置換基が、一対として位置1及
    び10、3及び4、6及び7、7及び8、または、9及び10に位置する) からなる群、または、その誘導体より選択され、全ての構造式において、当ては
    まる場合には、Ｒ'及びＲ''が各々、独立して融合されたアリール、脂肪族、第 一級、第二級若しくは第三級アミン、アミド、カルボキシル、ケトン、エステル
    、アルコール、またはアルデヒドであり、Ｙ及びＺは、各々独立して脂肪族、ア
    ルコキシまたはアリールである、請求項１５に記載の方法。
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