JP4748791B2 - 蛍光性ランタニド錯体 - Google Patents
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Description
【技術分野】
【０００１】
この発明は、２−キノリノール置換体とランタニドイオンとから成る新規な錯体に関し、より詳細には、光誘起電子移動（ＰＥＴ）により蛍光強度を制御できる長寿命蛍光性の２−キノリノール置換体とランタニドイオンとから成る新規な錯体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光性ランタニド錯体は長い蛍光寿命、鋭い蛍光スペクトル、大きいストークスシフトなど通常の蛍光性有機化合物とは大きく異なる蛍光特性を持つことが知られている（Richardson,F.S.; Chem.Rev. 1982, 82, 541-552.； 足立吟也 「希土類物語 先端材料の魔術師」産業図書； 足立吟也「希土類の化学」化学同人）。この蛍光の特徴を利用し、時間分解測定でその蛍光を測定することで、蛍光寿命の短い他の有機化合物の蛍光や励起散乱光を排除し、ランタニド錯体から発する蛍光のみを特異的に検出することができる。このため測定系のバックグラウンドの蛍光を抑えることが可能となるため、通常の有機化合物の蛍光を用いた蛍光検出系と比較し、Ｓ／Ｎ比の高い高感度な検出が可能となる。これまで、標識化試薬として様々な蛍光性ランタニド錯体が開発され、時間分解イムノアッセイや時間分解ＤＮＡハイブリダイゼーションにおいて用いられ、その検出感度の増大が報告されている（非特許文献１〜３）。このような特徴を持つ蛍光性ランタニド錯体の蛍光を制御することにより、分析対象物を高感度に感知することのできるプローブの開発が可能となる。
【０００３】
近年、蛍光性ランタニド錯体自身をセンサーとして利用する試みが行われ、分析対象物の有無により蛍光特性の変化するランタニド錯体の開発が行われている（非特許文献４，５）。その主な蛍光制御方法はランタニドの水の配位数を変化させるもの、クロモフォア自身を変化させるものに分けられる。
これまで通常の有機化合物においては、光誘起電子移動を蛍光の制御方法とする蛍光プローブが多数開発されている。光誘起電子移動は蛍光の消光機構として広く受け入れられている原理であり、それは電子供与部位から蛍光色素部位への電子移動によるものである。蛍光性ランタニド錯体の蛍光を光誘起電子移動で制御することが可能であれば、さらに光誘起電子移動を蛍光制御原理とする高感度な検出を可能とするプローブを設計し、開発することが可能となる。
【０００４】
光誘起電子移動により下式のようなランタニド錯体の蛍光を制御する試みはいくつか報告されている（非特許文献６、７）。
【化４】
【０００５】
【非特許文献１】
Morton,R.C. et al. Anal.Chem. 1990,62,1841
【非特許文献２】
Seveus,L. et al. Microsc.Res.Tech. 1994,28,149
【非特許文献３】
Mathis,G. Clin.Chem. 1993.39.1953-1959
【非特許文献４】
DeSilva,A.P et al. Chem.Rev. 1997,97,1515
【非特許文献５】
Bissell,R.A. et al. In Fluorescent Chemosensors for Ion and Moleclule Recognition; Garnik,A.W.,Ed.; ACS Symposium Series 538; American Chemical Society; Washington DC. 1993; Chapter4
【非特許文献６】
Chem. Comm. 2000, 473-474
【非特許文献７】
Chem. Comm. 1997, 1891-1892
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現在までに報告された光誘起電子移動により蛍光を制御可能とするランタニド錯体は、消光機構が十分に機能しないためバックグラウンドとなる蛍光が大きく蛍光の変化が十分に得られない、また、錯体のランタニド金属への配位が不十分であるため有機溶媒中でしか蛍光を発しないなどの欠点を持つ。これらの欠点を克服することで、実際に様々な系で実用が可能となる蛍光性ランタニド錯体を基にしたプローブの開発が可能となる。
本発明は、光誘起電子移動を蛍光制御原理とする蛍光性ランタニド錯体を提供することを目的とする。この錯体は、水中で安定にランタニドと錯生成し、水中で機能を発すること、また、蛍光の制御は完全であり消光時に全く蛍光を持たないことが求められる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題が、センサー置換基及び錯基を有する２−キノリノール置換体とランタニドイオンとから成る錯体により解決されることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、下式（化１）
【化１】
で表される２−キノリノールの４位の位置に、下式
−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−（Ｃ６Ｈ ４ ）（−ＮＨＲ１）
（式中、ｎは１〜５の整数、ｍは０〜２であってｎ−１以下の整数であり、Ｒ１は、−ＣＯＸ（Ｘはアルキル基を表す。）を表す。）で表されるセンサー置換基及び７位の位置に−ＣＨ２（ＣＯＮＨ）ｑ−（式中、ｑは０又は１を表す。）を介して結合する下式（化６）
【化６】
で表される錯基を有する２−キノリノール置換体又は
下式で表わされる
【化７】
２−キノリノール置換体、並びにランタニドから成り、該ランタニドイオンが該錯基と錯体結合し、該２−キノリノール置換体と該ランタニドとのモル比が１：１である蛍光性ランタニド錯体である。ここでランタニド(lanthnide)は５８Ｃｅ〜７１Ｌｕのいずれかの元素を意味する。
【０００８】
前記錯基は、下記のキレーター（化６）
【化６】
であって、そのＮ原子が−ＣＨ２（ＣＯＮＨ）ｑ−（式中、ｑは０又は１、好ましくは１を表す。）を介して前記２−キノリノールと結合する。
２−キノリノールの７位にアミノ基を常法により付加し、このアミノ基を介して、カルボン酸を有するキレ−タ−とアミド結合により、このキレーターと２−キノリノールを結合させることができる。
【０００９】
前記錯基は、前記２−キノリノールの７位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの４位に結合する。
更に、前記センサー置換基において、アミノ基（−ＮＨＲ１）は２価炭化水素基（−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−）に対してベンゼン環（Ｃ６Ｈ ４ ）のパラ位に位置し、前記アルキル基がメチル基であることが好ましく、ｎが１であり、ｍが０であることがより好ましい。
本発明の錯体は、一般的に２−キノリノール置換体とランタニドをアセトニトリル、メタノール、水など極性溶媒中で約等量混合し、１時間程度攪拌または１〜１２時間程度の加熱還流することによる作ることができる。
【００１０】
更に、本発明は、液相で、上記のいずれかの錯体を被測定物と共存させ、該錯体の蛍光を測定することにより、該被測定物の性質を知る方法である。
この溶媒としては、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、メタノールなど極性溶媒を用いることが好ましく、より好ましくは水を用いる。その溶媒中の、該錯体の濃度は０．１ｎＭ〜０．１ｍＭが好ましく、該被測定物の濃度は０．１ｎＭ〜０．２ｍＭが好ましい。
例えば、加水分解酵素等を測定対象として本発明の錯体を用いると、この測定対象により該錯体のセンサー部分が分解され、その結果錯体の蛍光強度に変化を及ぼしたり、あるいは本発明の錯体のセンサー部がＣａ２＋，Ｚｎ２＋，Ｈ＋と配位結合することにより該錯体の蛍光強度に変化を及ぼしたり、あるいは本発明の錯体のセンサー部がＮＯや一重項酸素などと化学反応することにより該錯体の蛍光強度に変化を及ぼしたりするため、本発明の錯体はこれら測定対象のプローブとして機能する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の錯体は、図１に示すように、センサー置換基から成るセンサー部分と、錯基を含む２−キノリノール置換体とランタニドから成る蛍光団から成る。
この錯体を測定対象と液相、特に水中で、共存させ、測定対象がセンサー部のアミノ基と反応すると、この錯体の蛍光に変化が起こるため、これを観察することにより、測定対象の性質を知ることが可能となる。
例えば、アミノ基が電子供与性の高いもの（例えば、センサー部がアニリン）の場合には図２（ａ）の左に示すように蛍光団から蛍光の発光が無いが、このような反応により、このアミノ基が電子供与性の低いもの（例えば、アセトアニリド）へ変化すると、図２（ａ）の右に示すように、蛍光団において蛍光が発光するようになる。逆の場合には、図２（ｂ）に示すように測定対象との反応により蛍光が消える。このような蛍光を調べることにより、本発明の錯体と測定対象との相互作用を知ることが可能になる（このようなＰＥＴセンサーの原理についてはDeSilva,A.P et al. 1997,97,1515を参照されたい）。
【００１２】
このような原理に基づいて、本発明の錯体をプローブとして応用する例として以下の例を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。各例の反応機構を図３に示す。
１）カスパーゼ等の加水分解酵素と反応する反応基（ペプチド：ＤＥＶＤ）をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
カスパーゼ等の加水分解酵素の特異的検出が可能となる。カスパーゼ等の加水分解酵素の細胞内生成を可視化することができる。この応用はアポトーシス等の生命現象のメカニズム解析に非常に有効である。カスパーゼ等の加水分解酵素の活性測定に応用でき，カスパーゼ等の加水分解酵素の阻害剤のハイスループットスクリーニングにも応用できる。
従来有機蛍光プローブに応用した例はないが、本発明の錯体は蛍光強度の変化を確実に起こすことができるので応用対象となる。
【００１３】
２）亜鉛イオンと配位結合する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
Ｚｎ２＋の特異的検出が可能となる。Ｚｎ２＋の細胞内生成を可視化することができる。
Ｚｎ２＋測定を有機蛍光プローブに応用した例にはHirano.T. et al. J.Am.Chem.Soc. 2000, 122, 12399.がある。
【００１４】
３）水素イオンが付加する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
ｐＨの変化を長寿命蛍光の強度変化として測定することが可能となる。ｐＨの変化測定を有機蛍光プローブに応用した例にはSelinger,B.K.; Aust.J.Chem. 1977,30, 2087がある。
【００１５】
４）一酸化窒素と反応する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
ＮＯの特異的検出が可能となる。ＮＯの細胞内生成を可視化することができる。ＮＯ合成酵素の活性測定に応用でき、ＮＯ合成酵素の阻害剤のハイスループットスクリーニングにも応用できる。
NOとの反応を有機蛍光プローブに応用した例には、Kojima,H. et al. Anal.Chem. 1998,70, 2446がある。
【００１６】
【発明の効果】
従来通常の有機化合物に対してＰＥＴ機構を用いた蛍光の制御は行われていたが、本発明の錯体はランタニド錯体へのＰＥＴ制御により従来の有機化合物と比較して約１００万倍程度寿命の長い蛍光を制御できる点が新規である。このため，時間分解蛍光測定が可能となりより精度の高い測定が可能となる。現在までにランタニド錯体を用いて時間分解測定を行った例はあるが，長寿命蛍光の強度を測定対象との反応で制御した例は存在しなかった。本発明は測定対象に応じて長寿命蛍光測定を行うことができる初めての例であり、本発明の錯体はより幅広い応用が期待できる。
【００１７】
【実施例１】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
本実施例では、ランタニドイオン（Ｌｎ３＋）と１対１の安定な錯体を形成するＤＴＰＡをキレーターとし、２−キノリノール誘導体であるｃｓ１２４を蛍光団とする下式
【化５】
で表されるＤＴＰＡ−ｃｓ１２４を基本骨格とした。これにＰＥＴセンサーを組み込んだランタニド錯体のデザイン、合成を行った。ＰＥＴセンサーとしては電子供与性の高いアニリンと電子供与性の低いアセトアニリドを選択した。
電子供与性の高いＰＥＴセンサーからは蛍光団への電子移動が起きるため蛍光を発しない。しかし、電子供与性の低いＰＥＴセンサーからは電子移動が起こらないために蛍光を持つと考えられる。
【００１８】
実施例で用いる各化合物を合成した。その合成経路を図４〜６に示す。各化合物番号は、図４〜６中の化合物番号に対応している。
製造例１
この製造例では化合物8を合成した。
4-ニトロフェニル酢酸(4402mg,24.3mmol)を塩化チオニル(20ml)、ジクロロメタン(20ml)に溶解し、2時間加熱還流した。塩化チオニルを減圧下で留去し、固体を得た。この固体をジクロロメタン(30ml)に溶解した後、その溶液を、メルドラム酸(3499mg,24.3mmol)とN.N-ジエチルイソプロピルアミン(5840mg,49.8mmol)を溶解したジクロロメタン(20ml)溶液に氷冷下一時間かけて滴下し、この溶液をさらに２時間室温で撹拌した。この反応液に0.1N塩酸(50ml)を加え、ジクロロメタンで抽出した。この反応液を減圧下で留去し得られた固体をエタノール(100ml)に溶解し、2時間加熱還流した。この反応液を減圧下で留去し、４℃で一晩放置し固体を得た。これをエタノールで再結晶し化合物2(5298mg,21.1mmol)を得た。黄色結晶。収率87%。
1H-NMR(CDCl3, 300MHz) : 1.29(t, 3H, J=7.1), 3.52 (s, 2H), 4.00(s, 2H), 4.21(q, 2H, J=7.1), 7.41(d, 2H, J=8.8), 8.21(d, 2H, J=8.8),
13C-NMR (CDCl3,75MHz): 14.1, 48.9, 49.0, 61.7, 123.8, 130.1, 130.5, 140.6, 166.8, 198.8
MS(EI): 251
【００１９】
化合物2(5297mg,21.1mg)とm-フェニレンジアミン(2290mg,21.2mmol)を混合し、140度で12時間加熱した。得られた固体にメタノールを加え、析出した黄色固体を桐山ロートで濾取し、化合物3(1876mg,6.34mmol)を得た。黄色固体。収率30%。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz) 4.15 (s, 2H), 5.75(br, 2H), 5.91(s, 1H), 6.35(d, 1H, J=2.1), 6.39(dd, 1H, J=8.4, 2.1), 7.34 (d, 1H, J=8.4), 7.55(d, 2H, J=8.8), 8.15 (d, 2H, J=8.8), 11.24 (s, 1H) 13C-NMR (DMSO-d6, 75MHz) 37.0, 96.8, 109.2, 110.6, 115.5, 123.6, 125.7, 129.9, 141.3, 146.1, 147.3, 149.2, 151.1, 162.3
MS(EI): 295
【００２０】
化合物3(295mg,1.0mmol)と9-フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド(297mg,1.23mmol)をジオキサン(40ml)、0.5N炭酸ナトリウム水溶液(20ml)に溶解し室温で１２時間撹拌した。反応液に水を加え、生じた固体を桐山漏斗で濾取し、この固体をメタノール、水で順次洗浄した。この固体をエタノールで再結晶し、化合物4(410mg,0.79mmol)を得た。無色結晶。収率79%。
1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)
4.29-4.33 (m, 3H), 4.48(d, 2H, J=6.8), 6.20(s, 1H, k), 7.12(d, 1H, J=8.7), 7.31-7.44 (m, 4H), 7.55-7.62 (m, 3H), 7.66(s, 1H), 7.74(d, 2H, J=7.5), 7.89(d, 2H, J=7.5), 8.17 (d, 2H, J=8.7), 10.02 (s, 1H), 11.65 (s, 1H) 13C-NMR (DMSO-d6,75MHz) 36.8, 46.5, 65.8, 103.6, 113.0, 113.9, 119.7, 120.2, 123.6, 125.1, 125.5, 127.1, 127.7, 130.0, 140.0, 140.8, 141.1, 143.7, 146.2, 146.8, 148.9, 153.2, 161.9
MS(FAB): 518
【００２１】
化合物4(385mg,0.74mmol)と鉄粉(273mg,4.96mmol)をエタノール(40ml)、酢酸(20ml)に溶解し、2時間加熱還流した。反応液をセライト濾過した後、反応液を減圧下で留去し得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し鉄を除き、化合物５(200mg)を混合物として得た。この混合物である化合物５(200mg)をジオキサン(40ml)、0.5N炭酸ナトリウム水溶液(20ml)に溶解し、反応液に炭酸ジブチル(300μl)を加え、室温で12時間撹拌した。この反応液に水を加え、これを酢酸エチルで抽出し、抽出液を減圧下で留去した。得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し、化合物6(111mg,0.18mmol)を得た。白色固体。収率36%(２工程)
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz) 1.52 (s, 9H), 4.09 (s, 2H), 4.38 (t, 1H, J=6.6), 4.55 (d, 2H, J=6.6), 6.15 (s, 1H), 7.17-7.23 (m, 3H), 7.39-7.51 (m, 6H), 7.68-7.71 (m, 2H), 7.82 (d, 2H, J=7.6), 7.97 (d, 2H, J=7.6), 9.34 (s, 1H), 10.07 (s, 1H), 11.64 (s, 1H)
13C-NMR (DMSO-d6, 75MHz) 28.1, 36.7, 46.6, 65.8, 78.9, 103.6, 112.9, 114.1, 118.3, 119.0, 120.2, 125.2, 125.5, 127.1, 127.7, 129.1 131.7, 137.9, 140.0, 140.8, 140.9, 143.7, 150.5, 152.8, 153.3, 162.1
MS(FAB) 588
【００２２】
化合物6(104mg,0.18mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(10ml)に溶解し、ピペリジン(1ml)を加え、室温で2時間撹拌する。反応液を減圧下で留去し、得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し、化合物7(63mg,0.17mmol)を得た。淡黄色固体。収率97%。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz) 1.39 (s, 9H), 3.87 (s, 2H), 5.66 (s, 2H), 5.74 (s, 1H), 6.28 (d, 1H, J=2.0), 6.32 (dd, 1H, J=9.6 2.0), 7.06 (d, 2H, J=8.4), 7.28-7.33 (m, 3H), 9.20 (s, 1H), 11.11 (s, 1H)
13C-NMR (DMSO-d6, 75MHz) 28.1, 36.8, 78.9, 96.8, 109.4, 110.4, 114.9, 118.2, 125.7, 129.0, 132.2, 137.8, 141.1, 150.7, 150.9, 152.8, 162.4
MS(FAB) 366
【００２３】
無水DTPA(44mg,0.12mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(10ml)に溶解し、トリエチルアミン(400μl)を加える。さらにN,N-ジメチルホルムアミド(10ml)に溶解した化合物7(37mg,0.10mmol)を20分、反応液に滴下する。室温で２時間撹拌後、水4mlを加え、反応液を減圧下で留去する。得られた固体にトリフルオロ酢酸(5ml)を加え、室温で１時間撹拌する。反応液を減圧下で留去し得られた固体を高速液体クロマトグラフィーで精製し、化合物8(19mg,0.03mmol)を得た。無色固体。収率30%。
1H-NMR(CD3OD, 300MHz) 3.05-3.30 (m, 4H), 3.35-3.60 (m, 12H), 4.19 (s, 2H), 4.29 (s, 2H), 6.12 (s, 1H), 7.22-7.33 (m, 5H,), 7.68 (d, 1H, J=7.9), 7.94 (s, 1H),
13C-NMR (CD3OD, 75MHz)
MS(FAB) 641
【００２４】
製造例２
この製造例では化合物11を合成した。
製造例1に示した化合物6の合成と同様に、化合物4(209mg,0.41mmol)から混合物である化合物5(172mg)を得た。これを酢酸(50ml)に溶解し、無水酢酸(10ml)を加える。30分間加熱環流し、反応液を減圧下で留去する。得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し、化合物9(169mg,0.32mmol)を得た。白色固体。収率79%。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz) 2.00 (s,3H), 3.95 (s, 2H), 5.71 (s, 2H), 5.81 (s, 1H), 6.34 (d, 1H, J=2.1), 6.39 (dd, 1H, J=8.6 2.1), 7.16 (d, 2H, J=8.4), 7.37 (d, 1H, J=8.6), 7.48 (d, 2H, J=8.4), 9.86 (s, 1H), 11.16 (s, 1H)
13C-NMR (DMSO-d6, 75MHz)171.3, 168.1, 162.1, 153.2, 150.3, 143.7, 140.9, 140.8, 140.0, 137.8, 132.8, 129.1, 127.7, 127.1, 125.5, 125.2, 120.2, 119.2, 114.1, 112.9, 103.6, 65.8, 46.6, 36.7, 24.0
FABMS(M+1)
【００２５】
化合物9(167mg,0.32mmol)から化合物7の合成法と同様に化合物10(94mg,0.31mmol)を得た。淡黄色固体。収率97%。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz), 2.00 (s, 3H), 4.04 (s, 2H), 4.31 (t, 1H, J=6.9), 4.47 (d, 2H, J=6.9), 6.09 (s, 1H), 7.14 (d, 1H, J=8.4), 7.18 (d, 2H, J=8.7), 7.31-7.44 (m, 4H), 7.63 (d, 2H, J=8.7), 7.61-7.65 (m, 2H, 7.75 (d, 2H, J=7.6), 7.90 (d, 2H, J=7.5), 9.89 (s, 1H), 10.00 (s, 1H), 11.57 (s, 1H)
13C-NMR (DMSO-d6, 75MHz) 168.1,162.4, 150.9, 150.6, 141.1, 137.6, 133.2, 129.0, 125.7, 119.1, 114.9, 110.4, 109.4, 96.8, 36.8, 23.9
FABMS(M+1) 308
【００２６】
無水DTPA(43mg,0.12mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(10ml)に溶解し、トリエチルアミン(400μl)を加える。さらにN,N-ジメチルホルムアミド(10ml)に溶解した化合物10(31mg,0.10mmol)を20分、反応液に滴下する。室温で２時間撹拌後、水4mlを加え、反応液を減圧下で留去する。得られた固体を高速液体クロマトグラフィーで精製し、化合物11(30mg,0.04mmol)を得た。無色固体。収率40%。
1H-NMR(CD3OD, 300MHz) 3.05-3.30 (m, 4H), 3.40-3.65 (m, 12H), 4.09 (s, 2H), 4.36 (s, 2H), 6.20 (s, 1H), 7.10-7.18 (m, 3H), 8.25 (d, 2H, J=8.3), 7.67 (s, 1H, J=8.0), 7.97 (s, 1H)
13C-NMR (CD3OD, 75MHz)
FABMS(M+1) 683
【００２７】
製造例３
この製造例では化合物15を合成した。
ジクロロメタン(30ml)に溶解したフェニルアセチルクロリド(化合物12, 2319mg,15.0mmol)をメルドラム酸(2160mg,14.9mmol)とN.N-ジエチルイソプロピルアミン(3877mg,30.0mmol)を溶解したジクロロメタン (30ml)に氷冷下一時間かけて滴下し、この溶液をさらに２時間室温で撹拌した。この反応液に0.1N塩酸を50ml加え、ジクロロメタンで抽出した。この反応液を減圧下で留去し得られた固体をエタノール(100ml)に溶解し、2時間加熱還流した。この反応液を減圧下で留去して、化合物12(2737mg,13.3mmol)を得た。淡黄色液体。収率88%。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz)1.16 (t, 3H, J=6.9), 3.64 (c, 2H), 3.85 (s, 2H), 4.06 (q, 2H, J=6.9), 7.00-7.41 (m, 5H)
13C-NMR (CDCl3,75MHz) 200.3, 166.9, 133.0, 129.3, 128.5, 127.0, 61.1, 49.7, 48.0, 13.8
MS(EI): 251
【００２８】
化合物13(1200mg,0.17mmol)から化合物3の合成法と同様に化合物14(555mg,2.22mmol)を得た。淡黄色固体。収率38%。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz) 4.01 (s, 2H), 5.73 (s, 2H), 5.83 (s, 1H) 6.34 (d, 1H, J=2.1), 6.38 (dd, 1H, J=8.7 2.1), 7.17-7.32 (m, 5H), 7.41 (d, 2H, J=8.7), 11.18 (s, 1H)
13C-NMR (DMSO-d6, 75MHz) 162.4, 151.0, 150.5, 141.2, 138.8, 128.8, 128.4, 126.3, 125.7, 115.1, 115.0, 110.4, 109.5, 96.9, 37.3,
FABMS(M+1) 251
【００２９】
化合物14(38mg,0.15mmol)から化合物11の合成法と同様に化合物15(37mg,0.06mmol)を得た。無色固体。収率40%。
1H-NMR(CD3OD, 300MHz) 3.05-3.30 (m, 4H), 3.35-3.60 (m, 12H), 4.13 (s, 2H), 4.35 (s, 2H), 6.18 (s, 1H), 7.12-7.23 (m, 6H), 7.68 (s, 1H), 7.96 (s, 1H)
13C-NMR (CD3OD, 75MHz) FABMS(M+1) 626
【００３０】
以下の実施例では、製造例１〜３で得た化合物8、11及び15を用いて錯体を作り、その蛍光特性を評価した。
実施例１〜３
化合物8、11及び15をジメチルスルホキシドに溶解し、10mMのstock solutionを作製した。また、塩化テルビウム(III)6水和物をジメチルスルホキシドに溶解し、10mMのstock solutionを作製した。作製した化合物8、11及び15の各溶液に、等量の塩化テルビウム(III)6水和物の溶液を添加し、室温で30分放置して、化合物8、11及び15のテルビウム(III)錯体作製した。これを100mMHEPES緩衝液(pH7.4)で希釈し、8μMとしその蛍光を測定した。
【００３１】
実施例４〜６
化合物8、11及び15をジメチルスルホキシドに溶解し、10mMのstock solutionを作製した。また、塩化ユウロピウム(III)6水和物をジメチルスルホキシドに溶解し、10mMのstock solutionを作製した。作製した化合物8、11及び15の各溶液に、等量の塩化ユウロピウム(III)6水和物の溶液を添加し、室温で30分放置して、化合物8、11及び15のユウロピウム(III)錯体を作製した。これを100mMHEPES緩衝液(pH7.4)で希釈し、8μMとしその蛍光を測定した。
これらユウロピウム(III)錯体及びDTPA-cs124のユウロピウム(III)錯体の吸収スペクトル（５μＭ in １００ｍＭ ＨＥＰＥＳ Buffer (pH7.4))を図７〜１０に示す。
【００３２】
蛍光は時間分解測定により測定した。いずれの錯体についても励起波長330nm、Delay Time 0.05ms、Gate Time 1.00msとしてその蛍光を測定した。また、蛍光寿命は励起波長330nm、蛍光波長は各テルビウム錯体は545nm、各ユウロピウム錯体は615nmとして測定した（各８μＭ in １００ｍＭ ＨＥＰＥＳ Buffer (pH7.4))。
化合物８，１１，１５のテルビウム(III)錯体の蛍光スペクトル図１１に示し、その蛍光寿命と水配位数を表１に示す。
【表１】
また、化合物８，１１，１５のユウロピウム(III)錯体の蛍光スペクトル図１２に示し、その蛍光寿命と水配位数を表２に示す。
【表２】
【００３３】
化合物15のテルビウム(III)錯体、ユウロピウム(III)錯体はいずれも強い蛍光を持つ。その蛍光強度はDTPA-cs124のテルビウム(III)錯体、ユウロピウム(III)錯体とほぼ同等であった。また、蛍光寿命にも変化は見られなかった。カルボスチリルの4位のベンジル基への変化は蛍光特性に変化を与えなかった。
化合物11のテルビウム(III)錯体、ユウロピウム(III)錯体はいずれも強い蛍光を持つ。しかし、化合物8のテルビウム(III)錯体、ユウロピウム(III)錯体はいずれも蛍光を全く持たず、蛍光寿命は測定できなかった。カルボスチリルの4位の置換基の電子密度が上昇することで、4位置換基からカルボスチリルへの光誘起電子移動が生じ、化合物8のテルビウム(III)錯体、ユウロピウム(III)錯体は蛍光を全く発しなかった。
【００３４】
これによりテルビウム(III)錯体、ユウロピウム(III)錯体をはじめとするランタニド錯体の蛍光を制御することが可能となることが示された。この錯体は水中で安定に錯体を生成し、蛍光の制御が完全であり、水中で機能することが明らかとなった。この結果から、光誘起電子移動による電子供与部位を適切な分析対象物のセンサーとし、電子供与能が変化するならば、さまざまな分析対象物に対して高感度に感知できるプローブの開発が可能となることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の錯体の構成を示す図である。
【図２】本発明の錯体のセンサー機能の原理を示す図である。ａはセンサー部が電子供与性の高いもの、ｂはセンサー部が電子供与性の低いものの場合を示す。
【図３】本発明の錯体の反応機構の例を示す図である。１）は、カスパーゼ等の加水分解酵素と反応する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例、２）は、亜鉛イオンと配位結合する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例、３）は、水素イオンが付加する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例、４）は、一酸化窒素と反応する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例を示す。
【図４】製造例１〜３で製造した化合物８，１１，１５の合成経路を示す図である。
【図５】製造例１〜３で製造した化合物８，１１，１５の合成経路を示す図である。
【図６】製造例１〜３で製造した化合物８，１１，１５の合成経路を示す図である。
【図７】DTPA-cs124のユウロピウム(III)錯体の吸収スペクトルを示す図である。
【図８】化合物８のユウロピウム(III)錯体の吸収スペクトルを示す図である。
【図９】化合物１１のユウロピウム(III)錯体の吸収スペクトルを示す図である。
【図１０】化合物１５のユウロピウム(III)錯体の吸収スペクトルを示す図である。
【図１１】化合物８（上）、１１（中）及び１５（下）のテルビウム(III)錯体の蛍光スペクトルを示す図である。
【図１２】化合物８（上）、１１（中）及び１５（下）のユウロピウム(III)錯体の蛍光スペクトルを示す図である。
【０００１】
この発明は、２−キノリノール置換体とランタニドイオンとから成る新規な錯体に関し、より詳細には、光誘起電子移動（ＰＥＴ）により蛍光強度を制御できる長寿命蛍光性の２−キノリノール置換体とランタニドイオンとから成る新規な錯体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光性ランタニド錯体は長い蛍光寿命、鋭い蛍光スペクトル、大きいストークスシフトなど通常の蛍光性有機化合物とは大きく異なる蛍光特性を持つことが知られている（Richardson,F.S.; Chem.Rev. 1982, 82, 541-552.； 足立吟也 「希土類物語 先端材料の魔術師」産業図書； 足立吟也「希土類の化学」化学同人）。この蛍光の特徴を利用し、時間分解測定でその蛍光を測定することで、蛍光寿命の短い他の有機化合物の蛍光や励起散乱光を排除し、ランタニド錯体から発する蛍光のみを特異的に検出することができる。このため測定系のバックグラウンドの蛍光を抑えることが可能となるため、通常の有機化合物の蛍光を用いた蛍光検出系と比較し、Ｓ／Ｎ比の高い高感度な検出が可能となる。これまで、標識化試薬として様々な蛍光性ランタニド錯体が開発され、時間分解イムノアッセイや時間分解ＤＮＡハイブリダイゼーションにおいて用いられ、その検出感度の増大が報告されている（非特許文献１〜３）。このような特徴を持つ蛍光性ランタニド錯体の蛍光を制御することにより、分析対象物を高感度に感知することのできるプローブの開発が可能となる。
【０００３】
近年、蛍光性ランタニド錯体自身をセンサーとして利用する試みが行われ、分析対象物の有無により蛍光特性の変化するランタニド錯体の開発が行われている（非特許文献４，５）。その主な蛍光制御方法はランタニドの水の配位数を変化させるもの、クロモフォア自身を変化させるものに分けられる。
これまで通常の有機化合物においては、光誘起電子移動を蛍光の制御方法とする蛍光プローブが多数開発されている。光誘起電子移動は蛍光の消光機構として広く受け入れられている原理であり、それは電子供与部位から蛍光色素部位への電子移動によるものである。蛍光性ランタニド錯体の蛍光を光誘起電子移動で制御することが可能であれば、さらに光誘起電子移動を蛍光制御原理とする高感度な検出を可能とするプローブを設計し、開発することが可能となる。
【０００４】
光誘起電子移動により下式のようなランタニド錯体の蛍光を制御する試みはいくつか報告されている（非特許文献６、７）。
【化４】
【非特許文献１】
Morton,R.C. et al. Anal.Chem. 1990,62,1841
【非特許文献２】
Seveus,L. et al. Microsc.Res.Tech. 1994,28,149
【非特許文献３】
Mathis,G. Clin.Chem. 1993.39.1953-1959
【非特許文献４】
DeSilva,A.P et al. Chem.Rev. 1997,97,1515
【非特許文献５】
Bissell,R.A. et al. In Fluorescent Chemosensors for Ion and Moleclule Recognition; Garnik,A.W.,Ed.; ACS Symposium Series 538; American Chemical Society; Washington DC. 1993; Chapter4
【非特許文献６】
Chem. Comm. 2000, 473-474
【非特許文献７】
Chem. Comm. 1997, 1891-1892
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現在までに報告された光誘起電子移動により蛍光を制御可能とするランタニド錯体は、消光機構が十分に機能しないためバックグラウンドとなる蛍光が大きく蛍光の変化が十分に得られない、また、錯体のランタニド金属への配位が不十分であるため有機溶媒中でしか蛍光を発しないなどの欠点を持つ。これらの欠点を克服することで、実際に様々な系で実用が可能となる蛍光性ランタニド錯体を基にしたプローブの開発が可能となる。
本発明は、光誘起電子移動を蛍光制御原理とする蛍光性ランタニド錯体を提供することを目的とする。この錯体は、水中で安定にランタニドと錯生成し、水中で機能を発すること、また、蛍光の制御は完全であり消光時に全く蛍光を持たないことが求められる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題が、センサー置換基及び錯基を有する２−キノリノール置換体とランタニドイオンとから成る錯体により解決されることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、下式（化１）
【化１】
−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−（Ｃ６Ｈ ４ ）（−ＮＨＲ１）
（式中、ｎは１〜５の整数、ｍは０〜２であってｎ−１以下の整数であり、Ｒ１は、−ＣＯＸ（Ｘはアルキル基を表す。）を表す。）で表されるセンサー置換基及び７位の位置に−ＣＨ２（ＣＯＮＨ）ｑ−（式中、ｑは０又は１を表す。）を介して結合する下式（化６）
【化６】
下式で表わされる
【化７】
【０００８】
前記錯基は、下記のキレーター（化６）
【化６】
２−キノリノールの７位にアミノ基を常法により付加し、このアミノ基を介して、カルボン酸を有するキレ−タ−とアミド結合により、このキレーターと２−キノリノールを結合させることができる。
【０００９】
前記錯基は、前記２−キノリノールの７位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの４位に結合する。
更に、前記センサー置換基において、アミノ基（−ＮＨＲ１）は２価炭化水素基（−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−）に対してベンゼン環（Ｃ６Ｈ ４ ）のパラ位に位置し、前記アルキル基がメチル基であることが好ましく、ｎが１であり、ｍが０であることがより好ましい。
本発明の錯体は、一般的に２−キノリノール置換体とランタニドをアセトニトリル、メタノール、水など極性溶媒中で約等量混合し、１時間程度攪拌または１〜１２時間程度の加熱還流することによる作ることができる。
【００１０】
更に、本発明は、液相で、上記のいずれかの錯体を被測定物と共存させ、該錯体の蛍光を測定することにより、該被測定物の性質を知る方法である。
この溶媒としては、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、メタノールなど極性溶媒を用いることが好ましく、より好ましくは水を用いる。その溶媒中の、該錯体の濃度は０．１ｎＭ〜０．１ｍＭが好ましく、該被測定物の濃度は０．１ｎＭ〜０．２ｍＭが好ましい。
例えば、加水分解酵素等を測定対象として本発明の錯体を用いると、この測定対象により該錯体のセンサー部分が分解され、その結果錯体の蛍光強度に変化を及ぼしたり、あるいは本発明の錯体のセンサー部がＣａ２＋，Ｚｎ２＋，Ｈ＋と配位結合することにより該錯体の蛍光強度に変化を及ぼしたり、あるいは本発明の錯体のセンサー部がＮＯや一重項酸素などと化学反応することにより該錯体の蛍光強度に変化を及ぼしたりするため、本発明の錯体はこれら測定対象のプローブとして機能する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の錯体は、図１に示すように、センサー置換基から成るセンサー部分と、錯基を含む２−キノリノール置換体とランタニドから成る蛍光団から成る。
この錯体を測定対象と液相、特に水中で、共存させ、測定対象がセンサー部のアミノ基と反応すると、この錯体の蛍光に変化が起こるため、これを観察することにより、測定対象の性質を知ることが可能となる。
例えば、アミノ基が電子供与性の高いもの（例えば、センサー部がアニリン）の場合には図２（ａ）の左に示すように蛍光団から蛍光の発光が無いが、このような反応により、このアミノ基が電子供与性の低いもの（例えば、アセトアニリド）へ変化すると、図２（ａ）の右に示すように、蛍光団において蛍光が発光するようになる。逆の場合には、図２（ｂ）に示すように測定対象との反応により蛍光が消える。このような蛍光を調べることにより、本発明の錯体と測定対象との相互作用を知ることが可能になる（このようなＰＥＴセンサーの原理についてはDeSilva,A.P et al. 1997,97,1515を参照されたい）。
【００１２】
このような原理に基づいて、本発明の錯体をプローブとして応用する例として以下の例を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。各例の反応機構を図３に示す。
１）カスパーゼ等の加水分解酵素と反応する反応基（ペプチド：ＤＥＶＤ）をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
カスパーゼ等の加水分解酵素の特異的検出が可能となる。カスパーゼ等の加水分解酵素の細胞内生成を可視化することができる。この応用はアポトーシス等の生命現象のメカニズム解析に非常に有効である。カスパーゼ等の加水分解酵素の活性測定に応用でき，カスパーゼ等の加水分解酵素の阻害剤のハイスループットスクリーニングにも応用できる。
従来有機蛍光プローブに応用した例はないが、本発明の錯体は蛍光強度の変化を確実に起こすことができるので応用対象となる。
【００１３】
２）亜鉛イオンと配位結合する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
Ｚｎ２＋の特異的検出が可能となる。Ｚｎ２＋の細胞内生成を可視化することができる。
Ｚｎ２＋測定を有機蛍光プローブに応用した例にはHirano.T. et al. J.Am.Chem.Soc. 2000, 122, 12399.がある。
【００１４】
３）水素イオンが付加する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
ｐＨの変化を長寿命蛍光の強度変化として測定することが可能となる。ｐＨの変化測定を有機蛍光プローブに応用した例にはSelinger,B.K.; Aust.J.Chem. 1977,30, 2087がある。
【００１５】
４）一酸化窒素と反応する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
ＮＯの特異的検出が可能となる。ＮＯの細胞内生成を可視化することができる。ＮＯ合成酵素の活性測定に応用でき、ＮＯ合成酵素の阻害剤のハイスループットスクリーニングにも応用できる。
NOとの反応を有機蛍光プローブに応用した例には、Kojima,H. et al. Anal.Chem. 1998,70, 2446がある。
【００１６】
【発明の効果】
従来通常の有機化合物に対してＰＥＴ機構を用いた蛍光の制御は行われていたが、本発明の錯体はランタニド錯体へのＰＥＴ制御により従来の有機化合物と比較して約１００万倍程度寿命の長い蛍光を制御できる点が新規である。このため，時間分解蛍光測定が可能となりより精度の高い測定が可能となる。現在までにランタニド錯体を用いて時間分解測定を行った例はあるが，長寿命蛍光の強度を測定対象との反応で制御した例は存在しなかった。本発明は測定対象に応じて長寿命蛍光測定を行うことができる初めての例であり、本発明の錯体はより幅広い応用が期待できる。
【００１７】
【実施例１】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
本実施例では、ランタニドイオン（Ｌｎ３＋）と１対１の安定な錯体を形成するＤＴＰＡをキレーターとし、２−キノリノール誘導体であるｃｓ１２４を蛍光団とする下式
【化５】
電子供与性の高いＰＥＴセンサーからは蛍光団への電子移動が起きるため蛍光を発しない。しかし、電子供与性の低いＰＥＴセンサーからは電子移動が起こらないために蛍光を持つと考えられる。
【００１８】
実施例で用いる各化合物を合成した。その合成経路を図４〜６に示す。各化合物番号は、図４〜６中の化合物番号に対応している。
製造例１
この製造例では化合物8を合成した。
4-ニトロフェニル酢酸(4402mg,24.3mmol)を塩化チオニル(20ml)、ジクロロメタン(20ml)に溶解し、2時間加熱還流した。塩化チオニルを減圧下で留去し、固体を得た。この固体をジクロロメタン(30ml)に溶解した後、その溶液を、メルドラム酸(3499mg,24.3mmol)とN.N-ジエチルイソプロピルアミン(5840mg,49.8mmol)を溶解したジクロロメタン(20ml)溶液に氷冷下一時間かけて滴下し、この溶液をさらに２時間室温で撹拌した。この反応液に0.1N塩酸(50ml)を加え、ジクロロメタンで抽出した。この反応液を減圧下で留去し得られた固体をエタノール(100ml)に溶解し、2時間加熱還流した。この反応液を減圧下で留去し、４℃で一晩放置し固体を得た。これをエタノールで再結晶し化合物2(5298mg,21.1mmol)を得た。黄色結晶。収率87%。
1H-NMR(CDCl3, 300MHz) : 1.29(t, 3H, J=7.1), 3.52 (s, 2H), 4.00(s, 2H), 4.21(q, 2H, J=7.1), 7.41(d, 2H, J=8.8), 8.21(d, 2H, J=8.8),
13C-NMR (CDCl3,75MHz): 14.1, 48.9, 49.0, 61.7, 123.8, 130.1, 130.5, 140.6, 166.8, 198.8
MS(EI): 251
【００１９】
化合物2(5297mg,21.1mg)とm-フェニレンジアミン(2290mg,21.2mmol)を混合し、140度で12時間加熱した。得られた固体にメタノールを加え、析出した黄色固体を桐山ロートで濾取し、化合物3(1876mg,6.34mmol)を得た。黄色固体。収率30%。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz) 4.15 (s, 2H), 5.75(br, 2H), 5.91(s, 1H), 6.35(d, 1H, J=2.1), 6.39(dd, 1H, J=8.4, 2.1), 7.34 (d, 1H, J=8.4), 7.55(d, 2H, J=8.8), 8.15 (d, 2H, J=8.8), 11.24 (s, 1H) 13C-NMR (DMSO-d6, 75MHz) 37.0, 96.8, 109.2, 110.6, 115.5, 123.6, 125.7, 129.9, 141.3, 146.1, 147.3, 149.2, 151.1, 162.3
MS(EI): 295
【００２０】
化合物3(295mg,1.0mmol)と9-フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド(297mg,1.23mmol)をジオキサン(40ml)、0.5N炭酸ナトリウム水溶液(20ml)に溶解し室温で１２時間撹拌した。反応液に水を加え、生じた固体を桐山漏斗で濾取し、この固体をメタノール、水で順次洗浄した。この固体をエタノールで再結晶し、化合物4(410mg,0.79mmol)を得た。無色結晶。収率79%。
1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)
4.29-4.33 (m, 3H), 4.48(d, 2H, J=6.8), 6.20(s, 1H, k), 7.12(d, 1H, J=8.7), 7.31-7.44 (m, 4H), 7.55-7.62 (m, 3H), 7.66(s, 1H), 7.74(d, 2H, J=7.5), 7.89(d, 2H, J=7.5), 8.17 (d, 2H, J=8.7), 10.02 (s, 1H), 11.65 (s, 1H) 13C-NMR (DMSO-d6,75MHz) 36.8, 46.5, 65.8, 103.6, 113.0, 113.9, 119.7, 120.2, 123.6, 125.1, 125.5, 127.1, 127.7, 130.0, 140.0, 140.8, 141.1, 143.7, 146.2, 146.8, 148.9, 153.2, 161.9
MS(FAB): 518
【００２１】
化合物4(385mg,0.74mmol)と鉄粉(273mg,4.96mmol)をエタノール(40ml)、酢酸(20ml)に溶解し、2時間加熱還流した。反応液をセライト濾過した後、反応液を減圧下で留去し得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し鉄を除き、化合物５(200mg)を混合物として得た。この混合物である化合物５(200mg)をジオキサン(40ml)、0.5N炭酸ナトリウム水溶液(20ml)に溶解し、反応液に炭酸ジブチル(300μl)を加え、室温で12時間撹拌した。この反応液に水を加え、これを酢酸エチルで抽出し、抽出液を減圧下で留去した。得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し、化合物6(111mg,0.18mmol)を得た。白色固体。収率36%(２工程)
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz) 1.52 (s, 9H), 4.09 (s, 2H), 4.38 (t, 1H, J=6.6), 4.55 (d, 2H, J=6.6), 6.15 (s, 1H), 7.17-7.23 (m, 3H), 7.39-7.51 (m, 6H), 7.68-7.71 (m, 2H), 7.82 (d, 2H, J=7.6), 7.97 (d, 2H, J=7.6), 9.34 (s, 1H), 10.07 (s, 1H), 11.64 (s, 1H)
13C-NMR (DMSO-d6, 75MHz) 28.1, 36.7, 46.6, 65.8, 78.9, 103.6, 112.9, 114.1, 118.3, 119.0, 120.2, 125.2, 125.5, 127.1, 127.7, 129.1 131.7, 137.9, 140.0, 140.8, 140.9, 143.7, 150.5, 152.8, 153.3, 162.1
MS(FAB) 588
【００２２】
化合物6(104mg,0.18mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(10ml)に溶解し、ピペリジン(1ml)を加え、室温で2時間撹拌する。反応液を減圧下で留去し、得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し、化合物7(63mg,0.17mmol)を得た。淡黄色固体。収率97%。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz) 1.39 (s, 9H), 3.87 (s, 2H), 5.66 (s, 2H), 5.74 (s, 1H), 6.28 (d, 1H, J=2.0), 6.32 (dd, 1H, J=9.6 2.0), 7.06 (d, 2H, J=8.4), 7.28-7.33 (m, 3H), 9.20 (s, 1H), 11.11 (s, 1H)
13C-NMR (DMSO-d6, 75MHz) 28.1, 36.8, 78.9, 96.8, 109.4, 110.4, 114.9, 118.2, 125.7, 129.0, 132.2, 137.8, 141.1, 150.7, 150.9, 152.8, 162.4
MS(FAB) 366
【００２３】
無水DTPA(44mg,0.12mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(10ml)に溶解し、トリエチルアミン(400μl)を加える。さらにN,N-ジメチルホルムアミド(10ml)に溶解した化合物7(37mg,0.10mmol)を20分、反応液に滴下する。室温で２時間撹拌後、水4mlを加え、反応液を減圧下で留去する。得られた固体にトリフルオロ酢酸(5ml)を加え、室温で１時間撹拌する。反応液を減圧下で留去し得られた固体を高速液体クロマトグラフィーで精製し、化合物8(19mg,0.03mmol)を得た。無色固体。収率30%。
1H-NMR(CD3OD, 300MHz) 3.05-3.30 (m, 4H), 3.35-3.60 (m, 12H), 4.19 (s, 2H), 4.29 (s, 2H), 6.12 (s, 1H), 7.22-7.33 (m, 5H,), 7.68 (d, 1H, J=7.9), 7.94 (s, 1H),
13C-NMR (CD3OD, 75MHz)
MS(FAB) 641
【００２４】
製造例２
この製造例では化合物11を合成した。
製造例1に示した化合物6の合成と同様に、化合物4(209mg,0.41mmol)から混合物である化合物5(172mg)を得た。これを酢酸(50ml)に溶解し、無水酢酸(10ml)を加える。30分間加熱環流し、反応液を減圧下で留去する。得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し、化合物9(169mg,0.32mmol)を得た。白色固体。収率79%。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz) 2.00 (s,3H), 3.95 (s, 2H), 5.71 (s, 2H), 5.81 (s, 1H), 6.34 (d, 1H, J=2.1), 6.39 (dd, 1H, J=8.6 2.1), 7.16 (d, 2H, J=8.4), 7.37 (d, 1H, J=8.6), 7.48 (d, 2H, J=8.4), 9.86 (s, 1H), 11.16 (s, 1H)
13C-NMR (DMSO-d6, 75MHz)171.3, 168.1, 162.1, 153.2, 150.3, 143.7, 140.9, 140.8, 140.0, 137.8, 132.8, 129.1, 127.7, 127.1, 125.5, 125.2, 120.2, 119.2, 114.1, 112.9, 103.6, 65.8, 46.6, 36.7, 24.0
FABMS(M+1)
【００２５】
化合物9(167mg,0.32mmol)から化合物7の合成法と同様に化合物10(94mg,0.31mmol)を得た。淡黄色固体。収率97%。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz), 2.00 (s, 3H), 4.04 (s, 2H), 4.31 (t, 1H, J=6.9), 4.47 (d, 2H, J=6.9), 6.09 (s, 1H), 7.14 (d, 1H, J=8.4), 7.18 (d, 2H, J=8.7), 7.31-7.44 (m, 4H), 7.63 (d, 2H, J=8.7), 7.61-7.65 (m, 2H, 7.75 (d, 2H, J=7.6), 7.90 (d, 2H, J=7.5), 9.89 (s, 1H), 10.00 (s, 1H), 11.57 (s, 1H)
13C-NMR (DMSO-d6, 75MHz) 168.1,162.4, 150.9, 150.6, 141.1, 137.6, 133.2, 129.0, 125.7, 119.1, 114.9, 110.4, 109.4, 96.8, 36.8, 23.9
FABMS(M+1) 308
【００２６】
無水DTPA(43mg,0.12mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(10ml)に溶解し、トリエチルアミン(400μl)を加える。さらにN,N-ジメチルホルムアミド(10ml)に溶解した化合物10(31mg,0.10mmol)を20分、反応液に滴下する。室温で２時間撹拌後、水4mlを加え、反応液を減圧下で留去する。得られた固体を高速液体クロマトグラフィーで精製し、化合物11(30mg,0.04mmol)を得た。無色固体。収率40%。
1H-NMR(CD3OD, 300MHz) 3.05-3.30 (m, 4H), 3.40-3.65 (m, 12H), 4.09 (s, 2H), 4.36 (s, 2H), 6.20 (s, 1H), 7.10-7.18 (m, 3H), 8.25 (d, 2H, J=8.3), 7.67 (s, 1H, J=8.0), 7.97 (s, 1H)
13C-NMR (CD3OD, 75MHz)
FABMS(M+1) 683
【００２７】
製造例３
この製造例では化合物15を合成した。
ジクロロメタン(30ml)に溶解したフェニルアセチルクロリド(化合物12, 2319mg,15.0mmol)をメルドラム酸(2160mg,14.9mmol)とN.N-ジエチルイソプロピルアミン(3877mg,30.0mmol)を溶解したジクロロメタン (30ml)に氷冷下一時間かけて滴下し、この溶液をさらに２時間室温で撹拌した。この反応液に0.1N塩酸を50ml加え、ジクロロメタンで抽出した。この反応液を減圧下で留去し得られた固体をエタノール(100ml)に溶解し、2時間加熱還流した。この反応液を減圧下で留去して、化合物12(2737mg,13.3mmol)を得た。淡黄色液体。収率88%。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz)1.16 (t, 3H, J=6.9), 3.64 (c, 2H), 3.85 (s, 2H), 4.06 (q, 2H, J=6.9), 7.00-7.41 (m, 5H)
13C-NMR (CDCl3,75MHz) 200.3, 166.9, 133.0, 129.3, 128.5, 127.0, 61.1, 49.7, 48.0, 13.8
MS(EI): 251
【００２８】
化合物13(1200mg,0.17mmol)から化合物3の合成法と同様に化合物14(555mg,2.22mmol)を得た。淡黄色固体。収率38%。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz) 4.01 (s, 2H), 5.73 (s, 2H), 5.83 (s, 1H) 6.34 (d, 1H, J=2.1), 6.38 (dd, 1H, J=8.7 2.1), 7.17-7.32 (m, 5H), 7.41 (d, 2H, J=8.7), 11.18 (s, 1H)
13C-NMR (DMSO-d6, 75MHz) 162.4, 151.0, 150.5, 141.2, 138.8, 128.8, 128.4, 126.3, 125.7, 115.1, 115.0, 110.4, 109.5, 96.9, 37.3,
FABMS(M+1) 251
【００２９】
化合物14(38mg,0.15mmol)から化合物11の合成法と同様に化合物15(37mg,0.06mmol)を得た。無色固体。収率40%。
1H-NMR(CD3OD, 300MHz) 3.05-3.30 (m, 4H), 3.35-3.60 (m, 12H), 4.13 (s, 2H), 4.35 (s, 2H), 6.18 (s, 1H), 7.12-7.23 (m, 6H), 7.68 (s, 1H), 7.96 (s, 1H)
13C-NMR (CD3OD, 75MHz) FABMS(M+1) 626
【００３０】
以下の実施例では、製造例１〜３で得た化合物8、11及び15を用いて錯体を作り、その蛍光特性を評価した。
実施例１〜３
化合物8、11及び15をジメチルスルホキシドに溶解し、10mMのstock solutionを作製した。また、塩化テルビウム(III)6水和物をジメチルスルホキシドに溶解し、10mMのstock solutionを作製した。作製した化合物8、11及び15の各溶液に、等量の塩化テルビウム(III)6水和物の溶液を添加し、室温で30分放置して、化合物8、11及び15のテルビウム(III)錯体作製した。これを100mMHEPES緩衝液(pH7.4)で希釈し、8μMとしその蛍光を測定した。
【００３１】
実施例４〜６
化合物8、11及び15をジメチルスルホキシドに溶解し、10mMのstock solutionを作製した。また、塩化ユウロピウム(III)6水和物をジメチルスルホキシドに溶解し、10mMのstock solutionを作製した。作製した化合物8、11及び15の各溶液に、等量の塩化ユウロピウム(III)6水和物の溶液を添加し、室温で30分放置して、化合物8、11及び15のユウロピウム(III)錯体を作製した。これを100mMHEPES緩衝液(pH7.4)で希釈し、8μMとしその蛍光を測定した。
これらユウロピウム(III)錯体及びDTPA-cs124のユウロピウム(III)錯体の吸収スペクトル（５μＭ in １００ｍＭ ＨＥＰＥＳ Buffer (pH7.4))を図７〜１０に示す。
【００３２】
蛍光は時間分解測定により測定した。いずれの錯体についても励起波長330nm、Delay Time 0.05ms、Gate Time 1.00msとしてその蛍光を測定した。また、蛍光寿命は励起波長330nm、蛍光波長は各テルビウム錯体は545nm、各ユウロピウム錯体は615nmとして測定した（各８μＭ in １００ｍＭ ＨＥＰＥＳ Buffer (pH7.4))。
化合物８，１１，１５のテルビウム(III)錯体の蛍光スペクトル図１１に示し、その蛍光寿命と水配位数を表１に示す。
【表１】
【表２】
化合物15のテルビウム(III)錯体、ユウロピウム(III)錯体はいずれも強い蛍光を持つ。その蛍光強度はDTPA-cs124のテルビウム(III)錯体、ユウロピウム(III)錯体とほぼ同等であった。また、蛍光寿命にも変化は見られなかった。カルボスチリルの4位のベンジル基への変化は蛍光特性に変化を与えなかった。
化合物11のテルビウム(III)錯体、ユウロピウム(III)錯体はいずれも強い蛍光を持つ。しかし、化合物8のテルビウム(III)錯体、ユウロピウム(III)錯体はいずれも蛍光を全く持たず、蛍光寿命は測定できなかった。カルボスチリルの4位の置換基の電子密度が上昇することで、4位置換基からカルボスチリルへの光誘起電子移動が生じ、化合物8のテルビウム(III)錯体、ユウロピウム(III)錯体は蛍光を全く発しなかった。
【００３４】
これによりテルビウム(III)錯体、ユウロピウム(III)錯体をはじめとするランタニド錯体の蛍光を制御することが可能となることが示された。この錯体は水中で安定に錯体を生成し、蛍光の制御が完全であり、水中で機能することが明らかとなった。この結果から、光誘起電子移動による電子供与部位を適切な分析対象物のセンサーとし、電子供与能が変化するならば、さまざまな分析対象物に対して高感度に感知できるプローブの開発が可能となることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の錯体の構成を示す図である。
【図２】本発明の錯体のセンサー機能の原理を示す図である。ａはセンサー部が電子供与性の高いもの、ｂはセンサー部が電子供与性の低いものの場合を示す。
【図３】本発明の錯体の反応機構の例を示す図である。１）は、カスパーゼ等の加水分解酵素と反応する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例、２）は、亜鉛イオンと配位結合する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例、３）は、水素イオンが付加する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例、４）は、一酸化窒素と反応する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例を示す。
【図４】製造例１〜３で製造した化合物８，１１，１５の合成経路を示す図である。
【図５】製造例１〜３で製造した化合物８，１１，１５の合成経路を示す図である。
【図６】製造例１〜３で製造した化合物８，１１，１５の合成経路を示す図である。
【図７】DTPA-cs124のユウロピウム(III)錯体の吸収スペクトルを示す図である。
【図８】化合物８のユウロピウム(III)錯体の吸収スペクトルを示す図である。
【図９】化合物１１のユウロピウム(III)錯体の吸収スペクトルを示す図である。
【図１０】化合物１５のユウロピウム(III)錯体の吸収スペクトルを示す図である。
【図１１】化合物８（上）、１１（中）及び１５（下）のテルビウム(III)錯体の蛍光スペクトルを示す図である。
【図１２】化合物８（上）、１１（中）及び１５（下）のユウロピウム(III)錯体の蛍光スペクトルを示す図である。
Claims (5)
- 下式（化１）
−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−（Ｃ６Ｈ ４ ）（−ＮＨＲ１）
（式中、ｎは１〜５の整数、ｍは０〜２であってｎ−１以下の整数であり、Ｒ１は、−ＣＯＸ（Ｘはアルキル基を表す。）を表す。）で表されるセンサー置換基及び７位の位置に−ＣＨ２（ＣＯＮＨ）ｑ−（式中、ｑは０又は１を表す。）を介して結合する下式（化６）
下式で表わされる
- 前記センサー置換基において、アミノ基（−ＮＨＲ１）が２価炭化水素基（−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−）に対してベンゼン環（Ｃ６Ｈ５−ｏ）のパラ位に位置し、前記アルキル基がメチル基である請求項１に記載の錯体。
- ｎが１であり、ｍが０である請求項１又は２に記載の錯体。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光性ランタニド錯体からなるＰＥＴセンサー。
- 液相で請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛍光性ランタニド錯体を被測定物と共存させ、該錯体の蛍光を測定することにより、該被測定物を高感度に感知する方法。
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