JP5887011B2 - 蛍光プローブ - Google Patents
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Description
より具体的には、フルオレセイン骨格を化学修飾することにより、分子内光誘起電子移動を利用した蛍光off/on型プローブであって、赤色のバイオイメージングを行うことができる新規な蛍光プローブを提供することが本発明の課題である。また、特定のオルガネラに集積せずにサイトゾル中で測定対象物質の挙動を測定することができる蛍光プローブを提供することも本発明の課題である。
上記の糖加水分解酵素と同様に他の加水分解酵素、例えば、R8がアルカリフォスファターゼの捕捉基であるリン酸基である上記の化合物又はその塩なども提供される。
(a)「TokyoMagenta」は、一般式(I)においてR1が水素原子であり、R2及びR3が水素原子であり、R4及びR5がメチル基であり、R6及びR7が水素原子であり、R8が水素原子であり、Xが珪素原子である化合物を意味しており、この化合物を「TM」と略す場合がある。
(b)一般式(I)においてR1が水素原子であり、R2及びR3が水素原子であり、R4及びR5がメチル基であり、R6及びR7が水素原子であり、R8が水素原子であり、Xがゲルマニウム原子である化合物を「Ge-TM」と略す場合がある。
また、「2-OMe-5-Me TokyoMagenta」と略式記載がある場合、「2-OMe-5-Me」は、「TM」のキサンテン環の9位に置換するベンゼン環の2位にR1としてメトキシ基が置換し、5位にR1としてメチル基が置換していることを示す。
上記のように「TM」を母核とした場合の略式記載例を説明した。「Ge-TM」が母核である場合には、「TM」が「Ge-TM」に置き換わるだけで、その他は同様である。
(A-1)
上記の捕捉基は特許4402191号公報及びJ. Am. Chem. Soc., 127, pp.10197-10204, 2005に開示されている。
上記の捕捉基はJ. Am. Chem. Soc., 124, pp.776-778, 2002に開示されている。
上記の捕捉基は米国特許第5648270号明細書に記載されている。
上記の捕捉基はCell Calcium, 31, pp.245-251, 2002に開示されている。
上記の捕捉基は特開2000-239272号公報に開示されている。
上記の捕捉基は特許第3200024号公報、米国特許第6441197号明細書、米国特許第675623号明細書、及び特許第3967943号公報に開示されている。
上記の捕捉基は国際公開WO2001064664号公報に開示されている。
(D-1)
上記の捕捉基は国際公開WO2010026743に開示されている。
上記の捕捉基は国際公開WO2009110487号公報に開示されている。
上記の捕捉基は特許第4373608号公報及び国際公開WO2002018362に開示されている。
上記の捕捉基は国際公開WO2008099914号公報及び国際公開WO2008059910号公報に開示されている。
上記の捕捉基はAmerican Journal of Physiology, 256, C540-548, 1989に開示されている。
上記の捕捉基はBioorg. Med. Chem. Lett., 15, pp.1851-1855, 2005に開示されている。
(1)R1aがメチル基若しくはエチル基などのC1-6アルキル基、又はカルボキシル基であり、R2、R3、R6、及びR7がそれぞれ独立に水素原子、フッ素原子、又は塩素原子であり、R4及びR5がそれぞれ独立にメチル基、エチル基などのC1-6アルキル基であり、R8が水素原子であり、R201、R202、R203、及びR204がカルボキシル基であり、R205及びR206がそれぞれ独立に水素原子、メチル基などのC1-6アルキル基、ニトロ基、又はフッ素原子である化合物;
(2)R1aがメチル基若しくはエチル基などのC1-6アルキル基、又はカルボキシル基であり、R2、R3、R6、及びR7がそれぞれ独立に水素原子、フッ素原子、又は塩素原子であり、R4及びR5がそれぞれ独立にメチル基、エチル基などのC1-6アルキル基であり、R8が水素原子、アセチル基などのアルカノイル基、又はアセトキシメチル基などのアルカノイルオキシアルキル基であり、R201、R202、R203、及びR204がアセトキシメチルオキシカルボニル基などのアルカノイルオキシアルキルオキシカルボニル基であり、R205及びR206がそれぞれ独立に水素原子、メチル基などのC1-6アルキル基、ニトロ基、又はフッ素原子である化合物;及び
(3)上記(2)の化合物においてR1aがカルボキシル基であり、X-キサンテン環の9位に結合してラクトンを形成しており、X-キサンテン環の3位のオキソ基が水酸基、アセトキシ基などのアルカノイルオキシ基、又はアセトキシメチルオキシ基などのアルカノイルオキシアルキルオキシ基となった化合物
(4) R1が結合するベンゼン環とR1との組み合わせで形成される捕捉基が式(j-1)で表される捕捉基となる化合物
などを挙げることができるが、本発明の化合物はこれらの化合物に限定されることはない。上記(4)の態様のように式(I)で表される化合物のベンゼン環が捕捉基の一部となる場合も本発明の範囲に包含されることに留意すべきである。
Xは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示すが、珪素原子であることが好ましい。
例1(参考例)
以下のスキームに従ってベンゼン環上にR1としてメチル基が導入された化合物を合成した。
炭酸カリウム (22.0 g, 159 mmol)をアセトニトリルに懸濁し、3-ブロモアニリン (8.71 mL, 80.0 mmol)、アリルブロミド (23.7 mL, 280 mmol) を加えて80℃で14時間攪拌した。室温まで冷却した後にセライトろ過を行い、酢酸エチルでよく洗った。溶媒を除去した後にカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 1/40 酢酸エチル/ヘキサン) で精製し、3-ブロモ-N,N-ジアリルアニリン (17.1 g, 67.9 mmol, 収率85%) を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CDCl3): δ 3.87-3.90 (m, 4H), 5.11-5.15 (m, 2H), 5.17-5.18 (m, 2H), 5.75-5.88 (m, 2H), 6.58 (dd, 1H, J = 2.2, 8.1 Hz), 6.77-6.81 (m. 2H), 7.01 (t, 1H, J = 8.1Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): δ 52.7, 110.8, 115.0, 116.3, 119.0, 123.3, 130.2, 133.2, 150.0
HRMS (ESI+): Found: 252.0429, calculated 252.0388 for [M+H]+ (+4.1 mmu)
3-ブロモ-N,N-ジアリルアニリン (17.1 g, 67.9 mmol) を酢酸 (200 mL) に溶解し、37% ホルムアルデヒド液 (10.2 g, 340 mmol)を加えて80℃で75分間加熱した。室温まで冷却した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とNaOHで中和した。この混合物をジクロルメタンで抽出し、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 1/30 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、ビス(2-ブロモ-4-N,N-ジアリルアミノフェニル)メタン (15.2 g, 29.5 mmol, 収率87%)を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CDCl3): δ 3.85-3.87 (m, 8H), 3.96 (s, 2H), 5.13-5.19 (m, 8H), 5.76-5.88 (m, 4H), 6.54 (dd, 2H, J = 2.9, 8.8 Hz), 6.81 (d, 2H, J =8.1 Hz), 6.90 (d, 2H, J = 2.9 Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): δ 39.7, 52.7, 111.7, 116.0, 116.2, 125.5, 126.9, 130.8, 133.5, 148.1
HRMS (ESI+): Found: 517.0654, calculated 517.0677 for [M+H]+ (-2.3 mmu)
乾燥させアルゴン置換したフラスコにビス(2-ブロモ-4-N,N-ジアリルアミノフェニル)メタン (8.16 g, 15.8 mmol) と脱水テトラヒドロフラン(THF, 50 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム (45 mL, 45mmol) を加え、20分間攪拌した。そのままの温度でジクロロジメチルシラン (2.9 mL, 30 mmol) を脱水THF 10 mLに溶解してゆっくりと加え、室温に戻して1時間攪拌した。2N 塩酸で反応を停止して炭酸水素ナトリウムで中和した。この混合物をジクロルメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を除去した。残渣をアセトン (150 mL)に溶解し、0℃に冷却して過マンガン酸カリウム (6.88 g, 43.5 mmol)を少量ずつ2時間かけて加え、さらに同じ温度で1時間攪拌した。ジクロルメタン (200 mL)を加えてろ紙を用いて吸引ろ過した。溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ジクロルメタン) で精製してN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントン (2.23 g, 5.20 mmol, 収率33%) を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CDCl3): δ 0.41 (s, 6H), 4.02 (d, 8H, J = 5.1 Hz), 5.17-5.23 (m, 8H), 5.82-5.94 (m, 4H), 6.80-6.83 (m, 4H), 8.34 (d, 2H, J = 8.1 Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): δ -1.1, 52.8, 113.5, 114.8, 116.7, 130.0, 131.7, 133.1, 140.5, 150.2, 185.1
HRMS (ESI+): Found:429.2347, calculated 429.2362 for [M+H]+ (-1.5 mmu)
乾燥させアルゴン置換したフラスコにPd(PPh3)4 (35.0 mg, 0.0303 mmol) と1,3-ジメチルバルビツール酸 (196 mg, 1.08 mmol) を加えた。この混合物にN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントン(99.2 mg, 0.231 mmol) をジクロルメタン 10 mL に溶解して加え、64℃で16時間攪拌した。溶媒を除去して飽和炭酸ナトリウム水溶液に懸濁し、ジクロルメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 4/3 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、ジアミノ-Si-キサントン(48.8 mg, 0.182 mmol, 収率79%) を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CD3OD): δ 0.40 (s, 6H), 6.76 (dd, 2H, J = 2.6, 8.4 Hz), 6.88 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 8.13 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CD3OD): δ -1.3, 116.6, 118.4, 131.0, 132.8, 142.6, 153.0, 187.5
HRMS (ESI+Tof): m/z Found: 269.1108, calculated 269.1110 for [M+H]+ (-0.2 mmu)
ジアミノ-Si-キサントン (48.8 mg, 0.182 mmol) を混合溶媒 (メタノール/6 N 硫酸, 4/5) 45 mLに溶解した。0℃に冷却後、亜硝酸ナトリウム (84.6 mg, 1.22 mmol) を水 2mLに溶解してゆっくりと加え、そのままの温度で1時間攪拌した。この混合物を沸騰した1 N 硫酸 (50 mL) にゆっくりと加え、さらに10分間還流した後に氷冷した。反応液をジクロルメタンで抽出し、食塩水でよく洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 1/20 メタノール/ジクロロメタン)で精製し、ジヒドロキシ-Si-キサントン (32.9mg, 0.122 mmol, 収率67%) を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CD3OD): δ 0.45 (s, 6H), 6.95 (dd, 2H, J = 2.2, 8.8 Hz), 7.07 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 8.26 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CD3OD): δ -1.5, 118.4, 120.0, 133.3, 133.8, 143.1, 162.2, 187.6
HRMS (ESI-Tof): Found 269.0674, calculated 269.0634 for [M-H]- (+4.0 mmu)
ジヒドロキシ-Si-キサントン (32.9 mg, 0.122 mmol), イミダゾール (85.5 mg, 1.26 mmol) をジクロルメタン 20 mLに溶解し、tert-ブチルジメチルシリルクロリド(185mg, 1.23 mmol)をジクロルメタン 5 mLに溶解してゆっくりと加え、室温で14時間攪拌した。この混合物に水を加えてジクロルメタンで抽出し、食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 1/20 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-ジ-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-Si-キサントン(52.8 mg, 0.106 mmol, 収率84%)を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CDCl3): δ 0.26 (s, 12H), 0.46 (s, 6H), 1.01 (s, 18H), 6.98 (dd, 2H, J = 2.2, 8.8 Hz), 7.04 (d, 2H, J = 2.9 Hz), 8.37 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): δ -4.3, -1.6, 18.3, 25.6, 121.8, 123.7, 132.3, 134.5, 141.1, 158.7, 186.0
HRMS (ESI+): Found: 499.2480, calculated 499.2520 for [M+H]+ (-4.0 mmu)
よく乾燥させアルゴン置換したフラスコに、2-ブロモトルエン (200 μL, 1.6 mmol) と 脱水THF (5 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム (1.0 mmol)を加えて20分間攪拌した。そのままの温度で3,6-ジ-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-Si-キサントン (9.4 mg, 0.019 mmol) を脱水THF 5 mL に溶解してゆっくりと加え、室温に戻した。室温で1時間攪拌後、2N 塩酸を10 mL加えて20分間攪拌した。この混合物をジクロルメタンで抽出して食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した後、HPLC で精製して2-Me TokyoMagenta (4.5 mg, 0.013 mmol, 収率69%) を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, D2O): δ 0.46 (s 6H), 2.01 (s, 3H), 6.33 (dd, 2H, J = 2.9, 9.5 Hz), 7.01-7.09 (m, 5H), 7.27-7.46 (m, 3H)
HRMS (ESI-): Found:,343.1120 calculated 343.1154 for [M-H]- (-3.41mmu)
例1の工程(6)で得られた3,6-ジ-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-Si-キサントンを用いて以下の方法により化合物(a)〜(e)を合成した。
よく乾燥させアルゴン置換したフラスコに、ブロモベンゼン誘導体(1.0 mmol)と脱水テトラヒドロフラン(THF, 5 mL)を加えた。−78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム (0.5 mmol)を加えて20分間攪拌した。そのままの温度で3,6-ジ-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-Si-キサントン(0.015−0.019 mmol)を脱水THF 5 mL に溶解してゆっくりと加え、室温に戻した。室温で1時間攪拌後、2N 塩酸を5 mL加えて20分間攪拌した。反応混合物をジクロルメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を除去した後、残渣をHPLC にて精製して目的物を得た。
1H-NMR (300 MHz, D2O): δ 0.37 (s, 6H), 1.83 (s, 3H), 2.25 (s, 3H), 6.21 (dd, 2H, J = 1.5, 9.5 Hz), 6.75 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.89-6.94 (m, 5H), 7.07 (s, 1H).
1H-NMR (300 MHz, D2O): δ 0.38, (s, 3H), 0.40, (s, 3H), 1.82 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 6.19 (dd, 2H, J = 2.2, 9.5 Hz), 6.73 (s, 1H), 6.89-7.11 (m, 6H).
1H-NMR (300 MHz, D2O): δ 0.40, (s, 3H), 0.44, (s, 3H), 3. 65 (s, 3H), 6.29 (dd, 2H, J = 2.9, 9.5 Hz), 6.96-7.18 (m, 7H), 7.50 (dd, 1H, J = 7.0, 7.0 Hz).
1H-NMR (300 MHz, D2O): δ 0.40, (s, 3H), 0.42, (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 3.58 (s, 3H), 6.23 (dd, 2H, J = 2.2, 9.5 Hz), 6.75 (s, 1H), 6.95-7.03 (m, 5H), 7.21 (d, 1H, J = 8.1 Hz).
1H-NMR (300 MHz, D2O): δ 0.39, (s, 3H), 0.41, (s, 3H), 3.53 (s, 3H), 3.58 (s, 3H), 6.22 (dd, 2H, J = 2.2, 9.5 Hz), 6.54 (d, 1H, J = 2.9 Hz), 6.89-7.02 (m, 6H).
HRMS (ESI+): m/z Found 743.2276, calculated 743.2272 for [M+H]+ (+0.3 mmu).
例3で得られたCalcium TokyoMagentaを用いて種々の濃度のカルシウムイオンの存在下で蛍光を測定した。100 mMの塩化カリウム及び10 mM EGTAを含む30 mM MOPS緩衝液(pH 7.2)に溶解したCalcium TokyoMagenta(1μM)に遊離カルシウムイオンを種々の濃度(0, 0.017, 0.038, 0.065, 0.100, 0.150, 0.225, 0.351, 0.602, 1.35, 35μM)で添加して22℃において蛍光スペクトルを測定した(励起波長: 550 nm)。カルシウムイオン濃度が増加するにつれて蛍光強度の増強が認められた(図2)。Kd値は0.25 μMであった。
以下の方法により本発明の化合物を製造するための母核化合物として利用可能なゲルマニウム含有化合物を合成した。
乾燥させアルゴン置換したフラスコに、ビス(2-ブロモ-4-N,N-ジアリルアミノフェニル)メタン(6.16 g, 11.9 mmol) と脱水THF (40 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム(BuLi) (34 mL, 34 mmol) を加え、20分間攪拌した。そのままの温度でジクロロジメチルゲルマン (2.62 mL, 22.7 mmol) を脱水THF 15 mLに溶解したものをゆっくりと加え、室温に戻し1時間攪拌した。2N 塩酸で反応を止め、炭酸水素ナトリウムで中和した。これをジクロルメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を除去した。これをアセトン (120 mL)に溶解し、0℃に冷却した。この混合物に過マンガン酸カリウム (5.20 g, 32.9 mmol)を少量ずつ2時間かけて加え、さらに同じ温度で1時間攪拌した。この混合物にジクロルメタン (200 mL)を加えて、その溶液をろ紙を用いて吸引ろ過した。そして溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー (シリカゲル、ジクロルメタン) で精製することにより目的物(1.29 g, 2.72 mmol, 収率 23%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.54 (s, 6H), 4.00-4.02 (m, 8H) 5.17-5.23 (m, 8H), 5.81-5.94 (m, 4H), 6.72 (d, 2H, J = 2.9 Hz), 6.78 (dd, 2H, J = 2.6, 9.2 Hz), 8.36 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ -1.8, 52.3, 112.6, 114.4, 116.2, 129.6, 131.7, 132.7, 142.8, 149.8, 184.5
LRMS (ESI+): m/z Found 475, calculated 475 for [M+H]+
乾燥させアルゴン置換したフラスコに、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム (330 mg, 0.285 mmol) と 1,3-ジメチルバルビツール酸(1.41 g, 9.04 mmol) を加えた。この混合物に、N,N,N',N'-テトラアリルジアミノ-Ge-キサントン (1.00 g, 2.11 mmol) をジクロルメタン 50 mL に溶解して加え、35℃で16時間攪拌した。溶媒を除去して飽和炭酸ナトリウム水溶液に懸濁し、ジクロルメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 4/3 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-ジアミノ-Ge-キサントン混合物 (760 mg, 定量的) を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 0.55 (s, 6H), 6.73-6.76 (m, 4H), 8.33 (d, 2H, J = 9.5 Hz)
13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ -1.9, 116.1, 118.3, 130.9, 133.2, 145.2, 152.9, 187.3
LRMS (ESI+): m/z Found: 315, calculated 315 for [M+H]+
3,6-ジアミノ-Ge-キサントン混合物 (760 mg) を3/4, メタノール / 6 N 硫酸 (45 mL)に溶解した。0℃に冷却後、亜硝酸ナトリウム (838 mg, 12.1 mmol) を水 5mLに溶解してゆっくりと加え、そのままの温度で1時間攪拌した。それを沸騰した1 N 硫酸 (70 mL) にゆっくりと加え、さらに10分間還流した後氷冷した。反応液をジクロルメタンで抽出し食塩水でよく洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 1/1 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-ジヒドロキシ-Ge-キサントン(478 mg, 1.52 mmol, 収率 56% 2 ステップ) を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 0.58 (s, 6H), 6.90 (dd, 2H, J = 2.2, 8.8 Hz), 7.0 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 8.25 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ -2.0, 117.7, 120.0, 133.7, 133.8, 145.6, 162.0, 187.7
LRMS (ESI+): Found 317, calculated 317 for [M+H]+
ジヒドロキシ-Ge-キサントン(478 mg, 1.52 mmol)、イミダゾール(1.77 g, 26.0 mmol) をジクロルメタン 150 mLに溶解し、TBDMSCl (tert-ブチルジメチルシリルクロリド:3.70 g, 24.5 mmol)をジクロルメタン 50mLに溶解してゆっくりと加えて室温で14時間攪拌した。この混合物に水を加えてジクロルメタンで抽出し食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー (シリカゲル, 1/30 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-diTBDMSO-Ge-キサントン (702 mg, 1.29 mmol, 収率 85%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.25 (s, 12H), 0.59 (s, 6H), 1.01 (s, 18H), 6.92-6.98 (d, 4H, m), 8.36 (d, 2H, J = 8.1 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ -4.4, -1.6, 18.2, 25.8, 121.1, 123.7, 132.5, 134.6, 143.6, 158.6, 185.9
LRMS (ESI+): m/z Found 545, calculated 545 for [M+H]+
よく乾燥させアルゴン置換したフラスコにブロモベンゼン誘導体 (1.0 mmol) と 脱水THF (5 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム (0.5 mmol)を加えて20分間攪拌した。そのままの温度で3,6-diOTBDMS-X-キサントン (0.015-0.020 mmol) を脱水THF 5 mL に溶解してゆっくりと加え、室温に戻した。室温で1時間攪拌後、2N 塩酸を10 mL加えて20分間攪拌した。それをジクロルメタン で抽出して食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した後、HPLC で精製して一般式(I)(式中、R8が水素原子を示す)で表される化合物を得た。
上記(e)の方法に従って目的物を得た(収率 99%)
1H-NMR (300 MHz, D2O): δ 0.42 (s, 6H), 1.80 (s, 3H), 6.11 (dd, 2H, J = 2.2, 9.5 Hz), 6.79-6.86 (m, 5H), 7.06-7.26 (m, 4H)
HRMS (ESI+): m/z Found 391.0755, calculated 391.0753 for [M+H]+ (0.2 mmu)
乾燥させアルゴン置換したフラスコにビス(2-ブロモ-4-N,N-ジアリルアミノフェニル)メタン(1.65 g, 3.20 mmol) と脱水THF (20 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム (10 mL, 10 mmol) を加え、20分間攪拌した。そのままの温度でジクロロジエチルシラン (1.04 mL, 7.02 mmol) を脱水THF 5 mLに溶解してゆっくり加え、室温に戻し1時間攪拌した。2N 塩酸で反応を止め、炭酸水素ナトリウムで中和した。これをジクロルメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を除去した。これをアセトン(50 mL)に溶解し、0℃に冷却した。この混合物に過マンガン酸カリウム (1.49 g, 9.43 mmol)を少量ずつ2時間かけて加え、さらに同じ温度で1時間攪拌した。この混合物にジクロルメタン(50 mL)を加えて、その溶液をセライトろ過した。そして溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー (シリカゲル, 10/1 ヘキサン/酢酸エチル) で精製することによりN,N,N',N'-3,6-テトラアリルジアミノ-ジエチルSi-キサントン (419 mg, 0.917 mmol, 収率 29%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.91 (s, 10H), 4.01-4.02 (m, 8H) 5.17-5.22 (m, 8H), 5.82-5.94 (m, 4H), 6.79-6.84 (m, 4H), 8.35 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 5.56, 7.48, 52.7, 113.3, 115.0, 116.5, 130.9, 131.6, 133.1, 138.3, 149.9, 185.3
HRMS (ESI+): m/z Found 457.2661, calculated 457.2675 for [M+H]+ (-1.5 mmu)
乾燥させアルゴン置換したフラスコに、Pd(PPh3)4 (204 mg, 0.176 mmol) と1,3-ジメチルバルビツール酸(1.04 g, 6.67 mmol) を加えた。この混合物に、N,N,N',N'-テトラアリルジアミノ-ジエチルSi-キサントン (419 mg, 0.917 mmo) をジクロルメタン 30 mL に溶解して加え、35℃で16時間攪拌した。溶媒を除去して飽和炭酸ナトリウム水溶液に懸濁し、ジクロルメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 4/5 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-ジアミノ-ジエチルSi-キサントン (236 mg, 0.796 mmol, 収率 87%) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.83-0.95 (m, 10H), 4.10 (s, 4H), 6.76-6.81 (m, 4H), 8.33 (d, 2H, J = 7.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 5.37, 7.38, 116.2, 117.5, 132.0, 132.9, 138.8, 148.9, 185.5
HRMS (ESI+): m/z Found 297.1462, calculated 297.1423 for [M+H]+ (3.9 mmu)
3,6-ジアミノ-ジエチルSi-キサントン混合物(236 mg, 0.796 mmol) を3/4 メタノール/6N 硫酸 (35 mL)に溶解した。0℃に冷却後、亜硝酸ナトリウム (315 mg, 4.56 mmol) を水 3 mLに溶解したてゆっくりと加え、そのままの温度で1時間攪拌した。それを沸騰した1 N 硫酸 (50 mL) にゆっくりと加え、さらに10分間還流した後に氷冷した。反応液をジクロルメタンで抽出し、食塩水でよく洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、1/1 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-ジヒドロキシ-ジエチルSi-キサントン (74.3 mg, 0.249 mmol, 収率 31%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 0.83-1.04 (m, 10H), 6.99 (dd, 2H, J = 2.2, 8.8 Hz), 7.09 (d, 2H, J = 2.9 Hz), 8.31 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 6.07, 7.56, 118.4, 120.0, 133.4, 135.0, 140.9, 162.0, 187.9
HRMS (ESI+): m/z Found 321.0964, calculated 321.0923 for [M+Na]+ (4.1 mmu)
ジヒドロキシ-ジエチルSi-キサントン(74.3 mg, 0.249 mmol)、イミダゾール(326 mg, 4.79 mmol)をジクロルメタン 20 mLに溶解し、TBDMSCl (715 mg, 4.74 mmol)をジクロルメタン 5 mLに溶解してゆっくり加えて室温で14時間攪拌した。この混合物に水を加えてジクロルメタンで抽出し、食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー (シリカゲル、1/30 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-diTBDMSO-ジエチルSi-キサントン (93.2 mg, 0.177 mmol, 収率 71%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.26 (s, 12H), 0.85-1.02 (m, 28H), 6.98-7.05 (m, 4H), 8.39 (d, 2H, J = 8.1 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ -4.14, 5.46, 7.45, 18.5, 25.8, 122.1, 123.9, 132.5, 135.8, 139.2, 158.7, 186.3
HRMS (ESI+): m/z Found 527.2869, calculated 527.2833 for [M+H]+ (3.6 mmu)
例5の工程(e)の方法に従って目的物を得た(収率 94%)。
1H NMR (300 MHz, D2O, CD3OD): δ 0.78-1.00 (m, 10H), 1.94 (s, 3H), 8.26 (dd, 2H, J = 2.6, 9.2 Hz) 6.88-6.98 (m, 5H), 7.24-7.39 (m, 3H)
HRMS (ESI+): m/z Found 373.1621, calculated 373.1624 for [M+H]+ (-0.3 mmu)
13C-NMR (100 MHz, CD3COCD3): δ -1.4, 0.2, 91.1, 117.6, 121.1, 125.5, 126.3, 127.0, 129.3, 130.1, 135.1, 136.7, 138.2, 155.3, 157.7, 170.4
HRMS (ESI+): m/z Found 375.1018 , calculated 375.1053 for [M+H]+ (-3.5 mmu)
3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン(81.1 mg, 0.300 mmol)をメタノール(5 mL) に溶解し、この混合物に 次亜塩素酸ナトリウム を100 mMになるように溶かした 0.1 N NaOH 4 mLをゆっくりと加え室温で1時間攪拌した。反応液に2 N 塩酸 を加えてpH 2とした後に 酢酸エチルで抽出し、食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、1/1 酢酸エチル/ヘキサン)で精製することにより、4,5-ジクロロ-3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン(83.8 mg, 0.247 mmol, 収率 82 %)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.80 (s, 6H), 7.11 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 8.27 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C-NMR (100 MHz, CD3OD): δ -1.6, 119.0, 127.0, 132.0, 133.8, 141.4, 158.4, 186.0
HRMS (ESI+): m/z Found 339.0053, calculated 339.0011 for [M+H]+ (4.2 mmu)
4,5-ジクロロ-3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン(69.0 mg, 0.203 mmol)、イミダゾール(54.5 mg, 0.801 mmol)をジクロルメタン(10 mL)に溶解し、TBDMSCl(121 mg, 0.803 mmol)をゆっくりと加え、室温で一晩攪拌した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ジクロルメタン)で精製することにより、4,5-ジクロロ-3,6-diOTBDMS-Si-キサントン(109 mg, 0.193 mmol, 収率 95%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.30 (s, 12H), 0.81 (s, 6H), 1.06 (s, 18H), 7.06 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 8.35 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ -4.3, -2.0, 18.4, 25.6, 121.5, 130.6, 131.0, 134.2, 140.5, 155.1, 184.9
HRMS (ESI+): m/z Found 567.1731, calculated 567.1740 for [M+H]+ (-0.9mmu)
乾燥させアルゴン置換したフラスコに2-ブロモトルエン(17.1 mg, 0.100 mmol)と脱水THF (2 mL) を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム (0.10 mmol)を加えて20分間攪拌した。 そのままの温度で4,5-ジクロロ-3,6-diOTBDMS-Si-キサントン(11.3 mg, 0.0200 mmol) を脱水THF 2 mL に溶解してゆっくり加え、室温に戻した。室温で1時間攪拌後、2N 塩酸を2 mL加えて20分間攪拌した。それをジクロルメタンで抽出して食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した後、HPLC で精製して2-Me DCTM (8.2 mg, 0.020 mmol, 収率 99%)を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD): δ 0.87 (s, 3H), 0.87 (s,3H), 2.04 (s, 3H), 6.57 (d, 2H, J = 9.5 Hz), 6.90 (d, 2H, J = 9.5 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 6.6 Hz), 7.32-7.47 (m, 3H)
HRMS (ESI+): m/z Found 413.0526, calculated 413.0531 for [M+H]+ (-0.5mmu)
乾燥させアルゴン置換したフラスコに2-ブロモ安息香酸tert-ブチル(129 mg, 0.502 mmol)と脱水 THF (5 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1 M sec-ブチルリチウム (0.30 mmol)を加えて20分間攪拌した。そのままの温度で4,5-ジクロロ-3,6-diOTBDMS-Si-キサントン(11.3 mg, 0.0200 mmol) を脱水THF 5 mL に溶解してゆっくりと加え、室温に戻した。室温で1時間攪拌後、2N 塩酸を10 mL加えて20分間攪拌した。それをジクロルメタン で抽出して食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した後、残渣にTFA (5 mL)を加えて室温で2時間攪拌した。溶媒を除去した後、HPLC で精製して2-COOH DCTM (5.7 mg, 0.013 mmol, 収率 64%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.83 (s, 3H), 0.98 (s, 3H), 6.85 (d, 2H J = 8.8 Hz), 6.89 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.98 (d, 1H J = 7.8 Hz), 7.51 (td, 1H, J = 1.0, 7.6 Hz), 7.60 (td, 1H, J = 1.0, 7.6 Hz), 7.90 (d, 1H, J = 7.8 Hz)
13C-NMR (100 MHz, CD3COCD3): δ -0.2, 0.5, 90.0, 119.8, 123.6, 124.3, 126.4, 127.1, 127.8, 129.9, 135.1, 136.2, 136.7, 153.6, 158.3, 171.2
HRMS (ESI+): m/z Found 443.0241, calculated 443.0273 for [M+H]+ (-3.2 mmu)
3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン (13.5 mg, 0.050 mmol)をアセトニトリル(3 mL)に溶解し、この混合物に Selectfluor (登録商標, 35.4 mg, 0.1 mmol)を加え、80℃で一晩加熱還流を行った後、HPLC で精製して4,5-ジフルオロ-3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン(4.1 mg, 0.013 mmol, 収率 27 %)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.62-0.63 (m, 6H), 7.12 (m, 2H), 8.13 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
HRMS (ESI+): m/z, Found 329.0393, calculated 329.0422 for [M + Na]+ (-2.9 mmu)
4,5-ジフルオロ-3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン(3.1 mg, 0.010 mmol)、イミダゾール(6.8 mg, 0.10 mmol)をジクロルメタン(2 mL)に溶解し、TBDMSCl(15.1 mg, 0.10 mmol)をゆっくりと加え、室温で一晩攪拌した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ジクロルメタン)で精製することにより、4,5-ジフルオロ-3,6-diOTBDMS-Si-キサントン(4.7 mg, 0.088 mmol, 収率 88%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.25 (s, 12H), 0.64 (s, 6H), 1.02 (s, 18H), 7.09 (t, 2H, J = 8.8 Hz), 8.20 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
HRMS (ESI+): m/z Found 535.2380, calculated 535.2332 for [M + H]+ (4.8 mmu)
乾燥させアルゴン置換したフラスコに2-ブロモトルエン(85.5 mg, 0.500 mmol)と脱水THF (3 mL) を加えた。 -78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム (0.050 mmol)を加えて20分間攪拌した。そのままの温度で4,5-ジフルオロ-3,6-diOTBDMS-Si-キサントン(5.4 mg, 0.010 mmol)を脱水THF 3 mL に溶解してゆっくり加え、室温に戻した。室温で1時間攪拌後、2N 塩酸を2 mL加えて20分間攪拌した。それをジクロルメタンで抽出して食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した後、HPLC で精製して2-Me DFTM (3.8 mg, 0.010 mmol, 収率 定量的)を得た。
1H-NMR (300 MHz, D2O): δ 0.60-0.64 (m, 6H), 1.94 (s, 3H), 6.42 (t, 2H, J = 9.5 Hz), 6.90 (d, 2H, J = 9.5 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 7.22 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 7.32 (t, 1H, J = 7.3 Hz), 7.44 (d, 1H, J = 7.3 Hz)
HRMS (ESI+): m/z Found 381.11145, calculated 381.1122 for [M + H]+ (2.3 mmu)
乾燥させアルゴン置換したフラスコに、2-ブロモ安息香酸tert-ブチル(51 mg, 0.20 mmol)と脱水 THF (3 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1 M sec-ブチルリチウム(0.30 mmol) を加えて20分間攪拌した。そのままの温度で4,5-ジフルオロ-3,6-diOTBDMS-Si-キサントン(5.4 mg, 0.010 mmol) を脱水THF 3 mL に溶解してゆっくり加え、室温に戻した。室温で1時間攪拌後、2N 塩酸を10 mL加えて20分間攪拌した。それをジクロルメタン で抽出して食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した後、残渣にTFA (3 mL)を加えて室温で2時間攪拌した。溶媒を除去した後、HPLC で精製して2-COOH DFTM (2.2 mg, 0.054 mmol, 収率 54%)を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD): δ 0.68 (s, 3H), 0.79 (s, 3H), 6.66 (d, 2H J = 8.8 Hz), 6.87 (t, 2H, J = 9.2 Hz), 7.13 (d, 1H J = 7.3 Hz), 7.57-7.68 (m, 2H), 7.92 (d, 1H, J = 8.1 Hz)
HRMS (ESI+): m/z Found 411.0902 , calculated 411.0864 for [M+H]+ (3.8 mmu)
3,6-ジヒドロキシキサントン (45.6 mg, 0.200 mmol) を メタノール (5 mL) に溶解し、そこに 次亜塩素酸ナトリウム を10 mMになるように溶かした 0.1 N NaOH 45 mLをゆっくりと加え室温で一晩攪拌した。反応液に2 N 塩酸 を加えてpH 2とした後に酢酸エチルで抽出し、食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 2/1 酢酸エチル/ヘキサン)で精製することにより、4,5-ジクロロ-3,6-ジヒドロキシキサントン (57.3 mg, 0.193 mmol, 収率 96 %)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.02 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 8.01 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C-NMR (100 MHz, CD3OD): δ 109.2, 114.7, 116.0, 126.4, 154.9, 161.2, 176.7
HRMS (ESI+): m/z Found 318.9527, calculated 318.9541 for [M+Na]+ (-1.4 mmu)
4,5-ジクロロ-3,6-ジヒドロキシキサントン(44.6 mg, 0.150 mmol)、イミダゾール (40.8 mg, 0.600 mmol) を ジクロロメタン(10 mL)に溶解し、TBDMSCl (90.4 mg, 0.600 mmol)をゆっくりと加え、室温で一晩攪拌した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ジクロロメタン)で精製することにより、4,5-ジクロロ-3,6-diOTBDMS-キサントン (68.2 mg, 0.130 mmol, 収率 87%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.31 (s, 12H), 1.07 (s, 18H), 6.95 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 8.12 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ -4.2, 18.4, 25.6, 113.8, 116.7, 117.1, 125.2, 153.5, 157.6, 175.2
HRMS (ESI+): m/z Found 525.1495, calculated 525.1451 for [M+H]+ (4.4 mmu)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.49 (s, 3H), 0.51 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 5.79 (s, 2H), 6.31 (dd, 1H, J = 9.5, 2.2 Hz), 6.89-6.99 (m, 3H), 7.00 (dd, 1H, J = 9.5, 2.2 Hz), 7.09 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.30-7.40 (m, 4H)
HRMS (ESI+): m/z Found 417.1536, calculated 417.1522 for [M + H]+ (1.4 mmu)
乾燥させアルゴン置換したフラスコに4-ブロモ-3-メチル安息香酸tert-ブチル(1.08 g, 3.98 mmol) と脱水 THF (20 mL)を加えた。 -78℃に冷却後、1 M sec-ブチルリチウム (4.0 mmol) を加えて20分間攪拌した。そのままの温度で3,6-diOTBDMS-Si-キサントン (200 mg, 0.403 mmol) を脱水THF 10 mL に溶解してゆっくり加え、室温に戻した。室温で1時間攪拌後、2N 塩酸を20 mL加えて20分間攪拌した。それをジクロルメタン で抽出して食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した後、残渣に TFA (20 mL)を加えて室温で2時間攪拌した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 1/24 メタノール/ジクロルメタン) で精製することにより2-Me-4-COOH TM (148 mg, 0.381 mmol, 収率 96 %)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3COCD3): δ 0.51 (s, 3H), 0.53 (s,3H), 2.14 (s, 3H), 6.50 (dd, 2H, J = 2.4, 9.8 Hz), 6.84 (d, 2H, J = 9.8 Hz), 7.11 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 7.31 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 8.03 (dd, 1H, J = 1.0, 7.8 Hz), 8.05 (s, 1H)
13C-NMR (100 MHz, CD3COCD3): δ -1.5, -1.3, 19.5, 123.0, 128.0, 130.1, 130.5, 131.4, 132.1, 137.5, 139.2, 145.0, 145.1, 145.3, 156.4, 167.4, 172.2
HRMS (ESI+): m/z Found 389.1209, calculated 389.1209 for [M+H]+ (0.0 mmu)
2-Me-4-COOH TM (1.9 mg, 0.0049 mmol)、DIEA (20 mg, 0.15 mmol)をアセトニトリル(1 mL)に溶解しブロモメチル酢酸エステル(25 mg, 0.16 mmol)をゆっくり加え、室温で一晩攪拌した。酢酸を加えて中和した後、HPLC で精製して2-Me TMCOOAM (1.3 mg, 0.0024 mmol, 収率 50%)を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD3CN): δ 0.49-0.52 (m, 6H), 2.04 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 5.78 (s, 2H), 5.97 (s, 2H), 6.12 (dd, 1H, J = 10.3, 2.2 Hz), 6.77 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.82 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 6.85 (d, 1H, J = 10.3 Hz), 6.92 (dd, 1H, J = 8.8, 2.9 Hz), 7.28 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.41 (d, 1H, J = 2.9 Hz), 7.99 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 8.05 (s, 1H)
HRMS (ESI+): m/z Found 533.1596, calculated 533.1632 for [M + H]+ (-3.6 mmu)
本発明の化合物を製造するための母核化合物として利用可能な化合物として、ベンゼン環に親水性官能基を導入した化合物を以下のように合成した。
(a)2-Me TMIDA
1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3): δ 0.50 (s, 3H), 0.51 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 4.32 (s, 2H), 4.37 (s, 2H), 6.48 (dd, 2H, J = 9.5, 2.2 Hz), 6.90 (d, 2H, J = 9.5 Hz), 7.09 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 7.24 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 7.42 (dd, 1H, J = 7.3, 1.5 Hz), 7.45 (d, 1H, J = 1.5 Hz)
13C-NMR (75 MHz, CD3COCD3): δ -1.6, -1.3, 19.5, 48.5, 52.4, 123.0, 125.1, 129.5, 130.0, 130.3, 130.7, 136.4, 137.5, 139.4, 142.2, 145.2, 156.7, 170.7, 171.3, 172.1
HRMS (ESI+): m/z Found 504.1471, calculated 504.1479 for [M + H]+ (-0.8 mmu)
1H-NMR (300 MHz, CD3CN): δ 0.49-0.52 (m, 6H), 2.01 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.09 (s,3H), 4.28-4.31 (m, 4H), 5.73 (s, 2H), 5.77 (s, 2H), 5.79 (s, 2H), 6.14 (d, 1H, J = 10.3, 2.2 Hz), 6.81-6.98 (m, 4H), 7.19 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.33 (d, 1H, J = 8.1 Hz),7.38-7.43 (m, 2H); HRMS (ESI+): m/z Found 720.2120, calculated 720.2112 for [M+H]+ (0.8 mmu).
1H-NMR (300 MHz, CD3OD + NaOD): δ 0.45 (s, 3H), 0.46 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 3.80-4.00 (m, 8H), 4.49-4.55 (m, 4H), 6.29 (dd, 2H J = 9.5, 2.9 Hz), 6.86 (d, 2H, J = 9.5 Hz), 6.89 (d, 1H J = 2.9 Hz), 7.19 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.54 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.58 (s, 1H)
HRMS (ESI+): m/z Found 734.1985, calculated 734.2017 for [M+H]+ (-3.2 mmu)
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ 0.38-0.43 (m, 6H), 1.96-2.04 (m, 18H), 3.98 (s, 2H), 4.12 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 4.26 (s, 2H), 4.29 (s, 2H), 4.34 (s, 2H), 5.59 (s, 2H), 5.64 (s, 2H), 5.67 (s, 2H), 5.69 (s, 2H), 5.73 (s, 2H), 6.09 (d, 1H, J = 9.8 Hz), 6.72 (d, 1H, J = 2.0 Hz)6.82-6.90 (m, 3H), 7.09 (dd, 1H, J = 7.8, 2.0 Hz), 7.22 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.30 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 7.36 (s, 1H)
HRMS (ESI+): m/z Found 1094.3043, calculated 1094.3074 for [M+H]+ (-3.1 mmu)
カルシウムプローブCaTM-1及びCaTM-2を下記のスキームにより合成した。
特表2009-541779に記載の方法などを参照して合成した5-アミノBAPTA テトラメチルエステル (64.5 mg, 0.118 mmol)、HATU (154 mg, 0.405 mmol)、HOBt-H2O (84.0 mg, 0.549 mmol)をDMF (5mL)に溶解し、2-Me-4-COOH TM (48.9 mg, 0.126 mmol)をDMF3 mLに溶解して加えた。反応混合物をアルゴン下で一晩撹拌し、0.5 N 塩酸 (8 mL)を加えたのちジクロロメタンで抽出して食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、2N NaOH (2mL)とメタノール (2 mL)を加えて3時間撹拌した。2N 塩酸で中和し、HPLCで精製してCaTM-1(20.0 mg, 0.0232 mmol, 収率 20% )を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3COCD3): δ 0.51-0.53 (m, 6H), 2.14 (s, 3H), 4.14-4.15 (m, 8H), 4.47-4.48 (m, 4H), 6.46 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.81 (dd, 2H, J = 2.2, 9.5 Hz), 6.89-7.13 (m, 7H), 7.30 (d, 1H, J = 6.6 Hz), 7.41 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.74 (s, 1H), 7.98-8.03 (m, 2H)
HRMS (ESI+): m/z Found 862.2682, calculated 862.2643 for [M+H]+ (+3.9 mmu).
5-アミノBAPTA テトラメチルエステル (66.7 mg, 0.122 mmol)、HATU (160 mg, 0.421mmol)、HOBt-H2O (84.2 mg, 0.550 mmol)をDMF (5mL)に溶解し、2-Me-4-COOH DCTM (11.9 mg, 0.0260 mmol)をDMF3 mLに溶解して加えた。 反応混合物をアルゴン下で一晩撹拌し、0.5 N 塩酸 (8 mL)を加えたのちジクロロメタンで抽出して食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、2N NaOH (2mL)とメタノール (4mL)を加えて2時間撹拌した。2N 塩酸で中和し、HPLCで精製してCaTM-2 (13.6 mg, 0.0146 mmol, 収率 56%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3COCD3) δ 0.88 (s, 6H), 2.14 (s, 3H), 4.11 (s, 3H), 4.48 (s, 3H), 6.66-7.13 (m, 9H), 7.31 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.43 (dd, 1H, J = 2.2, 8.8 Hz), 7.72 (s, 1H, J = 2.2 Hz), 7.99-8.04 (m, 2H)
HRMS (ESI+): m/z Found 952.1654, calculated 952.1683 for [M+Na]+ (-3.0 mmu)
(1) 5-アミノBAPTAテトラアセトキシメチルエステル
乾燥させアルゴン置換したフラスコに5-nitroBAPTA(5'-ニトロ-l,2-ビス(2-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸:Cell Calcium, 10, pp.491-498, 1989に記載の方法により製造したもの, 49.3mg, 0.0946 mmol)及びアセトニトリル(5 mL)を加えた。この溶液にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA) (129 mg, 1.00 mmol)のアセトニトリル(2 mL)溶液及びブロモメチルアセテート(106 mg, 0.700 mmol)のアセトニトリル溶液(1 mL)を加えた。室温で6時間撹拌した後、酢酸(2mL)を用いて溶液を酸性にし、水を加えてHPLCで精製することにより5-ニトロBAPTAテトラアセトキシメチルエステル(38.6 mg, 0.0477 mmol, 収率 50%)を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3) δ 2.08 (s, 6H), 2.09 (s, 6H), 4.19 (s, 4H), 4.31-4.38 (m, 8H), 5.59 (s, 4H), 5.66 (s, 4H), 6.72 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.87-6.98 (m, 4H), 7.77 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 7.84 (d, 1H, J = 2.2, 8.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 20.6, 53.3, 53.5, 66.9, 67.8, 79.2, 79.5, 108.2, 114.1, 116.5, 118.2, 120.3, 112.1, 123.2, 139.0, 141.5, 144.7, 148.9, 150.5, 169.2, 169.4, 169.4, 170.0
HRMS (ESI+): m/z Found 832.1981, calculated 832.2025 for [M+Na]+ (-4.3 mmu)
5-ニトロBAPTAテトラアセトキシメチルエステル(38.6 mg, 0.0477 mmol)を酢酸エチル(10 mL)に溶解し、Pd/C (触媒量) 加えた。水素雰囲気下にて3時間撹拌した後、メンブレンフィルターを用いてろ過し、溶媒を留去して5-アミノBAPTAテトラアセトキシメチルエステル(32.0 mg, 0.0410 mmol, 収率 86%)を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3) δ 2.07 (s, 6H), 2.08 (s, 6H), 4.10 (s, 4H), 4.21 (s, 4H), 4.29 (s, 4H), 5.64 (s, 4H), 5.66 (s, 4H), 6.22 (d, 1H, J = 2.2, 8.1 Hz), 6.31 (d, 1H, J = 2.9 Hz), 6.81-6.94 (m, 5H)
13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 20.6, 53.4, 53.9, 67.2, 67.3, 79.1, 79.3, 102.1, 107.8, 113.7, 119.8, 121.6, 122.9, 123.0, 130.5, 138.7, 143.4, 150.6, 152.5, 169.5, 170.2, 170.3
HRMS (ESI+): m/z Found m/z Found 802.2243, calculated 802.2283 for [M+Na]+ (-4.0 mmu).
1H NMR (300 MHz, CD3COCD3) δ 0.86 (s, 6H), 2.01-2.10 (m, 15H), 4.16 (s, 8H), 4.35 (s, 4H), 5.61 (s, 4H), 5.63 (s, 4H), 6.53-8.14 (m, 14H)
HRMS (ESI+): m/z Found 1240.2526, calculated 1240.2529 for [M+Na]+ (-0.3 mmu)
例13及び例14で製造した蛍光プローブの評価を行った。100 mM 塩化カリウム及び10 mM エチレングリコールテトラ酢酸(EGTA)を含む30 mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MPOS)バッファー(pH.7.2)中で種々の濃度のフリーCa2+イオン(0, 0.017, 0.038, 0.065, 0.100, 0.150, 0.225, 0.351, 0.602, 1.35, 39 μM)の存在下において22℃でCaTM-1(a)及びCaTM-2(b)のCa2+依存的な吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを測定した。結果をそれぞれ図6及び図7に示す。また、光物理化学的特性を下記の表4に示す。CaTM-1(a)及びCaTM-2(b)は共にCa2+イオン濃度によって吸収スペクトルは変化を受けないものの、蛍光強度はCa2+イオン濃度に伴って上昇していることから、試料中のカルシウムイオンを蛍光を用いて測定するための蛍光プローブとして機能することが確かめられた。
Claims (4)
- 下記の一般式(I):
- R 1b がカルシウムイオンを捕捉するための捕捉基である請求項1に記載の化合物又はその塩。
- 請求項1又は2に記載の一般式(I)で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
- 測定対象物質の測定方法であって、下記の工程:(a)請求項1に記載の一般式(I)で表される化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び(b)上記工程(a)で生成した測定対象物質の捕捉後の化合物又はその塩の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
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