JP7100363B2 - 深赤色蛍光プローブ - Google Patents
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Description
Ca2+蛍光プローブは、蛍光団部位とCa2+と配位結合するBAPTA(1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid)と呼ばれるキレーター部位からなっている。Rhod-2を除き、蛍光母核にはフルオレセイン誘導体を用いられている。これらプローブは細胞質に集積する特徴があり、細胞内の生理機能に関与するCa2+を感度良く検出するために適した特徴であるといえる。
一方、ローダミンを母核にしているRhod-2はフルオレセインを母核にしたものより長い波長を持つ。しかしながら、このプローブは他のローダミン類の例にもれずミトコンドリアへの局在性を示すため、ミトコンドリアのCa2+濃度を測定するために使用されている。
そこで本発明者らは、ローダミン類を蛍光母核としてCaSiR-1のように近赤外領域に蛍光を有し、細胞質に集積して、カルシウムイオン等の生体内の金属イオン等の濃度変動を可視化することができる、実用的な蛍光プローブを開発する検討を行った。
[1]以下の一般式(I):
(式中、
R1は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1~4個の同一又は異なる一価の置換基を示し、R1は、同一であっても異なっていてもよく;
R2は、アニオン性官能基、炭素数1~10のアルキル基又は炭素数1~10のアルコキシ基を示し;
R3及びR4は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1~6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R5及びR6は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1~6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
Xは、SiR11R12、GeR11R12、SnR11R12、CR11R12、SO2、又はPOR13であり、
R11及びR12は、それぞれ独立に、炭素数1~6個のアルキル基又はアリール基を示し、
R13は、炭素数1~6のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基を示し;
R7は、炭素数1~6個のアルキレン基を示し;
R8は、水素原子又は炭素数1~6個のアルキル基を示し、
R8は、R5と一緒になって、R8が結合している窒素原子を含む5~7員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される1~3個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数1~6個のアルキル、炭素数2~6個のアルケニル、又は炭素数2~6個のアルキニル、炭素数6~10個のアラルキル基、炭素数6~10個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく;
R9及びR10は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数1~6個のアルキル基を示し、
R9及びR10は一緒になってR9及びR10が結合している窒素原子を含む4~7員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
R9又はR10、或いは、R9及びR10の両方は、夫々、R4、R6と一緒になって、R9、R10が結合している窒素原子を含む5~7員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される1~3個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数1~6個のアルキル、炭素数2~6個のアルケニル、又は炭素数2~6個のアルキニル、炭素数6~10個のアラルキル基、炭素数6~10個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく;
Yは、存在する場合は、スペーサーを示し:
Lは、測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基を示す)
で表される化合物又はその塩。
[2]R2のアニオン性官能基は、水酸基、カルボキシ基、スルホ基、炭素数1~10のヒドロキシアルキル基、カルボキシ基を有する炭素数1~10のアルキル基、又はカルボキシ基を有する炭素数1~10のアルコキシ基から選択される、[1]に記載の化合物又はその塩。
[3]前記捕捉基が、プロトン、金属イオン、低酸素環境、活性酸素種、一酸化窒素、過酸化水素、一重項酸素又はpH環境を捕捉するための捕捉基である、[1]又は[2]に記載の化合物又はその塩。
[4]前記金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン又はカルシウムイオンから選択される、[3]に記載の化合物又はその塩。
[5]前記捕捉基が、カルシウムイオンを捕捉するための捕捉基である、[1]~[4]のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
[6]Yは、アミド、エステル又はチオウレアである、[1]~[5]のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
[7]Lが以下の一般式(1)で表されるカルシウムイオンを捕捉するための捕捉基である、[1]~[6]のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
(式中、R201、R202、R203及びR204は、それぞれ独立に、カルボキシ基、カルボキシ基を有するアルキル基、エステル基、置換されていてもよいアルキルエステル基、又はこれらの塩を示し;
R205、R206及びR207は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数1~6のアルキル基、メトキシ基又はニトロ基を示し;
R208は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する1ないし3個の同一又は異なる一価の置換基を示す。)
[8]Lが以下の式(2):
(式中、Rは、水素又は-CH2OCOCH3であり、各Rは同一あっても異なっていてもよく:
R’は、メチル基、メトキシ基又はフッ素原子である)
で表されるカルシウムイオンを捕捉するための捕捉基である、[1]~[7]のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
[9]R2は、カルボキシ基である、[1]~[8]のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
[10]R7は、メチレン基又はエチレン基から選択され、R8は、メチル基又はエチル基から選択される、[1]~[9]のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
[11]R9及びR10は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基から選択される、[1]~[10]のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
[12]R7は、メチレン基であり、R8、R9及びR10はいずれもメチル基である、[1]~[11]のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
[13]R1は何れも水素原子である、[1]~[12]のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
[14]以下の式(3)で表される化合物又はその塩。
(式中、Rは、水素又は-CH2OCOCH3であり、各Rは同一であっても異なっていてもよく:
R’は、メチル基、メトキシ基又はフッ素原子であり、R1は、一般式(I)で定義した通りである。)
[15][1]~[14]のいずれか1項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
[16]測定対象物質の測定方法であって、下記の工程:
(a)[1]~[15]のいずれか1項に記載の化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び
(b)上記工程(a)で生成した測定対象物質の捕捉後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
[17]前記測定対象物質がカルシウムイオンである、[16]に記載の方法。
を、提供するものである。
また、本発明により、Ca2+キレーターのBAPTA構造のカルボン酸をアセトキシメチル基(AM基)で保護した構造を、ローダミン色素のキサンテン環の窒素原子から伸長させたリンカーを介して結合させることで、生細胞イメージングにおいても、細胞質集積性が高く、高いS/N比を示すカルシウム蛍光プローブを提供することが可能である。
R1がベンゼン環上に存在する一価の置換基を示す場合には、ベンゼン環上に同一又は異なる置換基が1ないし2個程度存在していることが好ましい。
R1が1個又は2個以上の一価の置換基を示す場合には、該置換基はベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。好ましくは、R1の全てが水素原子であるか、R1の1つが一価の置換基であり、それ以外のR1は水素原子である。
R1が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが1個又は2個以上存在していてもよい。
R1が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基又はアミノアルキル基などであってもよい。
R1が示すアミノ基には1個又は2個のアルキル基が存在していてもよく、R1が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよく、R1が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基(例えば、4-カルボキシブトキシ基又は4-アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基など)であってもよい。
R1の捕捉基は、好ましくは、プロトン、金属イオン、低酸素環境、活性酸素種、一酸化窒素、過酸化水素、一重項酸素又はpH環境を捕捉するための捕捉基である。
ここで、金属イオンとしては、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン又はカルシウムイオンから選択される。好ましくは、金属イオンは、カルシウムイオンである。
R1の捕捉基は、Lの捕捉基と同じであっても異なっていてもよい。また、R1の捕捉基が作用する測定対象物質は、Lの捕捉基が作用する測定対象物質と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
また、本発明の1つの側面においては、R1及びLの捕捉基はカルシウムイオンの捕捉基である。また、本発明の1つの側面においては、R1及びLの捕捉基は、後述する式(1)又は(2)で表されるカルシウムイオンの捕捉基である。
理論に拘束されることを意図するものではないが、キサンテン骨格のベンゼン環にアニオン性官能基を導入することによりローダミンのカチオン性を解消することで、カチオン性に由来していたミトコンドリアのような特定の細胞内小器官への集積を抑制し、より細胞質に留まることが可能となる。
また、一般的に分子骨格内に水溶性官能基であるカルボン酸のようなアニオン性官能基を導入すると、細胞膜への透過性を低下させるが、キサンテン骨格のベンゼン環2位にカルボキシ基等のアニオン性官能基導入したローダミンは特定のオルガネラに強く保持されることなく、高い細胞膜透過性を示すことが可能となる。
アニオン性官能基として、好ましくは、水酸基、カルボキシ基、スルホ基、カルボキシ基を有する炭素数1~10のアルキル基であり、更に好ましくは、カルボキシル基である。
R3又はR4がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが1個又は2個以上存在していてもよく、例えばR3又はR4が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。R3及びR4はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、R3及びR4がともに水素原子である場合、又はR3及びR4がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
合成上のし易さの点から、R13は、好ましくはメチル基又はフェニル基である。また、R13がメチル基である方が水溶性が高いため、より好ましい。
また、R8は、R5と一緒になって、R8が結合している窒素原子を含む5~7員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される1~3個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数1~6個のアルキル、炭素数2~6個のアルケニル、又は炭素数2~6個のアルキニル、炭素数6~10個のアラルキル基(ベンジル基、フェネチル基等)、炭素数6~10個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
理論に拘束されることを意図するものではないが、捕捉基は、キサンテン環に結合したベンゼン環に導入することも可能ではあるが、例えば、Ca2+プローブの捕捉基に好適に用いられるBAPTA部位とキサンテン環の距離が短い(BAPTA構造とキサンテン環との間の結合数が少ない)ほど、Ca2+非存在下においてPeT(光誘起電子移動)によりよく消光することで、高いS/N比を示すことが可能である。
測定対象物質の種類は特に限定されず、例えば、プロトン、金属イオン(例えば、ナトリウムイオンやリチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなど)、非金属イオン(炭酸イオンや水酸イオンなど)、低酸素環境、活性酸素種(例えば、ヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸、過酸化水素など)、一酸化窒素、過酸化水素、一重項酸素、pH環境又は酵素などのいずれであってもよいが、本発明においては、好ましくは、プロトン、金属イオン、低酸素環境、活性酸素種、一酸化窒素、過酸化水素、一重項酸素又はpH環境であり、更に好ましくは、金属イオンである。
(A-1)
(式中、R101、R102、R103、及びR104はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、2-ピリジルメチル基、2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、又は2-メチル-6-ピリジルエチル基を示すが、R101、R102、R103、及びR104からなる群から選ばれる基のうち少なくとも1つは2-ピリジルメチル基、2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、及び2-メチル-6-ピリジルエチル基からなる群から選ばれる基を示し;R105は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する1ないし4個の同一又は異なる一価の置換基を示し;m及びnはそれぞれ独立に0又は1を示すが、m及びnが同時に0となることはない)で表される捕捉基。
上記の捕捉基は特許4402191号公報及びJ.Am.Chem.Soc.,127,pp.10197-10204,2005に開示されている。
上記の捕捉基の好適な例としては、以下の式で表される捕捉基が挙げられる。
(式中、R111、R112及びR133はそれぞれ独立にカルボキシ基及びその塩を示し、R114は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する1ないし3個の同一又は異なる一価の置換基を示す)で表される捕捉基。
上記の捕捉基はJ.Am.Chem.Soc.,124,pp.776-778,2002に開示されている。
(式中、R115は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する1ないし4個の同一又は異なる一価の置換基を示す)で表される捕捉基。
上記の捕捉基は米国特許第5648270号明細書に記載されている。
(式中、R121及びR122はそれぞれ独立にカルボキシ基及びその塩を示し;
R123はC1-6アルキル基を示し;R124はベンゼン環上に存在する1ないし3個の同一又は異なる水素原子を含む一価の置換基を示す)で表される捕捉基。
上記の捕捉基はCell Calcium,31,pp.245-251,2002に開示されている。
(式中、R125は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する1ないし4個の同一又は異なる水素原子を含む一価の置換基を示す)で表される捕捉基。
上記の捕捉基は特開2000-239272号公報に開示されている。
(式中、R131及びR132はベンゼン環上の隣接した位置に置換する置換基を示し、それぞれ独立にアミノ基又はC1-6アルキルモノ置換アミノ基を示すが、R131及びR132が同時にC1-6アルキルモノ置換アミノ基を示すことはなく;R133は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する1ないし3個の同一又は異なる一価の置換基を示す)で表される捕捉基。
上記の捕捉基は特許第3200024号公報、米国特許第6441197号明細書、米国特許第675623号明細書、及び特許第3967943号公報に開示されている。
(D-1)
[式中、R151及びR152はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数1ないし6個のアルキル基を示し、R151及びR152は互いに結合して炭素数2ないし6個のアルキレン基となってもよく;Y1は炭素数1ないし6個のアルキレン基を示し;X1は単結合、-CO-、又は-SO2-を示し;X2は-O-Y2-N(R154)-(式中、Y2は炭素数1ないし6個のアルキレン基を示し、R154は水素原子又は炭素数1ないし6個のアルキル基を示す)を示し;rは0又は1を示し;p-C6H4-はp-フェニレン基を示し;Arはアリールジイル基を示し;R153はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基を示す]
で表される捕捉基。
上記の捕捉基は国際公開WO2010/026743に開示されている。
(式中、R161はベンゼン環上に存在する1個又は2個以上の電子吸引性置換基を示す)で表される捕捉基。
上記の捕捉基は国際公開WO2009/110487号公報に開示されている。
(式中、R171及びR172それぞれ独立にC1-4アルキル基又はアリール基を示し;R173は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する1ないし3個の同一又は異なる一価の置換基を示す)で表される捕捉基。
上記の捕捉基は特許第4373608号公報及び国際公開WO2002/018362に開示されている。
(式中、R181、R182、R183はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、若しくは置換基を有していてもよいアリール基であるか、又はR181とR182とが結合してC1-3アルキレン基を示すか、若しくはR181とR183とが結合してC1-3アルキレン基を示し;Aは置換基を有していてもよいC1-3アルキレン基を示し;R184は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する1ないし4個の同一又は異なる一価の置換基を示す)で表される捕捉基。
上記の捕捉基は国際公開WO2008/099914号公報及び国際公開
WO2008059910号公報に開示されている。
(式中、R191、R192及びR193はそれぞれ独立にカルボキシ基及びその塩を示し;R194は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する1ないし3個の同一又は異なる一価の置換基を示す)で表される捕捉基。
上記の捕捉基はAmerican Journal of Physiology,256,C540-548,1989に開示されている。
(式中、R195は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する1ないし3個の同一又は異なる一価の置換基を示す)で表される捕捉基。
上記の捕捉基はBioorg.Med.Chem.Lett.,15,pp.1851-1855,2005に開示されている。
R205、R206及びR207は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子(フッ素原子、塩素原子及び臭素原子)、炭素数1~6のアルキル基、メトキシ基又はニトロ基を示す。
R208は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する1ないし3個の同一又は異なる一価の置換基を示す。
また、
また、カルシウムイオンの捕捉基のLとしては、以下の式(2)で表される補足基が好ましい。
酵素としては、例えば、還元酵素、酸化酵素、加水分解酵素などを挙げることができる。例えば、β-ラクタマーゼ、チトクロームP450酸化酵素、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼ、ラクターゼ、アルカリホスファターゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、及びグルタミルトランスフェラーゼなど、感染症やがんなどの診断対象として有用な酵素を挙げることができるが、これらに限定されることはない。酵素のうち、特に加水分解酵素が好ましい。加水分解酵素の典型例として、例えばβ-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ、アルカリフォスファターゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、及びグルタミルトランスフェラーゼなどを挙げることができるが、加水分解酵素は上記のものに限定されるわけではない。
式(3)において、Rは、水素又は-CH2OCOCH3であり、各Rは同一であっても異なっていてもよい。また、R’は、メチル基又はフッ素原子であり、R1は、一般式(I)で定義した通りである。
本発明の方法において、測定対象物質は好ましくはカルシウムイオンである。
一般的にローダミン色素はそのキサンテン環の持つカチオンによりミトコンドリアなどのオルガネラへの局在性を示す。そこで初めに、この局在性を構造修飾によって制御することで、細胞質に集積し、近赤外蛍光を有するローダミン類の開発が可能であるか検討を行った。
ローダミンの持つカチオン性を解消し、Net chargeを0にするような分子修飾として、構造中にカルボン酸のようなアニオン性官能基を導入する方法が考えられた。このようなアニオン性官能基の導入によりローダミンのカチオン性を解消することで、カチオン性に由来していたミトコンドリアのような特定の細胞内小器官への集積を抑制し、より細胞質に留まるSi等のローダミン類が開発可能であると考えられる。しかしその一方で、一般的に分子骨格内に水溶性官能基であるカルボン酸のようなアニオン性官能基を導入することは、細胞膜への透過性を低下させることが知られている。
そこで、ベンゼン環部位のカルボン酸とその細胞膜透過性について考察するために、ベンゼン環部位の異なる位置にカルボン酸を導入したSi-ローダミン類を合成することで、より詳細な検討を行った。具体的には、Si-ローダミン類のベンゼン環部位2位、3位、または4位にカルボン酸を導入した誘導体を合成した。さらに、合成したSi-ローダミン類をHeLa細胞へと応用することで、蛍光イメージングを行った。細胞外の余剰な色素を洗い流すことなく撮影した蛍光画像を図2に示す。
測定条件は、1μMのカルボキシ基を有するSi-ローダミンでHeLa細胞をインキュベーションし、Exは633nm、Emは670~750nmで、図2のスケールバーは30μmである。
図2で示されるように、ベンゼン環の3位及び4位にカルボキシ基を有するSi-ローダミン類は細胞内からの蛍光がほとんど観察されなかったのに対して(図2の中央と右側の写真)、2位にカルボキシ基を持つSi-ローダミンは細胞内から強い蛍光が観察された(図2の左側の写真)。また、2位にカルボキシ基を持つSi-ローダミンはwash outを行うことで細胞内からの蛍光強度が大きく減弱した。
以上の結果から、ベンゼン環2位にカルボキシ基を持つSi-ローダミンは特定のオルガネラに強く保持されることなく、高い細胞膜透過性を示すことが明らかとなった。
AM基によって保護された色素は細胞内へと導入された後、細胞内エステラーゼによりAM基が切断され、細胞外への漏出性が低下し細胞内に滞留することが知られている。AM基が切断される前はNet chargeが0であるため、ミトコンドリアなどのオルガネラへの局在は抑えられると考えた(図4参照)。それに加えて、コントロール色素として、分子内スピロ環化状態を形成することのできない、ベンゼン環部位2位がメチル基に置換されたSi-ローダミンを合成し、検討に用いることとした。
余剰分の色素を洗い流してから撮像したところ、ベンゼン環2位にカルボキシ基を導入したローダミン類は細胞質への集積を示した。その一方、ベンゼン環部位2位にメチル基を有する色素は異なる局在を示し、共染色実験の結果、主にリソソームへの局在を示すことが分かった。したがって、ベンゼン環部位へのカルボキシ基の導入はローダミンの細胞内局在に大きな影響を及ぼしていることが明らかとなった。
上記の検討で、ベンゼン環2位にカルボン酸を有するローダミン類にAM基で保護したイミノ二酢酸構造を導入することによってローダミンを細胞質に集積させることに成功した。次に、上記の実験によって得られた知見を活かしたCa2+蛍光プローブの分子デザインを以下のように行った。
Ca2+を検出する際の蛍光制御原理については、既存のCa2+プローブにも適用されているphotoinduced electron transfer(PeT)を用いることとした。PeTは、蛍光プローブが励起光によって蛍光団部位が励起された際に、励起された蛍光団が基底状態に戻り蛍光を発するより早く蛍光団近傍の電子密度が高い構造からの電子移動によって蛍光が消光する現象を指す。つまり、PeTにおいては、蛍光団励起時に蛍光団近傍の電子密度が高い構造が電子供与体、蛍光団が電子受容体となる。化学反応等により電子供与体である構造の電子密度が低下することでPeTが生じなくなり蛍光性が回復するため、様々な生理活性物質を捕捉する蛍光プローブの蛍光制御原理として用いられている。CaSiR-1のようなローダミンを蛍光団に用いたCa2+プローブの場合、キサンテン環部位が電子受容体、BAPTA構造のアミノフェノール部位が電子受供与体となるが、Ca2+非存在下ではPeTが生じることで蛍光プローブはほぼ無蛍光性となる。一方でカルシウム存在下においては、BAPTA構造にCa2+イオンが配位することによりBAPTA構造のアミノフェノール部位の電子密度が低下して電子移動が起こらなくなるため、プローブの蛍光性が回復する(図6)。
Eox:電子供与体の一電子酸化電位, Ered:電子受容体の一電子還元電位, ΔE0,0:励起エネルギー, C:励起によって生じたラシ゛カル種をクーロン引力圏外に引き離すために要するエネルギー
BAPTAの合成
以下のスキーム1により、化合物A~Cを合成するのに用いる合成中間体BAPTAを合成した。
文献1(Dong X., Yang Y., Sun J., Liu Z., Liu B.F., Chem. Commun., 2009, 26, 3883.)に従って合成した。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.26 (s, 3H), 3.56 (s, 6H), 3.58 (s, 6H), 4.12 (s, 4H), 4.16 (s, 4H), 4.27 (s, 4H), 6.67 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 6.74 (dd, J = 4.9 Hz, 3.4 Hz, 1H), 6.81-6.83 (m, 1H), 6.85-6.89 (m, 2H), 6.90-6.93 (m, 1H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 20.9, 51.5, 51.6, 53.3, 53.4, 67.0, 67.1, 113.2, 114.1, 119.0, 119.2, 121.5, 121.7, 122.2, 132.1, 136.8, 139.2, 150.3, 150.4, 172.0, 172.0.
以下のスキーム2により、化合物Aを合成した。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.42 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 4.44 (s, 2H), 4.47 (s, 4H), 4.48 (s, 2H), 4.61 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 4.63 (d, J = 1.2 Hz, 2H) 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 8.4 Hz, 1.5 Hz, 2H), 8.31 (d, J = 1.5 Hz, 1H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 21.0, 21.2, 39.1, 39.2, 69.9, 70.1, 79.3, 79.4, 121.3, 128.1, 131.1, 133.5, 135.1, 136.2, 164.3, 165.6.
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.15 (s, 3H), 0.22 (s, 3H), 2.85 (s, 12H), 6.31 (dd, J = 7.5 Hz, 2.1 Hz, 2H), 6.49 (d, J = 9.8 Hz, 2H), 6.74 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.93 (dd, J = 8.0 Hz, 1.7 Hz, 3H), 8.36-8.38 (m, 1H). HRMS (ESI+): Calcd for [M]+ 483.1896., Found, 473.1877 (-2.0 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.57 (s, 3H), 0.65 (s, 3H), 2.27 (s, 3H), 3.30 (s, 12H), 3.82 (s, 4H), 3.90 (s, 4H), 4.38-4.41 (m, 4H), 6.66 (dd, J = 9.0 Hz, 2.7 Hz, 3H), 6.74 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 6.88 (dd, J = 8.3 Hz, 4.9 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 7.37-7.42 (m, 2H), 8.31 (dd, J = 8.3 Hz, 1.5 Hz, 1H) 8.51 (d, J = 1.0 Hz, 1H).
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+ 960.3487., Found, 960.3461 (-2.7 mmu). HPLC analysis: eluent: A/B = 80/20 to 0/100, 20 min, liner gradient; solvent A: H2O, 0.1 % TFA; solvent B: acetonitrile/H2O = 80/20, 0.1 % TFA; flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength 650 nm.
以下のスキーム3により、化合物Bを合成した。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.53 (s, 3H), 0.64 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 2.94 (s, 12H), 3.79 (s, 4H), 3.92 (s, 4H), 4.29-4.30 (m, 4H), 6.61-6.64 (m, 3H), 6.72 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.79-6.83 (m, 2H), 6.86 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 8.7 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.79 (s, 1H), 8.03 (d, J = 8.2 Hz, 1H) 8.16 (dd, J = 8.2 Hz, 1.4 Hz, 1H). HRMS (ESI+): Calcd for [M]+ 960.3487., Found, 960.3507 (2.0 mmu). HPLC analysis: eluent: A/B = 80/20 to 0/100, 20 min, liner gradient; solvent A: H2O, 0.1 % TFA; solvent B: acetonitrile/H2O = 80/20, 0.1 % TFA; flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength 650 nm.
以下のスキーム4により、本発明の化合物Cを合成した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 2.81 (s, 3H), 3.78 (br, 1H), 6.51 (dd, J = 8.1, 2.2 Hz, 1H), 6.73-6.74 (m, 1H), 6.80 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.99-7.04 (m, 1H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 30.5, 111.2, 114.7, 119.9, 123.3, 130.4, 150.5.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 2.93 (s, 3H), 3.89-3.91 (m, 2H), 5.10-5.18 (m, 2H), 5.74-5.87 (m, 1H), 6.60 (dd, J = 8.4 Hz, 2.6 Hz, 1H), 6.78-6.81 (m, 2H), 7.05 (m, 1H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 38.1, 55.1,110.9, 115.0, 116.5, 119.1, 123.5, 130.4, 133.1, 150.7.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.87 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.94 (s, 6H), 4.64 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 6.63 (dd, J = 8.4, 2.6 Hz), 6.88 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.25 (d, J = 8.8 Hz, 1H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 40.3, 65.1, 111.4, 116.0, 124.4, 127.0 130.4, 151.1.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 2.88 (s, 9H), 3.83-3.85 (m, 2H), 3.98 (s, 2H), 5.10-5.15 (m, 2H), 5.74-5.83 (m, 1H), 6.52-6.58 (m, 2H), 6.80-6.85 (m, 2H), 6.90-6.93 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 38.1, 39.9, 40.6, 55.2, 111.8, 111.9, 116.1, 116.3, 116.5, 125.7, 127.0, 127.2, 130.9, 133.4, 149.0, 150.1.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 0.45 (s, 6H), 3.08 (s, 3H), 3.09 (s, 6H), 4.03-4.05 (m, 2H), 5.15-5.21 (m, 2H), 5.80-5.92 (m, 1H), 6.78-6.85 (m, 4H), 8.37 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 8.40 (d, J =4.5 Hz, 1H)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ = -1.1, 38.0, 40.0, 54.6, 113.1, 113.2, 114.2, 114.4, 116.5, 129.6, 131.5, 131.6, 132.7, 140.4, 140.5, 150.6, 151.4, 185.2.
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ = 0.56 (s, 3H), 0.61 (s, 3H), 3.03(s, 3H), 3.28 (s, 6H), 6.61 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 6.74 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 6.97-7.00 (m, 2H), 7.20-7.32 (m, 3H), 7.67 (m, 2H), 8.23 (d, J = 7.3 Hz, 1H). HRMS (ESI+): Calcd for [M]+ 415.1842., Found, 415.1843 (+0.1 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.50 (s, 3H), 0.57 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 2.90 (s, 6H), 3.08 (s, 3H), 3.46 (s, 4H), 3.50 (s, 4H), 4.09 (s, 2H), 4.22-4.26 (m, 4H), 6.57 (dd, J = 9.1 Hz, 3.2 Hz, 1H), 6.61-6.62 (m, 2H), 6.65 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.98 (dd, J = 1.4 Hz, 1.4 Hz, 2H), 7.02 (dd, J = 9.4 Hz, 2.5 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.25 (q, J = 7.8 Hz, 1H), 7.59 (ddd, J = 7.5 Hz, 7.5 Hz, 1.2 Hz 1H), 7.71 (ddd, J = 7.5 Hz, 7.5 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.49 (br, 1H).
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+ 960.3487., Found, 960.3453 (-3.6 mmu). HPLC analysis: eluent: A/B = 80/20 to 0/100, 20 min, liner gradient; solvent A: H2O, 0.1 % TFA; solvent B: acetonitrile/H2O = 80/20, 0.1 % TFA; flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength 650 nm.
化合物A~CのCa 2+ プローブとしての評価
合成した化合物A、B、CがCa2+センサーとして機能しうるかどうかを調べるために、様々なCa2+濃度の溶液の下で吸収・蛍光スペクトルを測定した。結果を図7に示す。
図7は、100nMのKCl及び10nMのエチレングリコール四酢酸(EGTA)を含有し、pH7.2の30mMの3-(N-モルホリノ)プロパン硫酸(MOPS)中で種々の濃度(0、0.017、0.038、0.065、0.100、0.150、0.225、0.351、0.602、1.35、39mM)の遊離Ca2+の存在下での1μMの化合物A、B、Cの吸収スペクトル(左側)、発光スペクトル(中央)を表す。励起波長は、646nm(A)、648nm(B)、635nm(C)であった。
図7の右側は、100nMのKCl及び10nMのEGTAを含有し、pH7.2の30mMのMOPS中で種々の濃度の遊離Ca2+の存在下での1μMの化合物A、B、Cの蛍光強度のプロットを示す。
また、化合物A、B、Cの光物理特性を表1に示す。
新規Ca 2+ 蛍光プローブの生細胞応用
次に、CaSiR-2が細胞内環境で特定のオルガネラに集積せず細胞質に留まるか確かめるため、HeLa細胞への応用を行った。生細胞応用をするにあたり、CaSiR-2に細胞膜透過性を付与するため、BAPTA構造のカルボン酸をAM基で保護したプローブCaSiR-2AMの合成を行った。
以下のスキーム5により、CaSiR-2AM(化合物D)を合成した。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ =2.27 (s, 3H), 4.12 (s, 4H), 4.24-4.34 (m, 8H), 6.67-6.71 (m, 3H), 6.77 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.83 (dd, J = 8.8, 2.9 Hz, 1H). 13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ = 21.0, 68.1, 69.3, 109.5, 115.7, 116.5, 119.2, 120.8, 122.8, 134.5, 137.1, 141.7, 147.0, 149.8, 151,9, 174.4, 175.3. HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 558.1336, Found, 558.1340 (+0.4 mmu).
1H NMR (300 MHz, CD2Cl2): δ =2.03 (s, 6H), 2.05 (s, 6H), 2.27 (s, 3H), 4.13 (s, 4H), 4.28-4.31 (m, 6H), 4.36-4.39 (m, 2H), 5.58 (s, 4H), 5.61 (s, 4H), 6.70-6.75(m, 3H), 6.80 (d, J = 8.1 Hz), 7.76 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.81 (dd, J = 9.2, 2.6 Hz, 1H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 20.5, 20.8, 53.3, 53.4, 66.7, 67.7, 79.0, 79.4, 108.2, 114.9, 116.4, 118.0, 120.4, 122.3, 133.0, 136.2, 141.3, 144.6, 148.7, 150.3, 169.1, 169.3, 169.3, 169.9. HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 846.2181, Found, 846.2173 (-0.8 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.55 (s, 3H), 0.62 (s, 3H), 2.00 (s, 6H), 2.03 (s, 6H), 2.28 (s, 3H), 2.98 (s, 6H), 3.17 (s, 3H), 4.13-4.17 (m, 10H), 4.26 (s, 4H), 5.58 (s, 4H), 5.60 (s, 4H), 6.63-6.84 (m, 8H), 7.01-7.08 (m, 3H), 7.29-7.33 (m, 2H), 7.64-7.68 (m, 1H), 7.75-7.78 (m, 1H), 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H). HRMS (ESI+): Calcd for [M]+ 1248.4332., Found, 1248.4289 (-4.3 mmu). HPLC analysis: eluent: A/B = 80/20 to 0/100, 20 min, liner gradient; solvent A: H2O, 0.1 % TFA; solvent B: acetonitrile/H2O = 80/20, 0.1 % TFA; flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength 650 nm.
実験条件として、HeLa細胞を、37℃、0.3%DMSOを含有するHBSS中3μMCaSiR-2AMと共に30分間インキュベートし、その後、色素を3回洗い流し、イメージングを開始した。
その結果、細胞内からわずかに点状に局在した蛍光が見えるものの、大部分のプローブは期待通り細胞質に分布することが分かった(図8及び図9)。また、細胞内に見える局在については、その点状の局在からリソソームへ局在していると考えられる。
続いて、細胞外部からの刺激によって細胞内に生じるCa2+濃度変動をCaSiR-2AMで捉えることができるか検討した(図8)。具体的にはHeLa細胞にCaSiR-2AMをロード後、細胞外液にhistamineまたはATPを添加して細胞内でカルシウムオシレーションを生じさせ、それを蛍光強度の変化として捉えることができるか検討した。また、最後にカルシウムイオノフォアであるionomycinを添加して、細胞内のCa2+濃度上昇が見られるか検討した。
なお、図8において、1から5までの個々の細胞のROIの蛍光変化を示し、励起および発光波長650nm/670-750nmで画像を捕捉した。
CaSiR-2AMとCaSiR-1AMのオルガネラごとにROIを囲って蛍光シグナルのトレースをとった結果を図9及び図10に示す。本実験においては、刺激を加える前の蛍光強度を把握するために、解析結果では縦軸は蛍光変化率ではなく蛍光強度を採用している。
histamine又はATP、ionomycinの添加条件は図8と同様である。図9において、1から7までの個々の細胞のROIの蛍光変化(#1~#3:核;#4-#6:細胞質;#7:バックグラウンド)を示す。また、励起および発光波長650nm/670-750nmで画像を捕捉した。
histamine又はATP、ionomycinの添加条件は図8と同様である。図10において、1から10までの個々の細胞のROIの蛍光変化(#1~#3:核;#4-#6:サイトゾル;#7-#9:リソソーム;#10:バックグラウンド)を示す。また、励起および発光波長650nm/670-750nmで画像を捕捉した。
CaSiR-1AMがリソソーム内で蛍光を発している理由については、先行研究(文献18:Lloyd-Evans E., Morgan A.J., He X., Smith D.A., Elliot-Smith E., Sillence D.J., Churchill G.C., Schuchman E.H., Galione A., Platt F.M., Nat. Med., 2008, 14, 1247-1255.)により説明がつけられる。すなわち、リソソームには初めからCaSiR-1AMの蛍光が振り切れる数100μMの濃度のCa2+が存在するからである。したがって、CaSiR-1AMはリソソームのカルシウム濃度を観察する場合には、有用なプローブである可能性があるが、カルシウムシグナリングにおいて重要となる細胞内カルシウムイオンの濃度変動を高感度に捉えるためには、細胞質に集積する性質を持つCaSiR-2AMの方が適していることが明らかとなった。
CaSiR-2AMのラット脳スライスにおけるCa 2+ イメージングへの応用
神経科学の分野においては、脳機能を解明するために複数の神経細胞の活動を同時に追跡することが必要であり、その基盤技術としてCa2+イメージング法は極めて重要である(文献19:Grienberger C., Konnerth A., Neuron, 2012, 73, 862-885.;文献20: Takahashi N., Sasaki T., Usami A., Matsuki N., Ikegaya Y., Neurosi. Res., 2007, 58, 219-225.;文献21:21. Losonczy A., Makara J.K., Magree J.C., Nature, 2008, 452, 436-441.)。
従来は、神経活動に伴う活動電位は電極を用いることで測定されてきた。しかし、このような電気生理学的手法によって測定可能なニューロンは数が限られている上に、実際の神経活動は複数のニューロンによって構成される巨大な神経ネットワークの上に成り立っているため、実際の神経活動を観察する手法として、複数のニューロンを1細胞レベルで時空間分解能よく観察できる機能的多ニューロン同時画像法(functional multineuron calcium imaging; fMCI)が用いられるようになった(文献22:Mizunuma M., Ikegaya Y., Folia Pharmacol. Jpn., 2009, 134, 17-21.)。
脳を構成する神経細胞は自発的な神経活動を行っており、これは自然発火と呼ばれている。そして、脳神経細胞は発火に伴い、電位依存性のCa2+チャネルが開口し、細胞内へCa2+が流入する。すなわち、fMCIを用いて神経細胞にCa2+プローブを導入して蛍光観察を行うことで、視野内の複数の神経細胞の活動をプローブの蛍光変化に置き換えることによって同時に観察することができ、どの神経細胞がどのタイミングで活動を行っているかを視覚的に観察することができる。そこで、本発明の化合物CaSiR-2AMによって神経細胞における自然発火現象を観察することができるか検討を行った。
CaSiR-2AMを添加した人工脳脊髄液にラット脳スライスを浸すという簡便な手法でプローブをロードし、蛍光イメージングを行い、CaSiR-2AMが神経細胞内に取り込まれるか、そして神経細胞の自然発火が1細胞レベルで観察できるかをCaSiR-1AMと比較することで確かめた(図11)。
プローブの局在が異なることによりカルシウム応答の様子が著しく変化することは非常に興味深い現象であり、CaSiR-1AMでシグナルが鋭くならなかった原因しては、色素が局在するオルガネラのカルシウム変動を同時に捉えているためと考えられた。本実験結果により、神経細胞における自然発火を捉えるためにはCa2+プローブを細胞質に集積させることが重要であることが改めて示された。
蛍光イメージングの結果から、神経細胞内のCaSiR-1AMの局在に対してはMitoTrackerよりもLysoTrackerの方がより良くmergeしている様子が観察された。従って、ラット脳スライスにおける実験でCaSiR-1AMは培養細胞と同様にリソソームへ局在することが分かった。
Claims (7)
- 以下の一般式(I):
(式中、
R1は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1~4個の同一又は異なる一価の置換基を示し、R1は、同一であっても異なっていてもよく、当該一価の置換基は炭素数1~6個のアルキル基である;
R2は、カルボキシ基を示し;
R3及びR4は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1~6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R5及びR6は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1~6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
Xは、SiR11R12であり、
R11及びR12は、それぞれ独立に、炭素数1~6個のアルキル基又はアリール基
を示し;
R7は、メチレン基又はエチレン基を示し;
R8は、メチル基又はエチル基を示し;
R9及びR10は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基を示し;
Yは、存在する場合は、スペーサーを示し、当該スペーサーは、アミド、エステル又はチオウレアから選択され:
Lは、以下の式(2)で表される。
(式中、Rは、水素又は-CH2OCOCH3であり、各Rは同一あっても異なっていてもよく:
R’は、メチル基、メトキシ基又はフッ素原子である))
で表される化合物又はその塩。 - R7は、メチレン基であり、R8、R9及びR10はいずれもメチル基である、請求項
1に記載の化合物又はその塩。 - R1は何れも水素原子である、請求項1又は2に記載の化合物又はその塩。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
- 測定対象物質の測定方法であって、下記の工程:
(a)請求項1~5のいずれか1項に記載の化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び
(b)上記工程(a)で生成した測定対象物質の捕捉後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。 - 前記測定対象物質がカルシウムイオンである、請求項6に記載の方法。
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