CN103288862A - 一种红色荧光钙离子探针的制备方法及其应用 - Google Patents
一种红色荧光钙离子探针的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种红色荧光钙离子探针的制备方法及其应用。本发明以红色荧光的荧光素类似物或其衍生物为荧光报告基团、以1,2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPETA)或其衍生物为钙离子螯合基团,通过二者共价键合,得到红色荧光钙离子探针;在缓冲溶液中,该探针荧光强度随钙离子浓度增加而增大;在几种哺乳细胞内,该探针的荧光强度随钙离子浓度波动而变化。本探针基于荧光素类似物或其衍生物的红色荧光特性与BAPETA或其衍生物的钙离子结合能力,能穿透细胞膜、并能特异性识别钙离子。本发明方法反应条件简单,操作方便,得到的探针可以用于实时监测动物细胞胞浆内游离钙离子浓度。
Description
技术领域
本发明涉及一种红色荧光钙离子探针的制备方法,属于化学合成技术及生化分析检测技术领域。
背景技术
荧光探针技术的发展推动了许多复杂生理机制的阐明,其中,钙离子荧光成像技术已成为研究涉及钙离子的信号通路的关键技术。由于许多生物学现象中都涉及钙离子信号变化,那么同时对钙离子和其它生物分子进行多色成像分析,将大大增加获得的信息量。因此,钙离子荧光探针的开发和不断改良具有重要意义。
按荧光信号基团,钙离子荧光探针大致可分为基于基因编码的荧光蛋白和基于荧光小分子两类,尽管两类探针各有优缺点,但基于有机小分子的荧光探针因其可以形成细胞渗透性乙酰氧基甲酯(AM)衍生物形式而很容易地大量装载入活细胞,不需要像荧光蛋白一样的转染步骤,故更易操作。现有的基于小分子的钙离子荧光探针大都以发绿色荧光的荧光素为荧光基团,例如Fluo-3,Fluo-4,Calcium Green-1和Oregon Green 488 BAPTA-1。也有一些发红色荧光的钙离子探针,例如一种基于罗丹明结构框架、发光波长为576 nm的Rhod-2探针。尽管这样的红色荧光钙离子探针在生物学研究中也得到了广泛应用,但是由于Rhod-2探针中罗丹明结构框架的阳离子性质,该探针常被非特异性地吸附于线粒体。虽然这种定位可以用于监测线粒体的钙离子动态,但相比于线粒体,胞浆内的钙离子成像对研究钙离子相关的信号通路更为重要。Fura Red是一个有代表性的发射近红外荧光的钙离子探针,然而它的荧光量子产率却相当低,仅有0.013,因此要想得到较强的信号,就必须增加探针用量或用高能量的激光激发荧光,但是增加探针用量会对钙离子产生缓冲效应,而高能量激光又会导致荧光分子的快速漂白和对细胞产生光毒性。因此,有必要开发新的钙离子探针,不但使其在长波长区(红色)有较强的荧光发射,而且需要使该探针能够有效的监测胞浆内的钙离子动态。
发明内容
本发明的目的是解决现有红色荧光钙离子探针的荧光量子产率低、信号较弱的问题,提供一种红色荧光钙离子探针的制备方法以及使用所述的红色荧光钙离子探针对胞浆内钙离子的动态监测应用。
本发明的目的通过下述方案实现:
一种红色荧光钙离子探针的制备方法,包含以下步骤:
(1) 在容有3~25 mL DMF的反应容器内,按摩尔比1:1.2~1:1.4加入多肽偶联剂2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)0.2~2.2 mmol和1-羟基苯并三唑(HOBt) 0.24~3.1 mmol,再按摩尔比1.5:1 ~ 1:5加入具有红色荧光的荧光素类似物或其衍生物0.02~0.2 mmol与1,2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPETA)或其衍生物0.013~1.0 mmol,氩气保护下磁力搅拌过夜;
(2) 向步骤(1)所得溶液中加入2~10 mL 0.5~1 M盐酸后,以二氯甲烷提取产物,有机相用盐水洗涤、Na2SO4干燥、挥发溶剂至完全干燥,再向所得固体加入1~5 mL 1 M氢氧化钠和2~10 mL甲醇,室温搅拌2~5小时后以1 M盐酸中和;
或者,
所述步骤(2)替换为:向步骤(1)所得溶液中加入1 mL 乙酸,振摇;
(3) 以柱色谱提纯,制得红色荧光的荧光素类似物或其衍生物与BAPETA或其衍生物的共价结合物,即本发明所设计的红色荧光钙离子探针。
其中,
步骤 (1) 中所述的红色荧光的荧光素类似物(或其衍生物)包括下列F1、F2两种化合物:
F1(X=H);F2(X=Cl)
所述的1,2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPETA)或其衍生物包括下列C1、C2两种化合物:
C1(Y=H);C2(Y=CH2OCOCH3) 。
步骤 (1) 中所述以多肽偶联剂2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)催化红色荧光的荧光素类似物(或其衍生物)的羧基与BAPETA(或其衍生物)的氨基偶联。
步骤 (3) 中所述的红色荧光钙离子探针以带有红色荧光的荧光素类似物F1、其衍生物F2为荧光报告基团、以1,2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPETA)C1或其衍生物C2为钙离子螯合基团。
本发明同时提供了一种通过上述方法制得的红色荧光钙离子探针,包括探针1、探针2、探针3,结构式如下,
本发明提供的红色荧光钙离子探针可用于对胞浆内钙离子的动态监测应用。
原理:选用BAPETA并进一步选用其AM衍生物,使探针具有较高的膜渗透性,能够得到较大的探针负载率;选用具有红色荧光的荧光素类似物F1和F2,其发射荧光波段较长、荧光量子产率较高,又不带有正电荷,不容易被细胞器吸附,可以在胞浆内自由运动。这一探针可以实时检测胞浆内游离钙离子的动态变化,也可以用于其它样品中钙离子的浓度检测。
本发明的优点及效果:
(1)本发明提供的红色荧光钙离子探针对溶液中游离钙离子有特异选择性。
(2)本发明提供的红色荧光钙离子探针能够特异性的识别细胞内的钙离子并对其进行动态示踪。
(3)本发明提供的红色荧光钙离子探针在实际应用中能够识别整个胞浆内的游离钙离子,不会像Rhod-2 AM那样非特异性的吸附于线粒体等细胞器。
(4)本发明提供的红色荧光钙离子探针在实际应用中灵敏度比Fura Red高。
(5)本发明提供的制备方法,操作安全、简便,条件温和,时间短,成本低。
附图说明
图1是实施例1所制备荧光探针1的紫外吸收光谱和荧光发射光谱,其中,A是紫外吸收光谱,B是荧光发射光谱。
图2是向实施例1所制备荧光探针1溶液中加入不同浓度钙离子后测定的荧光光谱。
图3是向实施例1所制备荧光探针1溶液中加入钙离子后拍摄的荧光照片。
图4是实施例1所制备荧光探针1对不同离子(二价)的荧光响应。
图5 a,b,c是以实施例3所制备荧光探针3对组胺诱导Hela细胞内钙离子变化的荧光动态成像,图中, a和b分别是在加入组胺后0 s和60 s拍摄的荧光照片,c是根据图中a选定的6个细胞的荧光强度随时间变化绘制的动态曲线;图中d,e,f是以商品化钙离子探针Rhod-2对组胺诱导Hela细胞内钙离子变化的荧光动态成像,其中,d和e分别是在加入组胺后0 s和60 s拍摄的荧光照片,f是根据图中d选定的6个细胞的荧光强度随时间变化绘制的动态曲线;
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)以化合物F1和C1制备探针1:在5 mL DMF中加入化合物F1 (48.9 mg, 0.126 mmol) 、化合物C1 (64.5 mg, 0.118 mmol)、偶联试剂HATU (154 mg, 0.405 mmol)、HOBt (84.0 mg, 0.549 mmol),磁力搅拌使其全部溶解,氩气保护下磁力搅拌过夜。
(2)向步骤(1)所得溶液中加入8 mL 0.5 M 盐酸,振摇。向上述溶液中加入10 mL 二氯甲烷,振摇后分层,分离出二氯甲烷有机相,对该有机相分别以10 mL盐水洗涤、3 g无水硫酸钠脱水、挥发至完全干燥为固体。向所得固体中加入4 mL 1 M氢氧化钠和3 mL甲醇。室温下磁力搅拌5小时,以1 M盐酸中和至pH中性。
(3)以十八(烷基)硅胶填充柱制备色谱分离提纯,制得红色荧光钙离子探针1为18 mg,0.02 mmol,产率约为18%。
(4)效果检测:
1H 核磁 (300 MHz, CD3COCD3): δ 0.51–0.53 (m, 6H), 2.14 (s, 3H), 4.14–4.15 (m, 8H), 4.47–4.48 (m, 4H), 6.46 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.81 (dd, 2H, J = 2.2, 9.5 Hz), 6.89–7.13 (m, 7H), 7.30 (d, 1H, J = 6.6 Hz), 7.41 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.74 (s, 1H), 7.98–8.03 (m, 2H),核磁结果证明所得化合物为本发明所涉及探针1结构。
ESI电离源,正离子模式: m/z 检测值862.2682, 计算值862.2643 [M+H]+ (+3.9 mmu),检测值与计算值比较吻合。
高效液相色谱结论
20分钟线性梯度洗脱,由A: (16% CH3CN/0.1% TFA水溶液)至B: (80% CH3CN/0.1% TFA水溶液),然后以B洗脱,检测波长为 460 nm,仅在18 min处出现明显单峰,经计算所得主组分纯度大于99%。
吸收光谱和荧光光谱检测结论
所用紫外分光光度计为Shimadzu UV-1650,荧光仪为Hitachi F4500,其激发和发射狭缝宽度均为 2.5 nm,光电倍增管电压700 V,紫外吸收光谱见附图1A,荧光发射光谱见附图1B。
在11支10.0 mL比色管中均加入1.0 mL pH 7.2 的Hanks平衡缓冲溶液(HBSS,含 0.3% DMSO)、10 nmol探针1,再向上述11支比色管中分别加入0, 0.17, 0.38, 0.65, 1.00, 1.50, 2.25, 3.51, 6.02, 13.5, 400 nmol钙离子,然后以超纯水定容至10.0 mL并混匀,使上述溶液中钙离子的最终浓度分别为0, 0.017, 0.038, 0.065, 0.100, 0.150, 0.225, 0.351, 0.602, 1.35, 40μM。检测上述溶液的荧光光谱,见附图2,钙离子的加入引起探针1的荧光逐渐增强。将上述钙离子浓度为0和0.038μM的溶液分别转移至两支比色皿中,在紫外灯下拍照,见图3,与无钙离子的探针1溶液相比,钙离子的加入使探针1发出较强的荧光。
在10支10.0 mL比色管中均加入1.0 mL pH 7.2 的HBSS、10 nmol探针1,再向上述10支比色管中分别加入0.4 nmol钙离子或 400 nmol Co2+, Zn2+, Cu2+, Mg2+, Ni2+, Sr,2+ Fe2+, Mn2+, Ba2+,然后以超纯水定容至10.0 mL并混匀。检测上述溶液的荧光光谱,见附图4,0.4 nmol(0.04μM)钙离子的加入引起探针1的荧光逐渐增强达90%,而其他离子即使在较高浓度(400 nmol,40μM)下引起的荧光变化不足20%。
实施例2
(1)以化合物F2和C1制备探针2:在25 mL DMF中加入化合物F2 (60 mg, 0.13 mmol)、化合物C1 (330 mg, 0.6 mmol)、偶联试剂HATU (0.8 g, 2.1 mmol)、HOBt (0.42 g, 2.75 mmol),磁力搅拌使其全部溶解,氩气保护下磁力搅拌48 h。
(2)向步骤(1)所得溶液中加入10 mL 1 M 盐酸,振摇。向上述溶液中加入30 mL 二氯甲烷,振摇后分层,分离出二氯甲烷有机相,对该有机相分别以20 mL盐水洗涤、4 g无水硫酸钠脱水、挥发至完全干燥为固体。向所得固体中加入5 mL 1 M氢氧化钠和8 mL甲醇。室温下磁力搅拌5小时,以1 M盐酸中和至pH中性。
(3)以十八(烷基)硅胶填充柱制备色谱分离提纯,制得红色荧光钙离子探针2为61 mg,0.065 mmol,产率约为50%。
(4)效果检测:
1H 核磁 (300 MHz, CD3COCD3): δ 0.88 (s, 6H), 2.14 (s, 3H), 4.11 (s, 3H), 4.48 (s, 3H), 6.66–7.13 (m, 9H), 7.31 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.43 (dd, 1H, J = 2.2, 8.8 Hz), 7.72 (s, 1H, J = 2.2 Hz), 7.99–8.04 (m, 2H),核磁结果证明所得化合物为本发明所涉及探针2结构。
ESI电离源,正离子模式: m/z 检测值952.1654, 计算值952.1683 [M+Na]+ (-3.0 mmu),检测值与计算值比较吻合。
20分钟线性梯度洗脱,由A: (16% CH3CN/0.1% TFA水溶液)至B: (80% CH3CN/0.1% TFA水溶液),然后以B洗脱,检测波长为 470 nm,仅在22 min处出现明显单峰,经计算所得主组分纯度大于99%。
实施例3
(1) 以化合物F2和C2制备探针3: 在3 mL DMF中加入化合物F2 (11 mg, 24μmol) 、化合物C2 (32 mg, 41μmol)、偶联试剂HATU (80 mg, 0.2 mmol)、HOBt ·H2O (40 mg, 0.26 mmol)。磁力搅拌使其全部溶解,氩气保护下磁力搅拌过夜。
(2)向步骤(1)制得溶液中加入1 mL 乙酸,振摇。
(3)以十八(烷基)硅胶填充柱制备色谱分离提纯,制得红色荧光的探针3为3.0 mg,0.0024 mmol,产率约为10%。
(4)效果检测:
1H 核磁 (300 MHz, CD3COCD3): δ 0.86 (s, 6H), 2.01–2.10 (m, 15H), 4.16 (s, 8H), 4.35 (s, 4H), 5.61 (s, 4H), 5.63 (s, 4H), 6.53–8.14 (m, 14H),核磁结果证明所得化合物为本发明所涉及探针3结构。
高分辨质谱结论
ESI电离源,正离子模式: m/z 检测值1240.2526, 计算值1240.2529 [M+Na]+ (–0.3 mmu),检测值与计算值比较吻合。
高效液相色谱结论
20分钟线性梯度洗脱,由A: (16% CH3CN/0.1% CH3COOH水溶液) 至B: (80% CH3CN/0.1% CH3COOH水溶液),然后以B洗脱,检测波长为 470 nm,仅在29 min处出现单峰,表明所得主组分纯度大于99%。
将Hela细胞置于容有DMEM培养基(含10%胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素)的、聚赖氨酸修饰的35-mm玻璃培养皿中培养。上载荧光染料前将旧的培养基弃掉,以HBSS洗三遍,然后加入1 mL含有3.0μM探针3(或Rhod-2)和0.3% DMSO的HBSS溶液。在37 oC下孵育30 min,弃掉介质,再以HBSS洗涤三次,荧光显微镜下采集细胞图像。组胺刺激实验:以1 mL 10μM 二盐酸组胺的HBSS溶液孵育细胞,荧光显微镜下采集细胞图像,见附图5,a,b,c是以实施例3所制备荧光探针3对组胺诱导Hela细胞内钙离子变化的荧光动态成像,图中, a和b分别是在加入组胺后0 s和60 s拍摄的荧光照片,图中c是根据图中a选定的6个细胞的荧光强度随时间变化绘制的动态曲线;图中d,e,f是以商品化钙离子探针Rhod-2对组胺诱导Hela细胞内钙离子变化的荧光动态成像,其中,d和e分别是在加入组胺后0 s和60 s拍摄的荧光照片,f是根据图中d选定的6个细胞的荧光强度随时间变化绘制的动态曲线。对比两种探针的荧光照片及荧光强度动态曲线,可以看出,实施例3所制备荧光探针3比Rhod-2对钙离子的变化更加灵敏。
Claims (6)
1.一种能够对动物细胞胞浆内钙离子实时荧光检测的红色荧光钙离子探针的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1) 在容有3~25 mL DMF的反应容器内,按摩尔比1:1.2~1:1.4加入多肽偶联剂2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)0.2~2.2 mmol和1-羟基苯并三唑(HOBt) 0.24~3.1 mmol,再按摩尔比1.5:1 ~ 1:5加入具有红色荧光的荧光素类似物或其衍生物0.02~0.2 mmol与1,2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPETA)或其衍生物0.013~1.0 mmol,氩气保护下磁力搅拌过夜;
(2) 向步骤(1)所得溶液中加入2~10 mL 0.5~1 M盐酸后,以二氯甲烷提取产物,有机相用盐水洗涤、Na2SO4干燥、挥发溶剂至完全干燥,再向所得固体加入1~5 mL 1 M氢氧化钠和2~10 mL甲醇,室温搅拌2~5小时后以1 M盐酸中和;
(3) 以柱色谱提纯,制得红色荧光的荧光素类似物或其衍生物与BAPETA或其衍生物的共价结合物,即本发明所设计的红色荧光钙离子探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)替换为,向步骤(1)所得溶液中加入1 mL 乙酸,振摇。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤 (1) 中以多肽偶联剂2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)催化红色荧光的荧光素类似物或其衍生物的羧基与BAPETA或其衍生物的氨基偶联。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:步骤 (3) 所制得的红色荧光钙离子探针以带有红色荧光的荧光素类似物或其衍生物F1、F2为荧光报告基团、以1,2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPETA)C1或其衍生物C2为钙离子螯合基团。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130911 |