CN109053549B - 一种定位线粒体检测粘度的双光子荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种定位线粒体检测粘度的双光子荧光探针及其合成方法和应用，属于小分子荧光探针领域。该双光子粘度探针的结构式为：
，可以以3‑溴‑9‑乙基咔唑和4‑甲酰基苯硼酸的产物与2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚和碘甲烷的产物反应获得。该探针具有双光子效应，对粘度具有较好的灵敏度，能够在单光子或者双光子模式下检测溶液、细胞和斑马鱼体内中粘度。在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种检测粘度的荧光探针。
背景技术
粘度是衡量一种浓稠流体的流动性和扩散性的主要因素，同时是流体扩散速率的主要参考指标。微环境的粘度在病理学研究中起到非常重要的作用，因为粘度的变化往往会影响细胞微环境中各种新陈代谢的进行。线粒体是大多数真核生物中主要的能量产生区，它在许多重要的细胞过程中发挥关键作用，如ATP产生，中枢代谢和细胞凋亡。线粒体中的粘度变化可能导致线粒体功能障碍。然而，在微观尺度上测量粘度，特别是在微小的活细胞中测量粘度仍然是困难的.细胞中的局部微粘度从一个区域到另一个区域变化很大，这与在宏观尺度上测量的粘度变化有很大不同。用于检测细胞或亚细胞水平的粘度变化的方法仍然是极度需求的。因此发展一种新的技术检测线粒体的粘度迫在眉睫。
荧光成像技术由于具有实时监测，背景信号低，灵敏度高等优点而成为检测生物分子以及生物微环境重要的一种手段。尽管目前已经存在一些荧光探针用于线粒体粘度的检测，但是由于这些探针的激发波长短对生物样品造成巨大的损害，导致这些探针不能广泛地应用在生物体上。所以发展一种激发波长长的粘度探针具有十分重要的意义。其中，双光子技术具有高穿透度，对生物样品损伤少等优点而被广泛应用到生物成像中。所以，发展一种新的双光子荧光探针对于检测线粒体内的粘度具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中检测线粒体粘度的探针激发波长短，易造成生物材料损害的问题，本发明提供一种靶向线粒体的检测粘度的双光子荧光探针，该探针选择性好、抗干扰。
本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种定位线粒体检测粘度的荧光探针，其化学名称为碘化2-(4-(9-乙基-9H-咔唑基)-苯乙烯基)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚，简称为CBI-V，其结构式如式（I）所示：
式（I）。
一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
（1）将3-溴-9-乙基咔唑与4-甲酰基苯硼酸在碳酸钾和四(三苯基膦)钯存在下于四氢呋喃与水的混合溶剂中加热回流，分离纯化得3-(4-甲醛基苯基)-9-乙基咔唑：
（2）将2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷在高压管中反应得到碘化1,2,3,3-四甲基吲哚：
（3）将3-(4-甲醛基苯基)-9-乙基咔唑与碘化1,2,3,3-四甲基吲哚在乙醇与几滴醋酸的混合液中加热回流，得到碘化2-(4-(9-乙基-9H-咔唑基)-苯乙烯基)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚，即得探针CBI-V：
步骤（1）中，所述3-溴-9-乙基咔唑：碳酸钾：4-甲酰基苯硼酸：四(三苯基膦)钯的摩尔比为1:3:1.2:0.03。
步骤（1）中，所述反应溶剂为四氢呋喃:水=3:1（V:V）的混合溶剂。
步骤（1）中，所述反应在N2保护下进行。
步骤（1）中，所述反应温度为60℃，反应时间为12h。
步骤（1）中，所述分离纯化步骤为：反应液用二氯甲烷萃取，再用无水硫酸钠除去萃取液中剩余的少量的水，然后进行减压蒸馏，旋干溶剂得粗产品，经柱色谱分离得到提纯产物；所述柱色谱分离的流动相优选为体积比为1:20的乙酸乙酯与石油醚。
步骤（2）中，所述2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷的摩尔比为1:1。
步骤（2）中，所述反应温度为50℃，反应时间为4 h。
步骤（3）中，3-(4-甲醛基苯基)-9-乙基咔唑与碘化1,2,3,3-四甲基吲哚的摩尔比为1:1.2。
步骤（3）中，所述反应温度为80℃，反应时间为12 h。
一种上述荧光探针用于检测溶液、细胞和斑马鱼粘度的应用。
本发明荧光探针的识别机理如下：
在探针结构中，由于“吲哚盐部分”与“4-（9-乙基-9H-咔唑基）-苯乙烯基”通过多个单键相连，使得吲哚盐部分可以绕单键旋转，从而导致整个分子不共平面。在低粘度的情况下，由于单键的自由旋转，探针中的一部分能量通过非辐射的方式，使得辐射方式发射的能量减少，导致荧光量子产率降低，即在低粘度的环境下探针基本上没有荧光；当在粘度比较大的体系中时，由于单键的自由旋转受到限制，使得整个探针分子共平面，探针以非辐射散发的能量减少，以辐射的形式散发的能量增多，导致荧光量子产率上升，探针就会发出很强的荧光，即荧光开关被打开。所以，通过这种“开关型”荧光探针可以检测不同的粘度。
本发明的有益效果为：
本发明所提供的区分不同粘度的荧光探针，具有较高的灵敏度，良好的光学稳定性以及对粘度特异性响应；并且实现了在细胞以及斑马鱼内粘度的检测。同时，本发明提供了该探针的合成方法，步骤简单、纯化方便、收率高，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是探针CBI-V的1H NMR谱；
图2是探针CBI-V的13C NMR谱；
图3是探针CBI-V在不同粘度体系中的发射光谱；
图4是探针CBI-V在线粒体中的定位实验
图5是探针CBI-V的细胞成像应用；
图6是探针CBI-V在斑马鱼中的成像应用。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 荧光探针的合成
（1）化合物3-（4-甲醛基苯基）-9-乙基咔唑（3）的合成：
称量0.274 g 3-溴-9-乙基咔唑（1）（1 mmol），0.18g 4-甲酰基苯硼酸（2）（1.2mmol），37 mg四-(三苯基膦)钯（0.03 mmol），0.445 g碳酸钾（3.23mmol）于四氢呋喃与水=3:1（V:V）的混合溶剂中反应，升温至60 ℃回流，在N2氛围环境下反应12 h后，用二氯甲烷萃取，并用无水硫酸钠除去体系中剩余少量的水，然后进行减压蒸馏，旋干溶剂得粗产品，以体积比为1:20的乙酸乙酯与石油醚为流动相进行柱色谱分离提纯得3-(4-甲醛基苯基)-9-乙基咔唑（3）。
（2）化合物碘化1,2,3,3-四甲基吲哚（6）的合成：
称量0.795 g 2,3,3-三甲基-3H-吲哚（4）（5mmo l）与0.719 g碘甲烷（5）（5mmol）于高压管中，在50℃的条件下反应4h。反应完成后用石油醚冲洗抽滤，烘干得到浅紫色的固体，即碘化1,2,3,3-四甲基吲哚（6）；
（4）碘化2-(4-(9-乙基-9H-咔唑基)-苯乙烯基)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚的制备：
称量0.150 g 3-（4-甲醛基苯基）-9-乙基咔唑（3）（0.5 mmol）与0.181g碘化1,2,3,3-四甲基吲哚（6）（0.6 mmol）于乙醇溶液中，滴加几滴醋酸并在80℃的条件下加热回流。反应约12 h，反应完成后，将反应后的体系减压蒸馏，旋干溶剂得到粗产物后，以体积比为1:1的二氯甲烷与石油醚为流动相进行柱色谱分离提纯得碘化2-(4-(9-乙基-9H-咔唑基)-苯乙烯基)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚，即探针CBI-V。探针1H NMR谱如图1，13C NMR谱如图2；
1H NMR (400 MHz, Dmso-d) δ 8.39 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.33 –- 8.27 (t,J = 6.0 Hz, 3H), 8.16 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.85 (s,1H), 7.77 (dd, J1 = 8.5, J2=1.8 Hz, 1H), 7.59 - 7.57 (m, 1H), 7.55 - 7.48 (m,4H), 7.45 (dd, J1 = 4.0 Hz, J2=4.0 Hz, 2H), 7.32 - 7.26 (m, 2H), 4.44 (s,3H), 4.38 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 1.86 (s, 6H), 1.45 (t, J = 8.0 Hz, 3H)；
13C NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 182.07, 154.65, 147.82, 142.96,141.52, 140.56, 132.43, 131.90, 129.83, 129.70, 127.71, 126.30, 125.16,123.76, 123.05, 122.63, 120.76, 119.53, 119.32, 114.84, 112.04, 109.18,108.92, 52.52, 37.85, 37.32, 27.12, 13.96。
实施例2 荧光探针CBI-V在不同粘度体系中的荧光光谱
配制浓度为1 mM实施例1所得荧光探针的二甲基亚砜（DMSO）的测试母液待用。
测试液中，分别取3 ml不同比例甘油与甲醇的溶剂（甘油:甲醇=0:10，1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1，10:0），然后加入探针母液（终浓度为10 μM），进行荧光扫描（激发波长520 nm，检测波段530-850 nm），测得各体系中相对荧光强度，如图3所示。由图3可知，随着溶剂粘度的增加，相对荧光强度变强。
实施例3 荧光探针对线粒体的共定位成像
配制浓度为1 mM实施例1所得荧光探针的二甲基亚砜（DMSO）的测试母液待用。
将适当密度的Hela细胞接种到灭菌的35 mm成像培养皿中，在CO2培养箱（温度为37 ℃，5 % CO2）中培养，待细胞贴壁后，同时向细胞中加入染细胞核染料DAPI，粘度荧光探针CBI-V以及商业化染料线粒体绿，使DAPI最终浓度为5 μM，粘度荧光探针最终浓度为10 μM，线粒体绿最终浓度为5 μM。半小时后，弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，随后进行荧光成像（激发波长：404nm，蓝色通道425-475 nm；激发波长：488 nm，绿色通道：500-550nm；激发波长：561 nm，红色通道570 nm-620 nm），结果如图4所示。其中，A为细胞核在蓝色通道的成像图，只有细胞核被染色说明此时细胞状态良好；B为商业化染料线粒体绿在绿色通道的成像图；C为本发明所合成的探针CBI-V在红色通道的成像图；D是A,B和C的叠加图；E为B,C箭头处细胞中两探针的光谱强度叠加图；F为B,C两通道的强度散点图；由图4可知，该探针与线粒体绿的成像位置高度吻合，说明探针CBI-V主要定位在细胞中的线粒体内，因而本发明的探针可以用来检测细胞中线粒体的粘度。
实施例4 荧光探针在细胞中的成像
配制浓度为1 mM实施例1所得荧光探针的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液待用。
将适当密度的Hela细胞接种到灭菌的35 mm成像培养皿中，在CO2培养箱（温度为37 ℃，5 % CO2）中培养，待细胞贴壁后，第一组不加任何物质进行成像；第二组加入10μM粘度荧光探针CBI-V孵育半小时后进行生物成像；第三组先加入10μM粘度刺激物莫能菌素（Monensin），40分钟后再加入10μM粘度荧光探针CBI-V，孵育半小时后进行生物成像；第四组先加入10μM粘度刺激物制霉菌素（Nystatin），40分钟后加入10μM粘度荧光探针CBI-V，孵育半小时后进行生物成像。成像条件：单光子成像：激发波长561 nm，发射波长：570-620nm；双光子成像：激发波长740 nm，发射波长：570-620nm）。成像结果如图5所示。通过分析比较可以看出无论在单光子还是在双光子条件下，在不加任何物质的情况下，细胞不发光；在只有探针的情况下细胞只发微弱的光；在加有探针以及粘度刺激物（莫能菌素，制霉菌素）的情况下细胞发出强烈的红光；因此不同粘度的细胞可以通过本发明合成的探针进行细胞成像来区分。
实施例5 荧光探针在斑马鱼中的成像
配制浓度为1 mM实施例1所得荧光探针的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液待用。
将斑马鱼放入不同组成像盘中，分成四组，第一组仅加入PBS(pH=7.4)缓冲溶液，半小时后进行生物成像；第二组加入10 μM粘度荧光探针CBI-V孵育半小时后进行生物成像；第三组先加入10 μM粘度刺激物莫能菌素（Monensin），40分钟后再加入10μM粘度荧光探针CBI-V，孵育半小时后进行生物成像第四组先10 μM粘度刺激物制霉菌素（Nystatin），40分钟后加入10 μM粘度荧光探针CBI-V，孵育半小时后进行生物成像。成像条件：单光子成像：激发波长488 nm，发射波长：500-550 nm；双光子成像：激发波长740 nm，发射波长：500-550 nm。成像结果如图6所示。通过分析比较可以看出，无论在单光子还是在双光子条件下，在只有PBS的条件下斑马鱼没有荧光；在只有探针的情况下斑马鱼只发微弱的光；在加有探针以及粘度刺激物（莫能菌素，制霉菌素）的情况下斑马鱼发出强烈的红光；因此不同粘度的斑马鱼可以通过本发明合成的探针进行斑马鱼成像来区分。
Claims (7)
1.一种定位线粒体的检测粘度的荧光探针，其化学名称为碘化2-(4-(9-乙基-9H-咔唑基)-苯乙烯基)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚，其结构式如式（I）所示：
式（I）。
2.一种如权利要求1所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将3-溴-9-乙基咔唑与4-甲酰基苯硼酸在碳酸钾和四(三苯基膦)钯存在下于四氢呋喃与水的混合溶剂中加热回流，分离纯化得3-(4-甲醛基苯基)-9-乙基咔唑；（2）将2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷在高压管中反应得到碘化1,2,3,3-四甲基吲哚；（3）将3-(4-甲醛基苯基)-9-乙基咔唑与碘化1,2,3,3-四甲基吲哚在乙醇与几滴醋酸的混合液中加热回流，得到碘化2-(4-(9-乙基-9H-咔唑基)-苯乙烯基)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述反应溶剂为四氢呋喃:水=3:1（V:V）的混合。
4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述分离纯化步骤为：反应液用二氯甲烷萃取，再用无水硫酸钠除去萃取液中剩余的少量的水，然后进行减压蒸馏，旋干溶剂得粗产品，经柱色谱分离得到提纯产物；所述柱色谱分离的流动相为体积比为1:20的乙酸乙酯与石油醚。
5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述3-溴-9-乙基咔唑：碳酸钾：4-甲酰基苯硼酸：四(三苯基膦)钯的摩尔比为1:3:1.2:0.03；步骤（2）中，2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷的摩尔比为1:1；步骤（3）中，3-(4-甲醛基苯基)-9-乙基咔唑与碘化1,2,3,3-四甲基吲哚的摩尔比为1:1.2。
6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，反应温度为60℃，反应时间为12 h；反应在N2保护下进行；步骤（2）中，所述反应温度为50℃，反应时间为4 h；步骤（3）中，反应温度为80 ℃，反应时间为12 h。
7.一种如权利要求1所述的荧光探针在制备检测溶液、细胞和斑马鱼的粘度的试剂中的应用。
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