CN110938425B

CN110938425B - 一种可以对癌细胞内线粒体粘度进行成像的荧光探针、制备方法与应用

Info

Publication number: CN110938425B
Application number: CN201911265894.6A
Authority: CN
Inventors: 任明光; 孔凡功; 刘克印; 王守娟
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: CN110938425A

Abstract

本发明提供一种可以对癌细胞内线粒体粘度进行成像的荧光探针，其特征在于：探针分子的分子式为：C30H36N7OBrS2；本发明还提供上述探针的制备方法及其应用；本发明探针的合成只需要两步就可以完成，且后处理过程相对简单；本发明实现了粘度探针的高灵敏性，靶向性好的特点。此外，用肉眼就可以观察到随着溶液粘度的增加而发生的颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。基于其特异性且显著的颜色变化，该试剂可作为显示流体粘度和生物细胞内粘度变化的指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。

Description

一种可以对癌细胞内线粒体粘度进行成像的荧光探针、制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种快速检测癌细胞内线粒体粘度的荧光探针的制备方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

粘度影响着液体的流动性和扩散性, 同时是流体扩散速率的主要参考指标。在细胞水平，粘度的异常影响着细胞内信号的传递和化学物质之间的相互作用，此外还影响到细胞内环境中各种新陈代谢的进行。从细胞生物力学的角度看，细胞结构可以分为细胞质，细胞膜和细胞骨架。其中细胞骨架被认为是刚性的结构，而细胞膜和细胞质则具有一定的粘弹性。当细胞处于病理状态时或者癌变时，细胞内粘度就会发生明显的变化。所以检测癌细胞内粘度的变化具有十分重要的意义，为癌症的发生发展研究提供重要的信息支撑。

粘度是衡量一种浓稠流体的流动性和扩散性的主要因素, 同时是流体扩散速率的主要参考指标。微环境的粘度在病理学研究中起到非常重要的作用，因为粘度的变化往往会影响到细胞内环境中各种新陈代谢的进行。

细胞内不同区域的粘度存在着较大的差别，线粒体是细胞产生能量的仓库，粘度的改变可以通过降低线粒体膜的流动性，增加ROS的产生。被广泛证明，增加线粒体粘度可能会导致一些疾病，如癌症、阿兹海默症，帕金森病，糖尿病等。因此，研究癌细胞内线粒体粘度的改变是非常有意义的工作。

然而具有可以靶向到癌细胞线粒体中的荧光探针还没有相关的报道。

发明内容

针对目前粘度荧光探针检测所面临的问题的现状，本发明通过分子设计，合成出一种具有癌细胞线粒体靶向的粘度荧光探针，随着粘度的增加，探针的荧光强度显著增强，具有高度的灵敏性，并且可以对癌细胞内微环境的粘度进行荧光成像。

本发明的所设计的荧光探针的分子结构式如下：

；

探针的合成可以通过以下几步进行：

（1）化合物1（1eq）和化合物2（1eq），溶于乙醇中，搅拌过程中加入哌啶，常温反应20min，然后90℃加热回流反应2h。通过柱色谱进行分离纯化得到化合物3。

所述化合物1和化合物2的摩尔比为1:1；

所述化合物1和乙醇的重量体积比为：25mg:1ml；

所述乙醇和哌啶的体积比为100:1；

（2）化合物3（1eq）和化合物4溶于干燥的二氯甲烷中，然后依次向反应液中加入六氟磷酸四乙腈铜（0.2 eq）和二异丙胺乙基胺（0.5 eq）常温反应12h。通过柱色谱分离得到化合物Biotin-V。

所述化合物3和化合物4的摩尔比为1:1；

所述化合物3与二氯甲烷的质量体积比为：40 mg：1ml；

所述化合物3和六氟磷酸四乙氰铜的摩尔比为5:1；

所述六氟磷酸四乙氰铜与N，N-二异丙基乙胺的摩尔比为：1:2.5；

上述常温反应12h后，用TCL板检测反应(用TLC板进行检测，化合物3或4 反应完全即为反应终点)，向反应液中加入稀释用二氯甲烷进行稀释反应液，用水洗涤三次，用饱和食盐水洗涤一次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干有机溶剂，得到粗产品。用二氯甲烷溶解，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷=1:10。

所述化合物4与稀释用二氯甲烷的质量体积比为：1.2-1.3mg:1ml；

所述稀释用二氯甲烷与每次洗涤水的体积比为2:1；

所述每次洗涤水与饱和食盐水的体积比为1:1。

本发明粘度探针的用途：该荧光探针可以应用于流体粘度和癌细胞线粒体中粘度变化传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）探针的合成只需要两步就可以完成，且后处理过程相对简单；

（2）本发明实现了粘度探针的高灵敏性，靶向性好的特点。此外，用肉眼就可以观察到随着溶液粘度的增加而发生的颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。基于其特异性且显著的颜色变化，该试剂可作为显示流体粘度和生物细胞内粘度变化的指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的粘度特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。其性能将在实施例中结合附图给予详细说明。

（3）本发明的Biotin-V荧光探针可以通过荧光光谱检测溶液的粘度，以420 nm 为激发光，Biotin-V荧光探针的浓度为10μmol/L，溶液的粘度范围为1.2-980.1cp时，随着溶液粘度的增加，荧光强度逐渐增加，当溶液的粘度为980.1cp时，荧光强度a.u.为7500。

（4）本发明的Biotin-V荧光探针可以对不同粘度的溶液进行目视定性检测，

在波长为365 nm，功率为16w的紫外灯照射下，对不同粘度的甲醇和甘油混合溶液进行目视定性检测，肉眼可视随着粘度的增强，荧光探针发出明亮的红色荧光也越来越强。

（5）本发明的Biotin-V荧光探针可以进行细胞成像检测，制霉菌素和莫奈菌素刺激细胞，提高线粒体内的粘度，红通道的荧光信号有了明显的增强，说明探针可以对癌细胞细胞线粒体中粘度变化进行荧光成像。

附图说明

图1是实施例1制备的探针Biotin-V的¹H NMR图谱；

图2是探针Biotin-V在不同粘度下的荧光谱图；

图3是探针Biotin-V在不同粘度溶液中用紫外灯照射后荧光颜色变化图；

图4是探针Biotin-V应用于细胞中粘度的荧光成像图；

图5是本发明荧光探针的合成路线图；

图3中，从左到右，甘油在甲醇和甘油混合溶液中体积占比分别为0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。

图4中，a-c为HeLa细胞中含5 μM的探针，培养30 min后明场、红通道荧光成像图以及重叠图；d-f）经过制菌霉素刺激30min再与5 μM 探针培养30 min后的明场、红通道荧光成像图以及重叠图；g-i) 经过莫奈菌素刺激30 min再与5 μM 探针培养30 min后的明场、红通道荧光成像图以及重叠图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对于上述方案中化合物的号码。

实施例1: 化合物Biotin-V粘度荧光探针的合成

（1）化合物3的合成：

将化合物1（500 mg, 1.86 mmol, 1eq），化合物2（278 mg, 1.86 mmol, 1eq）溶于20mL乙醇中，搅拌过程（1000转/min）中加入0.2mL哌啶，常温反应20min，然后90℃加热回流反应2h。用TCL板检测反应，反应完全后(用TLC板进行检测，化合物1或2 反应完全即为反应终点)，冷却至室温，减压过滤，真空干燥，得到产品，称重608 mg，产率为82%。

化合物1 化学名为：2-methyl-3-(prop-2-yn-1-yl)benzo[d]thiazol-3-ium

化合物2化学名为：4-(dimethylamino)benzaldehyde；4-N, N-二甲氨基苯甲醛

化合物3化学名为：(E)-N,N-dimethyl-4-(2-(3-(prop-2-yn-1-yl)-3l4-benzo[d]thiazol-2-yl)vinyl)aniline

（2）化合物Biotin-V的合成：

将化合物3（200 mg，0.5 mmol，1eq）和化合物4（127.6 mg， 0.5 mmol， 1eq）溶于5mL二氯甲烷中，然后依次加入六氟磷酸四乙氰铜（37.3 mg，0.1 mmol，0.2 eq）N，N-二异丙基乙胺（33 mg，0.25 mmol，0.5 eq），常温反应12 h。用TCL板检测反应(用TLC板进行检测，化合物3或4 反应完全即为反应终点)，向反应液中加入100 mL二氯甲烷稀释反应液，用水50 mL洗涤三次，用饱和食盐水50 mL洗涤一次(用分液漏斗进行洗涤，产物在有机层中)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干有机溶剂，得到粗产品。用2 mL二氯甲烷溶解，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷=1:10；产率为65%。

所述硅胶柱分离的方法为：二氯甲烷的溶解液加入到已经装好硅胶的玻璃柱的上沿，通过改变洗脱剂的极性来进行洗脱，流速一般为10 mL/ min。

制备的Biotin-V的氢核磁共振谱为：

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 8.41 (s, 1H), 8.31 (d, J = 8.0 Hz, 1H),8.24 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 8.02 – 7.84 (m, 3H),7.77 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.67 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.7 Hz, 2H),6.40 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 6.19 (s, 2H), 4.58 (s, 1H), 4.32 (dt, J = 18.3, 6.6Hz, 3H), 4.08 (s, 1H), 3.13 (s, 6H), 3.02 (q, J = 6.7 Hz, 1H), 2.79 (dd, J =12.4, 5.1 Hz, 1H), 1.84 – 1.67 (m, 2H), 1.53 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 1.45 –1.07 (m, 8H).

实施例2: 化合物Biotin-V粘度荧光探针随粘度的增加荧光谱图的变化

取实施例1制备的Biotin-V粘度荧光探针溶于二甲基亚砜（DMSO）中，制成1mmol/L储备液。从储备液中取出100 μL 加入到10 mL 的离心管当中，用甲醇和甘油配成不同比例的粘度值，将甲醇和甘油混合液加入到离心管中，使得离心管中溶液的体积为10ml，Biotin-V荧光探针的浓度为10μmol/L，测量其荧光性质。荧光光谱如图2 所示。由图2可见，随着粘度的增加荧光逐渐增强。

粘度值会随着温度的改变而进行变化，本实验测试时甲醇和甘油的粘度值分别为1.2 cp 和980.1 cp，甲醇和甘油配制的粘度值范围为1.2-980.1cp。

所述荧光光谱的检测是以420 nm 为激发光。

实施例3: 化合物Biotin-V荧光探针对粘度的可视化检测

从实施例2 中荧光探针储备液中取出分别20 μL 加入到12个3 mL 的样品管当中，一个加入1.5 mL不同配比的甲醇和甘油的混合液，伴随着紫外灯照射下肉眼可视的随着粘度的增强，荧光探针发出明亮的红色荧光也越来越强（图3），说明是一种具有生色传感功能的荧光探针。

所述紫外灯的波长为365 nm，功率为16w。

实施例4：化合物Biotin-V荧光探针对细胞的荧光成像

将本发明探针应用与宫颈癌细胞（HeLa）细胞中对线粒体中的粘度的变化进行荧光成像应用（图4）具体操作步骤如下：

将5 μL探针DMSO溶液母液加入到育有HeLa细胞的培养液（培养液体积为1 mL）中在二氧化碳培养箱中在37度条件下培养30 min后用共聚焦显微镜进行成像。通过对HeLa细胞进行明场、红通道（λ_ex= 561 nm; λ_em = 570-620 nm）进行荧光成像。我们利用制霉菌素和莫奈菌素作为刺激物来改变细胞中线粒体内的粘度，并利用Biotin-V探针进行荧光成像，来研究粘度变化前后红通道荧光强度的变化来进一步说明探针可以应用于细胞线粒体中，并对其粘度的变化进行荧光成像的应用。

将制霉菌素或莫奈菌素母液加入到育有HeLa细胞的1 mL的细胞培养液中，在二氧化碳培养箱中在37度条件下培养30 min后加入探针DMSO溶液母液，并继续孵育30 min。通过对HeLa细胞进行明场和红通道进行荧光成像。发现制霉菌素和莫奈菌素刺激前后红通道的荧光信号有了明显的增强，说明探针可以对癌细胞细胞线粒体中粘度变化进行荧光成像。

所述霉菌素或莫奈菌素在细胞培养液中最终浓度是10 µM；

所述探针DMSO在细胞培养液中的最终浓度是5µM。

Claims

1.一种对癌细胞内线粒体粘度进行成像的荧光探针，其特征在于：探针分子的分子式为：C₃₀H₃₆N₇OBrS₂；

所述荧光探针的结构式如下：

。

2.一种对癌细胞内线粒体粘度进行成像的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述制备方法，按照以下步骤进行：化合物1和化合物2，溶于乙醇中，搅拌过程中加入哌啶，常温反应18-22min，然后90℃加热回流反应1.9-2.2h；分离纯化得到化合物3；化合物3和化合物4溶于干燥的二氯甲烷中，然后依次向反应液中加入六氟磷酸四乙腈铜和二异丙胺乙基胺常温反应11-13 h；分离得到化合物Biotin-V；所述化合物1的结构式为：

；

所述化合物2为4-N, N-二甲氨基苯甲醛；

所述化合物3的结构式为：

；

所述化合物4的结构式为：

。

3.根据权利要求2所述的一种对癌细胞内线粒体粘度进行成像的荧光探针的制备方法，其特征在于：