WO2009139452A1 - 活性酸素測定用試薬 - Google Patents

活性酸素測定用試薬 Download PDF

Info

Publication number
WO2009139452A1
WO2009139452A1 PCT/JP2009/059031 JP2009059031W WO2009139452A1 WO 2009139452 A1 WO2009139452 A1 WO 2009139452A1 JP 2009059031 W JP2009059031 W JP 2009059031W WO 2009139452 A1 WO2009139452 A1 WO 2009139452A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
compound
ester
salt
apc
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/059031
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
哲雄 長野
泰照 浦野
沙希 和泉
Original Assignee
国立大学法人東京大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人東京大学 filed Critical 国立大学法人東京大学
Priority to US12/991,750 priority Critical patent/US8410164B2/en
Priority to JP2010512019A priority patent/JP5477749B2/ja
Publication of WO2009139452A1 publication Critical patent/WO2009139452A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
    • G01N31/223—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators for investigating presence of specific gases or aerosols
    • G01N31/225—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators for investigating presence of specific gases or aerosols for oxygen, e.g. including dissolved oxygen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
    • C07D311/82—Xanthenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/10—Spiro-condensed systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N2021/7769—Measurement method of reaction-produced change in sensor
    • G01N2021/7786—Fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a compound useful as a reagent for measuring active oxygen or a salt thereof.
  • the present invention also relates to a reagent for measuring active oxygen containing the above compound or a salt thereof.
  • free radical species such as nitric oxide act as a second messenger of information transmission in living organisms and biological phenomena, and exert various physiological actions such as controlling blood pressure in the circulatory system.
  • Active oxygen that is one of the free radical species includes superoxide anion, hydrogen peroxide, hydroxyl radical, singlet oxygen, etc.
  • hydroxyl radical is a vascular disorder or brain disorder after ischemia.
  • many findings related to DNA modification by ultraviolet rays have been reported, and it is considered to be a highly reactive reactive oxygen species in relation to the etiology and pathology.
  • a method for detecting hydroxyl radicals under a microscope is also known, but the results in the presence of an inhibitor include elements that are different from reactions in vivo.
  • DCFH-DA is extremely susceptible to auto-oxidation, so when it is necessary to observe the same visual field many times, background fluorescence due to auto-oxidation interferes with detection.
  • the method is extremely inconvenient in terms of operability and storage, such as requiring operation in a dark place.
  • An object of the present invention is to provide a compound useful as a reagent for measuring active oxygen such as hydroxyl radical. Another object of the present invention is to provide a reagent for measuring active oxygen containing the above compound and a method for measuring active oxygen using the above compound. In particular, it is possible to provide a reagent for measuring active oxygen present in a minute amount in a living body or tissue, more specifically, active oxygen present in a minute amount in a cell over a long period of time with a bioimaging technique. It is the subject of the present invention.
  • a substantially non-fluorescent compound represented by the following general formula (I) is efficient under active conditions such as hydroxyl radicals and physiological conditions. Reaction to give a dearylated fluorescent compound, and the dearylated fluorescent substance produced from the compound represented by the general formula (I) has a very high intracellular retention,
  • the present invention has been found to be excellent and useful as a reagent for measuring a very small amount of active oxygen present in water.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • R 1 represents an aryl group which may have a substituent
  • R 2 represents a 2 -carboxyphenyl group which may have a substituent
  • R 3 and R 4 each independently represent -(CH 2 ) p -N (R 5 ) (R 6 ) (wherein p represents an integer of 1 to 4
  • R 5 and R 6 are each independently-(CH 2 ) n -COOH (wherein , N represents an integer of 1 to 4)
  • a salt thereof, or an ester thereof is provided.
  • R 1 is a phenyl group substituted with an amino group or a hydroxyl group, a salt thereof, or an ester thereof; R 1 is a p-aminophenyl group or a p-hydroxyphenyl group.
  • the present invention provides a reagent for measuring active oxygen containing the compound represented by the above general formula (I), a salt thereof, or an ester thereof.
  • the above reagent which is a reagent for measuring reactive oxygen species having high reactivity; the above reagent wherein the active oxygen species is hydroxyl radical, peroxynitrite or hypochlorous acid Is done.
  • a method for measuring active oxygen comprising the following steps: (A) a step of reacting a compound represented by the above general formula (I) or a salt thereof with active oxygen, and (B) the above There is provided a method comprising measuring the fluorescence of the dearyl compound produced in step (A) (the compound in which R 1 is a hydrogen atom in the above general formula (I)) or a salt thereof.
  • the above method which is a reagent for measuring reactive oxygen species having high reactivity; the above method wherein the active oxygen species is hydroxyl radical, peroxynitrite or hypochlorous acid Is done.
  • the compound of the present invention is useful as a reagent for measuring reactive oxygen species, preferably reactive oxygen species having high reactivity (such as hydroxyl radical, peroxynitrite, or hypochlorous acid) and reacting with the reactive oxygen species. Since the fluorescent substance produced by the above has a high intracellular retention, it has an excellent feature that a very small amount of reactive oxygen species present in the cell can be measured over a long period of time with extremely high sensitivity.
  • the reagent for measuring active oxygen containing the compound of the present invention and the method for measuring active oxygen using the above compound are particularly sensitive to the measurement of active oxygen localized in specific cells and tissues in the living body by means of bioimaging. It is useful as a reagent and measurement method.
  • aryl group represented by R 1 for example, a monocyclic, bicyclic, or tricyclic aryl group having 6 to 14 ring atoms can be used.
  • a phenyl group or a naphthyl group More preferably, a phenyl group can be used.
  • the aryl group may have one or more substituents on the ring. When it has two or more substituents, they may be the same or different.
  • the type and position of the substituent are not particularly limited.
  • a C 1-6 alkyl group the alkyl group may be linear, branched, cyclic, or a combination thereof.
  • C 1-6 haloalkyl group C 1-6 alkenyl group, C 1-6 alkoxy group, halogen atom (halogen atoms include fluorine, chlorine, bromine Atom or iodine atom), cyano group, nitro group, amino group which may have a substituent, carboxy group, alkoxycarbonyl group, C 1-6 alkanoyl group, C 1-6 haloalkanoyl group, aroyl A group, a hydroxyl group, an alkylenedioxy group, or the like can be used as a substituent.
  • R 1 is preferably a substituted phenyl group, and more preferably a mono-substituted phenyl group.
  • the mono-substituted phenyl group an unsubstituted amino group or a phenyl group having a hydroxyl group is particularly suitable.
  • the substitution position of the substituent is preferably the ortho position or the para position.
  • R 1 is particularly preferably a p-aminophenyl group or a p-hydroxyphenyl group.
  • the benzene ring of the 2-carboxyphenyl group represented by R 2 may have one or more substituents. When it has two or more substituents, they may be the same or different.
  • the substituent on the benzene ring the group described for the aryl group can be used, and R 2 is preferably an unsubstituted 2-carboxyphenyl group.
  • R 5 and R 6 each independently represent — (CH 2 ) n —COOH, and n represents an integer of 1 to 4, preferably an integer of 1 to 3, more preferably 1 or 2, and particularly preferably 1. Indicates.
  • the compound represented by the general formula (I) may exist as a salt.
  • the salt include base addition salts, acid addition salts, amino acid salts and the like.
  • the base addition salt include metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, ammonium salt, or organic amine salts such as triethylamine salt, piperidine salt, morpholine salt, and acid addition salt.
  • examples thereof include mineral acid salts such as hydrochloride, sulfate, and nitrate, and organic acid salts such as methanesulfonate, paratoluenesulfonate, citrate, and oxalate.
  • amino acid salts include glycine salts.
  • the salt of the compound of the present invention is not limited to these. Among these, physiologically acceptable water-soluble salts can be suitably used for the reagent and measurement method of the present invention.
  • the ester of the compound represented by the general formula (I) is 1 or 2 selected from the group consisting of the carboxy group of the 2-carboxyphenyl group represented by R 2 and the carboxy group present in each two in R 3 and R 4
  • Two or more carboxy group esters can be used, and preferably one or two or more carboxy group esters selected from the group consisting of a total of four carboxy groups each present in R 3 and R 4 are used. be able to. More preferably an ester of 3 or more carboxyl groups selected from the group consisting of a total of four carboxy groups present two each in R 3 and R 4, respectively Particularly preferred for R 3 and R 4 2 A total of 4 esters of carboxy groups present one by one. When two or more esters are present, the ester residues may be the same or different.
  • the ester is preferably a physiologically acceptable ester.
  • suitable ester residues include, for example, methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, butyl group, isobutyl group, t-butyl group, benzyl group, acetoxymethyl group, 1- (acetoxy) ethyl group , Propionyloxymethyl group, 1- (propionyloxy) ethyl group, butyryloxymethyl group, 1- (butyryloxy) ethyl group, isobutyryloxymethyl group, 1- (isobutyryloxy) ethyl group, valeryloxy Methyl group, 1- (valeryloxy) ethyl group, isovaleryloxymethyl group, 1- (isovaleryloxy) ethyl group, pivaloyloxymethyl group, 1- (pivaloyloxy) ethyl group, methoxycarbonyloxymethyl group, 1- (methoxycarbon
  • the free form of the compound represented by the general formula (I), a salt thereof, or an ester thereof may exist as a hydrate or a solvate, and any of these substances is included in the scope of the present invention.
  • the kind of solvent which forms a solvate is not specifically limited, For example, solvents, such as ethanol, acetone, isopropanol, can be illustrated.
  • the compound represented by the general formula (I) may have one or more asymmetric carbons depending on the type of substituent, and there are stereoisomers such as optical isomers or diastereoisomers. There is a case. Pure forms of stereoisomers, any mixture of stereoisomers, racemates, and the like are all within the scope of the present invention.
  • the carboxy group of the 2-carboxyphenyl group in the compound represented by the general formula (I) may form a lactone ring in the molecule, but the compound forming the lactone ring is also included in the scope of the present invention. Needless to say.
  • optically active substances based on the lactone formation are also included in the scope of the present invention.
  • the compound of the present invention represented by the general formula (I) is generally prepared by introducing R 3 and R 4 into a corresponding fluorescein compound to produce a compound in which R 1 is a hydrogen atom. It can be produced by arylation.
  • the means for arylation is specifically shown in International Publication No. WO01 / 64664.
  • an alkali metal salt of a fluorescein compound is prepared and reacted with an aryl iodide compound in a suitable solvent. That's fine. Since the production method of a representative compound of the compound represented by the general formula (I) of the present invention is specifically shown in the examples of the present specification, those skilled in the art will be based on the specific description of the examples.
  • the compound of the present invention can be easily produced by appropriately selecting starting materials and reaction reagents, and appropriately changing or modifying the reaction conditions and steps as necessary.
  • the target product can be efficiently produced by carrying out the reaction while protecting specific functional groups as necessary in the reaction step.
  • Organic synthesis Protective Groups, Organic Synthesis, TWGreene, John Wiley & Sons, Inc., 1981
  • Organic synthesis and the like can be selected by those skilled in the art.
  • isolation and purification of the product in the above production method can be performed by appropriately combining methods used in ordinary organic synthesis, for example, filtration, extraction, washing, drying, concentration, crystallization, various chromatography, and the like.
  • the production intermediate in the above step can be subjected to the next reaction without particular purification.
  • the salt of the compound of the present invention when the salt of each compound is obtained in the above production method, it may be purified as it is.
  • the free form compound is obtained, the free form compound is obtained. Is dissolved or suspended in a suitable solvent, a base is added to form a salt, and purification may be performed as necessary.
  • the compound of the present invention represented by the above general formula (I) or a salt thereof reacts with active oxygen under mild conditions, for example, physiological conditions to produce a dearyl fluorescein compound (general formula (I) In which R 1 is a hydrogen atom) or a salt thereof.
  • the compound of the general formula (I) or a salt thereof is substantially non-fluorescent, while the dearylated fluorescein compound or a salt thereof has a property of emitting high intensity fluorescence. Therefore, after reacting the compound represented by the above formula (I) or a salt thereof with active oxygen, and measuring the fluorescence of the dearylated compound or the salt thereof, the active oxygen is selectively and highly sensitive. It is possible to measure.
  • This reaction mode is specifically described in International Publication No. WO01 / 64664.
  • ester of the compound represented by the general formula (I) may not itself have a property of reacting with active oxygen to give a fluorescent substance, but it has migrated into the cell through the cell membrane, for example. Later, the ester is cleaved by a hydrolase and converted to a compound represented by the general formula (I), and the generated compound represented by the general formula (I) reacts with active oxygen to give a fluorescent substance. Therefore, the ester of the compound represented by the general formula (I) can be used as a cell membrane-permeable reagent for measuring active oxygen.
  • the type of active oxygen that can be measured by the reagent of the present invention is not particularly limited, and any of superoxide anion, hydroxyl radical, singlet oxygen, hydrogen peroxide, and the like can be measured.
  • hydroxyl radical, peroxynitrite, or hypochlorous acid can be measured with high sensitivity and selectivity.
  • active oxygen localized in individual cells or specific tissues can be measured accurately and simply.
  • the active oxygen measurement method of the present invention generally comprises (A) a step of reacting a compound represented by the above general formula (I) or a salt thereof with active oxygen, and (B) the above step (A). And the step of measuring the fluorescence of the dearyl compound produced in (corresponding to the compound in which R 1 is a hydrogen atom in the above general formula (I)) or a salt thereof.
  • the above-mentioned step (A ) Proceeds.
  • the fluorescence of a dearylated compound or a salt thereof can be measured by a usual method, such as a method for measuring a fluorescence spectrum in vitro or a method for measuring a fluorescence spectrum in vivo using a bioimaging method. Can be adopted.
  • a gamma radiolysis method can be used as a quantitative hydroxyl radical generation system.
  • a naphthalene end peroxide system (Saito, I,. Et al., J. Am. Chem. Soc., 107, pp.6329-6334, 1985) can be used as a system for generating term oxygen.
  • the ester of the compound represented by the general formula (I) of the present invention has a property of permeating through a cell membrane and being taken up into a cell, and highly sensitive to active oxygen localized in each cell by a bioimaging technique. Can be measured.
  • the compound represented by the above formula (I), a salt thereof, or an ester thereof may be used as it is, but if necessary, an additive usually used for the preparation of the reagent May be used as a composition.
  • additives such as solubilizers, pH adjusters, buffers, and isotonic agents can be used as additives for using the reagent in a physiological environment, and the amount of these additives is appropriately selected by those skilled in the art. Is possible.
  • These compositions are provided as a composition in an appropriate form such as a mixture in a powder form, a lyophilized product, a granule, a tablet, or a liquid.
  • Example 1 The compounds of the present invention were prepared according to the following scheme.
  • the catalyst was removed by filtration, and the residue after evaporation of the solvent was roughly purified by silica gel chromatography (developing solvent: 1,2-dichloroethane / methanol) and then purified by HPLC to obtain a pale yellow powder of compound 4 (252.6 mg Yield: 72.1%).
  • Example 3 Changes in fluorescence spectrum were measured by reacting compound 5 (APC) with various active oxygen species or nitrogen species. The measurement was performed as follows. (1) Hydroxyl radical 10 ⁇ M APC in phosphate buffer solution (0.1 M, pH 7.4, containing 0.02% DMF as a co-solvent) Then, an iron (II) perchlorate aqueous solution was added dropwise so that the final concentrations were 0 ⁇ M, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M, 200 ⁇ M, 300 ⁇ M, 500 ⁇ M, 1000 ⁇ M, and 2000 ⁇ M. Immediately after the dropping, the fluorescence spectrum was measured with excitation light at 494 nm with a fluorometer.
  • Nitric oxide 10 ⁇ M APC phosphate buffer solution (0.1 M, pH 7.4, containing 0.02% DMF as a co-solvent) at 37 ° C. with stirring in a cuvette, NOC-13 (1-hydroxy-2 -Oxo-3- (3-aminopropyl) -3-ethyl-1-triazene: nitrogen monoxide releasing agent) was added to a final concentration of 10 ⁇ mol / L, and after 30 minutes, it was converted to excitation light at 494 nm with a fluorometer. The fluorescence spectrum was measured.
  • FIG. 2 The result is shown in figure 2.
  • (A) is hydroxyl radical
  • (B) is peroxynitrite
  • (C) is hypochlorous acid
  • (D) is singlet oxygen
  • (E) is superoxide
  • (F) is peroxidized.
  • Hydrogen and (G) show the results for nitric oxide.
  • APC rapidly reacts with highly reactive reactive oxygen species (hROS) such as hydroxyl radical, peroxynitrite, or hypochlorous acid, and the fluorescence intensity increases in a concentration-dependent manner.
  • hROS highly reactive reactive oxygen species
  • Example 4 Imaging of active oxygen species in living cells was performed using Compound 5 (APC).
  • Ester-type compound 6 (APC-AM, 1.0 ⁇ M; 0.1% dimethylformamide (co-solvent)) with enhanced cell membrane permeability of APC was added to the medium and loaded on HeLa cells for 15 minutes, followed by 500 ⁇ M sodium hypochlorite. Stimulation was performed.
  • (A) shows the result before sodium hypochlorite stimulation
  • Example 5 Compound 5 (APC) of the present invention and the conventional fluorescent probe aminophenylfluorescein (APF) were applied to HL-60 cells to compare the reactivity with reactive oxygen species and the intracellular retention of reaction products. went. Since HL-60 cells are blood cell suspension cells and have myeloperoxidase, it is known that hydrogen chloride and chloride ions react in the cells to produce hypochlorous acid. APC-AM (10 ⁇ M; 1.0% dimethylformamide (co-solvent)), an intracellular form of APC, is added to the medium, loaded onto HL-60 cells for 60 minutes, preincubated for 30 minutes, and stimulated with 100 ⁇ M hydrogen peroxide.
  • APC-AM 10 ⁇ M; 1.0% dimethylformamide (co-solvent)
  • APF and APC-AM both 10 ⁇ M; 1.0% dimethylformamide (co-solvent) were added to the medium and loaded on HL-60 cells for 60 minutes, followed by 100 ⁇ M hydrogen peroxide stimulation for 15 minutes. Thereafter, the fluorescence intensity was measured periodically (0 minutes, 30 minutes, 60 minutes) by FACS.
  • FIG. 6 (A) to (C) show the results of APF, (D) to (F) show the results of APC-AM, (A) and (D) immediately after hydrogen peroxide stimulation, (B) and (E) The results after 30 minutes (C) and (F) 60 minutes are shown.
  • Fluorescein produced by the reaction between APF and reactive oxygen species is observed to remain in the cell immediately after stimulation because an increase in fluorescence intensity is observed (A), but leaks quickly from the cell after the reaction. After 30 minutes, detection became difficult (B, C).
  • calcein produced by the reaction of APC and reactive oxygen species generated by hydrolysis of APC-AM in the cell does not change in fluorescence intensity immediately after stimulation and is retained in the cell for a long time. It was confirmed that Therefore, it was shown that a trace amount of reactive oxygen species (particularly, a trace amount of reactive oxygen species in cells) can be detected with high sensitivity over a long period of time by APC.
  • the reagent for measuring active oxygen containing the compound of the present invention and the method for measuring active oxygen using the above compound are particularly sensitive to the measurement of active oxygen localized in specific cells and tissues in the living body by means of bioimaging. It is useful as a reagent and measurement method.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

生体や組織中に微量に存在するヒドロキシルラジカルなどの活性酸素をバイオイメージングの手法によって長時間にわたって高感度に測定するための試薬として有用な式(I)（R1はヒドロキシフェニル基などのアリール基、R2は2-カルボキシフェニル基など、R3及びR4は-(CH2)p-N(R5)(R6)(R5及びR6は-(CH2)n-COOH）)で表される化合物、その塩、又はそのエステル。

Description

活性酸素測定用試薬
　本発明は、活性酸素測定用試薬として有用な化合物又はその塩に関するものである。また、本発明は上記化合物又はその塩を含む活性酸素測定用試薬に関する。
　生体および生命現象において一酸化窒素などのフリーラジカル種が情報伝達のセカンドメッセンジャーとして作用しており、循環器系において血圧の制御を行うなど多様な生理作用を発揮していることが知られている。フリーラジカル種の一つである活性酸素としてはスーパーオキサイドアニオン、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素などが挙げられるが、これらのうち、ヒドロキシルラジカルは、血管障害や虚血後の脳障害、あるいは紫外線によるDNA修飾に関わる知見が多数報告され、病因・病態との関係で特に障害性が高い活性酸素種と考えられている。
　このように活性酸素種の生体内での役割の解明の重要性が高まっているが、その測定方法については課題が多い。ヒドロキシルラジカルを測定する方法については、電子スピン共鳴（ESR）法で測定した多数の報告があるが、ESR法では生細胞を測定試料として使用すること自体が困難であり、個々の細胞レベルでの測定評価は実際上不可能である。一方、活性酸素種を広く測定可能なDCFH-DA (2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、モレキュラー・プローブス社、カタログ番号D-399)を他の活性酸素種生成の阻害剤と共に使用して顕微鏡下でヒドロキシルラジカルを検出する方法も知られているが、阻害剤共存下の成績は生体内での反応とは異なる要素を含んだものになる。またDCFH-DAは、極めて自動酸化をうけやすいため、同一視野を何度も観察する必要がある場合に、自動酸化によるバックグラウンド蛍光が検出を妨害してしまう。さらに、暗所での操作を必要とするなど操作性、保存性の点で極めて不便な方法であった。
　活性酸素種を簡便かつ高感度に測定できる試薬として、一重項酸素に対して特異的な検出試薬（国際公開WO99/51586号）、及びヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸などを特異的かつ高感度に測定できる試薬（化合物として、ヒドロキシフェニルフルオレセイン(HPF)、アミノフェニルフルオレセイン(APF)など）、（国際公開WO01/64664号、HPF及びAPFは積水メディカル株式会社により販売されている）が提供されている。しかしながら、後者の試薬では活性酸素種との反応により生じるフルオレセインの細胞内滞留性が悪く細胞から漏出することがあるため、細胞内の微量の活性酸素の測定が困難になる場合があった。
国際公開WO99/51586号 国際公開WO01/64664号
　本発明の課題は、ヒドロキシルラジカルなどの活性酸素の測定用試薬として有用な化合物を提供することにある。また、本発明の別な課題は、上記化合物を含む活性酸素測定用試薬及び上記化合物を用いた活性酸素の測定方法を提供することにある。特に、生体や組織中に微量に存在する活性酸素、より具体的には細胞内に微量に存在する活性酸素をバイオイメージングの手法によって長時間にわたって高感度に測定するための試薬を提供することが本発明の課題である。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、下記の一般式(I)で表される実質的に非蛍光性の化合物がヒドロキシルラジカルなどの活性酸素と生理的条件下で効率的に反応して脱アリール化された蛍光性の化合物を与えること、並びに一般式(I)で表される化合物から生じる脱アリール化された蛍光性物質の細胞内滞留性が極めて高く、細胞内に存在する微量の活性酸素を高感度に測定するための試薬として優れて有用であることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
　すなわち本発明は、下記の一般式(I)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 〔式中、R1は置換基を有していてもよいアリール基を示し、R2は置換基を有していてもよい2-カルボキシフェニル基を示し、R3及びR4はそれぞれ独立に-(CH2)p-N(R5)(R6)(式中、pは1ないし4の整数を示し、R5及びR6はそれぞれ独立に-(CH2)n-COOH（式中、nは1ないし4の整数を示す）で表される基を示す）を示す〕で表される化合物、その塩、又はそのエステルを提供するものである。
　本発明の好ましい態様によれば、R1がアミノ基又は水酸基で置換されたフェニル基である上記の化合物、その塩、又はそのエステル；R1がp-アミノフェニル基又はp-ヒドロキシフェニル基である上記の化合物、その塩、又はそのエステル；R2が2-カルボキシフェニル基である上記の化合物、その塩、又はそのエステル；R3及びR4が-(CH2)-N[(CH2)-COOH]2である上記の化合物、その塩、又はそのエステル；R1がp-アミノフェニル基又はp-ヒドロキシフェニル基であり、R2が2-カルボキシフェニル基であり、R3及びR4が-(CH2)-N[(CH2)-COOH]2である上記の化合物、その塩、又はそのエステル；エステルがR3及びR4におけるテトラアセトキシメチルエステルである上記の化合物のエステルが提供される。
　別の観点からは、上記の一般式(I)で表される化合物、その塩、又はそのエステルを含む活性酸素測定用試薬が本発明により提供される。
　この発明の好ましい態様によれば、反応性の高い活性酸素種の測定用試薬である上記の試薬；活性酸素種がヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸である上記の試薬が提供される。
　さらに、本発明により、活性酸素の測定方法であって、下記の工程：(A)上記一般式(I)で表される化合物又はその塩と活性酸素とを反応させる工程、及び(B)上記工程(A)で生成した脱アリール化合物（上記一般式(I)においてR1が水素原子である化合物）又はその塩の蛍光を測定する工程を含む方法が提供される。
　この発明の好ましい態様によれば、反応性の高い活性酸素種の測定用試薬である上記の方法；活性酸素種がヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸である上記の方法が提供される。
　本発明の化合物は活性酸素種、好ましくは反応性の高い活性酸素種（例えばヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸など）の測定用試薬として有用であり、活性酸素種との反応により生じる蛍光性物質が高い細胞内滞留性を有していることから、細胞内に存在する微量の活性酸素種を極めて高感度に長時間にわたって測定できるという優れた特徴を有している。本発明の化合物を含む活性酸素測定用試薬及び上記化合物を用いた活性酸素の測定方法は、特に生体内の特定の細胞や組織中に局在する活性酸素をバイオイメージングの手法によって高感度に測定するための試薬及び測定方法として有用である。
HL-60を用いてカルセイン(棒グラフ左)及びフルオレセイン(棒グラフ右)の細胞内滞留性を比較した結果（上図）、及びpKaの比較結果（下図、右側のプロットがフルオレセイン）を示した図である。 APCと活性酸素種又は窒素種との反応性を示した図である。(A)ヒドロキシルラジカル、(B)パーオキシナイトライト、(C)次亜塩素酸、(D)一重項酸素、(E)スーパーオキシド、(F)過酸化水素、及び(G)一酸化窒素の結果を示す。 APCと次亜塩素酸との反応をHPLCにより分析した結果を示した図である。（A）APC；（B）APCに次亜塩素酸-を反応させたもの；（C）カルセインの結果を示す。 HeLa細胞にAPC-AMを適用した結果を示した図である。(A)次亜塩素酸ナトリウム刺激前、(B)次亜塩素酸ナトリウム刺激後の結果を示す。 HL-60を用いて活性酸素種の検出を行った結果を示した図である。(A)過酸化水素刺激前、(B)過酸化水素刺激なし、(C)過酸化水素刺激ありの結果を示す。 APF及びAPC-AMを用いて活性酸素種との反応性及び細胞内滞留性を調べた結果を示した図である。図中、(A)～(C)はAPF、(D)～(F)はAPC-AMの結果を示す。(A)及び(D)過酸化水素刺激直後、(B)及び(E)30分後、(C)及び(F)60分後の結果を示す。
　R1が示すアリール基としては、例えば、環構成原子数が6個から14個の単環性、二環性、又は三環性アリール基を用いることができる。好ましくはフェニル基又はナフチル基、より好ましくはフェニル基を用いることができる。上記アリール基は環上に1個又は2個以上の置換基を有していてもよい。2個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基の種類及び置換位置は特に限定されないが、例えば、C1-6アルキル基（アルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよい。アルキル部分を有する他の置換基のアルキル部分についても同様である。）、C1-6ハロアルキル基、C1-6アルケニル基、C1-6アルコキシ基、ハロゲン原子（ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよい）、シアノ基、ニトロ基、置換基を有することもあるアミノ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、C1-6アルカノイル基、C1-6ハロアルカノイル基、アロイル基、水酸基、アルキレンジオキシ基などを置換基として用いることができる。
　R1としては置換フェニル基が好ましく、モノ置換フェニル基がより好ましい。モノ置換フェニル基としては、無置換のアミノ基又は水酸基を有するフェニル基が特に好適である。置換基の置換位置としては、オルト位又はパラ位が好ましい。R1としてはp-アミノフェニル基又はp-ヒドロキシフェニル基が特に好ましい。
　R2が示す2-カルボキシフェニル基のベンゼン環は1個又は2個以上の置換基を有していてもよい。2個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。ベンゼン環上の置換基としては上記のアリール基について説明した基を用いることができ、R2としては無置換の2-カルボキシフェニル基が好ましい。
　R3及びR4が示す-(CH2)p-N(R5)(R6)においてpは1ないし4の整数を示すが、好ましくは1ないし3の整数、より好ましくは1又は2、特に好ましくは1を示す。R5及びR6はそれぞれ独立に-(CH2)n-COOHを示し、nは1ないし4の整数を示すが、好ましくは1ないし3の整数、より好ましくは1又は2、特に好ましくは1を示す。
　上記一般式(I)で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。これらのうち、生理学的に許容される水溶性の塩は、本発明の試薬及び測定方法に好適に使用できる。
　一般式(I)で表される化合物のエステルとしては、R2が示す2-カルボキシフェニル基のカルボキシ基及びR3及びR4にそれぞれ2個ずつ存在するカルボキシ基からなる群から選ばれる1又は2以上のカルボキシ基のエステルを用いることができ、好ましくはR3及びR4にそれぞれ2個ずつ存在する合計4個のカルボキシ基からなる群から選ばれる1又は2以上のカルボキシ基のエステルを用いることができる。より好ましくはR3及びR4にそれぞれ2個ずつ存在する合計4個のカルボキシ基からなる群から選ばれる3個以上のカルボキシ基のエステルであり、特に好ましいのはR3及びR4にそれぞれ2個ずつ存在する合計4個のカルボキシ基のエステルである。2個以上のエステルが存在する場合には、エステルの残基は同一でも異なっていてもよい。
　エステルとしては生理学的に許容されるエステルが好ましい。好適なエステル残基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、t-ブチル基、ベンジル基、アセトキシメチル基、1-(アセトキシ)エチル基、プロピオニルオキシメチル基、1-(プロピオニルオキシ)エチル基、ブチリルオキシメチル基、1-(ブチリルオキシ)エチル基、イソブチリルオキシメチル基、1-(イソブチリルオキシ)エチル基、バレリルオキシメチル基、1-(バレリルオキシ)エチル基、イソバレリルオキシメチル基、1-(イソバレリルオキシ)エチル基、ピバロイルオキシメチル基、1-(ピバロイルオキシ)エチル基、メトキシカルボニルオキシメチル基、1-(メトキシカルボニルオキシ)エチル基、エトキシカルボニルオキシメチル基、1-(エトキシカルボニルオキシ)エチル基、プロポキシカルボニルオキシメチル基、1-(プロポキシカルボニルオキシ)エチル基、イソプロポキシカルボニルオキシメチル基、1-(イソプロポキシカルボニルオキシ)エチル基、ブトキシカルボニルオキシメチル基、1-(ブトキシカルボニルオキシ)エチル基、イソブトキシカルボニルオキシメチル基、1-(イソブトキシカルボニルオキシ)エチル基、t-ブトキシカルボニルオキシメチル基、1-(t-ブトキシカルボニルオキシ)エチル基、シクロペンタンカルボニルオキシメチル基、1-(シクロペンタンカルボニルオキシ)エチル基、シクロヘキサンカルボニルオキシメチル基、1-(シクロヘキサンカルボニルオキシ)エチル基、シクロペンチルオキシカルボニルオキシメチル基、1-(シクロペンチルオキシカルボニルオキシ)エチル基、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシメチル基、1-(シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ)エチル基、ベンゾイルオキシメチル基、1-(ベンゾイルオキシ)エチル基、フェノキシカルボニルオキシメチル基、1-(フェノキシカルボニルオキシ)エチル基、(5-メチル-2-オキソ-1，3-ジオキソレン-4-イル)メチル基、又は2-トリメチルシリルエチル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
　遊離形態の一般式(I)で表される化合物、その塩、又はそのエステルは、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
　一般式(I)で表される化合物は、置換基の種類に応じて1個または2個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。なお、一般式(I)で表される化合物における2-カルボキシフェニル基のカルボキシ基は分子内でラクトン環を形成することがあるが、ラクトン環を形成した化合物も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。また、上記ラクトン形成に基づく光学活性体も本発明の範囲に包含される。
　一般式(I)で表される本発明の化合物は、一般的には、対応のフルオレセイン化合物にR3及びR4を導入してR1が水素原子である化合物を製造した後、この化合物をアリール化することにより製造することができる。アリール化の手段については国際公開WO01/64664号などに具体的に示されているが、例えば、フルオレセイン化合物のアルカリ金属塩を調製しておき、適当な溶媒中でヨウ化アリール化合物と反応させればよい。本発明の一般式(I)で表される化合物の代表的化合物の製造方法が本明細書の実施例に具体的に示されているので、当業者は実施例の具体的説明を基にして、出発原料及び反応試薬を適宜選択し、必要に応じて反応条件や工程を適宜変更ないし修飾することにより、本発明の化合物を容易に製造することが可能である。
　なお、反応工程において特定の官能基を必要に応じて保護して反応を行うことにより、目的物を効率的に製造することができる場合があるが、保護基については、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス (Protective Groups in Organic Synthesis, T.W.Greene, John Wiley & Sons, Inc., 1981)などに詳しく説明されており、当業者は適宜の保護基を選択することが可能である。
　また、上記製造法における生成物の単離、精製は通常の有機合成で用いられる方法、例えば濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ行うことができる。また、上記工程における製造中間体は、特に精製することなく次の反応に供することも可能である。本発明の化合物の塩を製造する場合には、上記製造法においてそれぞれの化合物の塩が得られる場合はそのまま精製すればよればよく、遊離形態の化合物が得られる場合には、遊離形態の化合物を適当な溶媒に溶解又は懸濁した後、塩基を加えて塩を形成させ、必要に応じて精製を行えばよい。
　上記一般式(I)で表される本発明の化合物又はその塩は、緩和な条件下、例えば生理的条件下で活性酸素と反応して、脱アリール体であるフルオレセイン化合物（一般式(I)においてR1が水素原子である化合物に相当する）又はそれらの塩を与える性質を有している。一般式(I)の化合物又はその塩は実質的に非蛍光性であり、一方、脱アリール化されたフルオレセイン化合物又はそれらの塩は高強度の蛍光を発する性質を有している。従って、上記式(I)で表される化合物又はその塩を活性酸素と反応させた後、脱アリール化された化合物又はその塩の蛍光を測定することによって、活性酸素を選択的かつ高感度に測定することが可能である。この反応様式は国際公開WO01/64664号に具体的に説明されている。
　また、一般式(I)で表される化合物のエステルは、それ自体は活性酸素と反応して蛍光性物質を与える性質を有しない場合があるが、例えば細胞膜を通過して細胞内に移行した後に加水分解酵素によりエステルの開裂を受けて一般式(I)で表される化合物に変換され、生成した一般式(I)で表される化合物が活性酸素と反応して蛍光性物質を与える。従って、一般式(I)で表される化合物のエステルは細胞膜透過性の活性酸素測定用試薬として利用可能である。
　本発明の試薬により測定可能な活性酸素の種類は特に限定されず、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素、過酸化水素などのいずれも測定可能であるが、反応性の高い活性酸素種（例えばヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸など）を高感度かつ選択的に測定することができる。例えば、一般式(I)の化合物又はその塩を活性酸素測定用試薬として用いると、個々の細胞や特定の組織中に局在する活性酸素を正確にかつ簡便に測定できる。
　本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明の活性酸素の測定方法は、一般的には、(A)上記一般式(I)で表される化合物又はその塩と活性酸素とを反応させる工程、及び(B) 上記工程(A)で生成した脱アリール化合物（上記一般式(I)においてR1が水素原子である化合物に相当する）又はその塩の蛍光を測定する工程を含んでいる。上記一般式(I)で表される化合物のエステルを用いる場合には、細胞膜を透過したエステル化合物が加水分解されて生成する一般式(I)で表される化合物又はその塩により上記工程(A)の反応が進行する。
　脱アリール化された化合物又はその塩の蛍光の測定は通常の方法で行うことができ、インビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてインビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ましいが、定量的なヒドロキシルラジカルの発生系として、例えば、ガンマーラジオリシス法などを利用することができ、一重項酸素の発生系として、例えば、ナフタレンエンドパーオキシド系（Saito, I,. et al., J. Am. Chem. Soc., 107, pp.6329-6334, 1985）などを利用することができる。本発明の一般式(I)で表される化合物のエステルは細胞膜を透過して細胞内に取り込まれる性質を有しており、個々の細胞内に局在する活性酸素をバイオイメージング手法により高感度に測定できる。
　本発明の活性酸素測定用試薬としては、上記式(I)で表される化合物、その塩、又はそのエステルをそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
　以下のスキームにより本発明の化合物を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
3,6-ジヒドロキシ-4,5-ビス-[N,N'-ジ(カルボキシメチル)-アミノメチル]フルオレセイン テトラエチルエステル(2)
　フルオレセイン 1 (1.01 g, 3.04 mmol) とジエチルイミノジアセテート(1.6 mg, 9.1 mmol)及びパラホルムアルデヒド(0.31 g, 10.3 mmol) をアセトニトリル(35 ml) と水(15 ml) の混合溶液に懸濁させ、24時間加熱還流した。室温まで放冷後、溶媒を減圧除去してシリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒；1,2-ジクロルエタン) により精製し、淡黄色粉末の化合物2 (2.078 g, 収率：93.1%) を得た。
3-ヒドロキシ-4,5-ビス-[N,N'-ジ-(カルボキシメチル)-アミノメチル]-6-(4'-ニトロ)-フェノキシフルオレセイン テトラエチルエステル(3)
　化合物2 (1.345 g, 1.83 mmol)と4-フルオロニトロベンゼン (0.29 g, 2.06 mmol)及び炭酸ナトリウム（0.58 g, 5.5 mmol）をジメチルスルホキシド(DMSO, 5 ml) に溶解して8時間加熱還流した。室温まで放冷後、2N 塩酸で中和し1,2-ジクロルエタン/飽和食塩水で抽出した。有機層を集めて硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後に溶媒を留去して未精製の化合物3を得た。これをNHシリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒；n-ヘキサン/1,2-ジクロルエタン) で精製して黄色固体の化合物3 (251.6 mg, 収率：19.4%) を得た。
6-(4'-アミノ)-フェノキシ-3-ヒドロキシ-4,5-ビス-[N,N'-ジ-(カルボキシメチル)-アミノメチル]フルオレセイン テトラエチルエステル(4)
　化合物3 (363.1 mg, 0.424 mmol) と10% Pd-C (23.6 mg) をメタノール/1,2-ジクロルエタン=1:9 (10 ml) に加えて水素ガス置換して1時間接触還元した。触媒を濾去し、溶媒を留去した後の残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (展開溶媒：1,2-ジクロルエタン/メタノール) で粗精製した後、HPLCにより精製して淡黄色粉末の化合物4 (252.6 mg, 収率：72.1%) を得た。
3-ヒドロキシ-4,5-ビス-[N,N'-ジ-(カルボキシメチル)-アミノメチル]-6-(4'-ニトロ)-フェノキシフルオレセイン(化合物5：APC)
　化合物4 (42.2 mg, 0.05 mmol) を1N 水酸化カリウム メタノール溶液(40 ml) に溶解して12時間攪拌した。2N HCl 水溶液で中和した後に溶媒を留去し、HPLCにより精製して淡黄色粉末の化合物5 (24.5 mg, 収率：67.2%) を得た。
3-ヒドロキシ-4,5-ビス-[N,N'-ジ-(カルボキシメチル)-アミノメチル]-6-(4'-ニトロ)-フェノキシフルオレセイン テトラアセトキシメチルエステル(化合物6：APC-AM)
　化合物5 (23.1 mg, 0.03 mmol) とジイソプロピルエチルアミン(DIEA, 167.5 mg, 1.3 mmol) およびブロモメチルアセテート(198.9 mg, 1.3 mmol) をジメチルホルムアミド(5 ml) に溶解し、アルゴン置換して12時間攪拌した。酢酸エチルとpH 7.4のリン酸ナトリウムバッファー（Na-Pi buffer）を用いて抽出し、有機層を集めて硫酸ナトリウムで乾燥して濾過した後、溶媒を留去して残渣をHPCLにより精製して白色粉末の化合物6 (6.8 mg, 21.0%) を得た。
化合物5（APC）
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6)
δ 8.00 ( d, 1H, J=7.6 ), 7.83-7.71 ( m, 2H ), 7.32 ( d, 2H, J=7.2 ), 7.15 ( d, 2H, J=7.2 ), 7.03 ( d, 2H, J=8.8 ), 6.74 ( d, 1H, J=8.8 ), 6.66 ( d, 1H, J=8.8 ), 6.63 ( d, 1H, J=8.8 ), 6.54 ( d, 1H, J=8.8 ), 4.44-4.32 ( m, 4H ), 3.75 ( s, 4H ), 3.71 ( s, 4H )
13C-NMR (400MHz, DMSO-d6)
δ 171.7, 171.6, 168.7, 159.3, 158.5, 158.2, 157.4, 152.5, 150.8, 149.9, 135.8, 130.3, 128.9, 128.6, 125.7, 124.9, 124.1, 122.1, 120.3, 118.1, 115.2, 113.9, 113.0, 112.8, 109.3, 82.6, 54.1, 53.8, 47.4, 46.3
HRMS ( ESI+ ): m/z calcd for ( M+H )+, 714.19351; found, 714.19434
化合物6 (APC-AM)
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6)
δ 8.49 ( d, 1H, J=7.3 ), 7.71-7.59 ( m, 2H ), 7.24 ( d, 2H, J=7.7 ), 6.8 ( d, 2H, J=8.2 ), 6.65 ( d, 2H, J=8.6 ), 6.61 ( s, 2H ), 6.56 ( d, 1H, J=9.0 ), 6.36 ( d, 1H, J=9.0 ), 5.83-5.80 ( m, 4H ), 5.65 ( s, 4H ), 4.62 ( d, 1H, J=8.8 ), 4.42 ( d, 1H, J=14.1 ), 4.32 ( d, 1H, J=12.6 ), 4.32 ( d, 1H, J=9.5 ), 4.30 ( d, 1H, J=11.0), 3.88 ( s, 4H ), 3.73 ( d, 4H, J=4.8 ), 2.08 ( s, 6H ), 2.03 ( s, 6H )
HRMS (ESI-): m/z calcd for ( M-H )-, 1000.26238; found, 1000.26361
例２
　化合物5（APC）は活性酸素種と特異的に反応する部位を分子内に有するほぼ無蛍光性（Φf=0.007）の物質である。この物質は活性酸素種と特異的に反応してカルセイン(calcein)となって蛍光を発する。このカルセインのテトラアセトキシメチルエステルとフルオレセインのジアセチルエステルをHL-60細胞に取り込ませ、カルセインとフルオレセインの細胞内滞留性を評価した。結果を図1（上図）に示す。カルセイン(棒グラフ左)は60分後でもほとんどHL-60細胞内の蛍光強度が下がらないのに対し、フルオレセイン(棒グラフ右)は15分後であってもHL-60細胞内の蛍光強度が10分の1以下に低下していることが分かる。フルオレセインの蛍光強度低下はフルオレセインの細胞外への漏出が原因であり、カルセインが極めて優れた細胞内滞留性を有していることが示された。また、従来の活性酸素測定用蛍光プローブであるHPF及びAPF（積水メディカル株式会社）は活性酸素種と反応してフルオレセインとなり蛍光を発するが、このフルオレセインのpKaは6.4であり生理的条件下における蛍光強度の安定性に乏しいという問題がある。一方、APCから生成するカルセインのpKaはおよそ5.4であり（図1、下図）、生理的pHにおける蛍光強度が安定しており、かつ非常に大きい（Φf=0.793）。従って、APCを用いることで従来の活性酸素測定用プローブでは達成しえなかった長時間にわたる高感度の観察が可能となることが示された。
例３
　化合物5（APC）と様々な活性酸素種又は窒素種とを反応させて蛍光スペクトル変化を測定した。測定は以下のように行った。
(1)ヒドロキシルラジカル
　10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む)を室温下、フラスコ内で激しく攪拌しながら1 M 過酸化水素水溶液を終濃度1 mMとなるように加え、次いで過塩素酸鉄(II)水溶液を終濃度0μM、50μM、100μM、200μM、300μM、500μM、1000μM、2000μMとなるように滴下した。滴下後直ちに蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。
(2)パーオキシナイトライト
　10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む)を37℃で、キュベット中で攪拌しながら、パーオキシナイトライトの0.1N水酸化ナトリウム水溶液を終濃度0μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μMとなるように滴下した。30分後に蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。
(3)次亜塩素酸
　10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む)を37℃で、キュベット中で攪拌しながら、次亜塩素酸ナトリウムの0.1N水酸化ナトリウム水溶液を終濃度0μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μMとなるように滴下した。30分後に蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。
(4)一重項酸素
　10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む)を37℃、キュベット中で攪拌しながら、熱依存的に一重項酸素を放出することが知られている一重項酸素放出剤EP-1（3-(1,4-ジヒドロ-1,4-エピジオキシ-1-ナフチル)プロピオン酸）のDMF溶液を終濃度100μMになるように添加し、30分後に蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。
(5)スーパーオキシド
　10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む) を37℃、キュベット中で攪拌しながら、終濃度10μMとなるようキサンチンオキシダーゼ水溶液を加え、続いて終濃度10μMとなるようにキサンチン-DMF溶液を添加した。30分後に蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。
(6)過酸化水素
　10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む) を37℃、キュベット中で攪拌しながら過酸化水素水溶液を終濃度100μMとなるように添加し、30分後に蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。
(7)一酸化窒素
　10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む) を37℃、キュベット中で攪拌しながらNOC-13（1-ヒドロキシ-2-オキソ-3-(3-アミノプロピル)-3-エチル-1-トリアゼン:一酸化窒素放出剤）を終濃度10μmol/Lとなるよう添加し、30分後に蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。
　結果を図2に示す。図2中、 (A)はヒドロキシルラジカル、(B)はパーオキシナイトライト、(C)は次亜塩素酸、(D)は一重項酸素、(E)はスーパーオキシド、(F)は過酸化水素、及び(G)は一酸化窒素の結果を示している。APCは特にヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸などの反応性の高い活性酸素種(hROS)と速やかに反応して濃度依存的に蛍光強度が上昇することが確認された。一方、一重項酸素、スーパーオキシド、過酸化水素、及び一酸化窒素と反応せず、全く蛍光強度が上昇しないことが確認された。また、これらの蛍光上昇がAPCと活性酸素種との反応により生成したカルセインに由来するものであることを確認するため、APC、APCと次亜塩素酸との反応液、及びカルセインのHPLC分析を下記の条件で行った。
分析条件
溶出溶媒 : A = H2O / 0.1 % トリフルオロ酢酸：B = 80 % アセトニトリル / 20 % 水 / 0.1 % トリフルオロ酢酸：A / B = 95 / 5 で分析を開始し、5分後から30分のリニアグラジェントでA / B =20 / 80 とする。
検出 : 蛍光 (ex./em.=470 nm/525nm)
カラム : ODS-3, 4.6 x 250 mm
流速 : 1 mL / min
　この結果を図3に示す。APCは約19.8分に溶出ピークが確認され(図3中、A)）、カルセインは約21.5分に溶出ピークが確認された（図3中、C））。APCと次亜塩素酸との反応液では未反応のAPCが約19.8分に確認できると共に、次亜塩素酸と反応して生成したカルセインの溶出ピークも約21.5分に確認された（図3中、B））。よって、蛍光上昇が活性酸素種との反応により生成したカルセインによるものであることが確認された。カルセインは水中においてフルオレセインに匹敵する強い蛍光を発し、かつフルオレセインをはるかに凌ぐ極めて高い細胞内滞留性を有している。従って、本発明の化合物は細胞内の微量活性酸素種を長時間にわたって高感度に測定することができる。
例４
　化合物5（APC）を用いて生細胞内活性酸素種のイメージングを行った。APCの細胞膜透過性を高めたエステル型の化合物6(APC-AM、1.0μM; 0.1% ジメチルホルムアミド(共溶媒))を培地に加えHeLa細胞に15分間負荷した後、500μMの次亜塩素酸ナトリウム刺激を行った。（A）が次亜塩素酸ナトリウム刺激前、(B)が次亜塩素酸ナトリウム刺激後の結果を示す。次亜塩素酸ナトリウム刺激後に非常に強い蛍光が観察されたことから、APC-AMが非侵襲的に細胞内に導入された後に加水分解を受けてAPCが細胞内で生成し、このAPCが次亜塩素酸と反応して非常に強い蛍光を発することが確認された（図4）。この結果から本発明の化合物は次亜塩素酸等の生細胞内の活性酸素種の蛍光イメージングにおいても有用であることが示された。
例５
　本発明の化合物5（APC）と従来の蛍光プローブであるアミノフェニルフルオレセイン(APF)をHL-60細胞に適用して、活性酸素種との反応性及び反応生成物の細胞内滞留性の比較を行った。HL-60細胞は、血球系の浮遊細胞でありミエロペルオキシダーゼを有しているため、細胞内で過酸化水素と塩素イオンが反応して次亜塩素酸が生成することが知られている。APCの細胞内導入形であるAPC-AM (10μM; 1.0% ジメチルホルムアミド(共溶媒)) を培地に加えHL-60細胞に60分間負荷した後、30分間プレインキュベートし、100μMの過酸化水素刺激を15分行った後、FACS (fluorescence activated cell sorting)により蛍光強度を測定した。結果を図5に示す。(A)は過酸化水素刺激前のHL-60細胞、(B)は過酸化水素刺激を行わずに15分間経過したHL-60細胞、(C)は酸化水素刺激後15分間経過したHL-60細胞の測定結果を示している。(A)と(B)には有意な差は無く、過酸化水素刺激を行った（C）のみ蛍光強度が20倍以上上昇した。よって、HL-60細胞が産生した活性酸素種はAPCと反応させることによりFACSで測定可能なことが示された。
　同様の手法でAPF及びAPCから生じる活性酸素種との反応生成物について細胞内滞留性の比較を行った。APFおよびAPC-AM (ともに10μM; 1.0% ジメチルホルムアミド(共溶媒)) を培地に加えHL-60細胞に60分間負荷した後、100μMの過酸化水素刺激を15分行った。その後、定期的（0分、30分、60分）に蛍光強度をFACSにより測定した。結果を図6に示す。図6中、(A)～(C)はAPF、(D)～(F)はAPC-AMの結果を示し、(A)及び(D)過酸化水素刺激直後、(B)及び(E)30分後、(C)及び(F)60分後の結果を示す。APFと活性酸素種との反応により生成したフルオレセインは刺激直後では蛍光強度の上昇が観察されるため細胞内に留まっていることが確認されるが（A）、反応後に速やかに細胞内から漏出し、30分後には検出が困難となった（B、C）。一方、細胞内でAPC-AMが加水分解されることにより生成したAPCと活性酸素種とが反応して生成するカルセインは刺激直後から蛍光強度に変化が無く、長時間にわたり細胞内に保持されていることが確認された。よって、APCにより微量の活性酸素種（特に細胞内の微量の活性酸素種）を長時間にわたって高感度に検出できることが示された。
　本発明の化合物を含む活性酸素測定用試薬及び上記化合物を用いた活性酸素の測定方法は、特に生体内の特定の細胞や組織中に局在する活性酸素をバイオイメージングの手法によって高感度に測定するための試薬及び測定方法として有用である。

Claims (7)

  1. 下記の一般式(I)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式中、R1は置換基を有していてもよいアリール基を示し、R2は置換基を有していてもよい2-カルボキシフェニル基を示し、R3及びR4はそれぞれ独立に-(CH2)p-N(R5)(R6)(式中、pは1ないし4の整数を示し、R5及びR6はそれぞれ独立に-(CH2)n-COOH（式中、nは1ないし4の整数を示す）で表される基を示す）を示す〕で表される化合物、その塩、又はそのエステル。
  2. R1がp-アミノフェニル基又はp-ヒドロキシフェニル基である請求項１に記載の化合物、その塩、又はそのエステル。
  3. R2が2-カルボキシフェニル基である請求項１又は２に記載の化合物、その塩、又はそのエステル。
  4. R3及びR4が-(CH2)-N[(CH2)-COOH]2である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物、その塩、又はそのエステル。
  5. エステルがR3及びR4におけるテトラアセトキシメチルエステルである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の化合物のエステル。
  6. 請求項１ないし５のいずれか１項に記載の化合物、その塩、又はそのエステルを含む活性酸素測定用試薬。
  7. 活性酸素種がヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸である請求項６に記載の試薬。
PCT/JP2009/059031 2008-05-16 2009-05-15 活性酸素測定用試薬 WO2009139452A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/991,750 US8410164B2 (en) 2008-05-16 2009-05-15 Reagent for measurement of active oxygen
JP2010512019A JP5477749B2 (ja) 2008-05-16 2009-05-15 活性酸素測定用試薬

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008129024 2008-05-16
JP2008-129024 2008-05-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009139452A1 true WO2009139452A1 (ja) 2009-11-19

Family

ID=41318812

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/059031 WO2009139452A1 (ja) 2008-05-16 2009-05-15 活性酸素測定用試薬

Country Status (3)

Country Link
US (1) US8410164B2 (ja)
JP (1) JP5477749B2 (ja)
WO (1) WO2009139452A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102382641A (zh) * 2011-09-22 2012-03-21 厦门大学 检测次氯酸的荧光探针及其制备方法
JP2019069163A (ja) * 2015-05-22 2019-05-09 株式会社東芝 空間殺菌方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5067578B2 (ja) 2008-12-05 2012-11-07 国立大学法人 東京大学 活性窒素測定用試薬
WO2021007109A1 (en) * 2019-07-05 2021-01-14 Purdue Research Foundation Design and efficient synthesis of lipid-fluorescein conjugates for car-t cell therapy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001064664A1 (fr) * 2000-02-29 2001-09-07 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Reactifs destines au dosage de l'oxygene actif
WO2005103282A1 (ja) * 2004-04-20 2005-11-03 Mitochondria Research Institute Co., Ltd. 活性酸素の測定方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999051586A1 (fr) 1998-03-31 1999-10-14 Tetsuo Nagano Reactif de determination d'oxygene singulet
US6441197B1 (en) * 2000-01-20 2002-08-27 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Diaminofluorescein derivative
US7378282B2 (en) 2003-05-14 2008-05-27 Tetsuo Nagano Method for measuring hypochlorite ion
US7868147B2 (en) * 2003-09-05 2011-01-11 Tetsuo Nagano Fluorescent probe
JP5228190B2 (ja) 2005-11-14 2013-07-03 国立大学法人 東京大学 パーオキシナイトライト蛍光プローブ
WO2007100061A1 (ja) 2006-03-03 2007-09-07 The University Of Tokyo 蛍光プローブ
US7901852B2 (en) * 2008-02-29 2011-03-08 Freescale Semiconductor, Inc. Metrology of bilayer photoresist processes
JP5067578B2 (ja) 2008-12-05 2012-11-07 国立大学法人 東京大学 活性窒素測定用試薬

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001064664A1 (fr) * 2000-02-29 2001-09-07 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Reactifs destines au dosage de l'oxygene actif
WO2005103282A1 (ja) * 2004-04-20 2005-11-03 Mitochondria Research Institute Co., Ltd. 活性酸素の測定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABEGHETTO, C. ET AL.: "Implications of the generation of reactive oxygen species by photoactivated calcein for mitochondrial studies", EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 267, no. 17, 2000, pages 5585 - 5592 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102382641A (zh) * 2011-09-22 2012-03-21 厦门大学 检测次氯酸的荧光探针及其制备方法
CN102382641B (zh) * 2011-09-22 2013-07-24 厦门大学 检测次氯酸的荧光探针及其制备方法
JP2019069163A (ja) * 2015-05-22 2019-05-09 株式会社東芝 空間殺菌方法

Also Published As

Publication number Publication date
US8410164B2 (en) 2013-04-02
JP5477749B2 (ja) 2014-04-23
US20110251404A1 (en) 2011-10-13
JPWO2009139452A1 (ja) 2011-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4759200B2 (ja) 活性酸素測定用試薬
US8143069B2 (en) Fluorescent probe and method of measuring hypochlorite ion
JP5228190B2 (ja) パーオキシナイトライト蛍光プローブ
JP4334622B2 (ja) ジアミノローダミン誘導体
JP6351511B2 (ja) 非対称Ｓｉローダミン及びロドールの合成
US7939330B2 (en) Fluorescent probe
JP5441882B2 (ja) 過酸化水素特異的蛍光プローブ
JP2006219453A (ja) キノリン環を母核とする金属識別型二波長性蛍光分子
JP3967943B2 (ja) 蛍光プローブ
JP5477749B2 (ja) 活性酸素測定用試薬
JP5887011B2 (ja) 蛍光プローブ
JP4522365B2 (ja) 蛍光プローブ
JP4206381B2 (ja) パーオキシナイトライト測定用試薬
WO2019168199A1 (ja) カルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ
JPWO2007013201A1 (ja) 亜鉛蛍光プローブ
JP5067578B2 (ja) 活性窒素測定用試薬
JP2004315501A (ja) 亜鉛蛍光プローブ

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09746658

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010512019

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12991750

Country of ref document: US

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09746658

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1