WO2007100061A1

WO2007100061A1 - 蛍光プローブ

Info

Publication number: WO2007100061A1
Application number: PCT/JP2007/053960
Authority: WO
Inventors: Tetsuo Nagano; Yasuteru Urano; Suguru Kenmoku
Original assignee: The University Of Tokyo
Priority date: 2006-03-03
Filing date: 2007-03-01
Publication date: 2007-09-07
Also published as: US20090317914A1; JP5124780B2; US8143069B2; JPWO2007100061A1

Description

明細書

蛍光プローブ

技術分野

[0001] 本発明は次亜塩素酸イオンの選択的測定などに有用な蛍光プローブとして利用可能な新規化合物、及び該化合物を含む蛍光プローブに関する。

背景技術

[0002] 次亜塩素酸イオンは、近年その生体内での作用が注目されて、る活性酸素種の一つである。好中球による殺菌作用は主に次亜塩素酸イオンによると考えられており、ァズール顆粒中のミエ口ペルォキシダーゼにより、過酸化水素と塩化物イオンから次亜塩素酸イオンが生成することがインビトロで示されている（Klebanoff, S. J., and Clar k, R. A.(1978) The Neutrophils: Function andし linical Disorders, North-Holland Pu Wishing Company, Amsterdam, Netherlands)。また、次亜塩素酸イオンは血小板活性化因子に誘導される微小循環障害の血管内皮表面の損傷において重要な役割を果たすと考えられている（Suematsu, M., Kurose, I" Asako, H" Miura, S" and Tsuch iya, M.(1989) J. Biochem.106, 355-360)。しかしながら、次亜塩素酸イオンを完全に選択的に測定する方法、特にインビボでの測定方法が確立されて、な力たため、次亜塩素酸イオンが上述の生体内での機構に直接関わっていると結論付けるのは困難であった。

[0003] 活性酸素種による各種生理活性分子などに対する障害は様々な疾病に関与すると考えられている。なかでも次亜塩素酸イオン、パーォキシナイトライト、及びヒドロキシルラジカルなどの高ヽ酸化能を有する活性酸素種は生体に与える障害も大き!/ヽことから、これらの活性酸素種を生きている状態の生体試料で高感度に測定する手段の提供が望まれている。従来、パーォキシナイトライト及びヒドロキシルラジカルなどの活性酸素種を測定できる蛍光プローブはいくつ力提供されている。例えば、活性酸素種を測定する蛍光プローブとしては DCFH (2', 7'-ジクロロジヒドロフルォレセイン )などが知られている。しかしながら、 DCFHは活性酸素種の種類を識別することはできず、次亜塩素酸イオンを選択的に測定することはできない。国際公開 WO 01/6466 4号に記載されたィ匕合物を用いて次亜塩素酸イオンを測定できることが知られて、るが（Setsukinai, K., et al, J. Biol. Chem., 278, pp.3170— 3175, 2003)、次亜塩素酸ィオンを特定するためには組み合わせの測定が必要になる場合があり、操作が煩雑であるという問題がある。

非特許文献 1 :J. Biol. Chem., 278, pp.3170— 3175, 2003

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 本発明の課題は、次亜塩素酸イオンの選択的測定などに有用な化合物を提供することにめる。

課題を解決するための手段

[0005] 本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、下記の一般式 (I)で表される化合物が次亜塩素酸イオンの測定などに有用であり、特にローダミン様の化合物は弱い活性酸素種である過酸ィヒ水素と反応せず、さらに高い活性を有する活性酸素種であるヒドロキシルラジカルやパーォキシナイトライトによる蛍光増加も弓 Iき起こさないことから、この化合物を用いると次亜塩素酸イオンを極めて高選択的に測定できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成された。

[0006] すなわち、本発明により、下記の一般式 (I) :

[化 1]

〔式中、 R¹はベンゼン環上に置換する水素原子又は 1個ないし 4個の一価の置換基を示し、 2個以上の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよく； R²、 R⁴ 、 R⁵、及び R⁷はそれぞれ独立に水素原子又は一価の置換基を示し; R³は =0又は = N⁺(R⁸)(R⁹)-M" (式中、 R⁸及び R⁹はそれぞれ独立に置換基を有して、てもよ、アルキル基を示し、 M—は対イオンを示す)を示し; R⁶は— OH又は— N(R^1Q)(R^U) (式中、 R^1Q及び R ¹¹はそれぞれ独立に置換基を有してヽてもよヽアルキル基を示す)を示し、ただし!?³ が = 0である場合には R⁶は OHであり、 R³が = N+(R⁸)(R⁹) · M—である場合には R⁶は N(R^1Q)(R^U)であり； nは 1から 3の整数を示し;及び Xは- SH又は- OHを示す〕、又は下記の一般式 (II) :

[化 2]

〔式中、 R²¹はベンゼン環上に置換する水素原子又は 1個な!、し 4個の一価の置換基を示し、 2個以上の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよく； R²²、 R²⁵、及び R²⁷はそれぞれ独立に水素原子又は一価の置換基を示し; R²³は— OH 又は— N(R²⁸)(R²⁹) (式中、 R²⁸及び R²⁹はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいァルキル基を示す)を示し; R²⁶は— OH又は— N(R³°)(R³¹) (式中、 R³°及び R³¹はそれぞれ独立に置換基を有して、てもよ、アルキル基を示す）を示し、ただし R²³が― OHである場合には R²⁶は OHであり、 R²³がー N(R²⁸)(R²⁹)である場合には R²⁶は N(R³⁰)(R³¹)であり； nは 1から 3の整数を示し;及び Yは- S-又は- 0-を示す〕で表される化合物又はその塩

が提供される。

好まし、態様によれば、上記一般式 (I)にお!/、て、 R³が = N+(R⁸)(R⁹) ·Μ—であり、 ηが 1 であり、 Xが- SHである上記化合物又はその塩；上記一般式 (I)において、 R³が = N+(C H ) ·Μ—であり、 ηが 1であり、 Xが- SHである上記化合物又はその塩；上記一般式 (I)に

3 2

おいて、 R³が = N+(R⁸)(R⁹)'M—であり、 nが 1であり、 Xが- OHである上記化合物又はその塩；上記一般式 (I)において、 R³が =N+(CH ) ·Μ—であり、 ηが 1であり、 Xが- ΟΗであ

3 2

る上記化合物又はその塩；上記一般式 (I)において、 R³が =0であり、 ηが 1であり、 Xが -OHである上記化合物又はその塩；上記一般式 (I)において、 R³が =0であり、 nが 2であり、 Xカ 0Hである上記化合物又はその塩；上記一般式 (II)において R²³が— N(R²⁸)( R²⁹)であり、 nが 1であり、 Yが- S-である上記化合物又はその塩;上記一般式 (II)において R²³がー N(CH )であり、 nが 1であり、 Yカ S-である上記化合物又はその塩；上記一

3 2

般式 (II)において R²³が— N(R²⁸)(R²⁹)であり、 nが 1であり、 Yカ 0-である上記化合物又はその塩；上記一般式 (II)において R²³がー N(CH )であり、 nが 1であり、 Yカ 0-である

3 2

上記化合物又はその塩；上記一般式 (II)において R²³が— 0Hであり、 nが 1であり、 Yが -0-である上記化合物又はその塩；上記一般式 (II)において、 R²³が =0であり、 nが 2 であり、 Xカ 0Hである上記化合物又はその塩が提供される。

[0008] 別の観点力もは、本発明により、上記一般式 (I)又は一般式 (II)で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブが提供される。この蛍光プローブは次亜塩素酸イオン測定用プローブ又は pHプローブなどとして利用できる。特に、上記一般式 (II)において R²³が— N(R²⁸)(R²⁹)であり、 Yが- S-である上記化合物又はその塩を含む上記蛍光プローブは次亜塩素酸イオンの選択的蛍光プローブとして有用である。また、上記一般式 (I)において、 R³が =0であり、 Xカ 0Hである上記化合物又はその塩を含む上記蛍光プローブ、上記一般式 (I)において、 R³が = N+(R⁸)(R⁹) 'M—であり、 Xが- 0Hである上記化合物又はその塩を含む上記蛍光プローブ、上記一般式 (II)において R²³が— 0 Hであり、 Yが- 0-である上記化合物又はその塩を含む上記蛍光プローブ、上記一般式 (II)において R²³が— N(R²⁸)(R²⁹)であり、 Xが- 0Hである上記化合物又はその塩を含む上記蛍光プローブは pHプローブとして有用である。上記蛍光プローブの製造のための上記一般式 (I)または一般式 (II)で表される化合物又はその塩の使用も本発明により提供される。これらのプローブにおいて nが 1または 2であることが好ましい。

[0009] さらに別の観点からは、次亜塩素酸イオンの測定方法であって、上記一般式 (II)において、 R²³が— N(R²⁸)(R²⁹)であり、 Yが- S-であるジヒドロチォフェン環構造を持つ上記化合物又はその塩を試料と接触させ、試料中の次亜塩素酸イオンとの反応によりジヒドロチォフェン環部位が酸ィ匕されて生じたキノイド型の化合物又はその塩力生じる蛍光を測定する工程を含む方法が提供される。

発明の効果 [0010] 本発明により提供される上記一般式 (I)又は一般式 (II)で表される化合物又はその塩は次亜塩素酸イオン測定のための蛍光プローブ又は pHプローブなどの蛍光プロ一ブとして利用できる。特に、上記一般式 (II)において R²³が— N(CH )であり、 nが 1であ

3 2

り、 Yが- s-である上記化合物又はその塩を含む上記蛍光プローブは次亜塩素酸ィオンに対して高い反応性を有する力過酸化水素、ヒドロキシルラジカルやパーォキシナイトライトなどの活性酸素種に対しては実質的に反応せず、次亜塩素酸イオンに対する選択的蛍光プローブとして生体試料の測定などに極めて有用である。

図面の簡単な説明

[0011] [図 1]図 1は化合物 8、 9、 11、 13、 19、及び 21の pH特性を示した図である。（A)は pH による蛍光強度変化。（B)は pHによるモル吸光係数の変化。

[図 2]図 2は化合物 21に過酸ィ匕水素及び次亜塩素酸ナトリウム添加時の蛍光スぺタトルを測定した図である。

[図 3]図 3は化合物 21に過酸化水素及び次亜塩素酸ナトリウム添加時の蛍光強度の時間変化を測定した図である。図中の矢印は活性酸素種の添加を示す。

[図 4]図 4は化合物 21及び APFにパーォキシナイトライト添加時の蛍光強度変化を測定した図である。図中の矢印はパーォキシナイトライトの添加を示す。

[図 5]図 5は化合物 21及び APFとヒドロキシルラジカルを反応させた際の蛍光スぺタトルを測定した図である。

[図 6]図 6はブタ好中球の次亜塩素酸イオン測定を示した図である。図中の矢印（100 秒）は PMA又は DMF (ネガティブコントロール）の添加を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0012] 本明細書にぉ、て「一価の置換基」の種類は特に限定されず、任意の置換基を用いることができる。例えば、ハロゲン原子 (本明細書において「ハロゲン原子」としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい )、 C 程度の低級アルキル基 (本明細書にぉヽて「アルキル基」は直鎖状、分枝鎖

1-6

状、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基のいずれでもよぐアルキル部分を有する他の置換基の該アルキル部分にっ、ても同様である）、 C 程度の低

1-6 級ハロゲンィ匕アルキル基、 C 程度の低級ヒドロキシアルキル基、 C 程度の低級ァルコキシ基、水酸基、チオール基、カルボキシ基、アルコキシカルボ-ル基、アミノ基

(アミノ基はアルキル基などの置換基を 1個又は 2個有して、てもよ、)などを挙げることができる力これらに限定されることはない。

[0013] R¹又は R²¹はベンゼン環上に置換する水素原子又は 1個ないし 4個の一価の置換基を示すが、 2個以上の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい。 R¹が示す置換基の置換位置は特に限定されず、ベンゼン環上の置換可能な任意の位置に置換することができる。

R³にお、て Mは対イオンを示し、分子の電荷を中和する個数の対イオンを意味している。対イオンの種類は特に限定されないが、例えば、塩ィ匕物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、メタンスルホン酸ァ-オン、 p-トルエンスルホン酸ァ-オン、シユウ酸ァ- オン、クェン酸ァ-オン、酒石酸ァ-オンなどの有機酸ァ-オンなどを挙げることができる。グリシンなどのアミノ酸のカルボキシァ-オンを用いてもょ、。

nは 1又は 2であることが好ましぐ 1であることが特に好ましい。

[0014] 一般式 (I)で表される化合物において、好ましい化合物は、 R¹が水素原子であり、 R² 、 R⁴、 R⁵、及び R⁷が水素原子、ハロゲン原子又は C 程度の低級アルキル基である化

1-6

合物である。

特に、 R²、

R⁵、及び R⁷をハロゲン原子で置換することによって、本発明の化合物の pH特性を所望の特性に変化できる場合がある。

Xが- SHである場合には、 R³が = N+(R⁸)(R⁹) 'M—であることが好ましい。

Xカ OHである場合には、 R³が = N+(R⁸)(R⁹) · M—及び R³が = 0であることが好ましい。さらに好ましい化合物は、 R³が = N+(R⁸)(R⁹) 'M—であり、 nが 1であり、 Xが- SHである化合物であり、特に好ましい化合物は、 R³が =N+(CH ) ·Μ—であり、 ηが 1であり、 Xが- SH

3 2

である化合物である。別の好ましい化合物としては、 R³が =N+(R⁸)(R⁹) 'M—であり、 nが 1 であり、 Xが- OHである化合物、 R³が = 0であり、 nが 1であり、 Xが- OHである化合物、 R³が = 0であり、 nが 2であり、 Xが- OHである化合物、 R³が = 0であり、 nが 2であり、 X カ OHである化合物である。ただし R³が = N+(R⁸)(R⁹) 'M—である場合には R⁶は— N(R¹⁰) (R¹¹)であり、さらに好ましくは R⁶が = N+(CH ) ·Μ—であり、 R³が = 0である場合には R⁶は

3 2

一〇Ηである。 [0015] 一般式 (II)で表される化合物において、好ましい化合物は、が水素原子であり、 R 度の低級アルキル基であ

る化合物である。特に、 R²、 R⁴、 R⁵、及び R⁷をハロゲン原子で置換することによって、本発明の化合物の pH特性を所望の特性に変化できる場合がある。

Yが- S-である場合には、 R²³が— N(R²⁸)(R²⁹)であることが好ましい。

Xカ 0-である場合には、 R²³が一 N(R²⁸)(R²⁹)及び一 OHであることが好ましい。

さらに好ましい化合物は、 R²³がー N(R²⁸)(R²⁹)であり、 nが 1であり、 Yが- S-である化合物であり、特に好ましいィ匕合物は、 R²³が— N(CH )であり、 nが 1であり、 Yカ S-である

3 2

化合物である。別の好ましい化合物としては、 R²³がー N(R²⁸)(R²⁹)であり、 nが 1であり、 Yカ 0-である化合物、 R²³が— OHであり、 nが 1であり、 Yカ 0-である化合物、 R²³が — OHであり、 nが 2であり、 Yカ 0-である化合物である。ただし R²³が— N(R²⁸)(R²⁹)である場合には R²⁶は一 N(R³°)(R³¹)であり、さらに好ましくは R²⁶が一 N (CH )であり、 R²³が =

3 2

0である場合には R²⁶は OHである。

[0016] 本発明の化合物は置換基の種類に応じて塩を形成する場合もある。塩の種類は特に限定されず、酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであってもよい。本発明の化合物の塩としては、生理学的に許容される塩が好ましい。塩の種類は特に限定されない力例えば、塩酸塩、硫酸塩、若しくは硝酸塩などの鉱酸塩、又は酒石酸塩、 P-トルエンスルホン酸塩、リンゴ酸塩、シユウ酸塩、若しくは酢酸塩などの有機酸塩などの酸付加塩、あるいはナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、若しくはカルシウム塩などの金属塩、アンモニゥム塩、又はメチルァミン塩若しくはトリェチルァミン塩などの有機ァミン塩などを挙げることができる。もっとも、塩の種類はこれらに限定されることはない。また、本発明の化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物を形成する場合がある力任意の水和物又は溶媒和物も本発明の範囲に包含される。

[0017] 本発明の化合物は置換基の種類などに応じて 1個又は 2個以上の不斉炭素を有する場合があるが、 1個又は 2個以上の不斉炭素に基づく光学異性体ゃジァステレオ異性体などの純粋な形態の立体異性体、ラセミ体ゃジァステレオ異性体混合物などの立体異性体の任意の混合物なども本発明の範囲に包含される。また、一般式 (I)又は一般式 (II)で表される化合物が互変異性体であることは当業者に容易に理解されよう。これらの互変異性体の任意の混合物も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。

[0018] いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、例えば、一般式 (I)において R³が

= N+(CH ) ·Μ—であり、 ηが 1であり、 Xが- SHである化合物と、一般式 (II)において R²³が

3 2

N(CH )であり、 nが 1であり、 Yカ S-である化合物とは、水溶液環境において平衡

3 2

状態にある力生理的 pHにおいてはほとんどが一般式 (II)で表される閉環型の化合物として存在する。一般式 (II)で表される閉環型の化合物は無蛍光性であり、一方、一般式 (I)で表される開環型の化合物は蛍光性である。

[0019] 上記の性質を利用して、上記一般式 (II)において、 R²³が— N(R²⁸)(R²⁹) (好ましくは R²³ がー N(CH )であり）、 Yカ S-である化合物を次亜塩素酸イオンの選択的蛍光プロ

3 2 一ブとして用いることができる。この化合物は生理的な pHにおいては閉環型構造をとるため実質的に無蛍光性であり、次亜塩素酸イオンと特異的に反応して、ジヒドロチォフェン環が開環し、強蛍光性ィ匕合物を与える。この上記一般式 (II)において R²³が— N( R²⁸)(R²⁹) (好ましくは R²³が— N(CH )であり）、 Yが- S-である化合物と次亜塩素酸ィォ

3 2

ンとの反応は、ジヒドロチォフェン環が次亜塩素酸イオンによって酸ィ匕されることで進行するため、次亜塩素酸イオンと反応して開環する化合物は一般式 (I)において Xが- SHである化合物とは異なるものになり、生理的な pHで閉環することはない。また、この反応は次亜塩素酸イオンの存在下で特異的に進行し、他の活性酸素種 (例えばヒドロキシルラジカルやパーォキシナイトライトなどの高い活性を有する活性酸素種又は過酸ィ匕水素などの弱い活性酸素種)の存在下では進行しない。従って、上記一般式 (II)で表される化合物又はその塩は次亜塩素酸イオンの測定のための選択的蛍光プローブとして使用できる。

[0020] 本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明の蛍光プローブを用いた測定対象物の測定方法は、一般的には、（a)上記一般式 (Π)において、 R²³が— N(R²⁸)(R²⁹)であり、 Yが- S-である化合物又はその塩を試料と接触させる工程、及び (b)該試料中の次亜塩素酸イオンとの反応により生じた上記一般式 (I)において R³が = N+(R⁸)(R⁹)'M—であり、 Xが- SHである化合物又はその塩から生じる蛍光を測定する工程を含む。例えば、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに本発明の蛍光プローブ又はその塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。

また、いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、上記一般式 (I)において、 R³ が =0であり、 Xが- OHである化合物と一般式 (II)において R²³が— OHであり、 Yカ 0- である化合物は、水溶液中で平衡状態にあり、プロトネーシヨンにより蛍光性が変化する。例えば、上記一般式 (I)において、 R³が =0であり、 nが 1であり、 Xが- OHである化合物と一般式 (II)において R²³が— OHであり、 nが 1であり、 Yカ 0-である化合物は、水溶液中で下記の平衡状態にあり、 pH依存的に蛍光性が変化する。従って、上記一般式 (I)において、 R³が =0であり、 Xが- OHである化合物と一般式 (II)において R²³ がー OHであり、 Yカ 0-である化合物は pH依存性の蛍光プローブとして利用することがでさる。

[化 3]

弱蛍光強蛍光無蛍光

[0022] 本発明の化合物から生じる蛍光の測定は通常の方法で行うことができ、インビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてインビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ま U、。

[0023] 本発明の蛍光プローブは、必要に応じて、測定試薬の調製に通常用いられる添カロ剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、 pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。

実施例

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。

例 1 :化合物 8、 9、 11、及び 13の合成

<スキーム 1 >

[化 4]

[0025] (A)化合物 3の合成

化合物 1(2.7 g, 15 mmol)と蒸留ジクロロメタン 200 mLを混合し、氷水浴上で撹拌しながらイソブテンを 2時間バブルし、濃硫酸を 3滴加え 15時間室温で撹拌した。反応混合液を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧溜去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒:ジクロロメタン)で精製し、無色の針状晶を得た (19.1 g,収率 54.4%)。

^JH NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 1.31 (s, 9Η), 4.50 (s, 2H), 7.11 (m, 1H), 7.31 (m, 1H

3

), 7.50 (dd, 1H, J = 8.16, 0.93 Hz), 7.55 (m, 1H).

[0026] (B)化合物 6の合成

化合物 3(0.73 g, 3 mmol)及び化合物 5(0.91 g, 2 mmol)をそれぞれ 20 mL, 40 mLのテトラヒドロフランに溶解し、活性ィ匕したモレキュラーシーブズ 4A 1/16をカ卩えてァルゴン雰囲気下で 1時間乾燥した。よく乾燥したアルゴン雰囲気下の 2頸コルベンに化合物 3のテトラヒドロフラン溶液をシリンジにて移し、ドライアイス/アセトン浴上 (-80°C)にて撹拌しながら 1.5 mol/L t-ブチルリチウム n-ペンタン溶液 (4 mL, 6 mmol)をカ卩ぇ 30 分撹拌した後、化合物 5のテトラヒドロフラン溶液を加えドライアイス/アセトン浴力外して室温にし 2時間撹拌し、少量の水を加えた。反応混合物を減圧溜去して飽和リン酸-水素ナトリウム水溶液と酢酸ェチルをカ卩えて溶解し、酢酸ェチルで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧溜去して、赤橙色のオイルを得た。このオイルをシリ力ゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒:酢酸ェチル /メタノール = 20/1)で精製して橙色の固体を得た (0.58 g,収率 78%)。

1H NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 0.81 (s, 9H), 4.13 (s, 2H), 6.82 (dd, 2H, J = 2.01, 9.

3

18 Hz), 6.86 (d, 2H, J = 2.01 Hz), 7.09 (d, 2H, J = 9.18 Hz), 7.20 (d, 1H, J = 7.14 Hz), 7.46 (td, 1H, J = 7.37, 1.41 Hz), 7.54 (m, 1H), 7.59 (d, 1H, J = 7.41 Hz). ¹³C NMR (75 MHz, CDC1 ) δ 26.5, 59.7, 62.1, 72.5, 127.8, 129.3, 129.6, 130.7, 132.4,

3

137.4, 149.5.

HRMS (ESI-Tol) m/z Found 373.1419 (M- H)— , calculated 373.1439 for C H O (-2

24 21 4

.04 mmu).

[0027] (C)化合物 8の合成化合物 6(370 mg, 1 mmol)とトリフルォロ酢酸 10 mLを混合し、 100°Cで 16時間加熱還流し、氷冷下で 2 mol/L水酸ィ匕ナトリウム水溶液にて中性とし、飽和リン酸-水素ナトリウム水溶液を加えて PH4とした。この水層を酢酸ェチルで抽出し、無水硫酸ナトリゥムで乾燥し、減圧溜去して赤橙色の固体を得た。この固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒:酢酸ェチル)で精製し、赤橙色の固体を得た (220 mg,収率 70 %)。

^JH NMR (300 MHz, CD OD) δ 5.13 (s, 2H), 6.39 (dd, 2H, J = 7.60, 2.40 Hz), 6.48

3

(d, 2H, J = 2.40 Hz), 6.63 (d, 2H, J = 7.60 Hz), 6.72 (d, IH, J = 7.50 Hz), 7.2 (m, IH), 7.2-7.4 (m, 2H).

HRMS (ESI-Tol) m/z Found 317.0809 (M— H)— , calculated 317.0814 for C H O (-0

20 13 4

.51 mmu).

[0028] (D)化合物 4の合成

上記化合物 3と同様に合成した。

JH NMR (300 MHz, CDCl ) δ 1.16 (9H, s), 2.97 (t, 2H, J = 7.52 Hz), 3.56 (t, 2H, J

3

= 7.34 Hz), 7.06 (dt, IH, J = 10.39, 3.94 Hz), 7.2-7.3 (m, 2H), 7.52 (d, IH, J = 7.7 0 Hz).

[0029] (E)化合物 7の合成

上記化合物 6と同様に合成した。

JH NMR (300 MHz, (CD ) CO) δ 0.96 (s, 9H), 2.57 (dd, 2H, J = 12.8, 5.69 Hz), 3.

3 2

37 (t, 2H, J = 7.06 Hz), 6.57 (d, 2H, J = 1.83 Hz), 6.62 (dd, 2H, J = 9.17, 2.20 Hz), 6.94 (d, 2H, J = 9.17 Hz), 7.28 (dd, IH, J = 7.61, 1.01 Hz), 7.46 (td, IH, J = 7.34, 1.65 Hz), 7.55 (td, IH, J = 7.43, 1.47 Hz), 7.61 (dd, IH, J = 7.61, 1.01 Hz).

HRMS (ESI-Tol) m/z Found 387.1578 (M— H)— , calculated 387.1596 for C H O (-1

25 23 4

.83 mmu).

[0030] (F)化合物 9の合成

上記化合物 8と同様に合成した。

JH NMR (300 MHz, (CD ) CO) δ 2.97 (t, 2H, J = 5.50 Hz), 3.81 (t, 2H, J = 5.59 H

3 2

z), 6.54 (dd, 2H, J = 8.53, 2.48 Hz), 6.69 (d, 2H, J = 2.48 Hz), 6.70 (d, 2H, J = 8.5 3 Hz), 6.75 (d, IH, J = 8.44 Hz), 7.10-7.13 (m, IH), 7.26-7.28 (m, 2H), 8.68 (s, 2H ).

¹³C NMR (75 MHz, d DMSO) δ 48.5, 72.7, 101.9, 110.7, 117.3, 125.9, 126.6, 128.1

6

129.3, 130.5, 135.5, 138.7, 151.8, 157.9, 206.6.

HRMS (ESI-Tol) m/z Found 331.0948 (M- H)— , calculated 331.0970 for C H O (-2

21 15 4

.21 mmu).

[0031] (G)化合物 10の合成

化合物 6(440 mg, 1.2 mmol)をメタノール 30 mLと 2 mol/L水酸化ナトリウム水溶液 30 mLの混合溶液に溶解し、氷水浴上で撹拌しながら、 75 mmol/L次亜塩素酸ナトリウム Z2 mol/L水酸ィ匕ナトリウム水溶液をゆっくりと滴下し吸光光度計で 494 nmのピークトップがレッドシフトしていく様子を確かめながら 2.5 mmol相当の次亜塩素酸ナトリウム溶液を滴下した。反応混合物にァスコルビン酸を加え余剰の次亜塩素酸ナトリウムをス力べンジし、減圧溜去してメタノールを十分に除いた後、酢酸ェチルと飽和リン酸-水素ナトリウム水溶液を加えて溶解した。酢酸ェチルで抽出して有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧溜去して、赤橙色のオイルを得た。このオイルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒:ジクロロメタン/メタノール = 20/1)で精製して赤橙色の固体を得た (62 mg,収率 13%)。

HRMS (ESI-Tol) m/z Found 409.1214 (MH)⁺, calculated 409.1207 for C H CIO (+

24 22 4

0.74 mmu).

[0032] (H)化合物 11の合成

上記化合物 8と同様に合成した。

1H NMR (300MHz, (CD ) CO) δ 5.28 (s, 2Η), 6.62 (dd, IH, J = 2.37, 8.61 Hz), 6.7

3 2

-6.9 (m, 3H), 6.84 (d, IH, J = 8.61), 6.87 (d, IH, J = 7.14 Hz), 7.28 (dd, IH, J = 7.

45 Hz), 7.39 (td, IH, J = 0.98, 7.45 Hz), 7.46 (d, 2H, J = 7.45 Hz).

¹³C NMR (75MHz, (CD ) CO) δ 72.8, 84.2, 102.9, 112.4, 113.1, 117.5, 119.3, 121.8

3 2

, 124.3, 128.3, 128.9, 129.1, 130.8, 140.0, 146.4, 148.0, 151.8, 154.6, 159.1. HRMS (ESI-Tol) m/z Found 351.0415 (M— H)— , calculated 351.0424 for C H CIO (

20 12 4

—0.51 mmu). [0033] (I)化合物 12の合成

化合物 10を合成する際のもう一つの主生成物として赤橙色の個体を得た (130 mg, 収率 24%)。

1H NMR (300MHz, (CD ) CO) δ 0.77 (s, 9Η), 4.20 (s, 2H), 6.81 (d, 2H, J = 9.36 H

3 2

z), 7.04 (d, 2H, J = 9.36 Hz), 7.30 (d, IH, J = 6.93 Hz), 7.6-7.5 (m, 3H).

HRMS (ESI-Tol) m/z Found 441.0694 (M- H)— , calculated 441.0660 for C H CI O

24 19 2 4

(+3.35 mmu).

[0034] 0)化合物 13の合成

上記化合物 8と同様に合成した。

JH NMR (300MHz, (CD ) CO) δ 5.29 (s, 2H), 6.79 (d, 2H, J = 8.97 Hz) , 6.82 (d,

3 2

2H, J = 8.97 Hz), 6.92 (d, IH, J = 7.50 Hz), 7.30 (td, IH, J = 1.03, 7.43 Hz) 7.41 (t d, IH, J = 1.03, 7.47 Hz), 7.47 (d, IH, J = 7.50 Hz), 9.16 (s, 2H).

¹³C NMR (75MHz, (CD ) CO) δ 73.0, 84.4, 108.5, 113.0, 118.9, 121.9, 124.3, 128.1

3 2

, 129.1, 129.2, 140.0, 145.9, 147.7, 154.8.

HRMS (ESI-Tol): Found 385.0019 (M- H)— , calculated 385.0034 for C H CI O (-1.

20 11 2 4

56 mmu).

[0035] 例 2 :化合物 17の合成

<スキーム 2>

[化 5]

17 [0036] (K)化合物 15の合成

ィ匕合物 14 (2.50 g, 10.0 mmol)、 t-ブチルメルカプタン (1.35 g, 15.0 mmol)、炭酸セシゥム (3.30g, 10.0 mmol)、ジメチルホルムアミド 30 mLを混合し 15時間室温で撹拌した。反応混合液を n-へキサンに希釈し 0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液 (pH7.4)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、減圧溜去して得られた残渣をシリカゲルカラムク口マトグラフィー (展開溶媒: n-へキサン)で精製して無色の液体を得た（1.96 g,収率 75.7%) o

^JH NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 1.39 (s, 9Η), 3.89 (s, 2H), 7.08 (td, 1H, J = 7.66, 1.7

3

1 Hz), 7.25 (td, 1H, J = 7.47, 1.22 Hz), 7.44 (dd, 1H, J = 7.61, 1.74 Hz), 7.53 (dd, 1H, J = 8.07, 1.28 Hz).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1 ) δ 30.8, 33.5, 43.2, 124.4, 127.5, 128.4, 131.0, 132.9,

3

137.9.

[0037] (L)化合物 16の合成

化合物 15 (0.38 g, 1.5 mmol),化合物 5(0.46 g, 1.0 mmol)をそれぞれ 20mLの蒸留テトラヒドロフランに溶解し、活性ィ匕したモレキュラーシーブズ 4A 1/16をカ卩えてァルゴン雰囲気下で 1時間乾燥した。よく乾燥したアルゴン雰囲気下の 2頸コルベンに化合物 15のテトラヒドロフラン溶液をシリンジにて移し、ドライアイス/アセトン浴上 (-80°C) にて撹拌しながら 1.5 mol/L t-ブチルリチウム n-ペンタン溶液 (1.3 mL, 2 mmol)をカロえ 10分撹拌した後、化合物 5のテトラヒドロフラン溶液を加えドライアイス/アセトン浴から外して室温にて 30分撹拌し、少量の塩酸を加えた。反応混合物を減圧溜去して飽和リン酸-水素ナトリウム水溶液，酢酸ェチルを加えて溶解し、酢酸ェチルで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧溜去して赤色の固体得た。この固体をシリカゲルカラムにチャージして、酢酸ェチルで洗浄後メタノールで溶出し、メタノール画分を減圧溜去後、リン酸-水素ナトリウム水溶液、酢酸ェチルを加えて溶解し酢酸ェチルで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧溜去して赤色の固体を得た (0.40 mg 、定量的)。

^JH NMR (300 MHz, DMSO) δ 1.05 (s, 9H), 3.58 (s, 2H), 6.58 (d, 2H, J = 1.65 Hz), 6.61 (dd, 2H, J = 9.26, 2.11 Hz), 6.95 (d, 2H, J = 8.99 Hz), 7.33 (dd, 1H, J = 7.34, 1.56 Hz), 7.51 (td, 1H, J = 7.38, 1.53 Hz), 7.58 (td, 1H, J=7.47, 1.59 Hz), 7.66 (dd , 1H, J = 7.61, 1.38 Hz).

HRMS (ESI-Tol) m/z Found 389.1197 (M- H)— , calculated 389.1211 for C H O S (-

24 21 3

1.46 mmu).

[0038] (M)化合物 17の合成

化合物 16 (220 mg, 0.56 mmol),トリフルォロ酢酸 10 mLを混合し、 100°Cで 16時間加熱還流し、減圧溜去してトリフルォロ酢酸を除き、 2 mol/L水酸化ナトリウム水溶液に溶解して酢酸ェチルで水相を洗浄し、水相を ODSシリカゲルカラムにチャージして超純水で溶出して得た画分を塩酸で中和して PH7とし、析出した黄色の固体を濾取して、黄色の固体を得た (122 mg、収率 65%)。

^JH NMR (300 MHz, DMSO— d ) δ 4.49 (s, 2H), 6.43 (s, 2H), 6.45 (dd, 2H, J =7.98,

6

1.93 Hz), 6.72 (d, 1H, J = 7.52 Hz), 6.77 (m, 2H), 7.20 (td, 1H,J=7.38, 0.76 Hz), 7.

29 (td, 1H, J=7.52, 1.16 Hz), 7.43 (d, 1H, J=7.52 Hz), 9.73 (s, 2H).

HRMS (ESI-Tol) m/z Found 333.0577 (M— H)— , calculated 333.0585 for C H O S (―

20 13 3

0.86 mmu).

[0039] 例 3 :化合物 19の合成

<スキーム 3 >

[化 6]

[0040] (N)化合物 19の合成

化合物 3 (0.49 g, 2 mmol)と化合物 18 (0.28 g, 1 mmol)をそれぞれ 25 mLの蒸留テトラヒドロフランに溶解し、活性ィ匕したモレキュラーシーブズ 4A 1/16をカ卩えてアルゴン雰囲気下で 1時間乾燥した。よく乾燥したアルゴン雰囲気下の 2頸コルベンに化合物 3のテトラヒドロフラン溶液をシリンジにて移し、ドライアイス/アセトン浴上 (-80°C)にて撹拌しながら 1.5 mol/L t-ブチルリチウム n-ペンタン溶液 (1.5 mL, 2.3 mmol)を加え 30 min撹拌した後、化合物 18のテトラヒドロフラン溶液を加えドライアイス/アセトン浴から外して室温にし 2時間撹拌し、酢酸 3mLを加えた。反応混合物を減圧溜去して酢酸ェチルをカ卩えて溶解し、 2 mol/L塩酸で抽出した。水層を水酸化ナトリウム水溶液で中和して pH7にし、ジクロロメタンで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧溜去して紫色の固体を得た。この固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒:酢酸ェチル)で精製して減圧溜去し、紫色の固体を得た (4.8 mg,収率 1.3%)。

JH NMR (300 MHz, (CD ) CO) δ 2.96 (s, 12H), 5.21 (s, 2H), 6.43 (d, 2H, J = 2.38

3 2

Hz), 6.47 (d, 2H, J = 8.62, 2.57 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 8.62), 6.80 (d, 1H, 7.52 Hz), 7.25 (t, 1H, J = 7.15 Hz), 7.36 (td, 1H, J = 7.34, 0.98 Hz), 7.43 (d, 1H, J = 7.52 Hz ).

¹³C NMR (75 MHz, (CD ) CO) δ 40.5, 72.1, 99.1, 109.4, 114.5, 121.6, 124.4, 128.5

3 2

, 128.8, 130.4, 152.3, 152.6.

HRMS (ESI-Tol) m/z Found 373.1879 (MH)⁺, calculated 373.1916 for C H N O (-

24 25 2 2

3.67 mmu).

例 4 :化合物 21の合成

<スキーム 4>

[化 7]

(0)化合物 20の合成

化合物 15 (0.59 g, 2.4 mmol)と化合物 18 (0.28 g, 0.60 mmol)をそれぞれ 10 mLの蒸留テトラヒドロフランに溶解し、活性ィ匕したモレキュラーシーブズ 4A 1/16をカ卩えてァルゴン雰囲気下で 1時間乾燥した。よく乾燥したアルゴン雰囲気下の 2頸コルベンに化合物 15のテトラヒドロフラン溶液をシリンジにて移し、ドライアイス/アセトン浴上 (-80 °C)にて撹拌しながら 1.5 mol/L t-ブチルリチウム n-ペンタン溶液 (2 mL, 3 mmol)をカロえ 10分撹拌した後、化合物 18のテトラヒドロフラン溶液を加えドライアイス/アセトン浴から外して室温にし 30分撹拌し、少量の塩酸を加えた。反応混合物を減圧溜去して飽和リン酸-水素ナトリウム水溶液とジクロロメタンを加えて溶解し、ジクロロメタンで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧溜去して赤紫色の固体得た。この固体をクロ口ホルムに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒:クロ口ホルム→ 酢酸ェチル→ジクロロメタン/メタノール =20/1)で精製し、減圧溜去して赤紫色の固体を得た (48 mg,収率 17%)。

^JH NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 0.94 (s, 9H), 3.32 (s, 12H), 3.35 (s, 2H), 6.81 (d, 2H,

3

J = 2.4 Hz), 6.91 (dd, 2H, J = 9.4, 2.5 Hz), 7.10 (dd, 1H, J = 7.8, 1.0 Hz), 7.14 (d, 2H, J = 9.5 Hz), 7.39 (td, 1H, J = 7.4, 1.3 Hz), 7.47 (dd, 1H, J = 7.7, 1.3 Hz), 7.53 (td, 1H, J = 7.5, 1.2 Hz).

¹³C NMR (75MHz, CDC1 ) δ 30.1, 30.8, 41.0, 43.0, 96.5, 113.7, 114.2, 127.3, 129.

3

3, 130.3, 130.7, 131.4, 131.7, 136.4, 157.1, 157.3, 157.4.

HRMS (ESI-Tol) m/z Found 445.2291 (M- Cl)+, calculated 445.2314 for C H N OS

28 33 2

(-2.27 mmu).

[0043] (P)化合物 21の合成

化合物 20(48 mg, 0.1 mmol)とトリフルォロ酢酸 10 mLを混合し、 100°Cで 16時間加熱還流した。氷冷下で 2 mol/L水酸ィ匕ナトリウム水溶液で中性にし、更に食塩を添カロして飽和させ、この水層を酢酸ェチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧溜去して紫色の固体を得た。この固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒：酢酸ェチル)で精製し減圧溜去して、紫色の固体を得た (24 mg,収率 62%)。

1H NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 2.94 (s, 12H), 4.50 (s, 2H), 6.36 (d, 2H, J = 2.6 Hz),

3

6.40 (dd, 2H, J = 8.6, 2.6 Hz), 6.87 (d, 2H, J = 8.6), 6.92 (d, 1H, 7.2 Hz), 7.18 (t, 1H, J = 6.9 Hz), 7.2-7.3 (m, 1H), 7.35 (d, 1H, J = 7.5 Hz).

HRMS (ESI-Tol) m/z Found 389.1685 (MH)⁺, calculated 389.1688 for C H N OS (

24 25 2

-0.22 mmu).

[0044] 例 5 :化合物 8、 9、 11、 13、 19、及び 21の pH特性

各化合物の pH特性を調べた。それぞれ下記の化合物濃度、共溶媒（ジメチルホルムアミド (DMF》濃度となるように（化合物濃度 I DMF濃度)、各化合物の DMFストック溶液を任意の pHの 0.1 mol/Lナトリゥムリン酸緩衝液中に希釈した。

化合物 8: 0.2 μ mol/L I 0.1%,化合物 9: 5 μ mol/L I 0.5%,化合物 11: 5 μ mol/L I 0.5%,化合物 13: 5 μ mol/L I 0.5%,化合物 19: 1.25 μ mol/L I 1%,化合物 21: 1 μ mol/L I 1%

これらの蛍光強度及びモル吸光係数を測定した結果を図 1に示す。 pH依存的に蛍光性の変化が見られたことから、これらの化合物は pHプローブとして機能することが示された。

[0045] 例 6 :化合物 21の蛍光特性

5 mol/Lの化合物 21の 0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液 (pH7.4:共溶媒として 0.5 %DMFを含む）に過酸化水素を終濃度が 1 mmol/L、 100 mmol/Lとなるように、及び次亜塩素酸ナトリウムを終濃度が 2.5 mol/Lとなるようにそれぞれ添加し、励起波長 550 應における蛍光スペクトルを測定した。結果を図 2に示す。高濃度の過酸化水素を添加しても蛍光スペクトルに変化は見られな力つた力次亜塩素酸ナトリウム添加すると、 580 應の蛍光強度が増加し蛍光スペクトルに大きな変化が見られた。また、過酸ィ匕水素及び次亜塩素酸イオンを添加しなカゝつた溶液においては、蛍光強度が全く増加しな力つた。

[0046] 例 7 :化合物 21と次亜塩素酸イオン及び過酸化水素との反応

5 mol/Lの化合物 21の 0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液 (pH7.4:共溶媒として 0.5 %DMFを含む）に、 25°Cで、過酸化水素を終濃度が 1 mmol/L, 100 mmol/Lとなるように、及び次亜塩素酸ナトリウムを終濃度が 2.5 mol/Lとなるようにそれぞれ添加し、励起波長 550 nm、蛍光波長 580 nmにおける蛍光強度の時間変化をそれぞれ測定した。結果を図 3に示す。高濃度の過酸ィ匕水素を添加しても蛍光強度に変化は見られな力つたが、次亜塩素酸ナトリウム添加すると、蛍光強度の増加が見られた。

[0047] 例 8 :化合物 21とパーォキシナイトライトとの反応

1 mol/Lの化合物 21の 0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液 (pH7.4:共溶媒として 1 %DMFを含む）に、 25°Cで、励起波長 550 nm、蛍光波長 580 nmにて蛍光強度の時間変化測定を開始した。矢印が示す時間にパーォキシナイトライトを終濃度が 1 m ol/Lとなるように添加し、さらに同量のパーォキシナイトライトを一回、 10倍量のパーォキシナイトライトを一回、矢印の時間に追加して添加している。また、次亜塩素酸ィオン及びパーォキシナイトライトと反応して蛍光強度が増加することが知られている A PF(J. Biol. Chem., 278, 3170-3175 (2003))をポジティブコントロールとして測定した。 APFを用いた測定は、 1 /z mol/Lの APF溶液を用い、測定励起波長、蛍光波長のみそれぞれ 490 nm、 515 nmに変更した以外は化合物 21と同様にして、パーォキシナイトライトを最初の矢印の一回のみ終濃度が 1 /z mol/Lとなるように添加した。結果を図 4に示す。 APFはパーォキシナイトライト添カ卩により蛍光上昇が見られたが、化合物 21ではパーォキシナイトライトによる蛍光上昇は見られなかった。

[0048] 例 9：化合物 21とヒドロキシルラジカルの反応

3 /z mol/Lの化合物 21の 0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液 (pH7.4:共溶媒として 1 %DMFを含む）に終濃度 1 mol/Lとなるように過酸ィ匕水素を添加した。 25°Cで激しく撹拌しているところに、塩ィ匕鉄 (Π)溶液をそれぞれ終濃度が 1 mol/L、 2 μ mol/L 、 3 μ mol/L, 4 mol/Lとなるように添カ卩してヒドロキシルラジカルを発生させ、励起波長 550 nmにおける蛍光スペクトルを測定した。また、ポジティブコントロールとして A PFを用いて比較した。 APFを用いた測定は、 3 mol/Lの APF溶液を用い、測定励起波長、蛍光波長のみそれぞれ 490應、 515應に変更した以外は化合物 21と同様にして、塩ィ匕鉄（II)溶液を 4 mol/Lとなるように添カ卩して行った。結果を図 5に示す。 APFは塩ィ匕鉄 (Π)溶液添カ卩によって発生するヒドロキシルラジカルと反応して蛍光強度が増加した力化合物 21では塩ィ匕鉄 (II)溶液添加前後で蛍光スペクトルの変ィ匕は見られなかった。

例 6から 9の結果より、化合物 21は光による自動酸化もなぐまた過酸ィ匕水素、パーォキシナイトライト、ヒドロキシルラジカルなどの活性酸素種とは反応せず、次亜塩素酸イオンを選択的に測定するプローブとして機能することが示された。

[0049] 例 10：ブタ好中球の次亜塩素酸イオンの測定

PMA (Phorbol myristate acetate)刺激によってブタ好中球で生成される次亜塩素酸イオンの測定に化合物 21を適用した。 Wakeyama, H.らの方法（ Biochem. J. 205 (1 982), 593-601)に従って精製したブタ好中球を、 Krebs-Ringerリン酸緩衝液（114 m mol/L塩化ナトリウム、 4.6 mmol/L塩化カリウム、 2.4 mmol/L硫酸マグネシウム、 1.0 mmol/L塩化カルシウム、 15 mmmol/Lリン酸二水素ナトリウム/リン酸水素ニナトリウム、 pH 7.4)に懸濁して 1 X 10⁶ cell/mLとした。この細胞懸濁液に化合物 21を濃度が 1 μ mol/Lとなるように添カ卩し (この時点で細胞懸濁液は共溶媒として DMFを 0.1%含む）、 37°Cで蛍光強度測定を開始した (励起波長 550 nm、蛍光波長 580 nm) ₀ 100秒後に PMAの DMF溶液を PMA濃度が 2 ng/mLとなるように添カ卩して、更に 37°Cで蛍光測定を続けた (この時点で細胞懸濁液は共溶媒として DMFを 0.2%含む)。また、 100 秒後に DMFのみを細胞懸濁液の DMF濃度が 0.2%となるように添カ卩し、コントロールとして測定した。結果を図 6に示す。 DMF添加だけでは蛍光強度が増加せず、 PMAを添加した場合のみ蛍光強度が著しく増加した。このことから、化合物 21は PMA刺激によって好中球が産生する次亜塩素酸イオンを検出可能であり、次亜塩素酸イオンを測定する蛍光プローブとして機能することが示された。

産業上の利用可能性

本発明により提供される上記一般式 (I)又は一般式 (II)で表される化合物又はその塩は次亜塩素酸イオン測定のための蛍光プローブ又は pHプローブなどの蛍光プロ一ブとして利用できる。

Claims

請求の範囲

〔式中、 R¹はベンゼン環上に置換する水素原子又は 1個ないし 4個の一価の置換基を示し、 2個以上の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよく； R²、 R⁴ 、 R⁵、及び R⁷はそれぞれ独立に水素原子又は一価の置換基を示し; R³は =0又は = N⁺(R⁸)(R⁹)'M" (式中、 R⁸及び R⁹はそれぞれ独立に置換基を有して、てもよ、アルキル基を示し、 M—は対イオンを示す)を示し; R⁶は— OH又は— NO^XR¹¹) (式中、及び R 1¹はそれぞれ独立に置換基を有してヽてもよヽアルキル基を示す)を示し、ただし!?³ が = 0である場合には R⁶は OHであり、 R³が = N+(R⁸)(R⁹) · M—である場合には R⁶は N(R^1Q)(R^U)であり； nは 1から 3の整数を示し;及び Xは- SH又は- OHを示す〕、又は下記の一般式 (II) :

[化 2]

〔式中、 R²¹はベンゼン環上に置換する水素原子又は 1個な!、し 4個の一価の置換基を示し、 2個以上の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよく； R²²、 R²⁵、及び R²⁷はそれぞれ独立に水素原子又は一価の置換基を示し; R²³は— OH 又は— N(R²⁸)(R²⁹) (式中、 R²⁸及び R²⁹はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいァルキル基を示す)を示し; R²⁶は— OH又は— N(R³°)(R³¹) (式中、 R³°及び R³¹はそれぞれ独立に置換基を有して、てもよ、アルキル基を示す）を示し、ただし R²³が― OHである場合には R²⁶は OHであり、 R²³がー N(R²⁸)(R²⁹)である場合には R²⁶は N(R³°)(R³¹)であり； nは 1から 3の整数を示し;及び Yは- S-又は- 0-を示す〕で表される化合物又はその塩。

[2] 一般式 (I)にお、て、 R³が = N+(R⁸)(R⁹) ·Μ—であり、 Xが- SHである請求項 1に記載の化合物又はその塩。

[3] 一般式 (I)において、 R³が =0であり、 Xが- ΟΗである請求項 1に記載の化合物又はその塩。

[4] 一般式 (II)にお、て、 R²³が— N(R²⁸)(R²⁹)であり、 Yが- S-である請求項 1に記載の化合物又はその塩。

[5] 一般式 (II)において、 R²³が— OHであり、 Yが- 0-である請求項 1に記載の化合物又はその塩。

[6] nが 1である請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載の化合物又はその塩。

[7] 請求項 1に記載の一般式 (I)又は一般式 (II)で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。

[8] 請求項 4に記載の化合物又はその塩を含む次亜塩素酸イオン測定用蛍光プローブ

[9] 請求項 3又は 5に記載の化合物又はその塩を含む pH蛍光プローブ。

[10] 次亜塩素酸イオンの測定方法であって、下記の工程：

(a)請求項 1に記載の一般式 (II)にお、て、 R²³が— N(R²⁸)(R²⁹)であり、 Yが- S-であるィ匕合物又はその塩を試料と接触させる工程、及び

(b)該試料中に含まれる次亜塩素酸イオンとの反応により生じた上記一般式 (I)において R³が = N+(R⁸)(R⁹) 'M—であり、 Xが- SHである化合物又はその塩力も生じる蛍光を測定する工程

を含む方法。