CN113387973A - 一种双识别荧光探针分子及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种双识别荧光探针分子，用于同时检测具有关联性的过氧化氢和次氯酸生物活性小分子；一种双识别荧光探针分子为亚甲基蓝‑萘酰亚胺衍生物，该双识别荧光探针分子同时具有与双氧水发生反应的硼酸酯基团和与次氯酸发生反应的酰胺基团；当具有亲核性的双氧水与荧光探针分子中具有亲电性的硼酸酯识别位点作用后，C‑B键被C‑O键取代，经水解后生成酚，出现黄绿色荧光(548nm)；次氯酸具有较强的氧化性，可以使荧光探针分子中的酰胺键断裂，生成不稳定的中间体，最后释放出带正电荷的亚甲基蓝荧光团，在近红外光区出现荧光(690nm)；该荧光探针在可见光区和近红外光区出现荧光增强，从而实现双氧水和次氯酸的同时检测。
Description
技术领域
本发明涉及有机功能材料领域，更具体地，涉及一种双识别荧光探针分子及其制备方法与用途。
背景技术
光探针分子成像技术在外科手术和生物医学领域有着良好的应用前景。近年来，荧光成像技术取得了快速发展，由于其对生物样本具有便捷、无损伤、实时原位动态可视监测以及高灵敏度、高时空分辨率的特点，逐渐成为生物荧光探针研究领域的重要工具。
针对生物活性小分子(活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、活性硫(RSS)等)检测的荧光探针及生物活体荧光成像研究是目前的研究热点。相比于单一检测荧光探针，设计和合成同时检测两种关联性生物活性小分子的双位点协同响应荧光探针及荧光成像研究更是目前的难点和发展趋势。基于双识别位点检测不同或相同活性物种的荧光探针已经有一些报道，然而已报道的双识别位点检测荧光探针所检测的活性物种还比较有限，主要集中在生物硫醇(Cys、Hcy、GSH)的选择性识别以及不多的活性氧和活性硫物种检测上。
如中国专利“一种同时或分别检测细胞溶酶体内硫化氢和次氯酸的荧光探针及其制备方法与应用”(申请号：201610263094.0，公开日：2016.07.20)公开了一种探针，实现了单一探针对多种靶标分子(H2S、HClO和H2S/HClO)的同时或分别检测。
又如“抗肿瘤诊疗前药以及双识别位点荧光探针的设计、合成以及生物应用”(陈宇，华南师范大学，2020.6.3)公开的荧光探针分子可用于同时检测次氯酸和硫化氢。
上述的荧光探针都可以同时检测次氯酸和硫化氢，而针对另外一些重要关联性生物活性小分子的检测还比较缺乏，如：H2O2和ClO-。
过氧化氢(H2O2)在NADPH酶活化下产生，又被髓过氧化物酶(MPO)催化变成次氯酸，这两种具有关联性的活性氧参与细胞的生命历程，而且对人体免疫防御系统非常重要。例如：突然暴露在强紫外线、强辐射、或者温度过高的环境中，会引发氧化应激过程，依次引起过氧化氢和次氯酸浓度异常，使细胞自体受到损伤。还可能会引发心血管疾病、神经退行性疾病、肺损伤、关节炎、风湿病甚至癌症多种疾病。
因此，制备具有对细胞内过氧化氢与次氯酸同时实时动态监测的荧光探针具有重要的理论及应用价值。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷(不足)，提供一种双识别荧光探针分子，可同时检测具有关联性的过氧化氢和次氯酸生物活性小分子。
本发明的另一目的在于提供一种双识别荧光探针分子的制备方法。
本发明的又一目的在于提供双识别荧光探针分子的用途。
本发明采取的技术方案是，一种双识别荧光探针分子，具有如下结构：
在本发明中，该双识别荧光探针分子具有与双氧水发生反应的硼酸酯基团，与次氯酸发生反应的酰胺基团，是一种结构清晰、光性质稳定的亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物。当具有亲核性的H2O2与荧光探针分子中具有亲电性的硼酸酯识别位点作用后，C-B键被C-O键取代，经水解后生成酚，从而在绿色通道出现荧光；HClO具有较强的氧化性，可以使荧光探针分子中生物酰胺键断裂，不稳定的中间体生成，最后生成稳定的带正电荷的亚甲基蓝荧光团，从而在红色通道出现荧光，从而实现双识别位点选择性识别和同时检测双氧水和次氯酸。
一种如上述的双识别荧光探针分子的制备方法，包括如下步骤：
S1：将亚甲基蓝和碳酸钠溶于蒸馏水和二氯甲烷中，搅拌，再缓慢加入硫代硫酸钠水溶液，继续搅拌至溶液变黄，将上述溶液冷却，向其中缓慢滴加二(三氯甲基)碳酸酯的二氯甲烷溶液，继续搅拌，然后倒入冰水中，再用二氯甲烷萃取，干燥有机相，过滤，减压蒸馏，收集，经硅胶层析柱，洗脱、分离、提纯，得到化合物4；
S2：将S1得到的化合物4溶于二氯甲烷中，向其中缓慢滴入乙二胺的二氯甲烷溶液继续搅拌，倒入水中，经萃取、干燥、减压蒸馏，收集，经硅胶层析柱，洗脱、分离、提纯，得到化合物3；
S3：将4-溴-1,8-萘二甲酸酐，双(频哪醇合)二硼，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和乙酸钾溶于无水二恶烷中，在氮气保护下高温反应，将所得溶液冷却至室温，并用去离子水稀释，经萃取、干燥、减压蒸馏，收集，经硅胶层析柱，洗脱、分离、提纯，得到化合物2；
S4：将S2得到的化合物3和S3得到的化合物2溶于无水乙醇中，在氮气保护下，回流，减压蒸发溶剂，经硅胶柱层析分离提纯得到亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物1。
进一步地，在S1中，具体步骤为：将亚甲基蓝和碳酸钠溶于蒸馏水和二氯甲烷中，常温搅拌35分钟，然后向其中慢慢加入硫代硫酸钠水溶液，继续搅拌至溶液变黄，将上述溶液用冰水浴冷却后，向其中缓慢滴加二(三氯甲基)碳酸酯的二氯甲烷溶液，继续搅拌1小时，然后倒入冰水中，再用二氯甲烷萃取，干燥有机相，过滤，减压蒸馏，收集，经硅胶层析柱，洗脱、分离、提纯，得到化合物4；
或在S2中，具体步骤为：将S1得到的化合物4溶于二氯甲烷中，向其中缓慢滴入乙二胺的二氯甲烷溶液，在室温下继续搅拌2小时，倒入水中，经萃取、干燥、减压蒸馏，收集固体混合物，经硅胶层析柱，洗脱、分离、提纯，得到化合物3；
或在S3中，具体步骤为：将4-溴-1,8-萘二甲酸酐，双(频哪醇)二硼，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和乙酸钾溶于无水二恶烷中，氮气保护下在90℃下反应10小时，将所得溶液冷却至室温，并用去离子水稀释，经萃取、干燥、减压蒸馏，收集，经硅胶层析柱，洗脱、分离、提纯，得到化合物2；
或在S4中，具体步骤为：将S2得到的化合物3和S3得到的化合物2溶于无水乙醇中，在氮气保护下，回流8小时，减压蒸发溶剂，经硅胶柱层析分离提纯得到亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物1。
进一步地，在步骤S1中，所述硫代硫酸钠、亚甲基蓝、碳酸钠、二(三氯甲基)碳酸酯的物质的量比为6.66:1.72:6.66:1；所述洗脱剂为正己烷与二氯甲烷的混合物，其体积比为3:1。
进一步地，在步骤S2中，所述化合物4与乙二胺的物质的量比为1:2.5，所述洗脱剂为二氯甲烷与甲醇的混合物，其体积比为10:1。
进一步地，在步骤S3中，所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐、双(频哪醇)二硼、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、乙酸钾的物质的量比为18:27:1:27，所述洗脱剂为石油醚与二氯甲烷的混合物，其体积比为10:1。
进一步地，在步骤S4中，所述化合物2与化合物3的物质的量比为1:1，所述洗脱剂为二氯甲烷与甲醇的混合物，体积比为80:1。
一种如上述的双识别荧光探针分子用于同时检测双氧水和次氯酸。
进一步地，所述双识别荧光探针分子用于检测乙醇水溶液、细胞内、线虫体内的双氧水和次氧酸含量。
优选地，所述乙醇水溶液中乙醇与水的体积比＝2：8。
优选地，所述线虫为秀丽线虫。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供一种新的双识别荧光探针分子，可同时识别次氯酸和过氧化氢，灵敏性高，选择性良好；
(2)本发明的双识别荧光探针分子的合成方法步骤简单，收率高。
(3)本发明的双识别荧光探针分子能够非常好地选择识别双氧水和次氯酸(如图5所示)。当探针中加入H2O2和其它活性氧时，通过各个活性物种在548nm荧光强度值的柱形图对比(如图6所示)，在548nm处该荧光探针分子仅明显地增强H2O2荧光，表现出高度的荧光选择性，具有良好的抗干扰性；当探针中加入HClO和其它活性氧时，通过各个活性物种690nm荧光强度值的柱形图对比(如图6所示)，在690nm处该荧光探针分子仅明显地增强HClO荧光，表现出高度的荧光选择性，具有良好的抗干扰性。
(4)本发明双识别荧光探针分子物理化学性质稳定性好。
(5)本发明双识点荧光探针分子分别与双氧水和次氯酸反应前后，其荧光发射在水溶液、细胞、线虫体内显著增强，检测整个识别过程荧光变化灵敏度高，能够同时检测水溶液中的双氧水和次氯酸以及荧光成像细胞和线虫体内的双氧水和次氯酸。
(6)本发明双识别荧光探针分子穿透细胞的渗透性好，可荧光检测细胞、线虫体内双氧水和次氯酸。
附图说明
图1为本发明双识别荧光探针分子的合成路线。
图2为本发明双识别荧光探针分子的1H-NMR谱图。
图3为本发明双识别荧光探针分子的13C-NMR谱图。
图4为本发明双识别荧光探针分子的HRMS(ESI)谱图。
图5为本发明双识别荧光探针分子在乙醇水溶液体系中对双氧水响应的荧光光谱变化图和不同干扰离子在548nm处荧光强度柱状图。
图6为本发明双识别荧光探针分子在乙醇水溶液体系中对次氯酸响应的荧光光谱变化图和不同干扰离子在690nm处荧光强度柱状图。
图7为本发明双识别荧光探针分子在乙醇水溶液体系中对不同浓度双氧水的荧光光谱变化图。
图8为本发明双识别荧光探针分子在548nm处荧光强度与相对应的双氧水浓度拟合曲线图。
图9为本发明双识别荧光探针分子在乙醇水溶液体系中对不同浓度次氯酸的荧光光谱变化图。
图10为本发明双识别荧光探针分子在690nm处荧光强度与相对应的次氯酸浓度拟合曲线图。
图11为本发明双识别荧光探针分子在细胞内同时对双氧水和次氯酸荧光识别图。其中，a1-e1为绿色荧光通道图，a2-e2为红色荧光通道图，a3-e3为明场图；a1-a3为RAW264.7细胞，b1-b3为HIBEC细胞，图c1-c3为CT26细胞，图d1-d3为QBC939细胞，图e1-e3为HuCCT1细胞
图12为本发明双识别荧光探针分子在线虫体内同时对双氧水和次氯酸荧光识别图。其中，a1-d1为明场荧光图，a2-d2为绿色荧光通道图，a3-d3为红色荧光通道图；a1-a3为只加20μmol/L的探针化合物的荧光图片；b1-b3为20μmol/L的探针化合物以及76μmol/L的H2O2处理的荧光图片；c1-c3为20μmol/L的探针化合物以及14μmol/L的HClO处理的荧光图片；d1-d3为20μmol/L的探针化合物以及分别用76μmol/L的H2O2处理和14μmol/L的HClO处理的荧光图片。
具体实施方式
本发明实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。
实施例1
基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子的制备(合成路线见图1)：
(1)化合物4的制备：将亚甲基蓝(5.0g,15.66mmol)和碳酸钠(6.64g,62.52mmol)溶于蒸馏水(30mL)和二氯甲烷(20mL)中，常温搅拌35分钟，然后向其中慢慢加入硫代硫酸钠(10.98g,62.52mmol)水(40mL)溶液，继续搅拌至溶液变黄，将上述溶液用冰水浴冷却后，向其中缓慢滴加二(三氯甲基)碳酸酯(2.78g,9.38mmol)的二氯甲烷(13mL)溶液，继续搅拌1小时，然后倒入冰水中，再用二氯甲烷萃取，干燥有机相，过滤，减压蒸馏，收集，所得粗产物经硅胶层析柱，用正己烷：二氯甲烷＝3:1洗脱，得到2.7g白色固体化合物4，产率50％。
(2)化合物3的制备：将284mg(0.76mmol)化合物4溶于8mL二氯甲烷中，向其中缓慢滴入乙二胺(228mg,1.9mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液，在室温下继续搅拌2小时，倒入水中，经萃取、干燥、减压蒸馏，收集，所得粗产物经硅胶层析柱，用二氯甲烷：甲醇＝10:1洗脱，得到196mg固体化合物3，产率70％。
(3)化合物2的制备：将4-溴-1,8-萘二甲酸酐(498.7mg,1.8mmol)，双(频哪醇)二硼(685.6mg，2.7mmol)，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(65.9mg，0.1mmol)和乙酸钾(265.0mg，2.7mmol)溶解于无水二恶烷(10mL)，氮气气氛下在90℃下反应10小时，将所得溶液冷却至室温，并用去离子水稀释，然后经萃取、干燥、减压蒸馏，所得粗产物经硅胶层析柱，用石油醚：二氯甲烷＝10:1洗脱，得到561.8mg固体化合物2，产率96％。
(4)基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别位点荧光探针分子1的合成：将化合物3(148mg,0.4mml)，化合物2(114mg,0.41mml)溶解在5mL无水乙醇中。在氮气保护下，回流8小时，减压蒸发溶剂，所得粗产物经硅胶层析柱，用二氯甲烷：甲醇＝80:1洗脱，得到产物189mg，产率75％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)9.16(d,J＝7.9Hz,1H),8.61(d,J＝6.6Hz,1H),8.57(d,J＝7.2Hz,1H),8.33(d,J＝7.2Hz,1H),7.84–7.79(m,1H),7.24(d,J＝8.8Hz,2H),6.65(s,2H),6.54(d,J＝7.4Hz,2H),5.45(t,J＝5.0Hz,1H),4.40(t,J＝5.7Hz,2H),3.67(dd,J＝11.1,5.4Hz,2H),2.92(s,12H),1.49(s,12H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ(ppm)164.66(s),156.24(s),149.00(s),135.41(s),135.21(s),134.20(s),131.19(s),130.07(s),128.59(s),128.11(s),127.46(s),127.20(s),124.70(s),122.58(s),111.47(s),111.02(s),84.75(s),40.90(s),40.04(s),39.72(s),25.14(s).HEMS(ESI):Calcd forC37H41N5O5S[M+H]+＝677.2952,found m/z 677.2956.其中，CDCl3为氘代三氯甲烷。相关谱图见图2～4。
实施例2
本实施例考察基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子对双氧水识别位点荧光检测的选择性。
采用乙醇：PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝2:8(v:v)溶液控制实验条件。
将亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物加入乙醇溶剂中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/L的溶液。
将样品瓶分为15组，每组各样品瓶分别加入20μmol/L的基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物荧光探针分子溶液，第一瓶溶液作为空白组，其它14组分别加入380μmol/L的H2O2、NO2 -、NO3 -、ONOO-、1O2、NO、·OH、SO3 2-、H2S、S2O5 2-、HSO3 -、Cys、Hcy、GSH溶液。在室温下配制完待测液后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。激发波长为460nm，发射波长为548nm。基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子对双氧水荧光选择性检测如图5a所示，可见基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子在548nm处仅对H2O2有明显的荧光增强现象，我们选用了在548nm处各个离子的荧光强度值做了一个柱形图(图5b)，图5b可以直观地看出探针对双氧水的荧光选择性非常好。
实施例3
本实施例考察基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子对次氯酸识别位点荧光检测的选择性。
采用乙醇：PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝2:8(v:v)溶液控制实验条件。
将亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物加入乙醇溶剂中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/L的溶液。
将样品瓶分为15组，每组各样品瓶分别加入20μmol/L的基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子溶液，第一瓶溶液作为空白组，其它14组分别加入70μmol/L的HClO、NO2 -、NO3 -、ONOO-、1O2、NO、·OH、SO3 2-、H2S、S2O5 2-、HSO3 -、Cys、Hcy、GSH溶液。在室温下配制完待测液后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。激发波长为620nm，发射波长为690nm。基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子对次氯酸荧光选择性检测如图6a所示，可见基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子在548nm处仅对HClO有明显的荧光增强现象，我们选用了在548nm处各个离子的荧光强度值做了一个柱形图(图6b)，图6b可以直观地看出探针对次氯酸的荧光选择性非常好。
实施例2和实施例3表明本发明基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子对双氧水和次氯酸同时表现出高度的荧光选择性。
实施例4
本实施例考察基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子对双氧水的定量荧光检测。
采用乙醇：PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝2:8(v:v)溶液控制实验条件。
将基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子配制成浓度为2μmol/L的溶液，将不同溶度的H2O2溶液加入其中，在室温下配制完待测液后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱，荧光测试光栅缝隙大小为5nm×5nm，图7为本发明基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子在含水溶液体系中随双氧水浓度变化的荧光光谱图。将荧光光谱548nm处的荧光强度与相应双氧水浓度进行拟合，在双氧水浓度为0μmol/L～380μmol/L范围内得到一拟合曲线(图8)，表明本发明基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子在含水溶液体系中可以定量检测双氧水浓度。
实施例5
本实施例考察基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子对次氯酸的定量荧光检测。
采用乙醇：PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝2:8(v:v)溶液控制实验条件。
将基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子配制成浓度为2μmol/L的溶液，将不同溶度的HClO溶液加入其中，在室温下配制完待测液后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。荧光测试光栅缝隙大小为5nm×5nm。图9为本发明基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子在含水溶液体系中随次氯酸浓度变化的荧光光谱图。将荧光光谱690nm处的荧光强度与相应次氯酸浓度进行拟合，在次氯酸浓度为0μmol/L～70μmol/L范围内得到一拟合曲线(图10)，表明本发明基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子在含水溶液体系中可以定量检测次氯酸浓度。
实施例4和实施例5表明本发明基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子在含水溶液体系中可以定量同时检测双氧水和次氯酸浓度。
实施例6
本实施例考察基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子在多细胞内同时对双氧水和次氯酸的双位点荧光识别。
首先用移液枪移去培养液，再用PBS缓冲溶液洗涤，重复上述操作三次。然后用浓度为20μmol/L的探针分子孵育24h。最后用移液枪移去探针溶液，用PBS缓冲溶液洗涤，重复上述操作三次。将孵育后的细胞在共聚焦激光扫描显微镜下进行荧光成像。本实验采用来自西南医科大学重点实验室的RAW264.7(小鼠巨噬细胞)，HIBEC(正常胆管细胞)，CT26(结肠癌细胞)，QBC939(胆管癌细胞)，HuCCT1(胆管癌细胞)进行荧光成像研究。拍摄条件：Green Channel：λex＝448nm,λem＝500-580nm，激光输出功率1％；Red Channel：λex＝638nm,λem＝650-730nm，激光输出功率5％。目镜放大倍数10X，物镜放大倍数20X。实验结果见图11。与正常细胞相比，CT26，QBC939和HuCCT1癌细胞在绿色荧光通道和红色荧光通道荧光显著增强，这说明在CT26，QBC939和HuCCT1癌细胞中H2O2和HClO的含量均高于正常细胞。上述表明探针分子在多细胞内可以同时对双氧水和次氯酸的双位点荧光识别，可实现对CT26，QBC939和HuCCT1癌细胞的有效监测。
实施例7
本实施例考察基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子在线虫体内对双氧水和次氯酸的双位点荧光识别。
用滴管吸取M9缓冲溶液(每升缓冲液中含有15.12克Na2HPO4·12H2O；3克KH2PO4；5克NaCl；0.25克MgSO4·7H2O)冲洗下来的洗培养皿中的线虫于离心管中，调制离心机的转速为3000r/min进行离心，离心后的线虫位于离心管的底部，除去上清液，重复上述操作三次。将线虫平均装入4个离心管中，分成4组，先向离心管中分别加入1mL的M9缓冲溶液，再加入10μL的基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子并在20℃下孵育1h，用离心机下进行离心后除去上层清液，重复上述操作3次，洗净探针。继续加入1mL的M9缓冲溶液，然后第一组不加H2O2和HClO，第二组只加76μmol/L的H2O2不加HClO，第三组只加14μmol/L的HClO不加H2O2，第四组既加76μmol/L的H2O2又加14μmol/L的HClO，在20℃下继续孵育1h，用离心机下进行离心后除去上层清液，重复上述操作3次，洗净H2O2和HClO。加入1mL的甲醛溶液孵育30min，用离心机进行离心后除去上层清液，重复上述操作3次，除去甲醛溶液，加入1mL的M9缓冲溶液。然后转移到载玻片上进行荧光成像实验。结果见图12。图12a1-a3可以观察到仅用探针处理的秀丽隐杆线虫几乎不显示荧光，用H2O2孵育，在绿色荧光通道有绿光，红色荧光通道没有荧光(图12b1-b3)，用HClO孵育，在红色荧光通道有红光，绿色荧光通道无荧光(图12c1-c3)，同时用H2O2和HClO孵育，在红色和绿色荧光通道均有荧光(图12d1-d3)。该实验表明本发明基于亚甲基蓝-萘酰亚胺衍生物的双识别荧光探针分子可以在线虫体内对H2O2和HClO进行双位点荧光识别。实验所用仪器为Olympus BX51荧光显微镜。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种双识别荧光探针分子，其特征在于，具有如下结构：
2.一种如权利要求1所述的双识别荧光探针分子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将亚甲基蓝和碳酸钠溶于蒸馏水和二氯甲烷中，搅拌，再缓慢加入硫代硫酸钠水溶液，继续搅拌至溶液变黄，将上述溶液冷却，向其中缓慢滴加二(三氯甲基)碳酸酯的二氯甲烷溶液，继续搅拌，然后倒入冰水中，再用二氯甲烷萃取，干燥有机相，过滤，减压蒸馏，收集，经硅胶层析柱，洗脱、分离、提纯，得到化合物4；
S2：将S1得到的化合物4溶于二氯甲烷中，向其中缓慢滴入乙二胺的二氯甲烷溶液继续搅拌，倒入水中，经萃取、干燥、减压蒸馏，收集，经硅胶层析柱，洗脱、分离、提纯，得到化合物3；
S3：将4-溴-1,8-萘二甲酸酐，双(频哪醇合)二硼，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和乙酸钾溶于无水二恶烷中，在氮气保护下高温反应，将所得溶液冷却至室温，并用去离子水稀释，经萃取、干燥、减压蒸馏，收集，经硅胶层析柱，洗脱、分离、提纯，得到化合物2；
S4：将S2得到的化合物3和S3得到的化合物2溶于无水乙醇中，在氮气保护下，回流，减压蒸发溶剂，经硅胶柱层析分离提纯得到如权利要求1所述的双识别荧光探针分子1。
3.根据权利要求2所述的一种双识别荧光探针分子的制备方法，其特征在于，在S1中，具体步骤为：将亚甲基蓝和碳酸钠溶于蒸馏水和二氯甲烷中，常温搅拌35分钟，然后向其中慢慢加入硫代硫酸钠水溶液，继续搅拌至溶液变黄，将上述溶液用冰水浴冷却后，向其中缓慢滴加二(三氯甲基)碳酸酯的二氯甲烷溶液，继续搅拌1小时，然后倒入冰水中，再用二氯甲烷萃取，干燥有机相，过滤，减压蒸馏，收集，经硅胶层析柱，洗脱、分离、提纯，得到化合物4；
或在S2中，具体步骤为：将S1得到的化合物4溶于二氯甲烷中，向其中缓慢滴入乙二胺的二氯甲烷溶液，在室温下继续搅拌2小时，倒入水中，经萃取、干燥、减压蒸馏，收集固体混合物，经硅胶层析柱，洗脱、分离、提纯，得到化合物3；
或在S3中，具体步骤为：将4-溴-1,8-萘二甲酸酐，双(频哪醇)二硼，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和乙酸钾溶于无水二恶烷中，氮气保护下在90℃下反应10小时，将所得溶液冷却至室温，并用去离子水稀释，经萃取、干燥、减压蒸馏，收集，经硅胶层析柱，洗脱、分离、提纯，得到化合物2；
或在S4中，具体步骤为：将S2得到的化合物3和S3得到的化合物2溶于无水乙醇中，在氮气保护下，回流8小时，减压蒸发溶剂，经硅胶柱层析分离提纯得到如权利要求1所述的双识别荧光探针分子1。
4.根据权利要求2或3所述的一种双识别荧光探针分子的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述硫代硫酸钠、亚甲基蓝、碳酸钠、二(三氯甲基)碳酸酯的物质的量比为6.66:1.72:6.66:1；所述洗脱剂为正己烷与二氯甲烷的混合物，其体积比为3:1。
5.根据权利要求2或3所述的一种双识别荧光探针分子的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述化合物4与乙二胺的物质的量比为1:2.5，所述洗脱剂为二氯甲烷与甲醇的混合物，其体积比为10:1。
6.根据权利要求2或3所述的一种双识别荧光探针分子的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐、双(频哪醇)二硼、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、乙酸钾的物质的量比为18:27:1:27，所述洗脱剂为石油醚与二氯甲烷的混合物，其体积比为10:1。
7.根据权利要求2或3所述的一种双识别荧光探针分子的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述化合物2与化合物3的物质的量比为1:1，所述洗脱剂为二氯甲烷与甲醇的混合物，体积比为80:1。
8.一种如权利要求1-7任一所述的双识别荧光探针分子用于同时检测双氧水和次氯酸。
9.根据权利要求8所述的用于同时检测双氧水和次氯酸的双识别荧光探针分子，其特征在于，所述双识别荧光探针分子用于检测乙醇水溶液、细胞内、线虫体内的双氧水和次氧酸含量。
10.根据权利要求8所述的用于同时检测双氧水和次氯酸的双识别荧光探针分子，其特征在于，所述乙醇水溶液中乙醇与水的体积比＝2：8。
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