CN103242195A - 一种荧光增强检测汞离子探针的合成及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种荧光增强型汞离子探针的制备方法和应用，具体为一种基于2-(2-乙烯氧基-4-二烷氨基-苯亚基)-丙二腈的制备和应用于汞离子的高灵敏检测。本发明的荧光探针合成简便、反应条件温和、易于纯化、合成收率高且水溶性较好，选择性较高，光学性能稳定。该探针分子在PBS(pH＝7.4)和DMSO混合溶液(体积比为95∶5)中最大吸收波长为446nm，荧光很弱；随含汞离子的加入，吸收波长由446nm蓝移到437nm；并且荧光光谱在波长为486nm处强度不断增强，最大增强为90倍。该荧光探针分子很适合在生物体中的应用，在生物医药化学、环境科学等领域都具有重要的实际应用价值。

Description

一种荧光增强检测汞离子探针的合成及其应用

技术领域

本发明涉及的是化学分析检测技术领域，具体涉及一种荧光增强检测汞离子荧光分子探针的制备方法和该荧光分子在检测汞离子方面的应用。

背景技术

汞是一种毒性强且在环境污染中相当普遍的重金属离子，例如汞在固体垃圾、工厂污水、矿山废水等环境污染中广泛存在。在自然界中，汞离子会被各种动植物吸收并通过食物链传入到人体从而对身体健康造成一系列有害影响。如大脑损伤、肾脏衰竭、神经系统及免疫系统损伤。尽管，汞离子会对环境保护和人体健康产生不良影响，它仍然被广泛的应用于工业生产过程中。因此，寻求快速、高灵敏高选择性的汞离子检测方法，使其应用于医药、环境、食品等众多领域是十分必要的。[J]J.Lumin.2009.Wang X，Zheng W，Liu GC，Lin H.A turn-onfluorescent chemosensor for Hg²⁺based on phenanthroline fluorophore.[J]EnvironmentInternational.2001，27，285-290.Harada M，Nakaishi J，Yasoda E，Pinheiro MCN，Oikawa T.Mercury pollution in the Tapajos River basin，Amazon：Mercury level of head hair and healtheffects.[J]Org.Lett.2006，8，3413-3416.Ki CS，Jun SK，Sang MP，Kee-choo C，Sangdoo A，Suk-kyv chang.Fluorogenic Hg²⁺Selective Chemodosimeter Derived from8-Hydroxyquinoline.[J]Org.Lett.2007，10，1481-1484.Zhu M，Yuan M，Liu X，Xu J，Lv J，Huang C，Liu H，Li YL，WangS，Zhu DB.Visible Near-Infrared Chemosensor for Mercury Ion.

目前，常用的汞化合物检测方法包括分光光度法、原子发射光谱法、原子吸收光谱法、高效液相色谱法、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、这些方法往往存在样品预处理复杂、仪器昂贵、分析周期长、检测费用昂贵等问题，已经难以适应汞离子检测的方便、灵敏度高、快捷等方面的要求。相对而言，荧光探针在对汞离子进行检测分析时，表现出来灵敏度高、成本低、样品处理方便等一系列优点而越来越得到人们的青睐。根据汞离子荧光探针的反应机理，可以被分为两类：一类是利用汞离子与一些杂原子的络合配位，基于这种机理的汞离子探针通常具有比较好的灵敏度，以及快速的响应时间；但它的选择性也比较差，往往容易受到其它离子的干扰。另一类是基于汞离子催化作用的荧光探针，其中最近汞离子促进乙烯醚基水解成羟基，从而改变荧光团的荧光，基于这种类型的汞离子荧光探针往往具有较好的灵敏度和较高的选择性，响应时间快、水溶性好等优点，具有十分重要的研究意义。[J]Org.Lett.2010，12，5310-5313.Dong M，Wang Y，Peng Y.Highly Selective Rationmetric FluorescentSensing for Hg²⁺and Au³⁺，Respectively，in Aqueous Media.[J]Org.Lett.2009.11.2740-2743.Suresh M，Mishra S，Mishra SK，Suresh E，Mandal AK，Shrivastav A，Das A.Resonance energytransfer approach and a new ratiometric Probe for Hg²⁺in aqueous media and living organism.[J]Org.Lett.2011，13，3422-3425.Mithun S，Basab R，Kyo HA.A“Reactive”RationmetricFluorescent Probe for Mercury Species.[J]J.Org.Chem.2012，77，9072-9078.Peng Y，Dong Y，Dong M，Wang Y.A Selective，Sensitive，Colorimetric，and Fluorescence Probe for RelayRecognition of Fluoride and Cu(II)Ions with“Off-On-Off”Switching in Ethanol-Water Solution.[J]Tetr.Lett.2010，51，3852-3854.Yong-Suk C，Kyo HA.A“turn-on”fluorescent probe thatselectively response to inorganic mercury species.[J]Chem.Comm.2012.48.8371-8373.Jiang J，Liu W，Cheng J，Yang L，Jiang H，Bai D，Liu W.A sensitive colorimetric and ratiometric fluorescentprobe for mercury species in aqueous solution and living cells.

发明内容

本发明的目的之一是提供一种合成简便、反应条件温和、成本较低的汞离子荧光探针的合成方法；目的之二是提供一种选择性好、灵敏度高、水溶性好的荧光增强的检测汞离子的荧光探针。

本发明使用荧光增强检测汞离子荧光分子探针，采用2-乙烯氧基-4-二烷氨基苯甲醛和丙二腈合成，乙烯氧基部分作为识别基团。

本发明解决问题采用的技术方案为，一种荧光增强检测汞离子的分子探针，具有式I中的通式：

式I

其中：：R₁，R₂为H，C_1-6直链烷基中的一种，R₃为H，甲基或乙基中的一种。

当式I中R₁，R₂为-CH₂CH₃，R₃为H原子时，本发明代表性的化合物的合成路线如下图所示：

(1)将4-二烷氨基水杨醛、碳酸钾和1，2-二溴乙烷加入到乙腈中，加热回流48小时后冷却到室温，抽滤出去固体物质，用乙腈洗涤，旋干滤液得到固体物质，用柱层析分离纯化得纯的2-(2-溴乙氧基)-4-二烷氨基苯甲醛。

(2)将2-(2-溴乙氧基)-4-二烷氨基苯甲醛溶于干燥的二甲基亚砜中，加入叔丁醇钾，25℃下搅拌4小时后，将反应物倒入到水中，用乙酸乙酯萃取，分离出有机层，分别用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水、水洗涤。无水硫酸钠干燥后过滤，蒸馏除去溶剂得到纯的2-乙烯氧基-4-二烷氨基苯甲醛。

(3)将2-乙烯氧基-4-二烷氨基苯甲醛和丙二腈溶于无水乙醇中，加入哌啶，室温下搅拌5小时后析出淡黄色沉淀物，抽滤并用乙醇洗涤，固体物质放置在空气中干燥得到纯的探针化合物。

在本说明书的实施例中更详细地说明了该探针的合成和检测方法。本发明的荧光分子探针使用方法没有特殊限制，通常可以将探针分子溶解在PBS(磷酸盐缓冲溶液，pH＝7.4)和DMSO的混合溶液(体积比＝95∶5)中，室温下进行测试。当加入汞离子时，由于汞离子催化乙烯氧基的水解成为羟基，从而对α，β-不饱和腈分子进行分子内的1，2-亲和加成，形成了亚胺阴离子中间物后，迅速从溶液中得到质子而形成了异香豆素类产物，使得荧光增强。

本发明荧光增强检测Hg²⁺荧光分子探针的具体特征如下：

该分子探针在PBS(磷酸缓冲液，pH＝7.4)和DMSO混合溶液(体积比为95∶5)中的溶解性较好，最大吸收波长为446nm，荧光信号较弱；随着汞离子的加入，探针分子在446nm处的最大吸收逐渐下降，同时437nm处出现一个逐渐增强的新的吸收峰；在荧光光谱中，486nm处出现较强的发射峰，并且随着汞离子浓度的增加，其荧光强度也随之增加，最大增强为90倍。在紫外灯的照射下，探针呈现出较强的蓝绿色荧光。

本发明所述的探针分子原料易得，合成产率较高，光学性能稳定，灵敏度较高，水溶性较好，对汞离子识别能力强，响应速度较快，响应范围为0-20μM，检测限低为1μM。因此该类型探针在生物化学、环境科学等领域具有实际的应用价值。

附图说明

图1-图7中，本发明的荧光探针的测试均在PBS(磷酸缓冲液，pH＝7.4)和DMSO混合溶液(体积比为95∶5)体系中进行。

图1为本发明的荧光探针(10μM)在加入汞离子(10μM)前后的紫外吸收光谱的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。

图2为本发明的荧光探针(10μM)在加入汞离子(10μM)后荧光发射光谱变化随时间的关系，横坐标为波长，纵坐标荧光强度。插入图片为486nm处荧光强度变化随时间的关系，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。

图3为本发明的荧光探针(10μM)在加入不同浓度的汞离子时，荧光发射光谱随汞离子浓度增加的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图4为本发明的荧光探针(10μM)在加入不同浓度的汞离子时，荧光强度比值和汞离子浓度的线性关系，横坐标为汞离子的浓度，纵坐标为荧光强度。

图5为本发明的荧光探针(10μM)在加入不同金属离子：Na⁺，Ca²⁺，Cd²⁺，Fe³⁺，Ag⁺，Co²⁺，Pb²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cr³⁺，Mg²⁺，Ba²⁺，Al³⁺，Mn²⁺，Ni²⁺，Hg²⁺后的荧光发射光谱的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图6为本发明的荧光探针(10μM)在加入不同金属离子：Na⁺，Ca²⁺，Cd²⁺，Fe³⁺，Ag⁺，Co²⁺，Pb²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cr³⁺，Mg²⁺，Ba²⁺，Al³⁺，Mn²⁺，Ni²⁺，Hg²⁺后的柱形图，横坐标为金属离子种类，纵坐标为荧光强度。

图7为本发明的荧光探针(10μM)在其它竞争离子Na⁺，Ca²⁺，Cd²⁺，Fe³⁺，Ag⁺，Co²⁺，Pb²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cr³⁺，Mg²⁺，Ba²⁺，Al³⁺，Mn²⁺，Ni²⁺存在下加入汞离子前后的荧光强度变化，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图8为本发明合成的荧光探针(10μM)在不同pH条件下加入汞离子(10μM)前后荧光强度的变化，其中纵坐标为荧光强度，横坐标为pH。

图9为本发明合成的荧光探针(10μM)在pH＝4不同时间条件下的荧光强度，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图10为本发明合成的荧光探针(10μM)在pH＝4时加入汞离子后不同时间条件下荧光强度，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。插入图片为探针在pH＝4时加入汞离子后不同时间条件下荧光强度，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。

图11为本发明合成的荧光探针(10μM)在pH＝8时加入汞离子后不同时间条件下荧光强度，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。插入图片为探针在pH＝8时加入汞离子后不同时间条件下荧光强度，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。

图12为本发明合成的分子荧光探针的核磁共振氢谱。

具体实施方式

实施例1：2-(2-溴乙氧基)-4-二乙氨基苯甲醛的制备

将4-二乙氨基水杨醛(0.965g，5mmol)、碳酸钾(1.383g，20mmol)和1，2-二溴乙烷(9.4g，50mmol)加入到15mL的乙腈中，加热回流48h后，冷却至室温，过滤除去K₂CO₃，用乙腈进行洗涤，蒸馏除去溶剂，柱层析分离(体积比6∶1的石油醚∶乙酸乙酯为洗脱剂)得淡黄色固体0.780g(收率：52％)，即为2-(2-溴乙氧基)-4-二乙氨基苯甲醛。

实施例2：2-乙烯氧基-4-二乙氨基苯甲醛的制备

将2-(2-溴乙氧基)-4-二乙氨基苯甲醛(300mg，1mmol)溶于10mL干燥的二甲基亚砜中，加入叔丁醇钾(128mg，1.1mmol)在25℃下搅拌4小时，用薄层色谱监测反应进程。反应结束后，将反应液倒入到70mL水中，用乙酸乙酯(2x75mL)萃取两次，分离出有机层，分别用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水水洗涤。分离有机相，无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离(体积比6∶1的石油醚∶乙酸乙酯为洗脱剂)得淡黄色油状液体0.103g(收率：47％)，即为2-乙烯氧基-4-二乙氨基苯甲醛。

实施例3：分子荧光探针的制备

将2-乙烯氧基-4-二乙氨基苯甲醛(123mg，0.561mmol)和丙二腈(75mg，1.137mmol)溶于7mL无水乙醇中，加入哌啶(20μL，0.202mmol)，室温下搅拌5h后，析出浅黄色固体，抽滤置于空气中干燥，得到产物113.8mg(收率：72.09％)，即为探针分子。

HNMR(400MHz，CDCl₃)：δ_ppm＝1.33(6H，t，J＝8Hz)，3.47(4H，q，J＝8Hz)，4.65(1H，dd，J＝4，1.6Hz)，4.92(1H，dd，J＝1.6，1.6Hz)，6.22(1H，d，J＝2.4Hz)，6.66(1H，dd，J＝2.4，2.4Hz)，6.95(1H，dd，J＝6，5.6Hz)，7.09(1H，s)，8.06(1H，d，J＝9.6Hz).

实施例4：荧光增强检测汞离子荧光探针的应用

将该荧光探针溶于DMSO中，加入PBS磷酸缓冲液(pH＝7.4)，制配成10×10^-6M(体积比PBS∶DMSO＝95∶5)的溶液，测试其紫外吸收光谱和荧光光谱变化。图1-图11表明，探针对含汞离子具有很高的选择性，随着汞离子浓度的增加其紫外光谱和荧光光谱发生明显变化，荧光强度增强90倍，并且不受其它一些金属离子的影响，如：Na⁺，Ca²⁺，Cd²⁺，Fe³⁺，Ag⁺，Co²⁺，Pb²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cr³⁺，Mg²⁺，Ba²⁺，Al³⁺，Mn²⁺，Ni²⁺。在上述干扰离子存在的条件下，探针对含汞离子仍具有良好的选择性和灵敏度。

Claims (5)

1.本发明涉及一种荧光增强检测汞离子探针的制备方法以及该荧光分子探针在检测汞离子方面的应用，其特征是具有以下化学分子结构通式：

所述检测汞离子的荧光探针是以2-(2-乙烯氧基-4-二烷氨基-苯亚基)-丙二腈为荧光团，乙烯氧基为汞离子的识别基团的化合物。其中：R₁，R₂为H，C_1-6直链烷基中的一种，R₃为H，甲基或乙基中的一种。

2.根据权利要求1所述的荧光分子探针的合成方法，其制备方法如下：

1)将4-二烷氨基水杨醛、碳酸钾和1，2-二溴乙烷加入乙腈中，加热回流。反应完毕后，冷却到室温，抽滤并用乙腈进行洗涤，旋转蒸发除去溶剂，柱层析分离纯化。得到产物即为2-(2-溴乙氧基)-苯甲醛。

2)将步骤1)中所得的2-(2-溴乙氧基)-4-二烷氨基苯甲醛溶于二甲基亚砜中，加入叔丁醇钾，25℃下搅拌4小时后，将反应液倒入到水中，乙酸乙酯萃取，分离出有机层，分别用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水、水洗涤。分离收集有机相并用无水硫酸钠干燥，柱层析分离纯化，得到产物2-乙烯氧基-4-二烷氨基苯甲醛。

3)将步骤2)中所得的2-乙烯氧基-4-二烷氨基苯甲醛和丙二腈溶于无水乙醇中，加入哌啶，室温搅拌5小时后，析出淡黄色物质，抽滤后用乙醇洗涤，放置在空气中晾干，得到纯的荧光探针化合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：反应步骤1)中采用4-二烷氨基水杨醛，所用的溶剂为乙腈或者丙酮中的一种。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：反应步骤3)中采用的溶剂可以为干燥的二甲基亚砜或四氢呋喃中的一种。

5.权利要求1所述的荧光分子探针的应用，其特征在于：所选用的汞离子为氯化汞、硝酸汞、硫酸汞等汞离子的无机盐。

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