CN109370573B

CN109370573B - 一种二价汞离子和温度检测的荧光探针、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN109370573B
Application number: CN201811494336.2A
Authority: CN
Inventors: 文丹; 喻艳华; 邓宣凯; 舒婷婷; 杨智慧
Original assignee: Jianghan University
Current assignee: Jianghan University
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2038-12-07
Also published as: CN109370573A

Abstract

本发明公开了一种二价汞离子和温度检测的荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针是一种以罗丹明为荧光信号基团，基于螺酰胺环为识别基团的荧光探针，用于检测汞离子的同时，也可用于温度的检测，可克服电磁干扰的误差，灵敏度高，信号非常稳定。

Description

一种二价汞离子和温度检测的荧光探针、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及荧光小分子探针检测阳离子和温度传感领域，具体是一种以罗丹明为荧光信号基团，基于螺酰胺环“开-关”机理检测二价汞离子和温度传感的荧光探针的合成方法以及在含水体系中检测二价汞离子和检测温度的应用。

背景技术

汞离子（Hg²⁺）是一种极具生理毒性的化学物质，可以通过皮肤、消化道或呼吸道直接进入人体，也可以在环境中积聚，并通过在食物链中极强的富集能力最终进入人体，从而毒害人的中枢神经系统、口腔、呼吸系统、肾脏、血液、眼睛以及皮肤等，危害性非常大。Hg²⁺中毒的机理尚未完全清楚，目前被广泛接受的Hg²⁺产生毒性的基础是Hg-S反应。Hg²⁺可与体内蛋白质中某些基团（如巯基）结合，使细胞内许多代谢（如能量的生成、蛋白质和核酸的合成等）受到影响，从而影响了细胞的功能和生长。Hg²⁺具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性，这使其成为目前全球最引人关注的环境污染物之一。

但是，随着科技的发展，金属汞及其化合物被广泛应用于化学、医药、冶金、军事及其他精密高新科技领域。在汞的总用量中，化合物状态的汞约占70%。大量使用汞的化合物必然会导致汞离子对环境的污染和人类健康的危害，因此发展快速、高效且应用广泛的检测汞离子的方法有着非常重大的意义。传统检测汞离子的方法主要有：分光光度法、原子发射光谱法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法和二硫腙比色法，这些检测技术不仅依赖大型仪器设备，成本较高，处理过程繁琐耗时，而且灵敏度和选择性较低，不能满足金属离子痕量分析的要求。因此，发展易于操作，选择性好，灵敏度高，成本低廉的检测汞离子的方法具有重大意义。

近年来，利用荧光分子探针技术检测金属离子成为研究的热点之一，其具有检测方便，灵敏度高，选择性好，可实时、在线、原位检测等优势，被广泛应用于生命科学、环境科学等领域。荧光分子探针用于检测离子主要原理是以荧光光谱为手段，探针与待检测离子通过化学反应或者络合等结合后，改变探针了荧光基团的结构，导致其荧光性质发生改变，通过荧光信号的变化实现对待检测离子的定性以及定量分析。通过这个原理，设计合成了很多汞离子荧光探针。但是很多探针合成方法复杂，成本高，有些检测体系为有机溶剂，灵敏度也不够高，此外有些报道探针选择性也不够好，银离子和铜离子容易造成干扰，因此，开发灵敏度高、选择性好，可在水相中检测汞离子的荧光探针具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种二价汞离子和温度检测的荧光探针、制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种二价汞离子和温度检测的荧光探针，是一种以罗丹明为荧光信号基团，基于螺酰胺环为识别基团的荧光探针，其结构式如下：

二价汞离子和温度检测的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤01、合成3-（哌嗪）-罗丹明B酰肼；

步骤02、合成3-（4-(2,1,3-苯并噻二唑-4-羰基) 哌嗪）-罗丹明B酰肼：

在100 ml单口瓶中，加入化合物1（0.585 g，1.246 mmol），2,1,3-苯并噻二唑-4-甲酸（0.224 g, 1.246 mmol），碳二亚胺（0.359 g，1.869 mmol），4-二甲氨基吡啶（0.0374g，0.249 mmol）和CH₂Cl₂（25 mL），回流6 h，反应结束后，减压蒸馏浓缩，硅胶柱层析分离提纯（二氯甲烷：甲醇= 200:1，二氯甲烷：甲醇= 150:1，二氯甲烷：甲醇= 100:1，二氯甲烷：甲醇：三乙胺= 100:1:0.1），得黄色固体（0.4 g, 0.633 mmol），收率为51%。

作为本发明进一步的方案：合成3-（哌嗪）-罗丹明B酰肼的方法包括如下步骤：

（1）、取干燥的100 ml的两口瓶，瓶内置换成氮气，加入间羟基苯基哌嗪（1.78g,10.0 mmol），2-(4-二乙胺基)-2-羟基)-苯甲酸（3.13 g, 10.0 mmol）和三氟乙酸（20 mL），加热回流搅拌24 h，随后减压蒸馏除去有机溶剂，得到红色的残留物；

（2）、加入乙醇（30 mL）、乙二胺（15 mL），加热回流搅拌6 h，反应完全后，再通过减压蒸馏除去乙醇和未反应完的乙二胺，加入水相，二氯甲烷萃取，合并有机相（分三次萃取，总计约250 mL），无水MgSO₄干燥，过滤，浓缩；

（3）、硅胶柱层析梯度洗脱，分离提纯（二氯甲烷：甲醇= 200:1，二氯甲烷：甲醇=150:1，二氯甲烷：甲醇= 100:1），得到乳白色固体（3.66 g, 7.78 mmol），收率为77.8%。

作为本发明进一步的方案：所述二价汞离子和温度检测的荧光探针在含水体系中检测汞离子和温度中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的荧光探针，检测汞离子的同时，也可用于温度的检测，可以克服电磁干扰的误差，灵敏度高，信号非常稳定。

附图说明

图1为二价汞离子和温度检测的荧光探针制备方法的原理图；

图2为BR溶液中加入不同阳离子时的紫外吸收谱图；

图3为BR溶液中加入不同阳离子时的荧光发射谱图；

图4为BR溶液中加入不同阳离子时在日光灯照射下的结果图；

图5为BR溶液中加入不同阳离子时在手提紫外灯（365 nm）照射下的结果图；

图6为BR溶液中加入不同Hg²⁺浓度下紫外吸收光谱图，其中插图为A_{553 nm}与Hg²⁺浓度关系曲线；

图7为BR溶液中加入不同Hg²⁺浓度下荧光发射光谱，其中插图为I与Hg²⁺浓度关系曲线；

图8为BR荧光强度与Hg²⁺浓度的线性图；

图9为BR在与其它阴离子共存时对Hg²⁺响应时荧光强度变化柱状图；

图10为BR与BR+Hg²⁺在pH 值3.6-12 范围内577nm处荧光强度；

图11为BR试剂条浸泡在不同阳离子后在手提式紫外灯（365 nm）照射下的结果图；

图12为BR试剂条浸泡在不同浓度汞离子溶液后在手提式紫外灯（365 nm）照射下的结果图；

图13为BR+Hg²⁺在577 nm处荧光强度与温度的关系曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，实施例一，二价汞离子和温度检测的荧光探针分子，是以罗丹明为荧光信号基团，基于螺酰胺环为识别基团的荧光探针。其化学名称为3-（4-(2,1,3-苯并噻二唑-4-羰基) 哌嗪）-罗丹明B酰肼，标记为BR。

二价汞离子和温度检测的荧光探针的制备方法包括以下步骤：

步骤01、合成3-（哌嗪）-罗丹明B酰肼（1），包括如下步骤：

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.94 (t, 1H), 7.46 (m, 1H), 7.08(t, 1H),6.68 (s, 1H), 6.54(m, 2H), 6.47-6.42 (m, 2H), 6.31 (m, 1H), 3.63 (s, 2H),3.34 (q, J=8.0 Hz, 4H), 3.20 (d, J= 4.0 Hz,4H), 3.04 (d, J=4.0 Hz, 4H), 1.17(t, J= 8.0 Hz, 6H). 13C NMR(100 MHz, CDCl₃) δ 166.25, 153.65, 153.49, 152.52,151.32, 148.96,132.64, 129.86, 128.30, 128.03, 127.91, 123.80, 123.05,111.79, 108.86,108.24, 104.22, 102.42, 97.95, 65.74, 49.19, 45.77, 44.38,12.60.

步骤02、合成3-（4-(2,1,3-苯并噻二唑-4-羰基) 哌嗪）-罗丹明B酰肼（2）：

在100 ml单口瓶中，加入化合物1（0.585 g，1.246 mmol），2,1,3-苯并噻二唑-4-甲酸（0.224 g, 1.246 mmol），碳二亚胺（0.359 g，1.869 mmol），4-二甲氨基吡啶（0.0374g，0.249 mmol）和CH₂Cl₂（25 mL），回流6 h，反应结束后，减压蒸馏浓缩，硅胶柱层析分离提纯（二氯甲烷：甲醇= 200:1，二氯甲烷：甲醇= 150:1，二氯甲烷：甲醇= 100:1，二氯甲烷：甲醇：三乙胺= 100:1:0.1），得黄色固体（0.4 g, 0.633 mmol），收率为51%。¹H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.11– 8.08 (m, 1H), 7.98 – 7.88 (m, 1H), 7.75 – 7.62 (m, 2H),7.51 – 7.37 (m, 2H), 7.13 – 7.02 (m, 1H), 6.68 (m, 1H), 6.61 – 6.49 (m, 2H),6.50 – 6.36 (m, 2H), 6.31 (m, 1H), 4.07 (m, 2H), 3.41 (m, 4H), 3.34 (q, J =7.1 Hz, 4H), 3.18 (m, 2H), 1.16 (t, J = 7.1 Hz, 6H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl3)δ 166.25, 166.18, 154.66, 153.58, 153.52, 151.74, 151.30, 151.24, 149.01,132.68, 129.88, 129.42, 129.15, 128.39, 128.32, 128.18, 128.06, 123.78,123.12, 122.99, 112.29, 110.00, 108.34, 104.19, 103.20, 97.92, 65.60, 49.09,48.56, 47.09, 44.39, 41.94, 12.59。

实施例二，BR荧光探针对汞离子的识别性能研究

1、BR荧光探针对汞离子选择性的研究

无水甲醇配制BR（10^-3 mol·L^－１）储备液，超纯水配制Ag⁺、Ba²⁺、 Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、K⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni⁺、Zn²⁺储备液（10^-2 mol·L^－１），配制0.02 mol·L^－１的HEPES缓冲液（pH=7.2）。首先在比色皿中加入HEPES缓冲液（250μL）和无水甲醇（2230μL）的混合溶剂（V/V = 1:9），然后加入的BR储备液（20μL），检测BR溶液的紫外吸收光谱和荧光发射光谱，分别加入的离子储备液（20μL），检测其紫外吸收光谱和荧光发射光谱（λex=520nm），观察荧光探针BR对各种阳离子的相应情况。

图2为BR（HEPES缓冲溶液和无水甲醇V / V = 1:9，8 μmol·L^-1）溶液中加入不同阳离子（80 μmol·L^-1）时的紫外吸收谱图（T=25℃），结果表明，BR在HEPES缓冲溶液和无水甲醇（V / V = 1:9，pH=7.2）作为溶剂的条件下，无紫外特征吸收峰，加入Hg²⁺后，在553 nm处出现显著的吸收峰，此外，加入Cu²⁺后，在553 nm处出现较弱的吸收峰。而加入其它阳离子，BR的紫外吸收光谱没有明显变化。图3为BR（HEPES缓冲溶液和无水甲醇V/V = 1:9，8μmol·L^-1）溶液中加入不同阳离子（80 μmol·L^-1）时的荧光发射谱图（λ_ex = 520 nm）（T=25℃），以520 nm作为激发波长，BR并无特征发射峰，加入Hg²⁺后，在577 nm处出现显著的荧光发射峰，而加入其它阳离子，BR无特征发射峰，在日光照射下，Hg²⁺可以使BR由无色变为紫红色，Cu²⁺也可是BR的颜色出现微弱变红，其它阳离子则不会使BR溶液的颜色发生任何变化。此外，在365nm紫外灯照射下，加入Hg²⁺的溶液出现橙红色荧光，而其它离子溶液没有任何变化，如图4、5，这些结果表明BR荧光探针对Hg²⁺有较高的的选择性。

2、BR荧光探针对汞离子的滴定研究

无水甲醇配制BR（10^-3 mol·L^-1）储备液，去离子水配制Hg²⁺储备液（10^-2 mol·L^-1）。比色皿中加入HEPES缓冲液（250 μL）和无水甲醇（2230 μL）的混合溶剂（V / V = 1:9），然后加入的BR储备液（20 μL），检测BR溶液的紫外吸收光谱和荧光发射光谱，再加入Hg²⁺储备液（0.4 μL，0.2 equiv.），摇晃均匀后（2 min）检测其紫外吸收光谱和荧光发射光谱，重复此操作，直至加入8.0当量的Hg²⁺溶液；随后，再加入Hg²⁺储备液（2 μL，1 equiv.），摇晃均匀后（2 min）检测其紫外吸收光谱和荧光发射光谱，重复此操作，直至加入11.0当量的Hg²⁺溶液；随后，再加入Hg²⁺储备液（4μL，2 equiv.），摇晃均匀后测其紫外吸收光谱和荧光发射光谱，重复此操作，直至加入15.0当量的Hg²⁺溶液。

从图6可知随着Hg²⁺浓度增加，BR在553 nm处的吸收峰逐渐增强，直至加入63 μmol·L^－１Hg²⁺时达到平衡。同样，BR在577 nm处的荧光强度处很弱，随着Hg²⁺的加入，荧光强度逐渐增强，直至加入63μmol·L^-1Hg²⁺时达到平衡。当Hg²⁺的浓度为1.6-32μmol·L^-1时，BR的荧光强度与Hg²⁺的浓度表现出较好的线性关系，拟合得到的线性方程为y = 7.21849 ×10⁶ x -4.80355（R² = 0.99931），如图8，结果表明，可用BR荧光探针定量检测水溶液中Hg²⁺的浓度。

3、BR荧光探针对Hg²⁺最低检测限的研究

当Hg²⁺的浓度为1.6-32μmol·L^-1时，BR的荧光强度与Hg²⁺的浓度表现出较好的线性关系，拟合得到的线性方程为y = 7.21849 × 10⁶ x -4.80355（R² = 0.99931）依据“检测限＝ 3σ／k”可计算BR对Hg²⁺的检测限，其中σ为标准平均偏差，k为线性拟合直线的斜率．测15次BR（8 μmol·L^－１）的荧光强度，计算标准偏差σ 为0.42565，k为7.21849 × 10⁶．通过上述公式计算得出BR对Hg²⁺的检测限为0.17μM。

4、BR荧光探针在复杂环境中检测Hg²⁺研究

比色皿中加入HEPES缓冲液（250μL）和无水甲醇（2230μL）的混合溶剂（V/V = 1:9），然后加入的BR储备液（20μL），检测BR溶液的紫外吸收光谱和荧光发射光谱，然后加入除汞离子之外的阳离子储备液，例如钾离子（20μL），充分摇匀，检测其紫外吸收光谱和荧光发射光谱，最后加入Hg²⁺储备液（20μL），摇匀，检测其紫外吸收光谱和荧光发射光谱，其它每个阳离子重复上述操作。

图9为BR（HEPES缓冲溶液和无水甲醇V/V = 1:9，8μmol·L^-1）溶液中加入不同Hg²⁺浓度（0-60μmol·L^-1）下荧光发射光谱，插图：I与Hg²⁺浓度关系曲线；（T=25 ℃）结果表明，Hg²⁺在与其他阳离子共存的情况下依然可以使BR在553 nm处出现较强紫外吸收峰，同时使BR在577 nm处出现较强荧光发射峰，上述结果说明BR对Hg²⁺检测具有很好的抗干扰能力，其他阳离子不会对检测结果带来干扰。

5、BR在不同pH 值的含水体系中对Hg²⁺的检测研究

分别配置NaAc-HAc pH = 3.6、4.0、5.0和HEPES溶液pH = 6.0、7.2、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的缓冲溶液各10 mL，浓度为0.02 mol·L^－１。比色皿中加入pH = 3.6的缓冲溶液（250μL）和无水甲醇（2230μL）的混合溶剂（V/V = 1:9），然后加入的BR储备液（20μL）和Hg²⁺储备液（20μL），振荡10 s，放置2 min后检测其紫外吸收光谱和荧光发射光谱（测三次，取其平均值）。每个不同的缓冲溶液重复此操作。

图10为BR与BR+Hg²⁺在pH 值3.6-12 范围内577 nm处荧光强度；（T=25 ℃），实验结果表明，在不同的pH体系中，BR在577 nm处的无荧光发射峰，且保持稳定，pH为3.6－12范围内，Hg²⁺可使BR在577 nm处出现较强荧光发射峰，且荧光强度保持较为稳定，结果表明，BR在pH 值3.6-12 范围内可以有效地识别Hg²⁺。

6、BR用于实际水样的检测

分别用饮用水和矿泉水配制Hg²⁺储备液（10^-2mol·L^－１）。比色皿中加入HEPES缓冲液（250μL）和无水甲醇（2230μL）的混合溶剂（V/V =1:9），然后加入的BR储备液（20 μL），检测BR溶液的紫外吸收光谱和荧光发射光谱，然后加入饮用水配制的Hg²⁺储备液（2.4μL，最终Hg²⁺浓度9.6μmol·L^-1），检测其荧光发射光谱（分别测三次）；不同浓度Hg²⁺和不同水样重复上述操作。实验结果表1所示，测得的汞离子浓度与实际加入的汞离子浓度接近，相对标准平均偏差均小于5%，因此BR可有效的用于实际水样中的Hg²⁺测定。

表1，BR在不同水样中检测汞离子的实验结果

7、BR荧光探针用于试纸条测定Hg²⁺的研究

将大小相同的滤纸浸泡于BR的甲醇溶液（100μmol·L^-1）中，时间为5 min，随后取出自然晾干，制成试纸条待用。分别用水和无水甲醇的混合溶液（V / V = 1:9）配制各种待测阳离子的储备液（100μmol·L^-1）。此外，用水和无水甲醇的混合溶液（V / V = 1:9）配制100μmol·L^-1，200μmol·L^-1和500μmol·L^-1Hg²⁺溶液，将晾干后的试纸条浸泡于不同阳离子溶液和不同浓度的Hg²⁺溶液中，2 min后取出自然晾干，在365 nm紫外灯照射下观察试纸的颜色变化。

如图11、12所示分别为BR试剂条浸泡在不同阳离子（500 μmol·L^－１，水和无水甲醇（V/V ＝ 1/9）溶液）后在手提式紫外灯（365nm）照射下的照片，阳离子从左到右分别为：空白、Hg²⁺、Ag⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Fe³⁺、K⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Zn²⁺；（T=25 ℃）、BR试剂条浸泡在不同浓度汞离子溶液（水和无水甲醇（V/V＝1/9））后在手提式紫外灯（365nm）照射下的照片，汞离子浓度从左到右分别为：100μmol·L^－１，200μmol·L^－１、500μmol·L^－１和空白；（T=25 ℃）在不同离子溶液中浸泡过的试纸，只有Hg²⁺可以富集BR荧光探针试纸发出橙红色荧光，而其它离子则无响应。此外随着Hg²⁺浓度的增加，荧光强度相应增强。结果表明BR荧光探针可制成试纸用于Hg²⁺的定性检测。

实施例三，BR荧光探针对温度的检测

无水甲醇配制BR储备液（10^-3 mol·L^-1），去离子水配制Hg²⁺储备液（10^-2 mol·L^-1）。比色皿中加入HEPES缓冲液（250μL）和无水甲醇（2230 μL）的混合溶剂（V / V = 1:9），然后加入的BR储备液（20μL）和Hg²⁺储备液（20μL），摇晃均匀后在不同温度下（温度范围10-45℃）检测其荧光发射光谱。

如图13所示，随着温度的增强，BR+Hg²⁺体系的荧光强度逐渐减弱，并呈现出良好的线性关系（R² = 0.99075），表明BR+Hg²⁺体系可用于温度的检测。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种二价汞离子和温度检测的荧光探针，其特征在于：是一种以罗丹明为荧光信号基团，基于螺酰胺环为识别基团的荧光探针，其结构式如下：

2.一种基于权利要求1所述的二价汞离子和温度检测的荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤01、合成3-(哌嗪)-罗丹明B酰肼；

步骤02、合成3-(4-(2,1,3-苯并噻二唑-4-羰基)哌嗪)-罗丹明B酰肼：

在100ml单口瓶中，加入3-(哌嗪)-罗丹明B酰肼、2,1,3-苯并噻二唑-4-甲酸、碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和CH₂Cl₂，回流6h，反应结束后，减压蒸馏浓缩，硅胶柱层析分离提纯。

3.根据权利要求2所述的二价汞离子和温度检测的荧光探针的制备方法，其特征在于：合成3-(哌嗪)-罗丹明B酰肼的方法包括如下步骤：

(1)、取干燥的100ml的两口瓶，瓶内置换成氮气，加入间羟基苯基哌嗪，2-(4-二乙胺基)-2-羟基-苯甲酸和三氟乙酸，加热回流搅拌24h，随后减压蒸馏除去有机溶剂，得到红色的残留物；

(2)、加入乙醇、乙二胺，加热回流搅拌6h，反应完全后，再通过减压蒸馏除去乙醇和未反应完的乙二胺，加入水相，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水MgSO₄干燥，过滤，浓缩；

(3)、硅胶柱层析梯度洗脱，分离提纯，得到乳白色固体。

4.根据权利要求1所述的一种二价汞离子和温度检测的荧光探针在含水体系中检测汞离子和温度中的应用。