CN115490700B - 一种快速检测亚硝酸根离子的荧光探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测亚硝酸根离子的荧光探针及其应用，荧光染料罗丹明800和5‑氨基吲哚在三乙胺和乙腈溶液中反应得到具有亮红色的荧光探针，所述荧光探针的结构式为荧光探针在酸性条件下会与亚硝酸根离子发生亚硝化反应，导致探针的共轭体系减小，荧光猝灭。所述荧光探针能与亚硝酸根在3min内发生特异的快速识别反应引起体系荧光的猝灭，基于此，构建了高灵敏高选择的亚硝酸根快速测定方法，该方法可以能准确的检测环境和食品中的亚硝酸根。

Description

一种快速检测亚硝酸根离子的荧光探针及其应用
技术领域
本发明涉及荧光探针技术领域，具体涉及一种快速检测亚硝酸根离子的荧光探针及其应用。
技术背景
亚硝酸盐(NO2 -)是一种存在于环境的常见污染物，同时也作为食品着色剂、抑菌剂、抗氧化剂而广泛地应用于食品工业中，以延长食品的储存时间，改善其风味口感。然而，当人体日常摄入的亚硝酸盐含量超过一定的限量标准时会对人体造成巨大的损伤，诱发一些毁灭性的疾病，如：胃癌、食道癌、中枢神经系统先天性缺陷，亚硝酸盐还会在内环境为酸性的环境下与胺或亚胺类化合物发生反应生成致癌的亚硝胺。环境和食品中的亚硝酸根浓度都被严格限制。构建亚硝酸根的快速检测方法，对于食品和环境安全监管具有重要意义。
荧光探针法具有高灵敏、高选择、快速等特点，在亚硝酸根的检测中引起了广大科研工作者的关注。然而，目前现有文献中报道的亚硝酸根荧光探针一般需要长达30min的反应响应时间，同时在检测的过程中受一些常见离子的干扰，这大大限制了探针的实际应用。开发快速、高选择的亚硝酸根探针是该领域需要继续深入探讨的问题。
发明内容
针对现有技术中亚硝酸根离子检测响应时间长、易受干扰的技术问题，本发明提出了一种快速检测亚硝酸根离子的荧光探针及其应用，利用荧光探针对食品和饮用水中常见阴、阳离子的选择性差异及探针与亚硝酸根离子的快速反应，实现对食品及饮用水中亚硝酸根离子的特异性识别和快速检测。
实现本发明的技术方案是：
一种快速检测亚硝酸根离子的荧光探针，所述荧光探针的结构式为
所述荧光探针的制备方法包括以下步骤：将罗丹明800和5-氨基吲哚置于圆底烧瓶中，用乙腈和三乙胺作为反应溶剂，在室温下搅拌，反应结束后，将反应液重结晶并用柱色谱法进行分离提纯，得到荧光探针的纯品。
所述罗丹明800与5-氨基吲哚的物质的量之比为1:5。
所述乙腈和三乙胺的体积比为3.3:1。
在所述分离提纯的步骤中，采用二氯甲烷和无水甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，所述二氯甲烷和无水甲醇的体积比分别为150:1、100:1、50:1和20:1，收集20:1的洗脱液。
利用罗丹明800和5-氨基吲哚制备荧光探针的合成路线如下：
所述的荧光探针在检测亚硝酸根离子中的应用。
采用所述荧光探针检测亚硝酸根离子时，通过荧光光谱法进行检测，观察荧光探针与亚硝酸根离子反应前后的荧光光谱变化及溶液颜色变化。
荧光光谱变化：在盐酸缓冲(0.1mol/L，pH＝1)体系中，10μM荧光探针和8μM的NO2 -作用后，以578nm为激发波长时，在601nm处的荧光迅速猝灭，3min即可达到响应平台；以578nm为激发波长时，在含有6μM荧光探针的盐酸缓冲(0.1mol/L，pH＝1)体系中，分别加入不同浓度的NO2 -，于室温下放置3min后测试荧光光谱，在601nm处的荧光逐渐猝灭，且荧光强度的变化量△F与NO2 -的浓度具有很好的线性关系。
溶液颜色变化：在盐酸缓冲(0.1mol/L，pH＝1)体系中，加入探针储备液使荧光探针的浓度为6μM，再分别加入不同浓度的NO2 -，室温下放置3min后，在日光下观察到加入NO2 -后探针溶液由亮粉红色变为紫色。
所述荧光探针用于饮用水和食品中亚硝酸根离子的检测。
所述荧光探针在制备亚硝酸根离子检测用试纸条中的应用，将滤纸条浸泡在荧光探针浓度为10μM的pH＝1的盐酸溶液中，30min后取出，自然风干，即得亚硝酸根离子检测用试纸条，将所述试纸条分别浸泡在含有不同浓度NO2 -的溶液中，10s后取出，在365nm紫外灯下观察到：试纸条颜色由粉红色变为紫色，并且随着亚硝酸根离子浓度的增大，试纸条的紫色越来越深，可根据试纸条颜色的改变对溶液中亚硝酸根离子的含量进行半定量分析。
本发明的有益效果是：
(1)本发明制备的荧光探针中的氨基和罗丹明800母体间形成p-π共轭，使共轭体系延长而具有红色荧光，荧光探针在酸性条件下会与亚硝酸根离子发生亚硝化反应，在氨基上引入具有吸电子效应的亚硝基，导致探针的共轭体系减小，荧光猝灭，该反应能有效地避免食品中常见的阴、阳离子的干扰，可以通过荧光强度变化和溶液颜色的变化实现亚硝酸根离子的定量与半定量分析；
(2)本发明中荧光探针的合成步骤简单，反应条件较温和，便于操作，探针具有良好的水溶性，且有较高的量子产率，能实现亚硝酸根离子的快速识别和特异性检测；
(3)可以将探针负载在滤纸上制作成便携的试纸条，根据试纸条颜色的变化对待测组分中亚硝酸根离子的含量进行半定量分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中合成的荧光探针的1HNMR图谱；
图2为本发明实施例1中合成的荧光探针的高分辨质谱图；
图3为在不同pH条件下10μM荧光探针与8μM亚硝酸根离子反应前后的荧光强度变化图；
图4为在盐酸缓冲(0.1mol/L，pH＝1)体系中，6μM荧光探针，以578nm为激发波长时，加入不同浓度NO2 -后的荧光光谱、溶液颜色的变化图及体系中NO2 -的浓度与荧光强度的变化量(△F)之间的线性关系图；
图5为在盐酸缓冲(0.1mol/L，pH＝1)体系中，6μM荧光探针分别与食品和饮用水中常见的阴、阳离子等干扰物作用后的荧光强度柱状图；
图6为在盐酸缓冲(0.1mol/L，pH＝1)体系中，6μM荧光探针与不同干扰物共存的情况下和4μMNO2 -作用后的荧光强度柱状图；
图7为试纸条蘸取不同浓度的NO2 -溶液后在365nm紫外灯照射下的颜色变化图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
荧光探针的合成
在100mL圆底烧瓶中，加入34mg的罗丹明800，并加入47mg的5-氨基吲哚，再加入5mL乙腈和1.5mL三乙胺作为反应的溶剂，室温下搅拌7.5h；反应结束后，将反应液旋干后用3mL的二氯甲烷溶解后逐滴滴入乙醚中重结晶，抽滤得固体，所得固体再用二氯甲烷溶解，加入少量硅胶并旋干作为上柱样，以二氯甲烷和无水甲醇作为洗脱剂过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，洗脱剂中二氯甲烷和无水甲醇的体积比分别为150:1、100:1、50:1和20:1，收集20:1的洗脱液，经旋转蒸发和真空干燥后即可得到荧光探针的纯品。
图1为实施例1合成的荧光探针的核磁共振氢谱，谱图中显示如下数据：1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.77(s,1H),7.67(d,J＝3.3Hz,1H),7.30(s,3H),6.68(d,J＝8.6Hz,1H),6.49(s,1H),3.52(d,J＝5.8Hz,4H),3.47(d,J＝5.7Hz,3H),3.00(q,J＝6.8Hz,4H),2.68(d,J＝10.8Hz,5H),2.02(p,J＝6.2Hz,4H),1.90–1.86(m,4H),1.28–1.22(m,2H)。
图2为实施例1合成的荧光探针的高分辨质谱谱图，质核比为501.2620的峰为荧光探针的分子离子峰，质核比为502.2643的峰为M+1峰；
由以上谱图数据可知，本发明所述的荧光探针已成功合成。
实施例2
荧光探针在不同pH条件下与NO2 -反应前后荧光强度的变化情况
配制pH为1-10的缓冲溶液，其中pH为1和2的缓冲溶液采用盐酸配制，pH为3-10(pH为整数)的缓冲溶液为PB缓冲液；称取实施例1中合成的荧光探针，用分析纯的DMSO溶解，准确配制2mM的探针储备液；准确称取亚硝酸钠13.8mg，配制20mM的亚硝酸钠母液10mL，准确量取1mL亚硝酸钠母液加超纯水稀释至10mL，得到2mM的亚硝酸钠储备液；将上述不同pH的缓冲溶液各取2mL，分别加入10μL的探针储备液，再分别加入8μL的2mM的亚硝酸钠储备液，室温下静置3min后，以578nm为激发波长用荧光光谱仪测量各溶液的荧光光谱的变化，观察不同pH条件下，探针与NO2 -反应前后在601nm处的荧光强度变化情况。
由图3可知，pH＝1时，所述荧光探针的荧光强度的变化量是最大的，检测灵敏度是最佳的，因此后续实施例中的实验均是在pH＝1的条件下进行的。
实施例3
荧光探针与不同浓度的NO2 -反应后，荧光光谱及溶液颜色的变化情况
首先分别准确吸取0.1mL、0.6mL、1.2mL、2mL、3mL的2mM的亚硝酸钠储备液加水稀释至10mL得到0.02mM、0.12mM、0.24mM、0.4mM和0.6mM的亚硝酸钠储备液。在2mL盐酸缓冲(0.1mol/L，pH＝1)体系中，加入6μL的探针储备液(2mmol/L)，再分别加入10μL的0.02mM的亚硝酸钠储备液，5μL的0.12mM、0.24mM、0.4mM和0.6mM的亚硝酸钠储备液，2μL、2.5μL、3μL、3.5μL和4μL的2mM的亚硝酸钠储备液，室温下静置3min后，用荧光光谱仪测量各溶液荧光强度(激发波长为578nm)在601nm处的变化。观察日光下溶液颜色的变化。
如图4所示，探针对亚硝酸根离子具有明显的响应，随着亚硝酸根离子浓度的增大，601nm处的荧光强度逐渐降低，并且在亚硝酸根离子的浓度在0.1-4μM的范围内，荧光强度的变化量(△F)与亚硝酸根离子的浓度呈现良好的线性关系，线性方程为y＝-78.16x+1367.81，其中R2＝0.9995，y表示△F，x表示体系中亚硝酸根离子的浓度，检测限为13.8nM，远低于桶装饮用水(0.005mg/L)和食品中(20mg/kg)的NO2 -的最高限量标准，灵敏度高。由光谱图中内嵌的图片可以观察到：与NO2 -反应后，溶液的颜色由粉红色变为紫色，且随着亚硝酸根离子浓度的增大粉色减弱、紫色加深，可根据溶液颜色的变化对NO2 -的含量进行半定量分析。
上述现象说明，本发明制备的荧光探针能够对溶液中的NO2 -产生较为灵敏的响应，可以通过荧光强度的变化和溶液颜色变化的情况实现对NO2 -的定量检测与半定量检测。
实施例4
荧光探针对NO2 -的选择性
干扰物溶液的配制：所有干扰物的浓度均为10mM，配制完成后，将所有溶液置于4℃条件下保存备用，干扰物包括：Al3+，Mg2+，Ca2+，Fe2+，Fe3+，K+，Cu2+，Zn2+，F-，Br-，I-，CH3COO-，SO4 2-，SO3 2-，ClO-，CO3 2-，NO3 -，HPO4 2-，柠檬酸钠，Cys；
配制多组体积为2mL的含有6μM荧光探针的盐酸(0.1mol/L，pH＝1)缓冲溶液，取一组溶液加入NO2 -，剩余各组溶液分别加入不同的干扰物溶液，NO2 -的终浓度为4μM，干扰物的终浓度均为200μM，各溶液均在室温下静置3min后，以578nm为激发波长进行荧光光谱测定，观察各溶液在601nm处的荧光强度变化情况。
如图5(a)所示，所测干扰物大多对荧光探针的荧光强度无明显影响，荧光探针除对亚硝酸根离子有较强的响应外，稍受三价铁离子的干扰；图5(b)显示，当Fe3+的浓度是10eq的NO2 -时，Fe3+对荧光探针的荧光强度几乎无影响，又因实际待测体系中三价铁离子的含量较低，故其干扰可忽略不计，由此说明探针对亚硝酸根离子具有较高的选择性，能特异性识别亚硝酸根离子。
实施例5
荧光探针的抗干扰能力
干扰物溶液与实施例4相同；
配制多组体积为2mL的含有6μM荧光探针的盐酸(0.1mol/L，pH＝1)缓冲溶液，在每组溶液中均加入NO2 -，然后再在各组溶液中分别加入不同的干扰物溶液，终溶液中NO2 -的终浓度为4μM，干扰物的终浓度为200μM，各溶液均在室温下静置3min后，以578nm为激发波长进行荧光光谱测定，观察各溶液在601nm处的荧光强度变化情况。
如图6所示，所共存的干扰物大多对荧光探针和亚硝酸盐的响应无影响，唯独Fe2+有较为明显的影响，由于Fe2+在实际样品中含量很低且在空气中不稳定，极易被氧气氧化成Fe3+，而Fe3+对荧光探针和亚硝酸盐的响应无明显影响，因此Fe2+对实际样品中NO2 -含量检测的影响可忽略不不计；以上结果说明：在与大量其他干扰物共存的情况下，荧光探针对样品中NO2 -的检测结果几乎不受影响，具有较好的抗干扰能力。
实施例6
荧光探针在饮用水及食品检测中的应用
分别测试桶装饮用水(未做任何处理)和当地超市购买的火腿肠及咸菜中的NO2 -的含量。桶装饮用水直接取1mL作为待测样，而火腿肠和咸菜则是先用粉碎机粉碎，称取5g匀浆试样，置于500mL烧杯中，加12.5mL的50g/L饱和硼砂溶液，加入70℃左右的超纯水约150mL，混匀，于沸水浴中加热15min，取出自然冷却至室温，加入5mL的106g/L亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL的220g/L乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质，再加27.5mL的超纯水使溶液总体积为200mL，搅拌均匀，放置30min，离心后取上清液作为待测样；在盐酸、超纯水和待测样组成的pH＝1的测试体系中加入探针储备液，使探针的浓度为6μM，再分别加入不同量已知浓度的NO2 -，使得NO2 -的浓度增量分别为0μM、0.3μM、1.5μM和3μM，室温下静置3min后，以578nm为激发波长，测量各溶液在601nm处的荧光强度，根据图4中的标准曲线计算NO2 -的含量和回收率，检测结果见表1。
三组测试体系具体为：
桶装水，1mL盐酸+1mL桶装水待测样；
火腿肠，1.2mL盐酸+0.5mL超纯水+0.3mL火腿肠待测样；
咸菜，1.1mL盐酸+0.5mL超纯水+0.4mL咸菜待测样。
由表1可知，桶装饮用水中未检测出NO2 -，符合包装饮用水中NO2 -含量的相关规定(国家规定包装饮用水中NO2 -的含量不得超过0.005mg/L)，火腿肠(不超过30mg/kg)和腌渍咸菜中(不超过20mg/kg)检测出来的NO2 -含量也未超过国家允许的残留的最高限定标准，加标回收实验结果表明，本发明制备的探针可以用于检测水体和食品中的NO2 -的含量。
表1桶装饮用水、火腿肠、咸菜中NO2 -的检测结果以及回收率
实施例7
荧光探针在制备亚硝酸根离子检测用试纸条中的应用
将剪好的大小为1.2×0.6cm的滤纸条浸泡于体积为2mL的含有荧光探针浓度为10μM的pH＝1的盐酸溶液中，浸泡30min后取出，自然风干，即得方便携带的亚硝酸根离子检测用试纸条，将制得的试纸条分别浸泡于体积为2mL的NO2 -浓度为10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、400μM和600μM的溶液中10s，取出后即在365nm紫外灯照射下观察试纸条的颜色变化。
如图7所示，可以看到：试纸条颜色由粉红色变为紫色，并且随着亚硝酸根离子浓度的增大，试纸条的紫色越来越深，在亚硝酸根离子的浓度为50μM时即可明显观察到其颜色的改变，故可以根据试纸条颜色的改变对溶液中亚硝酸根离子的含量进行半定量分析。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种快速检测亚硝酸根离子的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式为
2.权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将罗丹明800和5-氨基吲哚置于圆底烧瓶中，用乙腈和三乙胺作为反应溶剂，在室温下搅拌，反应结束后，将反应液重结晶并用柱色谱法进行分离提纯，得到荧光探针的纯品。
3.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述罗丹明800与5-氨基吲哚的物质的量之比为1:5。
4.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述乙腈和三乙胺的体积比为3.3:1。
5.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，在所述分离提纯的步骤中，采用二氯甲烷和无水甲醇作为洗脱剂。
6.权利要求1所述的荧光探针在检测亚硝酸根离子中的应用，其特征在于，所述荧光探针用于非疾病诊断与治疗目的的亚硝酸根离子的检测。
7.根据权利要求6所述的荧光探针在检测亚硝酸根离子中的应用，其特征在于，用于饮用水和食品中亚硝酸根离子的检测。
8.权利要求1所述的荧光探针在制备亚硝酸根离子检测用试纸条中的应用。
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