JPWO2014136781A1

JPWO2014136781A1 - 蛍光プローブ

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Publication number: JPWO2014136781A1
Application number: JP2015504330A
Authority: JP
Inventors: 哲雄長野; 健二郎花岡; 和久平林
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2013-03-04
Filing date: 2014-03-04
Publication date: 2017-02-16
Anticipated expiration: 2034-03-04
Also published as: JP6275689B2; WO2014136781A1; US20160047748A1

Abstract

【解決課題】新規な蛍光団を有する蛍光プローブを提供すること。【解決手段】下記の一般式（Ｉ）：【化１】で表される化合物又はその塩。【選択図】なし

Description

本発明は新規な蛍光団を有する蛍光プローブに関するものである。

フルオレセインは１８７１年に報告された分子であり、高い水溶性、高い蛍光量子収率を有することからｐＨ指示薬やラベル化色素として広く用いられてきた。また、フルオレセインを母核としたカルシウムプローブが開発されて以来、分子内光誘起電子移動（ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄｅｌｅｃｔｒｏｎｔｒａｎｓｆｅｒ：ＰｅＴ）やスピロ環の開環や閉環などを利用した高感度な蛍光ｏｆｆ／ｏｎ型プローブが数多く提供されてきた。特に、分子内光誘起電子移動を利用したプローブでは、フルオレセインにおけるベンゼン環の酸化電位を考慮してプローブの設計をすることにより、測定対象物質の捕捉前後において蛍光のｏｆｆ／ｏｎを生じさせることができ、また、高感度に測定対象物質を測定することができる。

従来、赤色のバイオイメージングを行うことができる蛍光色素としてローダミンを母核とした蛍光プローブが知られており、Ｒｈｏｄ−２などのカルシウムプローブなどが分子内光誘起電子移動を利用したプローブとして実用化されている。しかしながら、ローダミンは分子内にアミノ基を有していることから生体内でカチオン性を帯びて特定のオルガネラ、特にミトコンドリアに集積しやすいという問題がある。

一方、フルオレセインのキサンテン環の１０位の酸素原子の構造修飾に関しては報告がほとんどなく、１０位の酸素原子を他の原子に置換した化合物についての光学特性は従来知られていなかった。ローダミンの基本骨格であるパイロニンＹ（ＰＹ）の酸素原子を珪素原子に置換した化合物（ＴＭＤＨＳ）及びこの化合物の蛍光プローブへの応用については既に報告があるが（Ｂｅｓｔ，Ｑら、Ｐａｃｉｆｉｃｈｅｍ２０１０，演題番号２３３５、２０１０年１２月１９日；小出裕一郎ら、第４回日本分子イメージング学会，演題番号Ｐ８−９，２００９年５月１４日）、フルオレセインのキサンテン環の１０位の酸素原子を珪素原子に置き換えた化合物については、その蛍光特性も従来全く知られていなかった。

本発明者らは、フルオレセイン骨格におけるキサンテン環の１０位の酸素原子を珪素原子に置き換えた化合物のベンゼン環上に測定対象物質を捕捉可能な基（以下、本明細書において「捕捉基」と呼ぶ場合がある）を導入することにより、測定対象物質の捕捉の前後において分子内光誘起電子移動を誘起させて蛍光のｏｆｆ／ｏｎを行うことができることを見出した（特許文献１参照）。特に、キサンテン環の９位に位置するベンゼン環にカルシウムイオンを捕捉するための捕捉基を導入した化合物（例えば、ＣａＴＭ−２−ＡＭ等）がカルシウムイオンプローブとして有用であることを示した。

しかしながら、特許文献１に開示されているＣａＴＭ−２−ＡＭは水溶性が低く、バッファに溶けないため、細胞イメージングの際に界面活性剤を添加する必要があるが、界面活性剤を加えない場合凝集体を形成するため、細胞イメージングの感度が悪く、高感度の細胞イメージングを得るには十分でないことが認められた。

ＷＯ２０１２／１１１８１７

Ｂｅｓｔ，Ｑら、Ｐａｃｉｆｉｃｈｅｍ２０１０，演題番号２３３５、２０１０年１２月１９日小出裕一郎ら、第４回日本分子イメージング学会，演題番号Ｐ８−９，２００９年５月１４日

本発明は、新規な蛍光団を有する蛍光プローブを提供することを目的とする。
より具体的には、フルオレセイン骨格を化学修飾することにより、分子内光誘起電子移動を利用した蛍光ｏｆｆ／ｏｎ型プローブであって、赤色のバイオイメージングを高感度で行うことができる新規な蛍光プローブを提供することが本発明の課題である。

前記の通り、これまで報告したＣａ^２＋検出蛍光プローブＣａＴＭ−２−ＡＭには水溶性が低くバッファに溶けないため、凝集体を形成し、その結果、細胞イメージングの感度が悪くなるという問題点があった。本発明者らは、カルボキシ基を導入することによって水溶性を高めることで細胞イメージングの感度を改善できると考え、鋭意検討したところ、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は、
［１］下記の一般式（Ｉ）：

（式中、Ｒ^１はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基（ただし該置換基のうちの少なくとも１個は測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基である）を示し；Ｒ^２及びＲ^３はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し；Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示し；Ｒ^６及びＲ^７はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し；Ｒ^８は測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基、水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示し；Ｘは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す）で表される化合物又はその塩。
［２］Ｘが珪素原子又はゲルマニウム原子である［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］Ｒ^１のうち捕捉基がプロトン、金属イオン、低酸素環境、又は活性酸素種を捕捉するための捕捉基である［１］又は［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］Ｒ^１のうち捕捉基がカルシウムイオンを捕捉するための捕捉基である［１］〜［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［５］Ｒ^１のうちの捕捉基がスペーサーを介してベンゼン環に結合している［１］〜［４］のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
［６］以下の一般式（Ｉａ）：

（式中、Ｒ^２〜Ｒ^８及びＸは、上記で定義した通りであり；
Ｒ^２０１、Ｒ^２０２、Ｒ^２０３、及びＲ^２０４が、カルボキシ基又はアルカノイルオキシアルキルオキシカルボニル基であり；
Ｒ^２０５及びＲ^２０６がそれぞれ独立に水素原子、Ｃ_１−６アルキル基、ニトロ基、又はハロゲン原子を示す）で表される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
［７］以下の一般式（Ｉｂ）：

（式中、Ｒ^２〜Ｒ^８及びＸは、上記で定義した通りである）で表される、［６］に記載の化合物又はその塩。
［８］Ｒ^８のうち捕捉基がプロトン、活性酸素種、糖加水分解酵素を捕捉するための捕捉基である［１］〜［７］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［９］［１］〜［８］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［１０］（ａ）４ブロモイソフタル酸とｔ−ブチルアルコールとを反応させて４−ブロモイソフタル酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルを得る工程、
（ｂ）４−ブロモイソフタル酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルとｓｅｃ−ブチルリチウムとを反応させ、その直後に、以下の式（ＩＩ）で表される化合物を添加し、その後、酸を添加して式（ＩＩＩ）の化合物を得る工程、

（式中、Ｒ^２〜Ｒ^７及びＸは、上記で定義した通りである）

（式中、Ｒ^２〜Ｒ^８及びＸは、上記で定義した通りである）
を含む、式（Ｉ）の化合物を調製する方法。
［１１］測定対象物質の測定方法であって、下記の工程：（ａ）［１］〜［８］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成した測定対象物質の捕捉後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
を、提供するものである。

本発明により提供される一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、測定対象物質の捕捉前には実質的に無蛍光であり、測定対象物質の捕捉後には分子内光誘起電子移動により高強度の赤色蛍光を発する化合物を与え、また水溶性が高いことから、ｐＨ、金属イオン、又は活性酸素種などを高感度に測定可能な蛍光プローブとして有用である。
また、本発明により提供される一般式（Ｉａ）、（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩は、水溶性が高く、細胞内へ取り込まれやすいため、カルシウムイオンを高感度に測定可能な蛍光プローブとして有用である。更に、本発明の一般式（Ｉａ）、（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩により、長波長でカルシウムイオンを測定できる蛍光プローブを提供することができるため、青色蛍光プローブ等と併用することができ、細胞のダイナミックな変化を追跡することが可能となる。

ＺｎＴＭ−１の吸収、蛍光スペクトルのｐＨによる変化ＺｎＴＭ−１のＺｎ^２＋添加時の吸収、蛍光スペクトルの変化ＺｎＴＭ−１を用いた細胞イメージングの結果図３の各細胞イメージング中での各ＲＯＩにおける平均蛍光強度ＣａＴＭ−３−ＡＭとＣａＴＭ−２−ＡＭの蛍光強度を比較した結果ＣａＴＭ−３−ＡＭを加えた細胞を用いてヒスタミンとイオノマイシンによる刺激時のＣａ^２＋イメージングを行った結果図６中のａ，ｂ，ｃの各時点での蛍光像

本明細書中で化合物名を略式記載する場合について説明する。なお、ここでの説明は明細書の記載内容の理解を容易にするためのものであり、例外を排除する意図はなく、又、本明細書中における個別の定義に優先するものではない。
「ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ」は、一般式（Ｉ）において、ベンゼン環の２位にカルボキシ基を有さず、Ｒ^１が水素原子であり、Ｒ^２及びＲ^３が水素原子であり、Ｒ^４及びＲ^５がメチル基であり、Ｒ^６及びＲ^７が水素原子であり、Ｒ^８が水素原子であり、Ｘが珪素原子である化合物を意味しており、この化合物を「ＴＭ」と略す場合がある。

本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、さらに好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。

一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ^１はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示すが、該置換基のうちの少なくとも１個は測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基である。捕捉基として作用する置換基は、単独で捕捉基として作用する置換基であってもよく、あるいはベンゼン環上の２個以上の置換基の組み合わせにより、好ましくはベンゼン環上において隣接する２個の置換基の組み合わせにより捕捉基として作用する置換基であってもよい。このような２個の置換基が結合して環状構造を形成していてもよく、測定対象物質との反応後に該環状構造が開環構造に変化するものであってもよい。あるいは隣接する２個の置換基が測定対象物質との反応後にこれらの２個の置換基とともに環状構造を形成するものであってもよい。捕捉基として作用するためにベンゼン環が捕捉基の一部を形成していてもよい。さらに、単独で捕捉基として作用する置換基がベンゼン環上に２個以上結合していてもよく、異なる測定対象物質に対してそれぞれ捕捉基として作用する異なる２種以上の置換基がベンゼン環上に存在していてもよい。ベンゼン環上において捕捉基として作用する１個又は２個以上の置換基の置換位置は特に限定されず、任意の位置に置換することができる。Ｒ^１が測定対象物質に対する捕捉基のみを示し、ベンゼン環上に捕捉基以外の他の置換基が存在しない場合もある。また、Ｒ^１が結合するベンゼン環とＲ^１との組み合わせの構造が捕捉基として機能する場合もあるが、このような態様も本発明の範囲に包含される。

測定対象物質の種類は特に限定されず、例えば、金属イオン（例えば、ナトリウムイオンやリチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなど）、非金属イオン（炭酸イオンや水酸イオンなど）、活性酸素種（例えば、ヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸、過酸化水素など）、又は酵素などのいずれであってもよいが、本発明においては、好ましくは、金属イオン、更に好ましくは、カルシウムイオンである。

測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉基は種々提案されており、測定対象物質の種類に応じて適宜選択可能である。例えば、特開平１０−２２６６８８号公報、国際公開ＷＯ９９／５１５８６、特開２０００−２３９２７２号公報、国際公開ＷＯ０１／６２７５５などのほか、モレキュラープローブス社のカタログ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＨａｎｄｂｏｏｋ１１ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ）の第１０章（酵素基質と分析）、第１７章シグナル伝達プローブ）、第１８章（一酸化窒素を含む活性酸素種プローブ）、第１９章（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、及び他の金属イオンインディケーター）、第２０章（ｐＨインディケーター）、及び第２１章（ナトリウムイオン、カリウムイオン、塩素イオン、及び他のイオン）に記載された捕捉基を用いることもできる。もっとも、捕捉基は上記刊行物に記載されたものに限定されることはない。

本明細書において「捕捉」という用語は、捕捉基が実質的に化学変化を起こさずに金属イオンなどをキレート化などにより捕捉する場合のほか、測定対象物質との化学反応により化学構造が変化する場合、酵素との接触によって捕捉基が切断されて脱離する場合を含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。

捕捉基としては、例えば、下記の（Ａ）から（Ｊ）で表される捕捉基が挙げられるが、本発明において使用可能な捕捉基はこれらに限定されることはない。

（Ａ）亜鉛イオンの捕捉基
（Ａ−１）

（式中、Ｒ^１０１、Ｒ^１０２、Ｒ^１０３、及びＲ^１０４はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、２−ピリジルメチル基、２−ピリジルエチル基、２−メチル−６−ピリジルメチル基、又は２−メチル−６−ピリジルエチル基を示すが、Ｒ^１０１、Ｒ^１０２、Ｒ^１０３、及びＲ^１０４からなる群から選ばれる基のうち少なくとも１つは２−ピリジルメチル基、２−ピリジルエチル基、２−メチル−６−ピリジルメチル基、及び２−メチル−６−ピリジルエチル基からなる群から選ばれる基を示し；Ｒ^１０５は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し；ｍ及びｎはそれぞれ独立に０又は１を示すが、ｍ及びｎが同時に０となることはない）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は特許４４０２１９１号公報及びＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７，ｐｐ．１０１９７−１０２０４，２００５に開示されている。
上記の捕捉基の好適な例としては、以下の式で表される捕捉基が挙げられる。

（a-1-1）
また、これらの捕捉基は、後述するように、例えば−ＣＯ−ＮＨ−などのスペーサーを介してベンゼン環に結合していてもよい。例えば、式（a-1-1)の捕捉基が−ＣＯ−ＮＨ−のスペーサーを介してベンゼン環に結合する場合は以下の式で表される。

（a-1-2）

（Ａ−２）

（式中、Ｒ^１１１、Ｒ^１１２及びＲ^１３３はそれぞれ独立にカルボキシ基及びその塩を示し、Ｒ^１１４は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基はＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４，ｐｐ．７７６−７７８，２００２に開示されている。

（Ａ−３）

（式中、Ｒ^１１５は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は米国特許第５６４８２７０号明細書に記載されている。

（Ａ−４）

（式中、Ｒ^１２１及びＲ^１２２はそれぞれ独立にカルボキシ基及びその塩を示し；Ｒ^１２３はＣ１−６アルキル基を示し；Ｒ^１２４はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる水素原子を含む一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基はＣｅｌｌＣａｌｃｉｕｍ，３１，ｐｐ．２４５−２５１，２００２に開示されている。

（Ａ−５）

（式中、Ｒ^１２５は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる水素原子を含む一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は特開２０００−２３９２７２号公報に開示されている。

（Ｂ）一酸化窒素の捕捉基

（式中、Ｒ^１３１及びＲ^１３２はベンゼン環上の隣接した位置に置換する置換基を示し、それぞれ独立にアミノ基又はＣ_１−６アルキルモノ置換アミノ基を示すが、Ｒ^１３１及びＲ^１３２が同時にＣ_１−６アルキルモノ置換アミノ基を示すことはなく；Ｒ^１３３は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は特許第３２０００２４号公報、米国特許第６４４１１９７号明細書、米国特許第６７５６２３号明細書、及び特許第３９６７９４３号公報に開示されている。

（Ｃ）活性酸素種の捕捉基

（式中、Ｒ^１４１はアミノ基又はヒドロキシ基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は国際公開ＷＯ２００１／０６４６６４号公報に開示されている。

（Ｄ）低酸素環境の捕捉基
（Ｄ−１）

［式中、Ｒ^１５１及びＲ^１５２はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数１ないし６個のアルキル基を示し、Ｒ^１５１及びＲ^１５２は互いに結合して炭素数２ないし６個のアルキレン基となってもよく；Ｙ^１は炭素数１ないし６個のアルキレン基を示し；Ｘ^１は単結合、−ＣＯ−、又は−ＳＯ_２−を示し；Ｘ^２は−Ｏ−Ｙ^２−Ｎ（Ｒ^１５４）−（式中、Ｙ^２は炭素数１ないし６個のアルキレン基を示し、Ｒ^１５４は水素原子又は炭素数１ないし６個のアルキル基を示す）を示し；ｒは０又は１を示し；ｐ−Ｃ_６Ｈ_４−はｐ−フェニレン基を示し；Ａｒはアリールジイル基を示し；Ｒ^１５３はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基を示す］で表される捕捉基。
上記の捕捉基は国際公開ＷＯ２０１０／０２６７４３に開示されている。

（Ｄ−２）

上記の捕捉基は特開２００９−２７５００６号公報に開示されている。

（Ｅ）過酸化水素の捕捉基

（式中、Ｒ^１６１はベンゼン環上に存在する１個又は２個以上の電子吸引性置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は国際公開ＷＯ２００９／１１０４８７号公報に開示されている。

（Ｆ）一重項酸素の捕捉基

（式中、Ｒ^１７１及びＲ^１７２それぞれ独立にＣ_１−４アルキル基又はアリール基を示し；Ｒ^１７３は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は特許第４３７３６０８号公報及び国際公開ＷＯ２００２／０１８３６２に開示されている。

（Ｇ）ｐＨ環境の捕捉基

（式中、Ｒ^１８１、Ｒ^１８２、Ｒ^１８３はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基、若しくは置換基を有していてもよいアリール基であるか、又はＲ^１８１とＲ^１８２とが結合してＣ_１−３アルキレン基を示すか、若しくはＲ^１８１とＲ^１８３とが結合してＣ_１−３アルキレン基を示し；Ａは置換基を有していてもよいＣ_１−３アルキレン基を示し；Ｒ^１８４は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は国際公開ＷＯ２００８／０９９９１４号公報及び国際公開ＷＯ２００８０５９９１０号公報に開示されている。

（Ｈ）マグネシウムイオンの捕捉基

（式中、Ｒ^１９１、Ｒ^１９２及びＲ^１９３はそれぞれ独立にカルボキシ基及びその塩を示し；Ｒ^１９４は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基はＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２５６，Ｃ５４０−５４８，１９８９に開示されている。

（Ｉ）ナトリウムイオン及びカリウムイオンの捕捉基

（式中、Ｒ^１９５は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基はＢｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１５，ｐｐ．１８５１−１８５５，２００５に開示されている。

（Ｊ）カルシウムイオンの捕捉基

Ｒ^１のうちの捕捉基又はＲ^１が結合するベンゼン環とＲ^１との組み合わせで形成される捕捉基が式（ｊ−１）で表される捕捉基である場合（式中、Ｒ^２０１、Ｒ^２０２、Ｒ^２０３及びＲ^２０４はそれぞれ独立にカルボキシ基及びその塩を示し；Ｒ^２０５、Ｒ^２０６及びＲ^２０７はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子及び臭素原子）、Ｃ１−６アルキル基、又はニトロ基を示し；Ｒ^２０８は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す）。これらの捕捉基は、例えば−ＣＯ−ＮＨ−などのスペーサーを介してベンゼン環に結合していてもよい。

カルシウム捕捉基を導入した本発明の好ましい化合物は、以下の一般式（Ｉａ）で表される化合物である。

（式中、Ｒ^２〜Ｒ^８及びＸは、上記で定義した通りであり；
Ｒ^２０１、Ｒ^２０２、Ｒ^２０３、及びＲ^２０４が、カルボキシ基又はアルカノイルオキシアルキルオキシカルボニル基であり；
Ｒ^２０５及びＲ^２０６がそれぞれ独立に水素原子、Ｃ_１−６アルキル基、ニトロ基、又はハロゲン原子を示す）

一般式（Ｉａ）で表される化合物の中でも、
（１）Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^６、及びＲ^７がそれぞれ独立に水素原子、フッ素原子、又は塩素原子であり、Ｒ^４及びＲ^５がそれぞれ独立にメチル基、エチル基などのＣ_１−６アルキル基であり、Ｒ^８が水素原子であり、Ｒ^２０１、Ｒ^２０２、Ｒ^２０３、及びＲ^２０４がカルボキシ基であり、Ｒ^２０５及びＲ^２０６がそれぞれ独立に水素原子、メチル基などのＣ_１−６アルキル基、ニトロ基、又はフッ素原子である化合物；
（２）Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^６、及びＲ^７がそれぞれ独立に水素原子、フッ素原子、又は塩素原子であり、Ｒ^４及びＲ^５がそれぞれ独立にメチル基、エチル基などのＣ_１−６アルキル基であり、Ｒ^８が水素原子、アセチル基などのアルカノイル基、又はアセトキシメチル基などのアルカノイルオキシアルキル基であり、Ｒ^２０１、Ｒ^２０２、Ｒ^２０３、及びＲ^２０４がアセトキシメチルオキシカルボニル基などのアルカノイルオキシアルキルオキシカルボニル基であり、Ｒ^２０５及びＲ^２０６がそれぞれ独立に水素原子、メチル基などのＣ１−６アルキル基、ニトロ基、又はフッ素原子である化合物；
などを挙げることができる。

上記一般式（Ｉａ）で表される化合物の中でも、より好ましい化合物としては、以下の一般式（Ｉｂ）で表される化合物が挙げられる。

（式中、Ｒ^２〜Ｒ^８及びＸは、上記で定義した通りである）

式（Ｉｂ）において、好ましくは、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^６、及びＲ^７がそれぞれ独立に水素原子、フッ素原子、又は塩素原子であり、Ｒ^４及びＲ^５がそれぞれ独立にメチル基、エチル基などのＣ_１−６アルキル基であり、Ｒ^８が水素原子、アセチル基などのアルカノイル基、又はアセトキシメチル基などのアルカノイルオキシアルキル基である。また、Ｘは、好ましくは珪素原子又はゲルマニウム原子であり、より好ましくは珪素原子である。

上記で示したカルシウム捕捉基はモレキュラープローブス社のカタログ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＨａｎｄｂｏｏｋ１１ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ）の第１９章（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、及び他の金属イオンインディケーター）及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，ｐｐ．３４４０−３４５０，１９８５に開示されている。

上記の（Ａ）から（Ｊ）で表される捕捉基は、Ｒ^１として上記一般式（Ｉ）で表される化合物のベンゼン環に直接置換するほか、適当なスペーサーを介して上記一般式（Ｉ）で表される化合物のベンゼン環に置換してもよい。例えば、スペーサーとしては上記の式（Ｒ^１a）及び（Ｒ^１b）に示したように−ＣＯ−ＮＨ−などを用いることができる。また、末端がベンゼン環（多環のものも含む）である捕捉基、例えば（Ａ）、（Ｂ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、及び（Ｊ）などは、該末端のベンゼン環が一般式（Ｉ）で表される化合物のＲ^１が置換するベンゼン環を含んだものであってもよい。

上記の（Ａ）から（Ｊ）で表される捕捉基は、本発明により提供される一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩に上記刊行物に開示された方法やその他の上記特許公報及び参照文献の開示のすべてを参照により本明細書の開示に含める。

いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の化合物の蛍光ｏｆｆ／ｏｎの特性は分子内光誘起電子移動（ＰｅＴ）により達成されるものである（ＰｅＴについては、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５，８６６６−８６７１，２００３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７，４８８８−４８９４，２００５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２８，１０６４０−１０６４１，２００６、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２６，１４０７９−１４０８５，２００４、ＹＡＫＵＧＡＫＵＺＡＳＳＨＩ，１２６，９０１−９１３，２００６に詳細に開示されている）。ＰｅＴとは蛍光消光の１つの方法であり、励起光照射により生成する１重項励起蛍光団が蛍光を発して基底状態に戻る速度よりも速く近隣の電子供与部位（ＰｅＴドナー）から電子移動が起き、蛍光消光が起こる現象（ａ−ＰｅＴ）、及び励起光照射により生成する１重項励起蛍光団が蛍光を発して基底状態に戻る速度よりも速く近隣の電子受容部位（ＰｅＴアクセプター）へ電子移動が起き、蛍光消光が起こる現象（ｄ−ＰｅＴ）である。なお、Ｒ^１が結合するベンゼン環や捕捉基の酸化電位の情報は、例えば該ベンゼン環や捕捉基の酸化電位を量子化学的手法に従って計算することにより容易に入手することができる。該ベンゼン環や捕捉基の酸化電位が低くなることは該ベンゼン環や捕捉基の電子密度が上昇することを意味しており、これはＨＯＭＯ軌道エネルギーが高くなることに対応している。例えば、該ベンゼン環部位や捕捉基部位のＨＯＭＯエネルギーを密度汎関数法（Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ））により求めることができる。Ｒ^１として測定対象物質に対する捕捉基を含む場合には、測定対象物質の捕捉後にＲ^１が結合するベンゼン環部位や捕捉基部位自身の酸化電位が変化するものを選択するか、捕捉基部位自身が測定対象物質の捕捉前には一般式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になる酸化電位を有する基を持ち、かつ該基が測定対象物質の捕捉時に切断されて離脱するものを選択する必要がある。

一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物において、捕捉基として作用するＲ^１、又は捕捉基以外のＲ^１が存在する場合には該Ｒ^１と捕捉基であるＲ^１との組み合わせは、捕捉基として作用するＲ^１が、Ｒ^１が結合するベンゼン環の酸化電位を変化させる捕捉基である場合には、例えば、（１）測定対象物質の捕捉前には一般式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように、Ｒ^１が結合するベンゼン環の酸化電位が１．５７Ｖ以下、好ましくは１．２６Ｖ以下、になるように、かつ（２）測定対象物質の捕捉後には、一般式（Ｉ）で表される化合物に由来する捕捉後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように、Ｒ^１が結合するベンゼン環の酸化電位が１．７５Ｖ以上、好ましくは１．９８Ｖ以上、になる組み合わせとして選択される。また、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物において、捕捉基として作用するＲ^１が測定対象物質の捕捉後にＲ^１が結合するベンゼン環の酸化電位に実質的に影響を与えない捕捉基であり、該捕捉基自身の酸化電位の変化によって測定対象物質の捕捉を検出する場合には、Ｒ^１が結合するベンゼン環の酸化電位が蛍光のｏｆｆ／ｏｎに影響を与えないように、すなわち捕捉基捕捉後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように、例えば、Ｒ^１が結合するベンゼン環の酸化電位が１．７５Ｖ以上、好ましくは１．９８Ｖ以上、になる組み合わせとして選択される。

一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物において、捕捉基として作用するＲ^１が、一般式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように該捕捉基自身が実質的に低い酸化電位を有する基である場合には、例えば、（１）該実質的に低い酸化電位を持つ基の酸化電位が１．５７Ｖ以下、好ましくは１．２６Ｖ以下、になるように、かつ（２）測定対象物質の捕捉によって、一般式（Ｉ）で表される化合物に由来する捕捉後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように、該実質的に低い酸化電位を持つ基の酸化電位が１．７５Ｖ以上、好ましくは１．９８Ｖ以上、に上昇する組み合わせとして選択される。

一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物において、Ｒ^８が捕捉基として作用する場合も上記理論は適用される。

また、特願２０１２−０３２３７３には、本発明の一般式（Ｉ）のＲ^８が水素原子でない化合物又はその塩が、測定対象物質との接触によりＲ^８が水素原子となることによって、分子内スピロラクトン環が開環して強い赤色蛍光を発する化合物に変化する性質を有していることから、この性質を利用することにより、活性酸素種、又は各種酵素などを高感度に測定可能な蛍光プローブを製造するための母核化合物として有用であることが示されている。よって、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の上記の性質と本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩におけるＲ^１とを組み合わせれば、複数の測定対象物質を捕捉した場合にのみ蛍光特性が大きく変化する蛍光プローブとすることができる。例えば、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩に、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩におけるＲ^８にβ−ガラクトシダーゼによって切断される１価の基を導入し、Ｒ^１にカルシウムイオンを捕捉するための基を導入して５８０ｎｍ付近の励起光で測定を行えば、β−ガラクトシダーゼ、カルシウムイオンがそれぞれ単独で存在する場合には発蛍光せず、β−ガラクトシダーゼとカルシウムイオンが同時存在する場合にのみ発蛍光する蛍光プローブとして使用できる。

上記の蛍光化合物と本発明により提供される一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を結合させるために、本発明により提供される一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩に置換する置換基に結合のための基、例えば、アミノ基、カルボキシ基及びその活性エステル基（スクシミジルエステルなど）、ホルミル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、マレイミド基、イソチアシアネート基及びイソシアネート基などを導入することができる。

一般式（Ｉ）で表される化合物において、ベンゼン環上に存在するＲ^１が示す置換基のうち、捕捉基として作用する以外の置換基もベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。捕捉基として作用する以外の置換基がベンゼン環上に存在しないことが好ましい場合もある。捕捉基として作用する以外の置換基がベンゼン環上に存在する場合には、該置換基が１ないし２個程度存在していることが好ましい。捕捉基として作用する以外の置換基がベンゼン環上に存在する場合には、該置換基はベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。

Ｒ^１が示す一価の置換基のうち、捕捉基として作用する以外の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基はさらに任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ^１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ^１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ^１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ^１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。さらに、Ｒ^１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４−カルボキシブトキシ基又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。

Ｒ^１が示す一価の置換基のうち、捕捉基として作用する以外の置換基がベンゼン環上に２個存在する場合には、それらの２個の置換基は例えば炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、及びカルボキシ基からなる群から選択されることが好ましく、炭素数１〜６個のアルキル基及び炭素数１〜６個のアルコキシ基からなる群から選ばれることがさらに好ましい。アルコキシ基（例えば無置換アルコキシ基、モノカルボキシ基置換アルコキシ基、モノアルコキシカルボニル置換アルコキシ基、又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基など）がベンゼン環上の他の位置に存在することが好ましい。

Ｒ^２及びＲ^３はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示す。Ｒ^２又はＲ^３がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ^２又はＲ^３が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ^２及びＲ^３はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ^２及びＲ^３がともに水素原子である場合、又はＲ^２及びＲ^３がともに塩素原子又はフッ素原子である場合がより好ましい。

Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示すが、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に炭素数１〜３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ^４及びＲ^５がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ^４及びＲ^５が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ^４又はＲ^５が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ^４又はＲ^５がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、イオウ原子、又は酸素原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。

Ｒ^６及びＲ^７はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示すが、Ｒ^２及びＲ^３について説明したものと同様である。
Ｘは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示すが、珪素原子であることが好ましい。

Ｒ^８は測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基、水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示す。アルキルカルボニル基としては、例えば、炭素原子数１〜１３個程度、好ましくは炭素原子数１〜７個程度、さらに好ましくは炭素原子数１〜５個程度のアルキルカルボニル基を用いることができる。アルキルカルボニルオキシメチル基におけるアルキルカルボニル基についても同様である。例えば、アセトキシメチル基などを好ましく用いることができる。一般式（Ｉ）で表される化合物においてＲ^８がアルキルカルボニル基又はアルキルカルボニルオキシメチル基である化合物は、一般式（Ｉ）で表される化合物の脂溶性が高まり、細胞膜を通過して細胞内部に取り込まれ易くなるので、細胞内の測定対象物質をバイオイメージング手法により測定する場合にはＲ^８がアルキルカルボニル基又はアルキルカルボニルオキシメチル基である化合物を好適に使用できる。

上記一般式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。

一般式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表される本発明の化合物は、置換基の種類に応じて１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、一般式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表される本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。

本発明の化合物の合成方法
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は、下記の合成スキームの工程（ａ）及び（ｂ）を含む方法により合成することができる。以下においては、本発明の一般式（Ｉｂ）の化合物を例にして説明するが、それ以外の化合物も同様の方法により合成することができる。

式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）中、Ｒ^２〜Ｒ^８及びＸは、式（Ｉ）で定義した通りである。また、式（ＩＩ）のＴＢＤＭＳは、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を意味する。

（１）工程（ａ）
４−ブロモイソフタル酸を、ＤＣＣ、ＤＭＡＰと共にジクロルメタン等の溶媒中に加え撹拌し、そこにｔＢｕＯＨを溶かしたジクロルメタンを加え室温で一晩程度攪拌することにより、４−ブロモイソフタル酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルを合成することができる。

（２）工程（ｂ）
乾燥させアルゴン置換したフラスコに、工程（ａ）で得た４−ブロモイソフタル酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルと脱水ＴＨＦを加え、−７８℃に冷却後、０．５〜０．７当量のｓｅｃ−ＢｕＬｉを滴下し、その直後（好ましくは、１０秒〜３０秒後）に一般式（ＩＩ）で表される化合物を脱水ＴＨＦ５ｍＬに溶解したものを加え、室温に戻す。室温で１時間攪拌後、ＨＣｌなどの酸を加えて攪拌し、ジクロルメタン等の溶媒で抽出し、乾燥させたのちに残渣にＴＦＡ５ｍＬを加え室温で１時間撹拌することにより、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物を合成することができる。
なお、一般式（ＩＩ）で表される化合物は、国際公開ＷＯ２０１２／１１１８１７等を参照して合成することができる。

（３）工程（ｃ）
工程（ｂ）で得られた一般式（ＩＩＩ）で表される化合物、２当量の５−アミノＢＡＰＴＡ−テトラアセトキシメチルエステル、２．５当量のＨＡＴＵ、２．５当量のＨＯＢｔ、をＤＭＦ等の溶媒に溶解させ、室温で一晩程度撹拌することにより、一般式（Ｉｂ）で表される化合物を得ることができる。

なお、５−アミノＢＡＰＴＡ−テトラアセトキシメチルエステルに代えて、前記した（Ａ）から（Ｊ）で表される捕捉基を与える化合物（例えば、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ピリジニルメチル）−１，４−ベンゼンジアミン）を用いることにより、一般式（Ｉ）、（Ｉａ）で表される化合物を同様に合成することができる。

本発明の一般式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩は測定対象物質の捕捉前には実質的に無蛍光であり、測定対象物質の捕捉後には高強度の赤色蛍光を発する性質を有していることから、測定対象物質の測定のための蛍光プローブとして使用することができる。本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。

本発明の蛍光プローブを用いた測定対象物の測定方法は、一般的には、（ａ）上記式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表される化合物と測定対象物質とを接触させてＲ^１のうちの捕捉基（又はＲ^１ａ、Ｒ^１ｂ）及び／又はＲ^８の捕捉基により測定対象物質を捕捉させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成した化合物（Ｒ^１のうちの捕捉基に金属イオンがキレート結合した化合物や、測定対象物質の捕捉後に化学構造が変化し、例えば環状構造を形成したり、開環するなどの化学修飾を受けた化合物、及び／又はＲ^８が測定対象物質の補足後に切断されるなどの化学修飾を受けた化合物に相当する）の蛍光を測定する工程を含んでいる。例えば、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに本発明の蛍光プローブ又はその塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、測定対象物質との接触の前後における蛍光スペクトルを測定すればよい。

測定対象物質を捕捉後の化合物の蛍光の測定は通常の方法で行うことができ、インビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてインビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ましい。例えば、励起波長として５８２ｎｍ程度、蛍光波長が５９８ｎｍ程度の蛍光を測定することができる。

本発明の蛍光プローブは、必要に応じて試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。

［実施例１］
（１）ＺｎＴＭ−１（５−［［［４−［［２−［ビス（２−ピリジニルメチル）アミノ］エチル］アミノ］フェニル］アミノ］カルボニル］−２−（１，８−ジフルオロ−２，９−ジヒドロ−７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−２−オキソ−９−シラアントラセン−１０−イル）−安息香酸）の合成
以下のスキーム１に従って、Ｚｎ^２＋検出蛍光プローブＺｎＴＭ−１を合成した。

工程（ａ）：４−ブロモイソフタル酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルの合成

４−ブロモイソフタル酸（６．２０ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１３．１ｇ、６３．５ｍｍｌ）、ＤＭＡＰ（６０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）をジクロルメタン（１００ｍＬ）に加え撹拌した。そこにｔＢｕＯＨ（１２ｍＬ）を溶かしたジクロルメタン（２０ｍＬ）をゆっくりと加え室温で一晩攪拌した。反応液を食塩水で洗った後に、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、４／１ヘキサン／ジクロルメタン）で精製することにより、４−ブロモイソフタル酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（６．０９ｇ、１７．４ｍｍｏｌ、収率６７％）を得た。
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 1.59 (s, 9H), 1.62 (s, 9H), 7.66 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.86 (dd, 2H, J = 8.1, 2.1 Hz), 8.24 (d, 1H, J = 2.1 Hz);
HRMS (ESI⁺): m/z Found 379.0552, calculated 379.0521 for [M+Na]⁺ (3.1 mmu).

工程（ｂ）：２，４−ｄｉＣＯＯＨＤＦＴＭ（４−（１，８−ジフルオロ−２，９−ジヒドロ−７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−２−オキソ−９−シラアントラセン−１０−イル）−１，３−ベンゼンジカルボン酸）の合成

乾燥させアルゴン置換したフラスコに、４−ブロモイソフタル酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３５７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌと脱水ＴＨＦ（１０ｍＬ）を加えた。−７８℃に冷却後、１Ｍｓｅｃ−ＢｕＬｉ（０．６ｍｍｏｌ）を滴下し、３０秒後に４，５−ジフルオロ−３，６−ｄｉＯＴＢＤＭＳ−Ｓｉ−キサントン（その合成方法は国際公開ＷＯ２０１２／１１１８１７等を参照）（１０．３ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ５ｍＬに溶解したものを加え、室温に戻した。室温で１時間攪拌後、２ＮのＨＣｌを１０ｍＬ加えて２０分間攪拌した。それをジクロルメタンで抽出して食塩水で洗った。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を除去した後、残渣にＴＦＡ（２ｍＬ）を加えて室温で１時間攪拌した。溶媒を除去した後、ＨＰＬＣで部分的に精製して２，４−ｄｉＣＯＯＨＤＦＴＭ（ｃｒｕｄｅ、３．８ｍｇ、０．００８４ｍｍｏｌ、４４％）を得た。
¹H-NMR (300 MHz, CD₃COCD₃): δ 0.69 (s, 3H), 0.82 (s, 3H), 6.81 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.04 (dd, 2H, J = 10.3, 8.8 Hz), 7.32 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 8.31 (dd, 1H, J = 8.1, 1.5 Hz), 8.47 (s, 1H)
HRMS (ESI⁺): m/z Found 455.0750, calculated 455.0763 for [M+H]⁺ (-1.3 mmu).

工程（ｃ）：Ｎ−（２，２−ジメトキシエチル）−Ｎ−ピリジニルメチル−２−ピリジンメタンアミンの合成

乾燥させたフラスコに、２，２’−ジピコリルアミン（１．８ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）と２−ブロモ−１，１−ジメトキシエタン（４．８ｍＬ、４０．６ｍｍｏｌ）、Ｎａ_２ＣＯ_３（１０．０ｇ、９４．３ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル（４０ｍＬ）に溶解させ、８０℃で三晩加熱還流した。不溶物をろ過によって除き、溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリガゲル、１９／１ジクロルメタン／メタノール）で精製することによりＮ−（２，２−ジメトキシエチル）−Ｎ−ピリジニルメチル−２−ピリジンメタンアミン（１．９３ｇ、６．７２ｍｍｏｌ、収率６７％）を得た。
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 2.79 (d, 2H, J = 5.1 Hz), 3.29 (s, 3H), 3.93 (s, 4H), 4.54 (t, 1H, J = 5.1 Hz), 7.14 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 7.56 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.66 (td, 2H, J = 7.7, 1.5 Hz), 8.52 (d, 2H, J = 4.4 Hz);
¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃): δ 53.5, 55.6, 60.9, 103.6, 121.9, 123.0, 136.3, 148.9, 159.7;
HRMS (ESI⁺): m/z Found 310.1490, calculated 310.1532 for [M+Na]⁺ (-4.2 mmu).

工程（ｄ）：２−［ビス（２−ピリジニルメチル）アミノ］−１，１−エタンジオールの合成

Ｎ−（２，２−ジメトキシエチル）−Ｎ−ピリジニルメチル−２−ピリジンメタンアミン（５７４ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）に１ＮのＨＣｌを３０ｍＬ加え、室温で７時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ_３溶液を加えて塩基性にした後、ジクロルメタンで抽出して食塩水で洗った。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を除去することにより２−［ビス（２−ピリジニルメチル）アミノ］−１，１−エタンジオール（４７０ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ、収率９５％）を得た。
¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 2.73 (t, 2H, J = 4.8 Hz), 3.92 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 4.65 (t, 1H, J = 4.8 Hz), 7.26 (dd, 2H, J = 6.4, 4.8 Hz), 7.63 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.78 (td, 2H, J = 7.6, 1.6 Hz), 8.42 (d, 2H, J = 4.8 Hz)
¹³C-NMR (75 MHz, CD₃OD): δ 60.4, 61.8, 98.4, 123.7, 124.9, 138.6, 149.3, 160.7
HRMS (ESI⁺): m/z Found 264.1094, calculated 264.1113 for [M-H₂O+Na]⁺ (-1.9 mmu)

工程（ｅ）：Ｎ−Ｂｏｃ−１，４−フェニレンジアミンの合成

１，４−フェニレンジアミン（１．１５ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）をジクロルメタン（５０ｍＬ）に溶解させアルゴン置換した後０℃に冷やして撹拌した。その溶液に二炭酸ジｔｅｒｔブチル（４６３ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）をジクロルメタン（１０ｍＬ）に溶解させた液をゆっくりと滴下し、０℃で３．５時間撹拌した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１／１酢酸エチル／ヘキサン）で精製することによりＮ−Ｂｏｃ−１，４−フェニレンジアミン（４１９ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ、収率９７％）を得た。
¹H-NMR (300 MHz, CDCｌ₃): δ 1.52 (s, 9H), 6.63 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.13 (d, 2H, J = 8.8 Hz);
¹³C-NMR (75 MHz, CDCｌ₃): δ 28.3, 79.9, 115.5, 120.9, 139.6, 142.3, 153.3;
HRMS (ESI⁺): m/z Found 209.1322, calculated 209.1290 for [M+H]⁺ (3.2 mmu).

工程（ｆ）：２−ＣＯＯＨ−４−ＣＯＰＤＡＤＦＴＭ（５−［［（４−アミノフェニル）アミノ］カルボニル］−２−（１，８−ジフルオロ−２，９−ジヒドロ−７−ヒドロキシ−９，９− ジメチル−２−オキソ−９−シラアントラセン−１０−イル）−安息香酸）の合成

２，４−ｄｉＣＯＯＨＤＦＴＭ（３．８ｍｇ、０．００８４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１５．２ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６．０ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−１，４−フェニレンジアミン（２０．８ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、ＤＩＥＡ（１２．９ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を加えて室温で６時間攪拌した。ＡｃＯＥｔ（２０ｍＬ）を加え、２ＮのＨＣｌで洗い、食塩水で洗った。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を除去した後、ＨＰＬＣで精製して２−ＣＯＯＨ−４−ＣＯＰＤＡＤＦＴＭ（２．１ｍｇ、０．００３９ｍｍｏｌ、収率４６％）を得た。
¹H-NMR (300 MHz, CD₃OD): 0.69 (s, 3H), 0.82 (s, 3H), 6.71 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.90 (t, 2H, J = 9.2 Hz), 7.23-7.25 (m, 3H), 7.79 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 8.20 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 8.47 (s, 1H);
HRMS (ESI⁺): m/z Found 545.1382, calculated 545.1344 for [M+H]⁺ (3.8 mmu).

工程（ｇ）：ＺｎＴＭ−１（５−［［［４−［［２−［ビス（２−ピリジニルメチル）アミノ］エチル］アミノ］フェニル］アミノ］カルボニル］−２−（１，８−ジフルオロ−２，９−ジヒドロ−７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−２−オキソ−９−シラアントラセン−１０−イル）−安息香酸）の合成

２−ＣＯＯＨ−４−ＣＯＰＤＡＤＦＴＭ（２．１ｍｇ、０．００３９ｍｍｏｌ）、２−［ビス（２−ピリジニルメチル）アミノ］−１，１−エタンジオール（９．６ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）、Ｎａ_２ＳＯ_４（１０ｍｇ）をメタノール（３ｍＬ）に溶解させ、室温で２時間撹拌した後、ＮａＢＨ_３ＣＮ（２．１ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩攪拌した。飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液を加えて中和した後、ジクロルメタンで抽出し、食塩水で洗い、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を除去した後、ＨＰＬＣで精製してＺｎＴＭ−１（０．７ｍｇ、０．０００９１ｍｍｏｌ、収率２４％）を得た。
¹H-NMR (400 MHz, acetone-d₆): 0.69 (s, 3H), 0.82 (s, 3H), 3.47-3.62 (m, 4H), 4.63 (s, 4H), 6.67 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.79 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.05 (t, 2H, J = 9.3 Hz), 7.32 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 7.44 (t, 2H, J = 6.1 Hz), 7.56 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.65 (d, 2H, J = 7.3 Hz), 7.92 (td, 2H, J = 7.7, 2.1 Hz), 8.28 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.45 (s, 1H), 8.62 (d, 2H, J = 3.4 Hz)
HRMS (ESI⁺): m/z Found 770.2591, calculated 770.2610 for [M+H]⁺ (-1.9 mmu).

（２）ＺｎＴＭ−１の光学特性の評価
得られたＺｎＴＭ−１の光学特性、吸収、蛍光スペクトルのｐＨによる変化を図１に示す。また、ＺｎＴＭ−１のＺｎ^２＋添加時の吸収、蛍光スペクトルの変化を図２に示す。
ｐＨによる変化の測定は１５％ＤＭＳＯを含む０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー中でＺｎＴＭ−１（１μＭ）にて行った。
Ｚｎ^２＋の添加実験は１５％ＤＭＳＯを含む０．１ＭＨＥＰＥＳバッファー中（ｐＨ７．４）中にＺｎＴＭ−１（１μＭ）を加えた溶液に、ＺｎＳＯ_４を添加することによって行った。
ｐＫ_ａは吸収極大波長の吸光度を用いて２相性のフィッティングによって求めた。Ｚｎ^２＋未添加時の量子収率の測定時には微量の金属イオンの影響を除外するためにＥＤＴＡ（１００μＭ）を加えて測定した。表１にＺｎＴＭ−１の光学特性を示す。

（３）ＺｎＴＭ−１の細胞イメージングへの応用
ＺｎＴＭ−１を用いて細胞イメージングを行った。１％のＤＭＳＯを含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中でＨｅｌａ細胞を１０μＭのＺｎＴＭ−１とともに３７℃で３０分間インキュベーションした。ＨＢＳＳで１回洗浄した後にＨＢＳＳを加えて落射蛍光顕微鏡ＩＸ−７１（オリンパス）を用いて、励起波長５６５−５８５ｎｍ、蛍光波長６００−６９０ｎｍにて観察した。３０秒おきに観察し、観察を開始してから２分３０秒後にＺｎＳＯ_４（５０μＭ）とイオノフォアであるピリチオン（ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ）（５μＭ）を加え、観察を開始してから６分後に細胞膜透過性の亜鉛キレーターであるＴＰＥＮ（１００μＭ）を加えた。
図３に細胞イメージングの結果を示す。また、図３の各細胞イメージング中での各ＲＯＩにおける平均蛍光強度を図４に示す。
図３及び４から、ＺｎＴＭ−１は細胞内に取り込まれ、Ｚｎ^２＋検出蛍光プローブとして有効に機能することが確認された。

［実施例２］
（１）ＣａＴＭ−３−ＡＭ（５−［［［４−［ビス［２−［（アセチルオキシ）メトキシ］−２−オキソエチル］アミノ］−５−［２−［２−［ビス［２−［（アセチルオキシ）メトキシ］−２−オキソエチル］アミノ］フェノキシ］エトキシ］−フェニル］アミノ］カルボニル］−２−（１，８−ジクロロ−２，９−ジヒドロ−７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−２−オキソ−９−シラアントラセン−１０−イル）−安息香酸）の合成
以下のスキーム２に従って、Ｃａ^２＋検出蛍光プローブＣａＴＭ−３−ＡＭを合成した。

工程（ｈ）：２，４−ｄｉＣＯＯＨＤＣＴＭ（４−（１，８−ジクロロ−２，９−ジヒドロ−７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−２−オキソ−９−シラアントラセン−１０−イル）−１，３−ベンゼンジカルボン酸）の合成

乾燥させアルゴン置換したフラスコに、４−ブロモイソフタル酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３５７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌと脱水ＴＨＦ（５ｍＬ）を加えた。−７８℃に冷却後、１Ｍｓｅｃ−ＢｕＬｉ（０．７ｍｍｏｌ）を滴下し、１０秒後に４，５−ジクロロ−３，６−ｄｉＯＴＢＤＭＳ−Ｓｉ−キサントン（その合成方法は国際公開ＷＯ２０１２／１１１８１７等を参照）（４０．０ｍｇ、０．０７０５ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ５ｍＬに溶解したものを加え、室温に戻した。室温で１時間攪拌後、２ＮのＨＣｌを１０ｍＬ加えて２０分間攪拌した。それをジクロルメタンで抽出して食塩水で洗った。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を除去した後、残渣にＴＦＡ（５ｍＬ）を加えて室温で１時間攪拌した。溶媒を除去した後、ＨＰＬＣで精製して２，４−ｄｉＣＯＯＨＤＣＴＭ（１８．１ｍｇ、０．０３７１ｍｍｏｌ、収率５３％）を得た。
¹H-NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 0.91 (s, 6H), 6.87 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.91 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.05 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 8.21 (dd, 1H, J = 8.1, 1.5 Hz), 8.49 (d, 1H, J = 1.5 Hz)
¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD): δ -0.1, 0.5, 91.4, 119.7, 124.0, 124.9, 127.8, 128.0, 128.3, 133.5, 135.6, 135.9, 137.5, 154.4, 162.3, 167.7, 171.9
HRMS (ESI⁺): m/z Found 487.0210, calculated 487.0171 for [M+H]⁺ (3.9 mmu).

工程（ｉ）：ＣａＴＭ−３−ＡＭ（５−［［［４−［ビス［２−［（アセチルオキシ）メトキシ］−２−オキソエチル］アミノ］−５−［２−［２−［ビス［２−［（アセチルオキシ）メトキシ］−２−オキソエチル］アミノ］フェノキシ］エトキシ］−フェニル］アミノ］カルボニル］−２−（１，８−ジクロロ−２，９−ジヒドロ−７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−２−オキソ−９−シラアントラセン−１０−イル）−安息香酸）の合成
２，４−ｄｉＣＯＯＨＤＣＴＭ（９．８ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）、５−アミノＢＡＰＴＡ−テトラアセトキシメチルエステル（３１．２ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１８．５ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（７．７ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、室温で一晩撹拌した。溶媒を除去した後、ＨＰＬＣで精製してＣａＴＭ−３−ＡＭ（８．６ｍｇ、０．００６９ｍｍｏｌ、収率３４％）を得た。
¹H-NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 0.84 (s, 3H), 1.00 (s, 3H), 2.00 (s, 6H), 2.02 (s, 6H), 4.17 (s, 8H), 4.30 (s, 4H), 5.58 (s, 4H), 5.59 (s, 4H), 6.83-7.09 (m, 9H), 7.08 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.17 (dd, 1H, J = 8.8, 2.2 Hz), 7.46 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 8.11 (dd, 1H, J = 8.1, 1.5 Hz), 8.44 (s, 1H);
HRMS (ESI⁺): m/z Found 1248.2420, calculated 1428.2451 for [M+H]⁺ (-3.1 mmu).

（２）ＣａＴＭ−３−ＡＭの細胞イメージングへの応用
ＣａＴＭ−３−ＡＭを用いて生細胞Ｃａ^２＋イメージングを行った。その有用性について検討するために、ベンゼン環の２位がカルボキシ基ではなくメチル基であるＣａＴＭ−２−ＡＭ（Ｎ−［２−［（アセチルオキシ）メトキシ］−２−オキソエチル］−Ｎ−［２−［２−［２−［ビス［２−［（アセチルオキシ）メトキシ］−２−オキソエチル］アミノ］−５−［［４−（１，８−ジクロロ−２，９−ジヒドロ−７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−２−オキソ−９−シラアントラセン−１０−イル）−３−メチルベンゾイル］アミノ］フェノキシ］エトキシ］フェニル］−グリシン（アセチルオキシ）メチルエステル）と比較した。０．０３％のＤＭＳＯを含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中でＨｅｌａ細胞を３μＭのＣａＴＭ−２−ＡＭまたはＣａＴＭ−３−ＡＭとともに３７℃で３０分間インキュベーションした。ＨＢＳＳで３回洗浄した後にＨＢＳＳを加えて共焦点顕微鏡ＳＰ５（Ｌｅｉｃａ）で、励起波長５９０ｎｍ、蛍光波長６１０−６８０ｎｍにて観察した。その結果を図５に示す。
図５から、ベンゼン環の２位がカルボキシ基を導入したＣａＴＭ−３−ＡＭではＣａＴＭ−２−ＡＭに比べてより明るい蛍光像が得られていることが分かる。このことから、ＣａＴＭ−３−ＡＭでは細胞内により多くの量の蛍光プローブが取り込まれていることが示される。
また、ＣａＴＭ−３−ＡＭを加えた細胞を用いてヒスタミンとイオノマイシンによる刺激時のＣａ^２＋イメージングを行った。観察を開始してから１分後にヒスタミン塩酸塩（１μＭ）を加え、観察を開始してから４分後にイオノマイシン（５μＭ）を加えた。その結果を図６に示す。また、図６中のａ，ｂ，ｃの各時点での蛍光像を図７に示す。図６及び７から、ＣａＴＭ−３−ＡＭを用いることにより、ヒスタミンとイオノマイシンによる刺激時の細胞内でのＣａ^２＋の変化を的確に捉えることができることが示される。

Claims

下記の一般式（Ｉ）：

（式中、Ｒ^１はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基（ただし該置換基のうちの少なくとも１個は測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基である）を示し；Ｒ^２及びＲ^３はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し；Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示し；Ｒ^６及びＲ^７はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し；Ｒ^８は測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基、水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示し；Ｘは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す）で表される化合物又はその塩。
Ｘが珪素原子又はゲルマニウム原子である請求項１に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^１のうち捕捉基がプロトン、金属イオン、低酸素環境、又は活性酸素種を捕捉するための捕捉基である請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^１のうち捕捉基がカルシウムイオンを捕捉するための捕捉基である請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^１のうちの捕捉基がスペーサーを介してベンゼン環に結合している請求項１〜４のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
以下の一般式（Ｉａ）：

（式中、Ｒ^２〜Ｒ^８及びＸは、上記で定義した通りであり；
Ｒ^２０１、Ｒ^２０２、Ｒ^２０３、及びＲ^２０４が、カルボキシ基又はアルカノイルオキシアルキルオキシカルボニル基であり；
Ｒ^２０５及びＲ^２０６がそれぞれ独立に水素原子、Ｃ_１−６アルキル基、ニトロ基、又はハロゲン原子を示す）で表される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
以下の一般式（Ｉｂ）：

（式中、Ｒ^２〜Ｒ^８及びＸは、上記で定義した通りである）で表される、請求項６に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^８のうち捕捉基がプロトン、活性酸素種、糖加水分解酵素を捕捉するための捕捉基である請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
（ａ）４ブロモイソフタル酸とｔ−ブチルアルコールとを反応させて４−ブロモイソフタル酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルを得る工程、
（ｂ）４−ブロモイソフタル酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルとｓｅｃ−ブチルリチウムとを反応させ、その直後に、以下の式（ＩＩ）で表される化合物を添加し、その後、酸を添加して式（ＩＩＩ）の化合物を得る工程、

（式中、Ｒ^２〜Ｒ^７及びＸは、上記で定義した通りである）

（式中、Ｒ^２〜Ｒ^８及びＸは、上記で定義した通りである）
を含む、式（Ｉ）の化合物を調製する方法。
測定対象物質の測定方法であって、下記の工程：（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成した測定対象物質の捕捉後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。