WO2023167305A1 - 酵素活性の検出方法、及び当該方法に用いる蛍光プローブ - Google Patents

酵素活性の検出方法、及び当該方法に用いる蛍光プローブ Download PDF

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WO2023167305A1
WO2023167305A1 PCT/JP2023/007926 JP2023007926W WO2023167305A1 WO 2023167305 A1 WO2023167305 A1 WO 2023167305A1 JP 2023007926 W JP2023007926 W JP 2023007926W WO 2023167305 A1 WO2023167305 A1 WO 2023167305A1
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salt
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compound
carbon atoms
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泰照 浦野
徹 小松
眞伍 坂本
達也 請川
力也 渡邉
Original Assignee
国立大学法人 東京大学
国立研究開発法人理化学研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention provides a novel enzymatic activity detection method using a fluorescent probe that selectively reacts with a thiol group, selenol group, or the like generated by a reaction between an enzyme and a substrate analog in a microdevice, and a fluorescent probe used in the method. involved.
  • microdevice-compatible enzyme activity detection fluorescent probes to detect enzymes in the blood at the single molecule level, perform profiling based on the activity, and detect disease.
  • Microdevices include microchamber devices, liposomes, droplets, and the like. Taking a microchamber device as an example, one device has hundreds of thousands of microscopic chambers, and the volume of the device is Since the amount of fluorochrome is as small as about 10 to 100 fL, it is designed to obtain sufficient sensitivity for detection even with the amount of fluorescent dye that is generated by turnover from one molecule of enzyme.
  • Non-Patent Document 1 Various experimental systems have been reported that make it possible to evaluate the activity of enzymes at the single-molecule level by making the most of the properties of the highly sensitive fluorescence method using this microdevice.
  • the present inventors have found that by detecting a single molecule of an enzyme in the blood using a single-molecule measurement method, the activity of the enzyme present in the blood at a low concentration that is difficult to detect with conventional protein analysis techniques. It has been reported that it is possible to find out, and expectations are gathering for pathological diagnosis by detecting enzymes in blood (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Documents 1 and 2 fluorescent substrate analogues whose fluorescence changes due to metabolic reactions have mainly been used as enzyme activity detection systems.
  • enzyme activities such as alkaline phosphatase and protein tyrosine phosphatase, which hydrolyze phosphate esters, are detected by using fluorescent probes with phosphate ester structures as reaction points (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • enzymes that can be detected using such fluorescent substrate analogues are limited. It is difficult to develop such probes for enzyme/substrate pairs that have a low tolerance for fluorophore binding to the substrate.
  • enzymes include, for example, acetylcholinesterase (AChE), which is an esterase present in the brain and muscles that hydrolyzes acetylcholine with high selectivity. Since this enzyme strictly recognizes cholinergic structures, it is known that the development of conventional fluorescent probes is difficult.
  • the present invention provides a method capable of detecting the activity of an enzyme, such as acetylcholinesterase (AChE), which recognizes a strict substrate, by a highly sensitive assay at the single-molecule level using a microdevice.
  • an enzyme such as acetylcholinesterase (AChE)
  • AChE acetylcholinesterase
  • the present invention provides a method capable of detecting the activity of an enzyme, such as acetylcholinesterase (AChE), which recognizes a strict substrate, by a highly sensitive assay at the single-molecule level using a microdevice.
  • an enzyme such as acetylcholinesterase (AChE)
  • AChE acetylcholinesterase
  • the present inventors have made extensive studies, and as a result, focused on a coupled assay system that selectively detects specific molecules produced by the metabolic reaction of non-fluorescent natural substrates (or substrate analogues). did. Using this methodology, thiol groups and selenol groups are generated by reactions between enzymes in microdevices and substrate analogues, and fluorescent probes that selectively react with these groups are used to generate acetylcholinesterase-like The inventors have found that it is possible to detect the activity of an enzyme with high substrate specificity, and have completed the present invention.
  • a method for detecting enzyme activity in a biological sample using a microdevice comprising: A step of contacting a biological sample, a substrate analogue or a natural substrate, and a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof,
  • the substrate analog or natural substrate is a compound having a thiol group (R-SH), a selenol group (R-SeH) or a polysulfur atom (R-(S)nH) by reacting with an enzyme.
  • R is a hydrogen atom or an alkyl group, n is 1 to 5
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof is a thiol group, a selenol group, or polysulfur observing or measuring the fluorescence emitted or enhanced from the fluorescent product produced by reacting with the atom; the method.
  • T is a reactive site that reacts with a thiol group (R-SH), a selenol group (R-SeH), a polysulfur atom (R-(S)nH);
  • S is a hydrophilic group selected from the group consisting of a sulfonic acid group, a carboxyl group and a phosphonic acid group;
  • n1 represents an integer from 1 to 10; represents a fluorophore, and the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof reacts with a thiol group, a selenol group or a polysulfur atom to change the optical properties of the entire molecule of the compound.
  • the fluorophore is a BODIPY-based fluorophore, a rhodamine-based fluorophore, a fluorescein-based fluorophore, a rhodol analogue fluorophore, a cyanine-based fluorophore, a resorufin-based fluorophore, or a coumarin-based fluorophore.
  • the reactive site is a nitroolefin group optionally having a substituent, a maleimide, an electron-deficient aryl group, an alkyl or arylsulfonic acid group (R'--SO 3 --; R' is a substituent
  • [5] The method according to [2], wherein the substrate analogue is one or more selected from the group consisting of acetylthiocholine, butylthiocholine, and sulfur-containing lipids.
  • the enzyme to be detected is selected from the group consisting of esterase, lipase, glyoxylase, SAH hydrolase, N-acetyltransferase, cystathionine ⁇ -lyase, S-adenosylhomocysteine hydrolase and cystathionine ⁇ -synthase 1
  • a fluorescent probe for use in a method for detecting the activity of an enzyme in a biological sample using a microdevice comprising A step of contacting a biological sample, a substrate analogue or a natural substrate, and a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof,
  • the substrate analog or natural substrate is a compound having a thiol group (R-SH), a selenol group (R-SeH) or a polysulfur atom (R-(S)nH) by reacting with an enzyme.
  • the substrate analog is a method of producing a compound A having a thiol group, a selenol group (R-SeH) or a polysulfur atom (R-(S)nH) by reacting with an enzyme, The said fluorescent probe containing the compound represented by the said general formula (I), or its salt.
  • T is a reactive site that reacts with a thiol group (R-SH), a selenol group (R-SeH), a polysulfur atom (R-(S)nH);
  • S is a hydrophilic group selected from the group consisting of a sulfonic acid group, a carboxyl group and a phosphonic acid group;
  • n1 represents an integer from 1 to 10; represents a fluorophore, and the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof reacts with a thiol group, a selenol group or a polysulfur atom to change the optical properties of the entire molecule of the compound.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof is It has 1 to 5 hydrophilic groups selected from the group consisting of sulfonic acid groups, carboxyl groups and phosphonic acid groups, and has 1 to 3 reactive sites that react with thiol groups, selenol groups or polysulfur atoms,
  • R a is each independently a hydrogen atom, a monovalent substituent, the hydrophilic group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the hydrophilic group, or the reactive site
  • R b each independently represents a hydrogen atom, a monovalent substituent, the hydrophilic group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the hydrophilic group, or the reactive site
  • R c each independently represents a hydrogen atom, a monovalent substituent, the hydrophilic group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the hydrophilic group, or the reactive site
  • Each X is independently selected from a fluorine atom, an alkyl group, an alkoxy group, an aryl group, the aforementioned hydrophilic group, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the aforementioned hydrophilic group.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof is It has 1 to 5 hydrophilic groups selected from the group consisting of sulfonic acid groups, carboxyl groups and phosphonic acid groups, and has 1 to 3 reactive sites that react with thiol groups, selenol groups or polysulfur atoms, 9.
  • R 1 if present, represents the same or different monovalent substituents present on the benzene ring; s is an integer of 0 to 4, and when s is 2 or more, each R 1 may be the same or different; S3 is a hydrophilic group selected from a sulfonic acid group, a carboxyl group or a phosphonic acid group; t is from 0 to 5: R 2 to R 7 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, the above hydrophilic group, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the above hydrophilic group; T2 is a reactive site that reacts with a thiol group, a selenol group or a polysulfur atom; X 1 and X 2 are selected from the combination of (O, O), (O, NR 8 ), (NR 9 R 10 , NR 8 ), (NR 9 R 10 ,
  • the enzyme to be detected is selected from the group consisting of esterase, lipase, glyoxylase, SAH hydrolase, N-acetyltransferase, cystathionine ⁇ -lyase, S-adenosylhomocysteine hydrolase and cystathionine ⁇ -synthase 1
  • the fluorescent probe according to any one of [8] to [16], which is the above.
  • the fluorescent probe of [17] wherein the enzyme is acetylcholinesterase, phospholipase A2 or glyoxylase 2.
  • a compound represented by the following general formula (IIb) or a salt thereof (I) (In the formula, R 1 , if present, represents the same or different monovalent substituents present on the benzene ring, said substituents being hydrophilic selected from the group consisting of sulfonic acid groups, carboxyl groups and phosphonic acid groups may have a group, m is an integer of 0 to 4, and when m is 2 or more, each R 1 may be the same or different; R 2 to R 7 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, the hydrophilic group or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the hydrophilic group; R 8 represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms; provided
  • the present invention it is possible to effectively detect the enzyme activity of enzymes such as acetylcholinesterase (AChE), phospholipase A2, glyoxylase 2, etc., which recognize strict substrates.
  • enzymes such as acetylcholinesterase (AChE), phospholipase A2, glyoxylase 2, etc.
  • AChE acetylcholinesterase
  • phospholipase A2 phospholipase A2
  • glyoxylase 2 glyoxylase 2
  • a conceptual diagram of the detection method of the present invention is shown using non-limiting examples of combinations of substrate analogs, enzymes and compounds represented by general formula (I). Reaction schemes are shown for how combinations of non-limiting examples of substrate analogues and enzymes that can be used in the detection method of the present invention generate SH groups.
  • AChE is detected using acetylthioester as a substrate analog and a compound of general formula (IIa) as a fluorescent probe
  • BChE is detected using an acetyl selenoester as a substrate analog and a compound of general formula (III) as a fluorescent probe.
  • a color assay is shown. 1 shows the optical properties of Compound 1 and Compound 2 obtained in Synthesis Example 2.
  • FIG. 1 shows the results of a microdevice compatibility study of Compounds 1 and 2.
  • FIG. 4 shows the optical properties of compound 4 and compound 9.
  • FIG. 1 shows the results of a microdevice compatibility study of Compounds 4 and 9.
  • FIG. 4 shows the results of examining the optical properties of Compound 17.
  • FIG. 1 shows the results of examining the compatibility of compound 17 with microdevices.
  • 1 shows the results of LC-MS analysis of a mixture of five compounds of the present invention.
  • the microdevice compatibility results for compounds 1, 2, 4, 9 and 17 are summarized. Schematic diagram of detection of enzymes in blood using a microdevice is shown. 2 shows the results of a blood enzyme detection test using Compound 17.
  • FIG. 2 shows the results of temporal analysis of microdevices containing human plasma in Example 4.
  • Example 4 shows the results of a Glyoxalase2 (GLO2) detection experiment. 1 shows the results of detecting acetylcholinesterase activity in blood using the probe of the present invention having a nitrophenol structure. The results of detection of AChE and phospholipase (PLA2) activities using a probe having a maleimide structure are shown.
  • GLO2 Glyoxalase2
  • halogen atom means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom.
  • alkyl may be straight chain, branched chain, cyclic, or an aliphatic hydrocarbon group consisting of a combination thereof.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group is not particularly limited. ) and 1 to 20 carbon atoms (C 1-20 ). When the number of carbon atoms is specified, it means “alkyl” having the number of carbon atoms within the specified range.
  • C 1-8 alkyl includes methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neo-pentyl, n-hexyl, isohexyl, n-heptyl, n-octyl and the like are included.
  • an alkyl group may have one or more optional substituents.
  • substituents include, but are not limited to, alkoxy groups, halogen atoms, amino groups, mono- or di-substituted amino groups, substituted silyl groups, acyl, and the like.
  • alkyl group When an alkyl group has more than one substituent, they may be the same or different.
  • alkyl moieties of other substituents containing alkyl moieties eg, alkoxy groups, arylalkyl groups, etc.
  • substituents include, but are not limited to, alkyl groups, alkoxy groups, hydroxyl groups, carboxyl groups, halogen atoms, sulfo groups, amino groups, alkoxycarbonyl groups, and oxo groups. These substituents may further have a substituent. Examples of such groups include, but are not limited to, halogenated alkyl groups, dialkylamino groups, and the like.
  • alkoxy group refers to a structure in which the aforementioned alkyl group is bonded to an oxygen atom, and examples thereof include saturated alkoxy groups that are linear, branched, cyclic, or a combination thereof.
  • methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, cyclopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, s-butoxy, t-butoxy, cyclobutoxy, cyclopropylmethoxy, n- Pentyloxy group, cyclopentyloxy group, cyclopropylethyloxy group, cyclobutylmethyloxy group, n-hexyloxy group, cyclohexyloxy group, cyclopropylpropyloxy group, cyclobutylethyloxy group, cyclopentylmethyloxy group and the like are preferred. Examples include:
  • Enzyme activity detection method is a method for detecting enzyme activity in a biological sample using a microchamber device, comprising: A step of contacting a biological sample, a substrate analogue or a natural substrate, and a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof,
  • the substrate analog or natural substrate is a compound having a thiol group (R-SH), a selenol group (R-SeH) or a polysulfur atom (R-(S)nH) by reacting with an enzyme.
  • A is a hydrogen atom or an alkyl group, n is 1 to 5
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof is a thiol group, a selenol group, or polysulfur observing or measuring the fluorescence emitted or enhanced from the fluorescent product produced by reacting with the atom; This is the method (hereinafter also referred to as "the detection method of the present invention").
  • the detection methods of the present invention employ coupled assay methodology utilizing thiols, selenol, and the like. That is, by reacting the enzyme to be detected with a substrate analog to generate thiol groups, selenol groups, etc., and using a fluorescent probe that selectively reacts with these groups, it has high substrate specificity like acetylcholinesterase. Enzyme activity can be detected. Although there have been coupled assays using thiols in the past, they dealt with molecules of 10 8 -10 9 or more as a group based on conventional biochemical analysis methodology.
  • the detection method using the microdevice of the present invention it is possible to detect the activity of an enzyme with high substrate specificity such as acetylcholinesterase. It is possible to detect activity at the single molecule level.
  • FIG. 1 A conceptual diagram of the detection method of the present invention is shown in FIG. 1 using a non-limiting example.
  • a substrate analog oxygen in the ester structure of choline is replaced with sulfur (S), and a compound having an SH group is produced by hydrolysis of the thioester by acetylcholinesterase (AChE), which is reacted with the SH group.
  • a coupled assay system with selective detection by a fluorescent probe having a sexual site is shown. This makes it possible to detect acetylcholinesterase with high sensitivity.
  • the substrate analog used in the detection method of the present invention is a compound having a thiol group (R-SH), a selenol group (R-SeH) or a polysulfur atom (R-(S)nH) by reacting with an enzyme.
  • R is a hydrogen atom or an alkyl group.
  • n is 1-5.
  • the substrate analog preferably has a structure in which one of the oxygen atoms of the carboxylic acid ester of the substrate molecule of the enzyme is replaced with sulfur or selenium.
  • Substrate analogues also preferably have a thioester- or selenoester-like structure and generate the corresponding thiol or selenol group upon enzymatic reaction.
  • substrate analogues examples include acetylthiocholine, butylthiocholine, and sulfur-containing lipids represented by the following structural formulas.
  • Natural substrates include SD-lactoyl-glutathione, S-adenosylhomocysteine, and coenzyme A derivatives.
  • the compounds represented by general formula (I) or salts thereof used in the detection method of the present invention are as follows.
  • T is a reactive site that reacts with a thiol group (R-SH), a selenol group (R-SeH), and a polysulfur atom (R-(S)nH).
  • R is a hydrogen atom or an alkyl group.
  • n is 1-5.
  • the reactive site is preferably an optionally substituted nitroolefin group, maleimides, an electron-deficient aryl group, an alkyl or arylsulfonic acid group (that is, a sulfonic acid substituted with an alkyl group or an aryl group, R'--SO 3 --, where R' represents an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group).
  • An electron-deficient aryl group refers to an aromatic compound substituted with a single or multiple nitro group, halogen group, sulfonic acid group, or the like.
  • a nucleophilic aromatic reaction with a thiol group or the like on an electron-deficient aromatic ring can be used to detect a desired nucleophilic agent. It is more preferable that the reactive site is a nitroolefin group because it has high reactivity with thiols.
  • S is a hydrophilic group selected from the group consisting of sulfonic acid groups, carboxyl groups and phosphonic acid groups.
  • n1 represents an integer of 1 to 10, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2, still more preferably 2.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof reacts with a thiol group, a selenol group or a polysulfur atom to change the optical properties of the entire molecule of the compound. is done.
  • the reactive site of T reacts with a thiol, selenol or polysulfur atom to change the fluorescence properties, and the progress of this chemical reaction is indicated by fluorescence.
  • fluorophores preferably include BODIPY-based fluorophores, rhodamine-based fluorophores, fluorescein-based fluorophores, rhodol analogue fluorophores, cyanine-based fluorophores, resorufin-based fluorophores, and coumarin-based fluorophores.
  • a fluorophore selected from the group consisting of fluorophores.
  • BODIPY-based fluorophores particularly preferred are BODIPY-based fluorophores, rhodamine-based fluorophores, fluorescein-based fluorophores, and rhodol analogue fluorophores.
  • S and T or when there are two or more of these, some of them may be bound to the fluorophore via a linker.
  • the linker is an alkylene group (provided that one or more —CH 2 — of the alkylene group may be substituted with —O—, —S—, —NH—, or —CO—), arylene (heteroarylene including), cycloalkylene, an alkoxyl group, a polyethylene glycol chain, and a group formed by optionally bonding two or more groups selected from these groups.
  • the reactive site and the hydrophilicity are partly or entirely fluorescent via a linker. May be in a group.
  • One preferred embodiment of the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof has 1 to 5 hydrophilic groups selected from the group consisting of a sulfonic acid group, a carboxyl group and a phosphonic acid group, and a thiol group , a selenol group or a polysulfur atom and 1 to 3 reactive sites, represented by the following general formula (II), or a salt thereof.
  • the compound represented by the general formula (II) or a salt thereof is a BODIPY-based fluorophore, and tends to have a high S/N ratio in fluorescence increase upon reaction with a thiol or the like. It is preferable because it is not easily affected by environmental factors such as the above and tends to be resistant to light fading.
  • each R a is independently a hydrogen atom, a monovalent substituent, the hydrophilic group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the hydrophilic group, or the reactive site.
  • Each R b is independently a hydrogen atom, a monovalent substituent, the above hydrophilic group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the above hydrophilic group, or the above reactive site.
  • Each Rc is independently a hydrogen atom, a monovalent substituent, the above hydrophilic group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the above hydrophilic group, or the above reactive site.
  • the types of monovalent substituents represented by R a , R b , and R c are not particularly limited, but examples include an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, and an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • a group consisting of alkynyl groups, alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms, hydroxyl groups, alkoxycarbonyl groups, halogen atoms, carboxyl groups and derivatives thereof (esters, amides, etc.), sulfonic acid groups, phosphonic acid groups, or amino groups is preferably selected from These monovalent substituents may further have one or more optional substituents.
  • the alkyl groups represented by Ra, Rb , and Rc may contain one or more halogen atoms, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, and the like .
  • the alkyl group represented by c may be a halogenated alkyl group, a hydroxyalkyl group, an aminoalkyl group, or the like.
  • Each X is independently selected from a fluorine atom, an alkyl group, an alkoxy group, an aryl group, the hydrophilic group, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the hydrophilic group.
  • One preferred embodiment of the compound represented by the general formula (II) or a salt thereof has 1 to 5 hydrophilic groups selected from the group consisting of a sulfonic acid group, a carboxyl group and a phosphonic acid group, and a thiol group , a compound or a salt thereof represented by the following general formula (IIa) having 1 to 3 reactive sites that react with a selenol group or a polysulfur atom
  • R 1 represents the same or different monovalent substituents present on the benzene ring.
  • the type of monovalent substituent represented by R 1 is not particularly limited, for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkynyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carbon It is preferably selected from the group consisting of 1 to 6 alkoxy groups, hydroxyl groups, alkoxycarbonyl groups, halogen atoms, carboxyl groups and derivatives thereof (esters, amides, etc.), sulfonic acid groups, phosphonic acid groups, or amino groups. .
  • These monovalent substituents may further have one or more optional substituents.
  • the alkyl group represented by R 1 may contain one or more halogen atoms, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, etc.
  • the alkyl group represented by R 1 may be a halogenated alkyl group, a hydroxy It may be an alkyl group, an aminoalkyl group, or the like.
  • the monovalent substituent may have the hydrophilic group.
  • n is an integer of 0 to 4, and when m is 2 or more, each R 1 may be the same or different.
  • One preferred aspect of the compound represented by general formula (IIa) or salt thereof is that m is 0 (ie R 1 is absent).
  • Another preferred aspect of the compound represented by formula (IIa) or a salt thereof is that m is 1 to 2 and R 1 is an alkoxyl group having 1 to 6 carbon atoms (preferably a methoxy group).
  • R 2 to R 7 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, the hydrophilic group or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the hydrophilic group.
  • T1 is a reactive site that reacts with a thiol group, a selenol group, and a polysulfur atom. Two or more T 1 may be bonded to the benzene ring.
  • the reactive site of T1 is preferably an optionally substituted nitroolefin group or a maleimide group.
  • X 1 and X 2 each independently represent a fluorine atom, an alkyl group, an alkoxy group, an aryl group, the hydrophilic group, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the hydrophilic group. is selected from
  • a preferred embodiment of the compound represented by the general formula (IIa) or a salt thereof is the compound represented by the following general formula (IIb) or a salt thereof.
  • R 1 to R 7 , X 1 , X 2 and m are as defined in general formula (IIa).
  • R 8 represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • two or more optionally substituted nitroolefin moieties may be bonded to the benzene ring.
  • R 2 , R 4 , R 5 and R 7 are all preferably methyl groups.
  • the nitroolefin moiety is preferably bonded to the 2- or 4-position of the benzene ring.
  • At least one of R 3 and R 6 is a sulfonic acid group, a carboxyl group or a phosphonic acid group. At least one of R 3 and R 6 is preferably a carboxyl group or a phosphonic acid group, more preferably a sulfonic acid group.
  • a sulfonic acid group has particularly high water solubility, and when a compound having a sulfonic acid group is used, adsorption to a microdevice is not observed, and it can be suitably used for single-molecule detection of enzymatic activity.
  • At least one, preferably two of R 3 and R 6 are sulfonic acid groups.
  • At least one, preferably two of R 3 and R 6 are carboxyl groups.
  • One more preferred embodiment of the compound of general formula (IIb) or a salt thereof At least one, preferably two of R 3 and R 6 are phosphonic acid groups.
  • the compound of general formula (IIb) or a salt thereof has 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 2 hydrophilic groups selected from the group consisting of a sulfonic acid group, a carboxyl group and a phosphonic acid group. have.
  • the compound of general formula (IIb) or a salt thereof has 1 to 3, preferably 1 to 2, more preferably 1 nitroolefin moiety.
  • a preferred embodiment of the compound represented by the general formula (IIa) or a salt thereof is the compound represented by the following general formula (IIc) or a salt thereof.
  • R 1 to R 7 , X 1 , X 2 and m are as defined in general formula (IIa).
  • two or more optionally substituted maleimide groups may be bonded to the benzene ring.
  • R 2 , R 4 , R 5 and R 7 are all preferably methyl groups.
  • At least one of R3 and R6 is a sulfonic acid group, a carboxyl group or a phosphonic acid group. At least one of R 3 and R 6 is preferably a carboxyl group or a phosphonic acid group, more preferably a sulfonic acid group.
  • a sulfonic acid group has particularly high water solubility, and when a compound having a sulfonic acid group is used, adsorption to a microdevice is not observed, and it can be suitably used for single-molecule detection of enzymatic activity.
  • At least one, preferably two of R 3 and R 6 are sulfonic acid groups.
  • At least one, preferably two of R 3 and R 6 are carboxyl groups.
  • the compound of general formula (IIc) or a salt thereof has 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 2 hydrophilic groups selected from the group consisting of a sulfonic acid group, a carboxyl group and a phosphonic acid group. have.
  • the compound of general formula (IIb) or a salt thereof has 1 to 3, preferably 1 to 2, more preferably 1 nitroolefin moiety.
  • Another preferred embodiment of the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof has 1 to 5 hydrophilic groups selected from the group consisting of a sulfonic acid group, a carboxyl group and a phosphonic acid group, and a thiol
  • R 1 if present, represents the same or different monovalent substituents present on the benzene ring.
  • R 1 is not particularly limited, for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkynyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carbon It is preferably selected from the group consisting of 1 to 6 alkoxy groups, hydroxyl groups, alkoxycarbonyl groups, halogen atoms, carboxyl groups and derivatives thereof (esters, amides, etc.), sulfonic acid groups, phosphonic acid groups, or amino groups. . These monovalent substituents may further have one or more optional substituents.
  • the alkyl group represented by R 1 may contain one or more halogen atoms, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, etc.
  • the alkyl group represented by R 1 may be a halogenated alkyl group, a hydroxyalkyl group, or the like. group, aminoalkyl group, or the like.
  • s is an integer of 0 to 4, and when s is 2 or more, each R 1 may be the same or different.
  • One preferred aspect of the compound represented by general formula (III) or a salt thereof is that m is 0 (ie R 1 is absent).
  • Another preferred aspect of the compound represented by formula (III) or a salt thereof is that m is 1 to 2 and R 1 is an alkoxyl group having 1 to 6 carbon atoms (preferably a methoxy group).
  • S3 is selected from a sulfonic acid group, a carboxyl group or a phosphonic acid group.
  • t is 0 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 or 2.
  • R 2 to R 7 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, the hydrophilic group, or a hydrophilic group having 1 to 6 carbon atoms. is an alkyl group.
  • T2 is a reactive site that reacts with thiol groups, selenol groups and polysulfur atoms.
  • the reactive site of T2 is preferably selected from any of the following.
  • * represents a binding site
  • X 1 and X 2 are selected from combinations of (O, O), (O, NR 8 ), (NR 9 R 10 , NR 8 ), (NR 9 R 10 , NR 8 ).
  • R 8 to R 10 each independently represent a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a substituted or unsubstituted alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, or the above hydrophilic group. an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms having the hydrophilic group.
  • Y is an oxygen atom, Si(R a )(R b ), C(R a )(R b ), P( ⁇ O)R c , S(R d ) 2 , Ge(R a )(R b ) , a tellurium atom or a bismuth atom.
  • R a and R b are each independently a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a substituted or unsubstituted aryl group.
  • R c is a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a substituted or unsubstituted phenyl group.
  • R d is the same or different, substituted or unsubstituted aryl group.
  • the alkyl group, aryl group, and phenyl group of R a to R d may be substituted with the hydrophilic group.
  • the compounds represented by general formulas (I), (II), (IIa), (IIb), (IIc), and (III) are acid addition salts or They can exist as base addition salts.
  • Acid addition salts include, for example, mineral acid salts such as hydrochlorides, sulfates and nitrates, or organic acid salts such as methanesulfonates, p-toluenesulfonates, oxalates, citrates and tartrates.
  • base addition salts include metal salts such as sodium, potassium, calcium and magnesium salts, ammonium salts, organic amine salts such as triethylamine salts, and the like. In addition to these, it may form a salt with an amino acid such as glycine.
  • the compounds represented by formulas (I) and (Ia) or salts thereof may exist as hydrates or solvates, and these substances can also be used in the present invention.
  • the compounds of the present invention also include stereoisomers such as tautomers, geometric isomers (eg, E-isomer, Z-isomer, etc.), and enantiomers. That is, when the compound of the present invention contains one or two or more asymmetric carbon atoms, the stereochemistry of the asymmetric carbon atoms is independently either the (R)-form or the (S)-form. and may exist as stereoisomers such as enantiomers or diastereomers of said derivatives. Therefore, as the active ingredient of the fluorescent probe used in the detection method of the present invention, any stereoisomer in a pure form, any mixture of stereoisomers, a racemate, etc. can be used, any of which can be used according to the present invention. is included in the range of
  • the enzyme to be detected is one or more selected from the group consisting of esterase, lipase, glyoxylase, SAH hydrolase, N-acetyltransferase, cystathionine ⁇ -lyase, and cystathionine ⁇ -synthase. and preferably acetylcholinesterase, phospholipase A2 or glyoxylase 2.
  • Fig. 2 shows a reaction scheme for how a combination of a substrate analog and an enzyme that can be used in the detection method of the present invention generates an SH group.
  • the scope of the detection method of the present invention is not limited to the combination of these substrate analogues and enzymes.
  • a microdevice can be suitably used in the detection method of the present invention.
  • Microdevices include microchamber devices, liposomes, droplets, and the like. In the following, microdevices will be described using a microchamber type device as an example.
  • the material of the microdevice is not particularly limited, and examples include glass materials, silicon, plastics including dendritic polymers or copolymers, and the like.
  • glass materials include soda-lime glass, Pyrex (registered trademark) glass, Vycol (registered trademark) glass, and quartz glass.
  • resin polymers include poly(vinyl chloride), poly(vinyl alcohol), poly(methyl methacrylate), poly(vinyl acetate-co-maleic anhydride), poly(dimethylsiloxane) monomethacrylate, cyclic olefin polymers, Examples include fluorocarbon polymers, polystyrene, polypropylene, polyethyleneimine, and the like.
  • Copolymers include, for example, poly(vinyl acetate-co-maleic anhydride), poly(styrene-co-maleic anhydride), poly(ethylene-co-acrylic acid), or derivatives thereof.
  • the shape of the microdevice includes a multiwell plate in which any number of wells (for example, microwells) are arranged.
  • the number of wells per plate is, for example, 1 to 10,000,000, such as 10 to 500,000, such as about 100,000.
  • the pore diameter of the wells of the microdevice may be, for example, 10 nm or more and 10 ⁇ m or less, for example, 100 nm or more and 10 ⁇ m or less, or for example, 1 ⁇ m or more and 10 ⁇ m or less.
  • the depth of the well of the microdevice may be, for example, 10 nm or more and 100 ⁇ m or less, for example, 100 nm or more and 80 ⁇ m or less, or, for example, 200 nm or more and 70 ⁇ m or less.
  • the amount of the compound of the present invention contained in one well of the microdevice may be, for example, 100 nM or more and 1000 ⁇ M or less, for example, 1 ⁇ M or more and 1000 ⁇ M or less, for example, 10 ⁇ M or more and 1000 ⁇ M or less.
  • the amount of the substrate analog contained in one well of the microdevice may be, for example, 100 nM or more and 100,000 ⁇ M or less, for example, 1 ⁇ M or more and 100,000 ⁇ M or less, for example, 10 ⁇ M or more and 100,000 ⁇ M or less. Just do it.
  • a solution containing a biological sample is added to the microdevice.
  • a drop of sealing oil is then applied to encapsulate the target enzyme in the biological sample within the well of the microdevice.
  • the compound of the present invention and substrate analogue may be added to the solution containing the biological sample.
  • a solution other than the enzyme may be added later.
  • the detection method of the present invention includes the step of contacting a biological sample, a substrate analog, and a compound of the present invention.
  • Biological samples include, for example, biological samples isolated from subjects, biopsy samples, body fluid samples, and aqueous solutions.
  • the biological sample can be a blood sample (eg, a serum sample, or a plasma sample).
  • Contacting can be performed by mixing the biological sample, the substrate analog, and the compound of the present invention.
  • a biological sample may be diluted in advance to a predetermined magnification.
  • the detection method of the present invention detects fluorescence emitted or enhanced from a fluorescent product produced by reacting a compound represented by general formula (I) or a salt thereof with a thiol group, a selenol group or a polysulfur atom. Including the step of observing or measuring.
  • the fluorescent product fluoresces, the presence or absence of fluorescence indicates the presence of enzyme activity in aqueous solution, and the intensity of fluorescence indicates the intensity of enzyme activity in aqueous solution.
  • the contact is performed in the presence of plasma.
  • a solution containing a biological sample is added to a microdevice comprising the compound of the present invention and a substrate analogue.
  • Biological samples include, for example, biological samples isolated from subjects, biopsy samples, body fluid samples, and aqueous solutions.
  • the biological sample may be a blood sample (eg, serum sample or plasma sample) Any pH value may be selected for the solution containing the biological sample.
  • the pH of the solution can be set to a value close to that in vivo, and in this case, it may be 6.0 or more and 8.0 or less.
  • the pH of the solution can be acidified to the pH optimum in order to target specific groups of enzymes.
  • a solution containing the biological sample, a solution containing the fluorescent probe of the present invention, and a solution containing the substrate analogue are separately prepared, and the ratios of the biological sample, the fluorescent probe, and the substrate analogue are appropriately adjusted and mixed.
  • the mixed solution may be added to the microdevice.
  • the protein concentration of the biological sample is usually, for example, 1 pM or more and 100 pM or less, such as 10 pM or more and 100 pM or less, as the concentration of the "target protein". Also, the upper limit of the total protein concentration in the sample can be set to about 10 ⁇ M, for example.
  • a method for measuring the protein concentration of a biological sample for example, a method using an antibody-antigen reaction (eg, ELISA method, etc.) can be used as a method for measuring the concentration of the “target protein”.
  • Methods for measuring the total protein concentration in a sample include colorimetric methods that utilize reactions between proteins and reagents (eg, bicinchoninic acid (BCA) method, Bradford method, Lowry method, Biuret method, etc.). be done.
  • the biological sample may be diluted with various aqueous solvents or the like so as to achieve the above concentrations.
  • the aqueous solvent include water, physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), Tris buffered saline (TBS), HEPES buffered saline, and the like. , but not limited to.
  • Step 2 Sealing oil is then dripped to encapsulate the enzymes in the biological sample within the wells of the microdevice.
  • the sealing oil any known oil that is usually used for encapsulating a sample in a microdevice may be used, and examples thereof include fluorine-based oil (FC-40, etc.).
  • Step 3 Fluorescence within the wells of the microdevice is then detected using a fluorescence scanner, fluorescence microscope, or the like. Enzyme activity can be evaluated from the detected fluorescence intensity.
  • what kind of enzyme is contained in the well of the microdevice where the enzyme activity is detected can be determined, for example, by comparing the separately prepared target protein with the enzyme activity pattern.
  • the detection method of the present invention can further include observing the fluorescence response using fluorescence imaging means.
  • a fluorometer having a wide measurement wavelength can be used, but the fluorescence response can also be visualized using fluorescence imaging means capable of displaying a two-dimensional image.
  • fluorescence imaging By using the means of fluorescence imaging, the fluorescence response can be visualized in two dimensions, so that the target enzyme can be visualized instantaneously.
  • a device known in the art can be used as the fluorescence imaging device.
  • it is also possible to detect the reaction between the sample to be measured and the fluorescent probe by means of a change in the ultraviolet-visible absorption spectrum (for example, a change in absorbance at a specific absorption wavelength).
  • FIG. 3 shows the detection of AChE using acetylthioester as a substrate analogue and the compound of general formula (IIa) as a fluorescent probe, and BChE using acetylselenoester as a substrate analogue and the compound of general formula (III) as a fluorescent probe. shows a multicolor assay that detects .
  • Fluorescent Probe Another embodiment of the present invention is a fluorescent probe for use in a method for detecting enzyme activity in a biological sample using a microdevice, the method comprising: A step of contacting a biological sample, a substrate analogue or a natural substrate, and a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof,
  • the substrate analog or natural substrate is a compound having a thiol group (R-SH), a selenol group (R-SeH) or a polysulfur atom (R-(S)nH) by reacting with an enzyme.
  • the substrate analog is a method of producing a compound A having a thiol group, a selenol group (R-SeH) or a polysulfur atom (R-(S)nH) by reacting with an enzyme,
  • a fluorescent probe containing the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof hereinafter also referred to as "the fluorescent probe of the present invention”.
  • the fluorescent probe of the present invention in the detection method using the microdevice of the present invention, it is possible to detect the activity of an enzyme with high substrate specificity such as acetylcholinesterase. It is possible to detect the activity of specific enzymes at the single-molecule level.
  • the linker is an alkylene group (provided that one or more —CH 2 — of the alkylene group may be substituted with —O—, —S—, —NH—, or —CO—), arylene (heteroarylene including), cycloalkylene, an alkoxyl group, a polyethylene glycol chain, and a group formed by optionally bonding two or more groups selected from these groups.
  • the reactive site and the hydrophilicity are partly or entirely fluorescent via a linker. May be in a group.
  • the compound represented by general formula (I) or a salt thereof has 1 to A compound represented by the following general formula (II) or a salt thereof, having 5 reactive sites and 1 to 3 reactive sites that react with a thiol group, selenol group or polysulfur atom.
  • the compound represented by the general formula (II) or a salt thereof is a compound represented by the following general formula (IIa) or a salt thereof.
  • the compound represented by the general formula (IIa) or a salt thereof is a compound represented by the following general formula (IIb) or a salt thereof.
  • the compound represented by the general formula (IIb) or a salt thereof is a compound represented by the following general formula (IIc) or a salt thereof.
  • the compound represented by general formula (I) or a salt thereof is a compound represented by general formula (III) or a salt thereof.
  • the reactive site of T2 is preferably either: (In the formula, * represents a binding site.)
  • the substrate analog used in the detection method using the fluorescent probe of the present invention preferably has a structure in which one of the oxygen atoms of the carboxylic acid ester of the substrate molecule of the enzyme to be detected is replaced with sulfur or selenium.
  • Substrate analogues also preferably have a thioester- or selenoester-like structure and generate the corresponding thiol or selenol group upon enzymatic reaction.
  • substrate analogues examples include acetylthiocholine, butylthiocholine, and sulfur-containing lipids represented by the following structural formulas.
  • Natural substrates include SD-lactoyl-glutathione, S-adenosylhomocysteine, and coenzyme A derivatives.
  • Examples of combinations of natural substrates and enzymes that use them include natural substrates/enzymes (Japanese names): S-adenosylhomocysteine/S-adenosylhomocysteine hydrolase, SD-lactoylglutathione/glyoxy enzymes, coenzyme A derivatives/acetyltransferases.
  • the fluorescent probe of the present invention is preferably selected from the group consisting of esterase, lipase, glyoxylase, SAH hydrolase, N-acetyltransferase, cystathionine ⁇ -lyase, cystathionine ⁇ -synthase, and S-adenosylhomocysteine hydrolase. More preferably, it can be used to detect acetylcholinesterase, phospholipase A2 or glyoxylase-2.
  • the method of using the fluorescent probe of the present invention is not particularly limited, and it can be used in the same manner as conventionally known fluorescent probes.
  • the compound of the present invention or a salt thereof is added to an aqueous medium such as physiological saline or a buffer solution, or a mixture of a water-miscible organic solvent such as ethanol, acetone, ethylene glycol, dimethylsulfoxide and dimethylformamide and an aqueous medium. is dissolved, the solution is added to an appropriate buffer containing cells or tissues, and the fluorescence spectrum is measured.
  • the fluorescent probe of the present invention may be used in the form of a composition in combination with suitable additives. For example, it can be combined with additives such as buffers, solubilizers, and pH adjusters.
  • the fluorescent probe of the present invention can be suitably used for enzymatic activity detection methods using microdevices. Therefore, by providing the fluorescent probe and substrate analogue of the present invention in the well of the microdevice, they can be used in a method for detecting the enzymatic activity of a target hydrolase in a biological sample.
  • Microdevices include microchamber devices, liposomes, droplets, and the like. Details of the microdevice are as described in detail in the detection method of the present invention.
  • Another embodiment of the present invention is an enzyme detection kit containing the compound of general formula (I) or a salt thereof or a substrate analogue.
  • the compound of general formula (I) or a salt thereof is usually prepared as a solution. It can also be applied by dissolving in distilled water for injection or an appropriate buffer at the time of use.
  • kit may contain other reagents and the like as necessary.
  • additives such as dissolution aids, pH adjusters, buffers, tonicity agents, and the like can be used, and the amount of these additives can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • R 1 represents the same or different monovalent substituents present on the benzene ring.
  • the type of monovalent substituent represented by R 1 is not particularly limited, for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkynyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carbon It is preferably selected from the group consisting of 1 to 6 alkoxy groups, hydroxyl groups, alkoxycarbonyl groups, halogen atoms, carboxyl groups and derivatives thereof (esters, amides, etc.), sulfonic acid groups, phosphonic acid groups, or amino groups. .
  • These monovalent substituents may further have one or more optional substituents.
  • the alkyl group represented by R 1 may contain one or more halogen atoms, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, etc.
  • the alkyl group represented by R 1 may be a halogenated alkyl group, a hydroxy It may be an alkyl group, an aminoalkyl group, or the like.
  • the monovalent substituent may have the hydrophilic group.
  • n is an integer of 0 to 4, and when m is 2 or more, each R 1 may be the same or different.
  • m is 0 (ie R 1 is absent).
  • Another preferred aspect of the compound represented by the general formula (IIb) or a salt thereof is that m is 1 to 2 and R 1 is an alkoxyl group having 1 to 6 carbon atoms (preferably a methoxy group).
  • R 8 represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • R 2 to R 7 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, the hydrophilic group, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having the hydrophilic group. is.
  • R 2 , R 4 , R 5 and R 7 are all preferably methyl groups.
  • nitroolefin moieties may be bonded to the benzene ring.
  • the nitroolefin moiety is preferably attached to the 2- or 4-position of the benzene ring.
  • At least one of R 3 and R 6 is a sulfonic acid group, a carboxyl group or a phosphonic acid group. At least one of R 3 and R 6 is preferably a carboxyl group or a phosphonic acid group, more preferably a sulfonic acid group.
  • a sulfonic acid group has particularly high water solubility, and when a compound having a sulfonic acid group is used, adsorption to a microdevice is not observed, and it can be suitably used for single-molecule detection of enzymatic activity.
  • At least one, preferably two of R 3 and R 6 are sulfonic acid groups.
  • At least one, preferably two of R 3 and R 6 are carboxyl groups.
  • One more preferred embodiment of the compound of general formula (IIb) or a salt thereof At least one, preferably two of R 3 and R 6 are phosphonic acid groups.
  • the compound of general formula (IIb) or a salt thereof has 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 2 hydrophilic groups selected from the group consisting of a sulfonic acid group, a carboxyl group and a phosphonic acid group. have.
  • the compound of general formula (IIb) or a salt thereof has 1 to 3, preferably 1 to 2, more preferably 1 nitroolefin moiety.
  • Another embodiment of the present invention is a compound represented by the following general formula (IIc) or a salt thereof.
  • R 1 to R 7 , X 1 , X 2 and m are as defined in general formulas (IIa) and (IIb).
  • two or more optionally substituted maleimide groups may be bonded to the benzene ring.
  • R 2 , R 4 , R 5 and R 7 are all preferably methyl groups.
  • At least one of R3 and R6 is a sulfonic acid group, a carboxyl group or a phosphonic acid group. At least one of R 3 and R 6 is preferably a carboxyl group or a phosphonic acid group, more preferably a sulfonic acid group.
  • a sulfonic acid group has particularly high water solubility, and when a compound having a sulfonic acid group is used, adsorption to a microdevice is not observed, and it can be suitably used for single-molecule detection of enzymatic activity.
  • At least one, preferably two of R 3 and R 6 are sulfonic acid groups.
  • At least one, preferably two of R 3 and R 6 are carboxyl groups.
  • the compounds represented by general formulas (IIb) and (IIc) can exist as acid addition salts or base addition salts.
  • Acid addition salts include, for example, mineral acid salts such as hydrochlorides, sulfates and nitrates, or organic acid salts such as methanesulfonates, p-toluenesulfonates, oxalates, citrates and tartrates.
  • base addition salts include metal salts such as sodium, potassium, calcium and magnesium salts, ammonium salts, organic amine salts such as triethylamine salts, and the like. In addition to these, it may form a salt with an amino acid such as glycine.
  • the compounds represented by formulas (I) and (Ia) or salts thereof may exist as hydrates or solvates, and these substances can also be used in the present invention.
  • the compounds represented by general formulas (IIb) and (IIc) may also be stereoisomers such as tautomers, geometric isomers (e.g., E isomer, Z isomer, etc.), enantiomers, etc. included. That is, when the compound of the present invention contains one or two or more asymmetric carbon atoms, the stereochemistry of the asymmetric carbon atoms is independently either the (R)-form or the (S)-form. and may exist as stereoisomers such as enantiomers or diastereomers of said derivatives.
  • stereoisomers such as tautomers, geometric isomers (e.g., E isomer, Z isomer, etc.), enantiomers, etc. included. That is, when the compound of the present invention contains one or two or more asymmetric carbon atoms, the stereochemistry of the asymmetric carbon atoms is independently either the (R)-form or the (S)-form. and may exist as stereoisomers such as
  • any stereoisomer in a pure form, any mixture of stereoisomers, a racemate, etc. can be used, any of which can be used according to the present invention. is included in the range of
  • Non-limiting examples of compounds of general formula (IIb), (IIc) or salts thereof are shown below.
  • the method for producing the compounds represented by the general formulas (IIb), (IIc), and (III) or salts thereof is not particularly limited. Specific examples are shown. Those skilled in the art can refer to the examples of the present specification and the following schemes and, if necessary, modify or modify the starting materials, reaction reagents, reaction conditions, etc., to obtain the general formulas (IIa) (IIc), ( A compound represented by III) can be prepared.
  • Eluent A H2O with 0.1% TFA
  • Eluent B 80% acetonitrile and 20% H2O with 0.1% TFA
  • Eluent C H2O with 100 mM triethylammonium acetate
  • eluent D 80% acetonitrile and 20% H 2 O containing 100 mM triethylammonium acetate
  • LC-MS analysis was performed on a Waters Acquity UPLC (H-class)/QDa quadrupole MS analyzer equipped with an Acquity UPLC BEH C18 column (Waters) or an Acquity UPLC (H-class)/Xevo TQD quadrupole MS/MS analyzer.
  • UV-Vis Absorption and Fluorescence Spectroscopy UV-Vis spectra were obtained with a Shimadzu UV-1800. Fluorescence spectroscopy studies were performed using a Hitachi F7000. The slit width was 5 nm for both excitation and emission. The photomultiplier tube voltage was 400V.
  • Enzyme assay was performed in phosphate-buffered saline (pH 7.4). A half-area 384-well plate (Corning 3677) was used for the assay (20 ⁇ L reaction volume). Fluorescence was detected on a plate reader, EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin Elmer) with appropriate filter settings.
  • Plasma samples and code of ethics Plasma samples were obtained from the National Cancer Center Hospital (Tokyo, Japan), Osaka Medical Center (Osaka, Japan), Osaka Medical College (Takatsuki City, Japan), and independent administrative agency pharmaceuticals.
  • Osaka Medical Center Osaka, Japan
  • Osaka Medical College Osaka Medical College (Takatsuki City, Japan)
  • independent administrative agency pharmaceuticals In the health science basic research promotion project and the Kagoshima Prefectural General Health Center, which are carried out by the Basic Research Institute and the Health Labor Science Research Grant of the Ministry of Health, Labor and Welfare, P-CREATE 36-39 project of the Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) taken as part of Ethical approval for this study was obtained from the Nippon Medical School Central Ethics Committee (M-2021-002) and the Nippon Medical School Ethics Committee (A-2020-032 and A-2020-044).
  • Phosphorus oxychloride (2 mL) was added dropwise to dimethylformamide (2 mL) in an ice batch for 5 minutes under Ar atmosphere. The solution was warmed to room temperature and stirred for 30 minutes. 8-(p-Nitroolefin)-BODIPY (20 mg, 0.050 mmol) was added to dichloroethane (10 mL), the temperature was raised to 50° C. and the reaction mixture was stirred for 30 minutes. The reaction mixture was then cooled to room temperature and quenched with saturated aqueous NaHCO3. The aqueous layer was then extracted with CH2Cl2 .
  • the residual red solid was purified with a filtration column (alumina).
  • the obtained crude dipyrromethene was dissolved in toluene and N,N-diisopropyl-N-ethylamine (DIEA; 2 mL).
  • DIEA N,N-diisopropyl-N-ethylamine
  • BF 3 —OEt 2 1.5 mL was added dropwise under Ar atmosphere and stirred at room temperature for 1 hour. AcOEt was then added and the mixture was washed with brine, dried over Na2SO4 , filtered and evaporated .
  • the resulting residue was purified by MPLC (silica gel, 80/20 to 0/100 hexanes/AcOEt) to give compound 5 (orange solid, 120 mg, 33% yield).
  • tert-Butyl-3-oxobutanoic acid (8 mL, 48 mmol) was dissolved in acetic acid (20 mL) in a round bottom flask and cooled to about 10° C. in an ice bath.
  • Sodium nitrite (3.6 g, 52 mmol) was added over 30 minutes while maintaining the temperature below 15°C. The cold water bath was removed and the mixture was stirred at room temperature for 3.5 hours.
  • the reaction mixture was diluted with CH 2 Cl 2 , washed with saturated aqueous NaHCO 3 and brine, dried over anhydrous Na 2 SO 4 , filtered and the solvent removed under reduced pressure. Crude compound 10 was used in the next step without further purification.
  • Zinc dust (1.3 g, 20 mmol) was added in portions to a stirred mixture of diethyl (2-oxopropyl) phosphonate (3.5 mL, 20 mmol). The mixture was heated to 60°C. At this temperature crude compound 10 (3.6 g, 20 mmol) in acetic acid (3 mL) slowly precipitated. The temperature was then raised to 75° C. and held for 1 hour. The reaction mixture was diluted with CH2Cl2 , washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4 , filtered and the solvent removed under reduced pressure .
  • FIG. 4(a) shows the absorption and emission spectra of Compounds 1 and 2, respectively. These spectra were measured at pH 7.4 in 0.1 M sodium phosphate buffer with 0.1% DMSO as co-solvent. Glutathione (GSH; 100 ⁇ M) was added as a model thiol. Fluorescence spectra were measured under 460 nm excitation.
  • FIG. 4(b) shows the absorbance, emission maximum wavelength and quantum yield of compounds 1 and 2.
  • FIG. All data were measured in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.4.
  • FIG. 5 shows the results of examining the compatibility of compounds 1 and 2 with microdevices.
  • FIG. 5(a) shows a photograph of three types of probes including 2,6-unsubstituted BODIPY and GSH supplemented with octanol and water.
  • FIG. 5(b) shows a fluorescence image of a microdevice loaded with probes and reacted with thiols.
  • FIG. 5(c) shows a schematic diagram of an acetylthiocholine-based coupled assay for the detection of cholinesterase (ChE) activity.
  • (d) of FIG. 5 is a microdevice containing human plasma, which was incubated at 37° C.
  • the upper figure shows the results of a plasma sample (1000-fold dilution) containing no acetylthiocholine iodide, and the lower figure shows the results of a plasma sample (1000-fold dilution) to which acetylthiocholine iodide (1 mM) was added.
  • Example 2 (1) Optical Properties of Compound 4 and Compound 9
  • the optical properties of Compound 4 obtained in Synthesis Example 3 and Compound 9 obtained in Synthesis Example 4 were evaluated. The results are shown in FIG. 6
  • FIG. 6 shows the absorption and emission spectra of compounds 4 and 9, respectively. These spectra were measured at pH 7.4 in 0.1 M sodium phosphate buffer with 0.1% DMSO as co-solvent. GSH (100 ⁇ M) was added as a model thiol. Fluorescence spectra were measured under 460 nm excitation. Also shown are the maximum wavelengths of absorption and emission for each probe.
  • FIG. 7(a) shows a photograph (water-octanol distribution experiment) of each probe and GSH supplemented with octanol and water.
  • FIG. 7(b) shows a fluorescence image of a microdevice loaded with probes and reacted with thiols.
  • FIG. 8(a) shows the absorption spectrum and emission spectrum of compound 17, respectively. These spectra were measured at pH 7.4 in 0.1 M sodium phosphate buffer with 0.1% DMSO as co-solvent. GSH (100 ⁇ M) was added as a model thiol. Fluorescence spectra were measured under 470 nm excitation.
  • FIG. 8(b) shows the absorbance, emission maximum wavelength, and quantum yield of the probe. All data were measured in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.4.
  • FIG. 8 shows the results of examining the compatibility of compound 17 with microdevices.
  • Figure 9 shows that human plasma (3000-fold dilution) was mixed with fluorescent probe (compound 17; 30 ⁇ M) and treated with HEPES buffer (10 mM, pH 7.4, 0.1) with or without acetylthiocholine iodide (1 mM). Fluorescent images of microdevices placed in 10% CHAPS) are shown. Images were acquired after 30 min incubation at 25°C.
  • FIG. 10 shows a mixture of 5 compounds analyzed by LC-MS and the extract ion chromatogram for each compound in indicated colors. From the left, the results for diphosphonic acid, dicarboxylic acid, disulfonic acid, monosulfonic acid, and monocarboxylic acid are shown.
  • A/B 100/0 at 0.5 min detected at 500 nm (eluent A: H2O containing 10 mM ammonium formate; eluent B: acetonitrile 80%, H2O containing 10 mM ammonium formate 20%). Eluted with a linear gradient from 100/0 to 0/100 in 3 minutes.
  • FIG. 11 summarizes the microdevice compatibility results of compounds 1, 2, 4, 9 and 17 performed in Examples 1 to 3.
  • Example 4 Next, using compound 17 (2,6-diPO 3 H 2 nitroolefin BODIPY) studied in Example 3, it was verified whether it was possible to detect enzymatic activity in human blood using a microdevice. First, various parameters were set, and the following conditions were set as optimum conditions.
  • FIG. 12 shows a schematic diagram of detection of enzymes in blood using a microdevice.
  • FIG. 13 shows the measurement results.
  • Figure 13 shows human plasma (3000-fold and 1 10,000-fold dilution) is a fluorescence image of a microdevice. Images were acquired after 30 min incubation at 25°C.
  • FIG. 14 shows time course analysis of fluorescence images of microdevices containing human plasma.
  • the top panel is a fluorescence image of a microdevice loaded with probe (30 ⁇ M), acetylthiocholine (1 mM), and a 1:10,000 diluted plasma sample from a healthy human subject. Images were acquired 2-10 minutes after sealing.
  • White arrows indicate chambers containing fast-reacting enzymes and white arrowheads indicate chambers containing slow-reacting enzymes.
  • the bottom panel shows the normalized fluorescence intensity of the device by line-scan analysis along the ROI indicated by the white line in the 10 min image.
  • the resulting fluorescence image of the microdevice containing human plasma is shown in FIG.
  • the upper panel shows human plasma mixed with a fluorescent probe (Compound 17; 30 ⁇ M) and acetylthiocholine iodide (1 mM) in HEPES buffer (10 mM, pH 7.4, containing 0.1% CHAPS) (10,000 ⁇ ). Diluted) is a fluorescence image of a microdevice. Images were acquired after a 5 minute incubation at 25°C. The lower part of the figure shows a histogram showing the number of plotted chambers and the increase in fluorescence.
  • Glyoxalase2 (GLO2) Detection
  • GLO2 is known to play a role in the glyoxalase metabolic pathway responsible for the 2-methylglyoxal metabolic system, and to cause abnormal activity in many cancers. Since GLO2 metabolizes SD-lactoyl-glutathione (see reaction scheme below), it is possible to construct a coupled assay using the probe of the present invention.
  • FIG. 16 shows the results of detecting the activity of hydrolyzing the ester of glutathione (considered to be GLO2) in blood.
  • the fluorescent probe of the present invention can use highly electrophilic compounds such as nitrophenols and maleimide or groups thereof as reaction points that react with substrate analogs. .
  • highly electrophilic compounds such as nitrophenols and maleimide or groups thereof as reaction points that react with substrate analogs. .
  • the results of verifying the applicability of nitrophenols to single-molecule measurement and the results of verifying the applicability of maleimides to coupled assays are shown below.
  • FIG. 17 shows the fluorescent probe of the present invention (2.4-dinitro sTM, 1 ⁇ M) represented by the following formula in HEPES buffer (10 mM, pH 7.4, containing 0.1% CHAPS) and iodine. Fluorescent images of microdevices containing human plasma (1:1000 dilution) mixed with acetylthiocholine (1 mM). Images were acquired after 90 minutes at 37°C.
  • the activity of acetylcholinesterase in blood could be detected by using the probe of the present invention having a nitrophenol structure.
  • FIG. 18 shows the results of AChE and phospholipase (PLA2) activity detection using a probe having a maleimide structure.
  • PPA2 phospholipase
  • FIG. 18 shows the fluorescence spectrum of the solution obtained by reacting the sulfur-containing lipid analog and phospholipase A2 (PLA2) described above with the probe having the maleimide group described in the figure added.
  • PPA2 sulfur-containing lipid analog and phospholipase A2

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Abstract

【解決手段】　アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のような厳密な基質認識をするような酵素についても、酵素の活性を検出することが可能な方法を提供すること。 【解決課題】　マイクロデバイスを用いて、生体試料中の酵素の活性を検出する方法であって、　生体試料と、基質アナログ又は天然基質と、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを接触させる工程であって、　ここで、前記基質アナログ又は天然基質は、酵素と反応することにより、チオール基（Ｒ－ＳＨ）、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）又はポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）を有する化合物Ａ（Ｒは、水素原子又はアルキル基であり、ｎは、１～５である）を生成し、及び　該一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩がチオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応することにより生成する蛍光性生成物から発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含む、 当該方法。

Description

酵素活性の検出方法、及び当該方法に用いる蛍光プローブ
　本発明は、マイクロデバイス中で、酵素と基質アナログとの反応により生成するチオール基、セレノール基などと選択的に反応する蛍光プローブを用いる新規な酵素活性の検出方法、及び当該方法に用いる蛍光プローブに関わる。
　生体内には、数千種類を超える酵素が存在し、それらの中には種々の疾患の発生と関連して活性異常が起こるものがある。血液中の特定の酵素活性の異常を知ることは、疾患の有無を判断する際の指標として、臨床の場面でも用いられている。 
　しかしながら、現在、血液中の酵素を検出する方法論では、その感度の不十分さから血液中にごく微少量で存在する酵素を検出することが困難である場面がしばしば見られ、特に、疾患の早期診断に関わる酵素活性異常を見つけるためには、このような酵素の活性検出法の高感度化が求められている。
　一方、発明者らの研究グループは、これまでに、マイクロデバイス適合性の酵素活性検出蛍光プローブ群を用いて、血中の酵素を１分子レベルで検出・活性に基づくプロファイリングをおこない、疾患との新たな関連性を見出してきた。
　マイクロデバイスには、マイクロチャンバー型デバイス、リポソーム、ドロップレット等が含まれるが、マイクロチャンバー型デバイスを例にして説明すると、1つのデバイスに数十万個の微小なチャンバーを有し、デバイスの容積は１０－１００ｆＬ程度と非常に微小であるために、１分子の酵素からターンオーバーで生成するレベルの蛍光色素量でも検出に十分な感度が得られるように設計されている。
　このマイクロデバイスを用いて、高感度な蛍光法の性質を最大限に活かすことで１分子レベルの酵素の活性評価を可能とする実験系が様々に報告されている。一例として、近年、本発明者らにより、１分子計測法を用いて血液中の酵素を１分子検出することで、従来のタンパク質解析技術では検出が困難な低濃度で血中に存在する酵素活性を見出すことが可能であることが報告され、血液中の酵素検出による病態診断への期待が集まっている（非特許文献１）。
　酵素活性の検出系としては、従来は、代謝反応によって蛍光性が変化する蛍光性の基質アナログが用いられることが主である。例えば、リン酸エステル構造を反応点とする蛍光プローブを用いることにより、リン酸エステルを加水分解する アルカリンホスファターゼ、プロテインチロシンホスファターゼなどの酵素活性検出がなされている（非特許文献１及び２）。
　しかしながら、このような蛍光性の基質アナログを用いて検出をおこなうことができる酵素の種類には限りがあり、特に、比較的分子量の大きい蛍光物質を基質に結合させる必要性から、厳密な基質認識を有し、基質への蛍光団の結合が許容されにくい酵素／基質ペアに対してこのようなプローブ開発をおこなうことは困難である。
　このような酵素として、例えば、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）があり、ＡＣｈＥは脳および筋肉に存在するエステラーゼで、アセチルコリンを高選択的に加水分解する。この酵素はコリン性の構造を厳密に認識するため、従来型の蛍光プローブの開発は困難であることが知られている。
Sakamoto, S. et al. Multiplexed single-molecule enzyme activity analysis for counting disease-related proteins in biological samples. Sci. Adv vol. 6 https://www.science.org (2020). Obayashi, Y., Iino, R. & Noji, H. A single-molecule digital enzyme assay using alkaline phosphatase with a cumarin-based fluorogenic substrate. Analyst 140, 5065-5073 (2015).
　本発明は、例えば、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のような厳密な基質認識をするような酵素についても、マイクロデバイスを用いた１分子レベルの高感度アッセイによって酵素の活性を検出することが可能な方法を提供することを目的とする。また、本発明はかかる方法に使用することができる蛍光プローブを提供することを目的とする。
　上記の課題を解決するために本発明者らは鋭意検討した結果、非蛍光性の天然型基質（又は基質アナログ）の代謝反応によって生じる特定の分子を選択的に検出するカップルドアッセイ系に着目した。そしてこの方法論を利用し、マイクロデバイス内の酵素と基質アナログとの反応によりチオール基やセレノール基などを生成させ、これらの基と選択的に反応する蛍光プローブを用いることで、アセチルコリンエステラーゼのような高い基質特異性をもつ酵素の活性を検出することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は、以下の構成を有するものである。
［１］マイクロデバイスを用いて、生体試料中の酵素の活性を検出する方法であって、
　生体試料と、基質アナログ又は天然基質と、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを接触させる工程であって、
　ここで、前記基質アナログ又は天然基質は、酵素と反応することにより、チオール基（Ｒ－ＳＨ）、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）又はポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）を有する化合物Ａ（Ｒは、水素原子又はアルキル基であり、ｎは、１～５である）を生成し、及び
　該一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩がチオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応することにより生成する蛍光性生成物から発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含む、
　当該方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
（式中、
Ｔは、チオール基（Ｒ－ＳＨ）、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）、ポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）と反応する反応性部位であり；
Ｓは、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基であり；
ｎ１は、１～１０の整数を表し；
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
は、蛍光団を表し、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩がチオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応することにより、当該化合物の分子全体として光学特性が変化する分子設計がなされており；
Ｓ、Ｔは、リンカーを介して前記蛍光団に結合していてもよい。）
［２］前記基質アナログは、チオエステル、又はセレノエステル様の構造を有し，酵素反応によって対応するチオール基又はセレノール基を生成する、［１］に記載の方法。
［３］前記蛍光団が、ＢＯＤＩＰＹ系の蛍光団、ローダミン系の蛍光団、フルオレセイン系の蛍光団、ロドール類縁体の蛍光団、シアニン系の蛍光団、レゾルフィン系の蛍光団、クマリン系の蛍光団からなる群から選択される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記反応性部位が、置換基を有してもよいニトロオレフィン基、マレイミド類、電子欠損アリール基、アルキル又はアリールスルホン酸基（Ｒ’－ＳＯ３－；Ｒ’は、置換基を有してもよいアルキル基又は置換基を有してもよいアリール基を示す）からなる群から選択される、［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］前記基質アナログが、アセチルチオコリン、ブチルチオコリン、又は含硫黄脂質からなる群から選択される１以上である、［２］に記載の方法。
［６］検出対象の酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、グリオキシラーゼ、ＳＡＨヒドラーゼ、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニンγリアーゼ、Ｓ－アデノシルホモシステイン加水分解酵素及びシスタチオニンβシンターゼからなる群から選択される１以上である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］前記酵素が、アセチルコリンエステラーゼ、ホスホリパーゼＡ２又はグリオキシラーゼ２である、［６］に記載の方法。
［８］マイクロデバイスを用いて、生体試料中の酵素の活性を検出する方法に用いる蛍光プローブであって、該方法は、
　生体試料と、基質アナログ又は天然基質と、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを接触させる工程であって、
　ここで、前記基質アナログ又は天然基質は、酵素と反応することにより、チオール基（Ｒ－ＳＨ）、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）又はポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）を有する化合物Ａ（Ｒは、水素原子又はアルキル基であり、ｎは、１～５である）を生成し、及び
　該一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩がチオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応することにより生成する蛍光性生成物から発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含み、
　前記基質アナログは、酵素と反応することにより、チオール基、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）又はポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）を有する化合物Ａを生成する方法であって、
　前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、当該蛍光プローブ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
（式中、
Ｔは、チオール基（Ｒ－ＳＨ）、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）、ポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）と反応する反応性部位であり；
Ｓは、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基であり；
ｎ１は、１～１０の整数を表し；
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
は、蛍光団を表し、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩がチオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応することにより、当該化合物の分子全体として光学特性が変化する分子設計がなされており；
Ｓ、Ｔは、リンカーを介して前記蛍光団に結合していてもよい。）
［９］前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、
　スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基を１～５個有し、チオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応する反応性部位を１～３個有する、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩である、［８］に記載の蛍光プローブ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
（式中、
Ｒａは、それぞれ独立に、水素原子、一価の置換基、前記親水性基、前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基又は前記反応性部位であり；
Ｒｂは、それぞれ独立に、水素原子、一価の置換基、前記親水性基、前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基又は前記反応性部位であり；
Ｒｃは、それぞれ独立に、水素原子、一価の置換基、前記親水性基、前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基又は前記反応性部位であり、
Ｘは、それぞれ独立に、フッ素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基から選択される。）
［１０］前記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩が、以下の一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩である、［９］に記載の蛍光プローブ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
（式中、
Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し、当該置換基は前記親水性基を有してもよく；
ｍは、０～４の整数であり、ｍが２以上の場合は、各々のＲ１は同じであっても異なっていてもよく；
Ｔ１は、チオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応する反応性部位であり、Ｔ１は、ベンゼン環上に２以上結合していてもよく；
Ｒ２～Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基であり；
Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立に、フッ素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基から選択される。）
［１１］前記一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩が、以下の一般式（ＩＩｂ）で表される化合物又はその塩である、［１０］に記載の蛍光プローブ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
（式中、
Ｒ１～Ｒ７、Ｘ１、Ｘ２及びｍは、般式（ＩＩａ）で定義した通りであり；
Ｒ８は、水素原子又は炭素数１～１０の置換又は無置換のアルキル基を示し、
置換基を有してもよいニトロオレフィン部位は、ベンゼン環上に２以上結合していてもよく；
ただし、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは前記親水性基である。）
［１２］前記一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩が、以下の一般式（ＩＩｃ）で表される化合物又はその塩である、［１０］に記載の蛍光プローブ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
（式中、
Ｒ１～Ｒ７、Ｘ１、Ｘ２及びｍは、般式（ＩＩａ）で定義した通りであり；
マレイミド基は、ベンゼン環上に２以上結合していてもよく；
ただし、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは前記親水性基である。）
［１３］前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、
　スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基を１～５個有し、チオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応する反応性部位を１～３個有する、以下の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩である、請求項８に記載の蛍光プローブ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
（式中、
Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し；
ｓは、０～４の整数であり、ｓが２以上の場合は、各々のＲ１は同じであっても異なっていてもよく；
Ｓ３は、スルホン酸基、カルボキシル基又はホスホン酸基から選択される親水性基であり；
ｔは、０～５であり：
Ｒ２～Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基であり；
Ｔ２は、チオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応する反応性部位であり；
Ｘ１及びＸ２は、（Ｏ、Ｏ）、（Ｏ、ＮＲ８）、（ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ８）、（ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ８）の組み合わせから選択され、ここで、Ｒ８～Ｒ１０は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６の置換または無置換のアルキル基、炭素数１～６の置換または無置換のアルケニル基、前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基、又は前記親水性基を有する炭素数１～６のアルケニル基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ、Ｓ（Ｒｄ）２、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、テルル原子又はビスマス原子から選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のアリール基であり、
Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基であり、
Ｒｄは、同一又は異なる、置換又は無置換のアリール基であり、
Ｒａ～Ｒｄの前記アルキル基、前記アリール基、前記フェニル基は、前記親水性基で置換されていてもよい。）
［１４］Ｔ２の反応性部位が、以下のいずれかである、［１３］に記載の蛍光プローブ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
（式中、＊は、結合箇所を表す。）
［１５］前記基質アナログは、チオエステル、又はセレノエステル様の構造を有し，酵素反応によって対応するチオール基又はセレノール基を生成する、［８］～［１４］のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
［１６］前記基質アナログが、アセチルチオコリン、ブチルチオコリン、及び含硫黄脂質誘導体からなる群から選択される１以上である、［１５］に記載の蛍光プローブ。
［１７］検出対象の酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、グリオキシラーゼ、ＳＡＨヒドラーゼ、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニンγリアーゼ、Ｓ－アデノシルホモシステイン加水分解酵素及びシスタチオニンβシンターゼからなる群から選択される１以上である、［８］～［１６］のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
［１８］前記酵素が、アセチルコリンエステラーゼ、ホスホリパーゼＡ２又はグリオキシラーゼ２である、［１７］に記載の蛍光プローブ。
［１９］血液などの生体サンプル中のアセチルコリンエステラーゼの活性を検出するために用いられる、［８］～［１８］のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
［２０］以下の一般式（ＩＩｂ）で表される化合物又はその塩。
（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
（式中、
Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し、当該置換基は、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基を有してもよく
ｍは、０～４の整数であり、ｍが２以上の場合は、各々のＲ１は同じであっても異なっていてもよく；
Ｒ２～Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基であり；
Ｒ８は、水素原子又は炭素数１～１０の置換又は無置換のアルキル基を示し；
但し、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、スルホン酸基、カルボキシル基又はホスホン酸基であり：
Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立に、フッ素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はアリール基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基から選択される。）
［２１］Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、スルホン酸基である、［２０］に記載の化合物又はその塩。
［２２］Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、カルボキシル基である、［２０］に記載の化合物又はその塩。
［２３］Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、ホスホン酸基である、［２０］に記載の化合物又はその塩。
［２４］ｍが１～２であり、Ｒ１が、炭素数１～６のアルコキシル基である、［２０］に記載の化合物又はその塩。
［２５］ニトロオレフィン部位がベンゼン環の２位又は４位に結合している、［２０］に記載の化合物又はその塩。
［２６］Ｒ３～Ｒ６は、いずれもメチル基である、［２２］に記載の化合物又はその塩。
［２７］以下から選択される化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
　本発明により、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）、ホスホリパーゼＡ２、グリオキシラーゼ２などのような厳密な基質認識をするような酵素についても、酵素活性を有効に検出することが可能である。
　また、マイクロデバイスを用いて本発明の検出方法を行うことにより、これらの酵素について、高感度かつ分子ごとの個性（翻訳後修飾，タンパク質間相互作用の違いなどに基づく）を反映した１分子酵素活性解析を行うことが可能である。
本発明の検出方法の概念図を、基質アナログ、酵素及び一般式（Ｉ）で表される化合物の組み合わせの非限定的な例を用いて示す。 本発明の検出方法において使用することができる基質アナログと酵素の非限定的例の組み合わせがどのようにＳＨ基を生成するのかについて反応式を示す。 基質アナログとしてアセチルチオエステルと蛍光プローブとして一般式（ＩＩａ）の化合物を用いてＡＣｈＥを検出すると共に、基質アナログとしてアセチルセレノエステルと蛍光プローブとして一般式（ＩＩＩ）の化合物を用いてＢＣｈＥを検出する多色アッセイを示す。 化合物１と、合成実施例２で得た化合物２の光学特性を示す。 化合物１及び２のマイクロデバイス適合性の検討を行った結果を示す。 化合物４及び化合物９の光学特性を示す。 化合物４及び９のマイクロデバイス適合性の検討を行った結果を示す。 化合物１７の光学特性を調べた結果を示す。 化合物１７のマイクロデバイス適合性の検討を行った結果を示す。 本発明の５つの化合物の混合物をＬＣ－ＭＳで分析した結果を示す。 化合物１、２、４、９及び１７のマイクロデバイス適合性の結果をまとめて示す。 マイクロデバイスを用いた血液中酵素の検出の模式図を示す。 化合物１７を用いて血液中酵素の検出試験を行った結果を示す。 実施例４においてヒト血漿を含むマイクロデバイスの経時解析を行った結果を示す。 実施例４において活性パターンの確認を行った結果を示す。 Ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ２（ＧＬＯ２）の検出実験の結果を示す。 ニトロフェノール構造を有する本発明のプローブを用いることで血液中のアセチルコリンエステラーゼの活性を検出した結果を示す。 マレイミド構造を有するプローブを用いたＡＣｈＥ及びホスホリパーゼ（ＰＬＡ２）の活性検出結果を示す。
　本明細書中において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。
　本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個（Ｃ１～６）、炭素数１～１０個（Ｃ１～１０）、炭素数１～１５個（Ｃ１～１５）、炭素数１～２０個（Ｃ１～２０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ１～８アルキルには、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。そのような置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
　本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
　本明細書中において、「アルコキシ基」とは、前記アルキル基が酸素原子に結合した構造であり、例えば直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせである飽和アルコキシ基が挙げられる。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ－ブトキシ基、ｔ－ブトキシ基、シクロブトキシ基、シクロプロピルメトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロプロピルエチルオキシ基、シクロブチルメチルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルプロピルオキシ基、シクロブチルエチルオキシ基又はシクロペンチルメチルオキシ基等が好適な例として挙げられる。
１．酵素活性の検出方法
　本発明の１つの実施形態は、マイクロチャンバー型のデバイスを用いて、生体試料中の酵素の活性を検出する方法であって、
　生体試料と、基質アナログ又は天然基質と、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを接触させる工程であって、
　ここで、前記基質アナログ又は天然基質は、酵素と反応することにより、チオール基（Ｒ－ＳＨ）、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）又はポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）を有する化合物Ａ（Ｒは、水素原子又はアルキル基であり、ｎは、１～５である）を生成し、及び
　該一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩がチオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応することにより生成する蛍光性生成物から発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含み、
　当該方法である（以下「本発明の検出方法」とも言う）。
　理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明の検出方法は、チオールやセレノール等を利用したカップルドアッセイの方法論を用いるものである。すなわち、検出対象の酵素と基質アナログとの反応によりチオール基やセレノール基などを生成させ、これらの基と選択的に反応する蛍光プローブを用いることで、アセチルコリンエステラーゼのような高い基質特異性をもつ酵素の活性を検出することが可能である。
　これまでにチオールを用いたカップルドアッセイ自体はあったが、これは従来の生化学分析の方法論に基づいて１０８－１０９以上の分子を集団として取り扱うものであったが、本発明の検出方法においては、１分子ごとの酵素活性検出法を用いることで、分子ごとの活性の違いを加味した解析をおこなうことができ、特にチオールを用いたアッセイでこのような目的を達成することができたのである。
　このように、本発明のマイクロデバイスを用いた検出方法により、アセチルコリンエステラーゼのような高い基質特異性をもつ酵素の活性を検出することが可能であり、好ましくは、高い基質特異性をもつ酵素の活性を１分子レベルで検出することが可能である。
　本発明の検出方法の概念図を、非限定的例を用いて図１に示す。
　図１では、基質アナログとして、コリンのエステル構造の酸素を硫黄（Ｓ）に置き換えて、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）によるチオエステルの加水分解によってＳＨ基を有する化合物が生成し、これをＳＨ基との反応性部位を有する蛍光プローブにより選択的に検出するカップルドアッセイ系を示す。これによりアセチルコリンエステラーゼを高感度で検出することが可能である。
　本発明の検出方法に用いる基質アナログは、酵素と反応することにより、チオール基（Ｒ－ＳＨ）、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）又はポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）を有する化合物Ａを生成する。ここで、Ｒは、水素原子又はアルキル基である。また、ｎは、１～５である。
　基質アナログは、好ましくは、酵素の基質分子が有するカルボン酸エステルの酸素原子の１つが硫黄又はセレンに置き換えられた構造を有する。
　また、基質アナログは、好ましくは、チオエステル又はセレノエステル様の構造を有し、酵素反応によって対応するチオール基又はセレノール基を生成する。
　基質アナログとしては、例えば、アセチルチオコリン、ブチルチオコリン、又は以下の構造式で表される含硫黄脂質が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
　天然基質としては、Ｓ－Ｄ－ラクトイル－グルタチオン、Ｓ－アデノシルホモシステイン、コエンザイムＡ誘導体が挙げられる。
　本発明の検出方法で用いられる一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
　一般式（Ｉ）において、Ｔは、チオール基（Ｒ－ＳＨ）、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）、ポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）と反応する反応性部位である。ここで、Ｒは、水素原子又はアルキル基である。また、ｎは、１～５である。
　反応性部位は、好ましくは、置換基を有してもよいニトロオレフィン基、マレイミド類、電子欠損アリール基、アルキル又はアリールスルホン酸基（即ち、アルキル基又はアリール基が置換したスルホン酸であり、Ｒ’－ＳＯ３－で表される。ここで、Ｒ’は、置換基を有してもよいアルキル基又は置換基を有してもよいアリール基を示す）からなる群から選択される。また、電子欠損アリール基とは、ニトロ基、ハロゲン基、スルホン酸基などが単独あるいは複数置換された芳香族化合物を指す。電子欠損の芳香環にチオール基等が芳香族求核反応を起こすことにより、目的の求核剤の検出に利用可能である。
　反応性部位がニトロオレフィン基であるとチオールとの反応性が高いためより好ましい。
　Ｓは、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基である。
　マイクロデバイス、とりわけマイクロチャンバーを用いる１分子計測の実験系で行う場合は、チャンバーの構築に脂溶性の高いデバイスやオイルを使用するため、これへの吸着や漏出を防ぐために高い水溶性を有するプローブを用いることが好ましい。
　ｎ１は、１～１０の整数を表し、好ましくは１～３であり、より好ましくは１又は２であり、更に好ましくは２である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
は、蛍光団を表し、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩がチオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応することにより、当該化合物の分子全体として光学特性が変化する分子設計がなされている。
　即ち、一般式（Ｉ）で表される化合物が有する重要な性質として、Ｔの反応性部位がチオール、セレノール又はポリ硫黄原子と反応して蛍光特性が変化して、この化学反応の進行を蛍光シグナルの違いによって検出することができるという点にある。
　このような蛍光団としては、好ましくはＢＯＤＩＰＹ系の蛍光団、ローダミン系の蛍光団、フルオレセイン系の蛍光団、ロドール類縁体の蛍光団、シアニン系の蛍光団、レゾルフィン系の蛍光団、クマリン系の蛍光団からなる群から選択される蛍光団である。特に好ましくは、ＢＯＤＩＰＹ系の蛍光団、ローダミン系の蛍光団、フルオレセイン系の蛍光団、ロドール類縁体の蛍光団である。
　ここで、Ｓ、Ｔのいずれか又は両方、あるいはこれらが２以上ある場合はそのうちの一部は、リンカーを介して前記蛍光団に結合していてもよい。
　リンカーは、アルキレン基（但し、アルキレン基の１以上の－ＣＨ２－は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、又は－ＣＯ－で置換されていてもよい。）、アリーレン（ヘテロアリーレンを含む）、シクロアルキレン、アルコキシル基、ポリエチレングリコール鎖、及び、これらの基から選択される２種以上の基が任意に結合して構成される基からなる群から選択される。後述する、一般式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩＩ）の化合物又はその塩についても、反応性部位、親水性の一部あるいはすべては、リンカーを介して蛍光団に結合していてもよい。
　一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の１つの好ましい態様は、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基を１～５個有し、チオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応する反応性部位を１～３個有する、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
　一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩は、ＢＯＤＩＰＹ系の蛍光団であり、チオール等との反応時の蛍光増大におけるＳ／Ｎ比が高くなる傾向があり、また、蛍光強度がｐＨなどの環境要因に左右されにくく，光褪色にも強い傾向があるため好ましい。
　一般式（ＩＩ）において、Ｒａは、それぞれ独立に、水素原子、一価の置換基、前記親水性基、前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基又は前記反応性部位である。
　また、Ｒｂは、それぞれ独立に、水素原子、一価の置換基、前記親水性基、前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基又は前記反応性部位である。
　また、Ｒｃは、それぞれ独立に、水素原子、一価の置換基、前記親水性基、前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基又は前記反応性部位である。
　Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃが示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、カルボキシル基およびその誘導体（エステル，アミドなど）、スルホン酸基、ホスホン酸基、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。
　これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃが示すアルキル基にはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えば、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃが示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。
　Ｘは、それぞれ独立に、フッ素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基から選択される。
　一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩の１つの好ましい態様は、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基を１～５個有し、チオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応する反応性部位を１～３個有する、以下の一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩である
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
　一般式（ＩＩａ）において、Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表す。
　Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、カルボキシル基およびその誘導体（エステル，アミドなど）、スルホン酸基、ホスホン酸基、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。
　これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えば、Ｒ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。
　また、当該一価の置換基は前記親水性基を有してもよい。
　ｍは、０～４の整数であり、ｍが２以上の場合は、各々のＲ１は同じであっても異なっていてもよい。
　一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩の１つの好ましい側面は、ｍは０である（即ち、Ｒ１は存在しない）。
　一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩の別の好ましい側面は、ｍが１～２であり、Ｒ１が、炭素数１～６のアルコキシル基（好ましくは、メトキシ基）である。
　一般式（ＩＩａ）において、Ｒ２～Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基を示す。
　一般式（ＩＩａ）において、Ｔ１は、チオール基、セレノール基、ポリ硫黄原子と反応する反応性部位である。Ｔ１は、ベンゼン環上に２以上結合していてもよい。
　Ｔ１の反応性部位としては、好ましくは、置換基を有してもよいニトロオレフィン基又はマレイミド基である。
　一般式（ＩＩａ）において、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立に、フッ素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基から選択される。
　一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩の１つの好ましい態様は、以下の一般式（ＩＩｂ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
　一般式（ＩＩｂ）において、Ｒ１～Ｒ７、Ｘ１、Ｘ２及びｍは、一般式（ＩＩａ）で定義した通りである。
　Ｒ８は、水素原子又は炭素数１～１０の置換又は無置換のアルキル基を示す。
　一般式（ＩＩｂ）において、置換基を有してもよいニトロオレフィン部位は、ベンゼン環上に２以上結合していてもよい。
　一般式（ＩＩｂ）において、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７は、好ましくは、いずれもメチル基である。
　一般式（ＩＩａ）において、好ましくは、ニトロオレフィン部位がベンゼン環の２位又は４位に結合している。
　一般式（ＩＩｂ）において、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、スルホン酸基、カルボキシル基又はホスホン酸基である。
　Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、好ましくはカルボキシル基又はホスホン酸基であり、より好ましくはスルホン酸基である。スルホン酸基は水溶性が特に高く、スルホン酸基を有する化合物を使用するとマイクロデバイスへの吸着も観察されず、酵素活性の１分子検出に好適に利用することができる。
　一般式（ＩＩｂ）の化合物又はその塩の１つの好ましい態様は、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つ、好ましくは２つは、スルホン酸基である。
　一般式（ＩＩｂ）の化合物又はその塩の１つの好ましい態様は、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つ、好ましくは２つは、カルボキシル基である。
　一般式（ＩＩｂ）の化合物又はその塩の１つのより好ましい態様は。Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つ、好ましくは２つは、ホスホン酸基である。
　一般式（ＩＩｂ）の化合物又はその塩は、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基を１～５個、好ましくは１～３個、更に好ましくは２個有する。
　一般式（ＩＩｂ）の化合物又はその塩は、ニトロオレフィン部位を１～３個、好ましくは１～２個、更に好ましくは１個有する。
　一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩の１つの好ましい態様は、以下の一般式（ＩＩｃ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
　一般式（ＩＩｃ）において、Ｒ１～Ｒ７、Ｘ１、Ｘ２及びｍは、一般式（ＩＩａ）で定義した通りである。
　一般式（ＩＩｃ）において、置換基を有してもよいマレイミド基は、ベンゼン環上に２以上結合していてもよい。
　一般式（ＩＩｃ）において、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７は、好ましくは、いずれもメチル基である。
　一般式（ＩＩｃ）において、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、スルホン酸基、カルボキシル基又はホスホン酸基である。
　Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、好ましくはカルボキシル基又はホスホン酸基であり、より好ましくはスルホン酸基である。スルホン酸基は水溶性が特に高く、スルホン酸基を有する化合物を使用するとマイクロデバイスへの吸着も観察されず、酵素活性の１分子検出に好適に利用することができる。
　一般式（ＩＩｃ）の化合物又はその塩の１つの好ましい態様は、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つ、好ましくは２つは、スルホン酸基である。
　一般式（ＩＩｃ）の化合物又はその塩の１つの好ましい態様は、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つ、好ましくは２つは、カルボキシル基である。
　一般式（ＩＩｃ）の化合物又はその塩の１つのより好ましい態様は。Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つ、好ましくは２つは、ホスホン酸基である。
　一般式（ＩＩｃ）の化合物又はその塩は、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基を１～５個、好ましくは１～３個、更に好ましくは２個有する。
　一般式（ＩＩｂ）の化合物又はその塩は、ニトロオレフィン部位を１～３個、好ましくは１～２個、更に好ましくは１個有する。
　一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩のもう１つの好ましい態様は、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基を１～５個有し、チオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応する反応性部位を１～３個有する、以下の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
　一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表す。
　Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、カルボキシル基およびその誘導体（エステル，アミドなど）、スルホン酸基、ホスホン酸基、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。
　これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。
　一般式（ＩＩＩ）において、ｓは、０～４の整数であり、ｓが２以上の場合は、各々のＲ１は同じであっても異なっていてもよい。
　一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩の１つの好ましい側面は、ｍは０である（即ち、Ｒ１は存在しない）。
　一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩の別の好ましい側面は、ｍが１～２であり、Ｒ１が、炭素数１～６のアルコキシル基（好ましくは、メトキシ基）である。
　Ｓ３は、スルホン酸基、カルボキシル基又はホスホン酸基から選択される。
　ｔは、０～５であり、好ましくは１～４であり、より好ましくは１又は２である。
　一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ２～Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基である。
　Ｔ２は、チオール基、セレノール基、ポリ硫黄原子と反応する反応性部位である。
　Ｔ２の反応性部位は、好ましくは、以下のいずれかから選択される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
　式中、＊は、結合箇所を表す。
　Ｘ１及びＸ２は、（Ｏ、Ｏ）、（Ｏ、ＮＲ８）、（ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ８）、（ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ８）の組み合わせから選択される。
　ここで、Ｒ８～Ｒ１０は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６の置換または無置換のアルキル基、炭素数１～６の置換または無置換のアルケニル基、前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基、又は前記親水性基を有する炭素数１～６のアルケニル基である。
　Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ、Ｓ（Ｒｄ）２、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、テルル原子又はビスマス原子から選択される。
　ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のアリール基である。
　Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。
　Ｒｄは、同一又は異なる、置換又は無置換のアリール基である。
　Ｒａ～Ｒｄの前記アルキル基、前記アリール基、前記フェニル基は、前記親水性基で置換されていてもよい。
　一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩＩ）で表される化合物（これらをまとめて「本発明の化合物」ともいう）は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。一般式（Ｉ）及び（Ｉａ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、本発明においては、これらの物質も用いることができる。
　本発明の化合物は、特に断らない限り、その互変異性体、幾何異性体（例えば、Ｅ体、Ｚ体など）、鏡像異性体等の立体異性体も含まれる。すなわち、本発明の化合物中に、１個又は２個以上の不斉炭素が含まれる場合、不斉炭素の立体化学については、それぞれ独立して（Ｒ）体又は（Ｓ）体のいずれかをとることができ、該誘導体の鏡像異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体として存在することがある。従って、本発明の検出方法に用いる蛍光プローブの有効成分としては、純粋な形態の任意の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などを用いることが可能であり、いずれも本発明の範囲に包含される。
　本発明の検出方法において、検出対象の酵素（標的酵素）は、エステラーゼ、リパーゼ、グリオキシラーゼ、ＳＡＨヒドラーゼ、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニンγリアーゼ、及びシスタチオニンβシンターゼからなる群から選択される１以上であり、好ましくは、アセチルコリンエステラーゼ、ホスホリパーゼＡ２又はグリオキシラーゼ２である。
　本発明の検出方法において使用することができる基質アナログと、酵素の組み合わせがどのようにＳＨ基を生成するのかについて図２に反応式を示す。ただし、本発明の検出方法の範囲は、これら基質アナログと酵素の組み合わせに限定されるものではない。
　本発明の検出方法においては、マイクロデバイスを好適に用いることができる。
　マイクロデバイスには、マイクロチャンバー型デバイス、リポソーム、ドロップレット等が含まれる。
　以下では、マイクロチャンバー型デバイスを例にしてマイクロデバイスについて説明する。
　マイクロデバイスの材料は特に限定されず、例えばガラス材料、シリコン、樹状ポリマー又はコポリマーを含むプラスチック等が挙げられる。ガラス材料としては、例えば、ソーダ石灰ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、バイコール（登録商標）ガラス、石英ガラス等が挙げられる。樹脂ポリマーとしては、例えば、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（酢酸ビニル－共－無水マレイン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミン等が挙げられる。コポリマーとしては、例えば、ポリ（酢酸ビニル－共－無水マレイン酸）、ポリ（スチレン－共－無水マレイン酸）、ポリ（エチレン－共－アクリル酸）又はこれらの誘導体等が挙げられる。
　マイクロデバイスの形状は、任意の数のウェル（例えば、マイクロウェル）が配置されたマルチウェルプレート等が挙げられる。ウェルの数としては、プレート１枚当たり、例えば１個以上１０００万個以下、例えば１０個以上５０万個以下、例えば１０万個程度等が挙げられる。
　マイクロデバイスのウェルの孔径は、例えば１０ｎｍ以上１０μｍ以下であればよく、例えば１００ｎｍ以上１０μｍ以下であればよく、例えば１μｍ以上１０μｍ以下であればよい。
　また、マイクロデバイスのウェルの深さは、例えば１０ｎｍ以上１００μｍ以下であればよく、例えば１００ｎｍ以上８０μｍ以下であればよく、例えば２００ｎｍ以上７０μｍ以下であればよい。
　孔径及び深さが上記範囲内であることにより、ウェル内に１分子の標的酵素を捕捉することができ、生体試料中の酵素１分子ずつの酵素活性を検出することができる。
　マイクロデバイスの１ウェルに含まれる本発明の化合物の量としては、例えば１００ｎＭ以上１０００μＭ以下であればよく、例えば１μＭ以上１０００μＭ以下であればよく、例えば１０μＭ以上１０００μＭ以下であればよい。
　また、マイクロデバイスの１ウェルに含まれる基質アナログの量としては、例えば１００ｎＭ以上１００，０００μＭ以下であればよく、例えば１μＭ以上１００，０００μＭ以下であればよく、例えば１０μＭ以上１００，０００μＭ以下であればよい。
　マイクロデバイスの使用方法としては、例えば、まず、生体試料を含む溶液をマイクロデバイスに添加する。次いで、マイクロデバイスのウェル内の生体試料中の標的酵素を封入するために、シーリングオイルを滴下する。
　また、上記の生体試料を含む溶液には、本発明の化合物及び基質アナログを添加してもよい。また、後から酵素以外の溶液を添加してもよい。
　本発明の検出方法は、生体試料と、基質アナログと、本発明の化合物とを接触させる工程を含む。
　生体試料としては、例えば、被検者から単離された生体試料、生検試料、体液試料、水溶液が挙げられる。ある態様では、生体試料は、血液試料（例えば、血清試料、または血漿試料）であり得る。
　接触は、生体試料と、基質アナログと、本発明の化合物とを混合することにより行うことができる。生体試料は、予め所定の倍率まで希釈してもよい。
　本発明の検出方法は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩がチオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応することにより生成する蛍光性生成物から発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含む。
　蛍光性生成物が蛍光を発する場合には、その蛍光の有無が、水溶液中の酵素の活性の存在を示し、その蛍光の強度が、水溶液中の酵素の活性の強度を示す。
　本発明の検出方法の１つの好ましい側面においては、接触が血漿存在下で行われる。
　マイクロデバイスを用いた本発明の検出方法について、以下に詳細を示す。
［工程１］
　まず、本発明の化合物、基質アナログを備えるマイクロデバイスに、生体試料を含む溶液を添加する。生体試料としては、例えば、被検者から単離された生体試料、生検試料、体液試料、水溶液が挙げられる。また、生体試料は、血液試料（例えば、血清試料、または血漿試料）であり得る
　生体試料を含む溶液のｐＨは任意の値を選んでよい。例えば、溶液のｐＨは、生体内に近しい値にすることができ、この場合は、例えば６．０以上８．０以下であればよい。また、特定の酵素群に標的を絞るために、溶液のｐＨを至適ｐＨに当たる酸性にすることもできる。
　また、生体試料を含む溶液、本発明の蛍光プローブを含む溶液、基質アナログを含む溶液を別々に調製して、生体試料、蛍光プローブ、基質アナログの比率を適切に調整してこれらを混合して、混合した溶液をマイクロデバイスに添加してもよい。
　生体試料のタンパク質濃度は、「目的とするタンパク質」の濃度としては、通常は、例えば１ｐＭ以上１００ｐＭ以下であればよく、例えば１０ｐＭ以上１００ｐＭ以下であればよい。
　また、試料中の全体のタンパク質濃度としては、例えば上限を１０μＭ程度までにすることもできる。
　生体試料のタンパク質濃度の測定方法は、「目的とするタンパク質」の濃度の測定方法としては、例えば、抗体抗原反応を利用した方法（例えば、ＥＬＩＳＡ法等）を用いることができる。また、試料中の全体のタンパク質濃度の測定方法としては、タンパク質と試薬との反応を利用した比色法（例えば、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法、ブラッドフォード法、ローリー法、ビウレット法等）が挙げられる。
生体試料は上記濃度となるように、各種水性溶媒等を用いて、希釈してもよい。前記水性溶媒としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ；ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等が挙げられ、これらに限定されない。
［工程２］
　次いで、マイクロデバイスのウェル内の生体試料中の酵素を封入するために、シーリングオイルを滴下する。シーリングオイルとしては、通常マイクロデバイスにおいて試料の封入用途で用いられる公知のものであればよく、例えば、フッ素系オイル（ＦＣ－４０等）等が挙げられる。
［工程３］
　次いで、蛍光スキャナー、蛍光顕微鏡等を用いて、マイクロデバイスのウェル内の蛍光を検出する。検出された蛍光強度から、酵素活性を評価することができる。
　ここで、酵素活性が検出されたマイクロデバイスのウェル内にどのような酵素が含まれているかは、例えば、別途調整した目的タンパク質との酵素活性パターンとの比較等により決定することができる。
　本発明の検出方法は、さらに蛍光イメージング手段を用いて蛍光応答を観測することを含むことができる。蛍光応答を観測する手段は、広い測定波長を有する蛍光光度計を用いることができるが、前記蛍光応答を２次元画像として表示可能な蛍光イメージング手段を用いて可視化することもできる。蛍光イメージングの手段を用いることによって、蛍光応答を二次元で可視化できるため、標的酵素を瞬時に視認することが可能となる。蛍光イメージング装置としては、当該技術分野において公知の装置を用いることができる。なお、場合によって、紫外可視吸光スペクトルの変化（例えば、特定の吸収波長における吸光度の変化）によって上記測定対象試料と蛍光プローブの反応を検出することも可能である。
　本発明の検出方法のもう１つの態様は、生体試料中の酵素を検出する方法であって、２以上の本発明の化合物と、複数の酵素とを接触させることを含む、方法である。
　この態様の非限定的な例の模式図を図３に示す。
　図３は、基質アナログとしてアセチルチオエステルと蛍光プローブとして一般式（ＩＩａ）の化合物を用いてＡＣｈＥを検出すると共に、基質アナログとしてアセチルセレノエステルと蛍光プローブとして一般式（ＩＩＩ）の化合物を用いてＢＣｈＥを検出する多色アッセイを示している。
２．蛍光プローブ
　本発明のもう１つの実施態様は、マイクロデバイスを用いて、生体試料中の酵素の活性を検出する方法に用いる蛍光プローブであって、該方法は、
　生体試料と、基質アナログ又は天然基質と、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを接触させる工程であって、
　ここで、前記基質アナログ又は天然基質は、酵素と反応することにより、チオール基（Ｒ－ＳＨ）、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）又はポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）を有する化合物Ａ（Ｒは、水素原子又はアルキル基であり、ｎは、１～５である）を生成し、及び
　該一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩がチオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応することにより生成する蛍光性生成物から発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含み、
　前記基質アナログは、酵素と反応することにより、チオール基、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）又はポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）を有する化合物Ａを生成する方法であって、
　前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、当該蛍光プローブである（以下「本発明の蛍光プローブ」ともいう）。
　本発明の蛍光プローブは、本発明のマイクロデバイスを用いた検出方法に用いることにより、アセチルコリンエステラーゼのような高い基質特異性をもつ酵素の活性を検出することが可能であり、好ましくは、高い基質特異性をもつ酵素の活性を１分子レベルで検出することが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
　一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の詳細（Ｔ、Ｓ、ｎ１、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
）については、本発明の検出方法で詳述した通りである。
　また、Ｓ、Ｔのいずれか又は両方、あるいはこれらが２以上ある場合はそのうちの一部は、リンカーを介して前記蛍光団に結合していてもよい。
　リンカーは、アルキレン基（但し、アルキレン基の１以上の－ＣＨ２－は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、又は－ＣＯ－で置換されていてもよい。）、アリーレン（ヘテロアリーレンを含む）、シクロアルキレン、アルコキシル基、ポリエチレングリコール鎖、及び、これらの基から選択される２種以上の基が任意に結合して構成される基からなる群から選択される。後述する、一般式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩＩ）の化合物又はその塩についても、反応性部位、親水性の一部あるいはすべては、リンカーを介して蛍光団に結合していてもよい。
　本発明の蛍光プローブの１つの態様においては、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基を１～５個有し、チオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応する反応性部位を１～３個有する、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
　一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩の詳細（Ｒａ～Ｒｃ、Ｘ等）については、本発明の検出方法で詳述した通りである。
　本発明の蛍光プローブの１つの態様においては、一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩は、以下の一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
　一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩の詳細（Ｒ１～Ｒ７、Ｘ１、Ｘ２、Ｔ１、ｍ等）については、本発明の検出方法で詳述した通りである。
　本発明の蛍光プローブの１つの態様においては、一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩は、以下の一般式（ＩＩｂ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
　一般式（ＩＩｂ）で表される化合物又はその塩の詳細（Ｒ１～Ｒ７、Ｘ１、Ｘ２及びｍ等）については、本発明の検出方法で詳述した通りである。
　本発明の蛍光プローブのもう１つの態様においては、一般式（ＩＩｂ）で表される化合物又はその塩は、以下の一般式（ＩＩｃ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
　一般式（ＩＩｃ）で表される化合物又はその塩の詳細（Ｒ１Ｒ７、Ｘ１、Ｘ２及びｍ等）については、本発明の検出方法で詳述した通りである。
　本発明の蛍光プローブの１つの態様においては、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、以下の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
　一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩の詳細（Ｒ１～Ｒ７、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ、Ｔ２、ｓ及びｔ等）については、本発明の検出方法で詳述した通りである。
　Ｔ２の反応性部位は、好ましくは、以下のいずれかである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
（式中、＊は、結合箇所を表す。）
　本発明の蛍光プローブが使用される検出方法で用いる基質アナログは、好ましくは、検出対象の酵素の基質分子が有するカルボン酸エステルの酸素原子の１つが硫黄又はセレンに置き換えられた構造を有する。
　また、基質アナログは、好ましくは、チオエステル又はセレノエステル様の構造を有し、酵素反応によって対応するチオール基又はセレノール基を生成する。
　基質アナログとしては、例えば、アセチルチオコリン、ブチルチオコリン、又は以下の構造式で表される含硫黄脂質が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000042
　天然基質としては、Ｓ－Ｄ－ラクトイル－グルタチオン、Ｓ－アデノシルホモシステイン、コエンザイムＡ誘導体が挙げられる。天然基質およびこれを使う酵素の組み合わせの例としては、天然基質　／　酵素（和名）：Ｓ－アデノシルホモシステイン／Ｓ－アデノシルホモシステイン加水分解酵素、Ｓ－Ｄ－ラクトイルグルタチオン／グリオキシラーゼ、コエンザイムＡ誘導体／アセチルトランスフェラーゼが挙げられる。
　本発明の蛍光プローブは、好適には、エステラーゼ、リパーゼ、グリオキシラーゼ、ＳＡＨヒドラーゼ、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニンγリアーゼ、シスタチオニンβシンターゼ、及びＳ－アデノシルホモシステイン加水分解酵素からなる群から選択される１以上の酵素を検出するのに用いることができ、より好ましくは、アセチルコリンエステラーゼ、ホスホリパーゼＡ２又はグリオキシラーゼ２を検出するのに用いることができる。
　本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに本発明の化合物又はその塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
　本発明の蛍光プローブは、マイクロデバイスを用いる酵素活性検出法に好適に使用することができる。従って、本発明の蛍光プローブ及び基質アナログをマイクロデバイスのウェル内に備えることにより、生体試料中の標的加水分解酵素の酵素活性を検出する方法に用いることができる。
　マイクロデバイスには、マイクロチャンバー型デバイス、リポソーム、ドロップレット等が含まれる。
　マイクロデバイスの詳細については、本発明の検出方法で詳述した通りである。
　本発明のもう１つの実施態様は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩、基質アナログを含む、酵素検出用キットである。
　当該キットにおいて、通常、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩は溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。
　また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいてもよい。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
３．一般式（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）で表される化合物又はその塩
　本発明のもう１つの実施態様は、以下の一般式（ＩＩｂ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043
　一般式（ＩＩａ）において、Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表す。
　Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、カルボキシル基およびその誘導体（エステル，アミドなど）、スルホン酸基、ホスホン酸基、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。
　これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えば、Ｒ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。
　また、当該一価の置換基は前記親水性基を有してもよい。
　ｍは、０～４の整数であり、ｍが２以上の場合は、各々のＲ１は同じであっても異なっていてもよい。
　一般式（ＩＩｂ）で表される化合物又はその塩の１つの好ましい側面は、ｍは０である（即ち、Ｒ１は存在しない）。
　一般式（ＩＩｂ）で表される化合物又はその塩の別の好ましい側面は、ｍが１～２であり、Ｒ１が、炭素数１～６のアルコキシル基（好ましくは、メトキシ基）である。
　一般式（ＩＩｂ）において、Ｒ８は、水素原子又は炭素数１～１０の置換又は無置換のアルキル基を示す。
　一般式（ＩＩｂ）において、Ｒ２～Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基である。
　一般式（ＩＩｂ）において、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７は、好ましくは、いずれもメチル基である。
　一般式（ＩＩｂ）において、置換基を有してもよいニトロオレフィン部位は、ベンゼン環上に２以上結合していてもよい。
　一般式（ＩＩａ）において、好ましくは、ニトロオレフィン部位がベンゼン環の２位又は４位に結合している。
　一般式（ＩＩｂ）において、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、スルホン酸基、カルボキシル基又はホスホン酸基である。
　Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、好ましくはカルボキシル基又はホスホン酸基であり、より好ましくはスルホン酸基である。スルホン酸基は水溶性が特に高く、スルホン酸基を有する化合物を使用するとマイクロデバイスへの吸着も観察されず、酵素活性の１分子検出に好適に利用することができる。
　一般式（ＩＩｂ）の化合物又はその塩の１つの好ましい態様は、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つ、好ましくは２つは、スルホン酸基である。
　一般式（ＩＩｂ）の化合物又はその塩の１つの好ましい態様は、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つ、好ましくは２つは、カルボキシル基である。
　一般式（ＩＩｂ）の化合物又はその塩の１つのより好ましい態様は。Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つ、好ましくは２つは、ホスホン酸基である。
　一般式（ＩＩｂ）の化合物又はその塩は、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基を１～５個、好ましくは１～３個、更に好ましくは２個有する。
　一般式（ＩＩｂ）の化合物又はその塩は、ニトロオレフィン部位を１～３個、好ましくは１～２個、更に好ましくは１個有する。
　本発明のもう１つの実施態様は、以下の一般式（ＩＩｃ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000044
　一般式（ＩＩｃ）において、Ｒ１～Ｒ７、Ｘ１、Ｘ２及びｍは、一般式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）で定義した通りである。
　一般式（ＩＩｃ）において、置換基を有してもよいマレイミド基は、ベンゼン環上に２以上結合していてもよい。
　一般式（ＩＩｃ）において、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７は、好ましくは、いずれもメチル基である。
　一般式（ＩＩｃ）において、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、スルホン酸基、カルボキシル基又はホスホン酸基である。
　Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、好ましくはカルボキシル基又はホスホン酸基であり、より好ましくはスルホン酸基である。スルホン酸基は水溶性が特に高く、スルホン酸基を有する化合物を使用するとマイクロデバイスへの吸着も観察されず、酵素活性の１分子検出に好適に利用することができる。
　一般式（ＩＩｃ）の化合物又はその塩の１つの好ましい態様は、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つ、好ましくは２つは、スルホン酸基である。
　一般式（ＩＩｃ）の化合物又はその塩の１つの好ましい態様は、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つ、好ましくは２つは、カルボキシル基である。
　一般式（ＩＩｃ）の化合物又はその塩の１つのより好ましい態様は。Ｒ３及
　一般式（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。一般式（Ｉ）及び（Ｉａ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、本発明においては、これらの物質も用いることができる。
　一般式（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）で表される化合物は、特に断らない限り、その互変異性体、幾何異性体（例えば、Ｅ体、Ｚ体など）、鏡像異性体等の立体異性体も含まれる。すなわち、本発明の化合物中に、１個又は２個以上の不斉炭素が含まれる場合、不斉炭素の立体化学については、それぞれ独立して（Ｒ）体又は（Ｓ）体のいずれかをとることができ、該誘導体の鏡像異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体として存在することがある。従って、本発明の検出方法に用いる蛍光プローブの有効成分としては、純粋な形態の任意の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などを用いることが可能であり、いずれも本発明の範囲に包含される。
　一般式（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）の化合物又はその塩の非限定的例を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
　また、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物に含まれる以下の化合物も本発明の範囲内である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046
　一般式（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩の製造方法は特に限定されないが、上記に包含される化合物のうち代表的化合物についての合成方法を本明細書の実施例に具体的に示した。当業者は本明細書の実施例及び下記のスキームを参照しつつ、必要に応じて出発原料、反応試薬、反応条件などを適宜改変ないし修飾することにより、一般式（ＩＩａ）（ＩＩｃ）、（ＩＩＩ）で表される化合物を製造することができる。
　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．材料と方法
（１）材料
　試薬・溶剤は、東京化成工業、和光純薬、シグマ・アルドリッチ、同仁化学、関東化学、渡辺化学工業から供給される特級品を使用し、精製することなく使用した。酵素はSigma-Aldrichから購入し、精製することなく使用した。
（２）測定装置
　ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ ＪＮＭ－ＬＡ４００装置を用いて、１ＨＮＭＲは４００ＭＨｚで、１３ＣＮＭＲは１００ＭＨｚで測定した。
　質量スペクトル（ＭＳ）は、ＪＥＯＬ ＪＭＳ－Ｔ１００ ＬＣ ＡｃｃｕＴｏＦ（ＥＳＩ）で測定した。
　分取ＨＰＬＣは、ポンプ（ＰＵ－２０８０、ＪＡＳＣＯ）と検出器（ＭＤ－２０１５又はＦＰ－２０２５、ＪＡＳＣＯ）からなるＨＰＬＣシステムを用いて、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３（１０．０×２５０ｍｍ）カラム（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で行った。溶離液Ａ（０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ）、溶離液Ｂ（０．１％ＴＦＡを含む８０％アセトニトリルと２０％Ｈ２Ｏ）、溶離液Ｃ（１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含むＨ２Ｏ）、溶離液Ｄ（１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含む８０％アセトニトリルと２０％Ｈ２Ｏ）をＨＰＬＣ精製に使用した。
　ＬＣ－ＭＳ分析は、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を搭載したＷａｔｅｒｓ　Ａｃｑｕｉｔｙ　ＵＰＬＣ（Ｈクラス）／ＱＤａ四重極ＭＳ分析器又はＡｃｑｕｉｔｙ　ＵＰＬＣ（Ｈクラス）／Ｘｅｖｏ　ＴＱＤ四重極ＭＳ／ＭＳ分析器で行った。溶離液Ａ（０．１％ギ酸を含むＨ２Ｏ）、溶離液Ｂ（０．１％ギ酸を含む８０％アセトニトリル及び２０％Ｈ２Ｏ）、溶離液Ｃ（１０ｍＭギ酸アンモニウムを含むＨ２Ｏ）、溶離液Ｄ（１０ｍＭギ酸アンモニウムを含む８０％アセトニトリル及び２０％Ｈ２Ｏ）を用いた。
　シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーをＨＰＬＣシステム（Ｙａｍａｚｅｎ　Ｓｍａｒｔ　Ｆｌａｓｈ　ＥＰＣＬＣ　ＡＩ－５８０５　（日本・東京））で行った。ＳＮＡＰ　Ｕｌｔｒａ　Ｃ３０ｇ（Ｂｉｏｔａｇｅ）を搭載したＩｓｏｌｅｒａ　Ｏｎｅ（Ｂｉｏｔａｇｅ）で逆相ＭＰＬＣ精製を行った。
（３）ＵＶ－Ｖｉｓ吸収と蛍光分光法
　紫外可視スペクトルは島津製作所のＵＶ－１８００で得た。日立Ｆ７０００を用いて蛍光分光法による研究を行った。スリット幅は励起と発光の両方で５ｎｍであった。光電子増倍管電圧は４００Ｖであった。
（４）マイクロデバイスでのデジタル酵素測定
　酵素原液を、蛍光プローブを含むアッセイ緩衝液で希釈した。次に、４０μＬの反応混合物を手動ピペッティングによってマイクロデバイス（Ｓｉｍｏａ　ｄｉｓｋ；　Ｑｕａｎｔｅｒｘ）に導入した。次に、８０μＬのＦＣ－７０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をマイクロデバイスに導入して、過剰量の反応混合物を洗い流し、Ｗ／Ｏ液滴を形成させた。触媒的に生成した蛍光色素の蛍光信号を蛍光顕微鏡下で測定し、チャンバー内の酵素活性を測定した。
（５）マイクロデバイスの蛍光イメージング
　蛍光画像は、２０倍の乾式対物レンズ（Ｐｌａｎ Ａｐｏ ２０×）、ｓＣＭＯＳカメラ（ＯＲＣＡ－ＦｕｓｉｏｎＣ１４４４０、浜松フォトニクス）、白色ＬＥＤ照明ユニット（Ｘ－Ｃｉｔｅ Ｘｙｌｉｓ、Ｏｐｔｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、及びモーター駆動ステージを備えた蛍光顕微鏡（Ｔｉ２、ニコン）を使用して取得した。分析は、内部標準としてｓＳｉＲ（１０μＭ）を含む溶液を用いて測定を行い、焦点は蛍光を用いて調整した。画像は完全な焦点でタイルスキャンモードで取得した。励起フィルターはＦＩＴＣ（ミラー＝５１０ｎｍ、Ｅｘ．＝４６０～５００ｎｍ、Ｅｍ．＝５１０－５６０ｎｍ）、発光フィルターはｍＣｈｅｒｒｙ（ミラー＝６００ｎｍ、Ｅｘ．＝５５０～５９０ｎｍ、Ｅｍ．＝６０８－６８３ｎｍ）をそれぞれ使用した。
（６）画像処理
　ＮＩＳ　Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア（ニコン）のＧＡ３モジュールを使用して画像を処理した。まず、すべての蛍光画像をローリングボール補正（３μｍ）を用いて背景補正した。次に、ｍＣｈｅｒｒｙフィルター（直径＝３μｍ、コントラスト＝５００）を使用した輝点検出によってＲＯＩを選択し、蛍光デブリま又は気泡に由来する不規則な蛍光スポットは、ＲＯＩを拡張し、重複するＲＯＩを除去することによって省いた。蛍光シグナルは、各ＲＯＩの中心からのシグナルの平均として取得した。データはＥｘｃｅｌ又はＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈソフトウェアを使用して処理し、ヒストグラム及び散布図を作成した。
（７）酵素アッセイ
　酵素アッセイはリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ　７．４）で行った。半面積３８４ウェルプレート（コーニング３６７７）をアッセイに用いた（反応量２０μＬ）。蛍光は適切なフィルター設定のプレートリーダー、ＥｎＶｉｓｉｏｎ　２１０３　Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ　Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）で検出した。
（８）血漿サンプルと倫理規定
　血漿サンプルは、国立がん研究センター中央病院(日本・東京都)、大阪医療センター(日本・大阪府)、大阪医科大学 (日本・高槻市)、独立行政法人医薬基盤研究所及び厚生労働省の厚生労働科学研究費補助金により行われている健康科学基礎研究推進事業と鹿児島県民総合保健センター、において日本医療研究開発機構　（ＡＭＥＤ）　のＰ－ＣＲＥＡＴＥ　３６-３９事業の一環として採取された。本研究の倫理的承認は、日本医科大学中央倫理委員会 (M-2021-002) および日本医科大学倫理委員会 (A-2020-032およびA-2020-044) から得た。
１．化合物の合成と特性評価
［合成実施例１］
化合物１（２－スルホ－ニトロオレフィンＢＯＤＩＰＹ）の合成
　以下のスキーム１により、化合物１を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
（スキーム１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000048
　ニトロオレフィンＢＯＤＩＰＹまでの合成は、文献（In Situ Evaluation of Kinetic Resolution Catalysts for Nitroaldol by Rationally Designed Fluorescence Probe (J. Org. Chem. 2011, 76, 10, 3616-3625 Publication Date:March 3, 2011)に基づいて合成した。
　ニトロオレフィンＢＯＤＩＰＹ（７ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液（３　ｍＬ）を０℃に冷却し、クロロ硫酸（３．１３ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で１０分間撹拌した。続いて２Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムを含むＨ２Ｏで反応をクエンチした。反応混合物をＨＰＬＣ（溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ含有Ｈ２Ｏ、溶離液Ｂ：０．１％ＴＦＡ含有の８０％アセトニトリル及び２０％Ｈ２Ｏ；勾配：Ａ／Ｂ＝９５／５～０／１００、１５分）で精製して化合物１（赤色固体、１．４ｍｇ、収率１７％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ 8.33 (d,J=13.7Hz,1H), 8.23 (d,J=13.7Hz,1H), 8.06 (d, J=8.0Hz,2H), 7.52 (d,J=8.0Hz,2H), 6.21(s, 1H), 2.65(s, 3H), 2.46 (s, 3H),1.57(s, 3H),1.32(d,3H); HRMS (ESI-) : Calcd. for [M-H]-, 474.11065 ; Found, 474.10862 (-2.04 mDa) 
　精製後のＨＰＬＣクロマトグラムは次のとおりであった（溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ含有Ｈ２Ｏ、溶離液Ｂ：０．１％ＴＦＡ含有の８０％アセトニトリル及び２０％Ｈ２Ｏ；勾配：Ａ／Ｂ＝８０／２０～２０／８０、６０分；流量：１．０　ｍＬ／ｍｉｎ；検出：４９０ｎｍでの吸光度）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000049
［合成実施例２］
化合物２（２，６－スルホ－ニトロオレフィンＢＯＤＩＰＹ）の合成
　上記のスキーム１により、化合物２を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
　８－（ｐ－ニトロオレフィン）－ＢＯＤＩＰＹ（１０．７ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（３ｍＬ）溶液を０℃に冷却し、次にクロロ硫酸（１１．０４ｍｇ、６．３μＬ、０．０９４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を０℃で１０分間撹拌した。続いて２Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムを含むＨ２Ｏでクエンチした。反応混合物をＨＰＬＣ（溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ含有Ｈ２Ｏ、Ｂ：０．１％ＴＦＡ含有の８０％アセトニトリル及び２０％Ｈ２Ｏ；勾配：Ａ／Ｂ＝９５／５～０／１００、１５分）で精製して化合物２（赤色固体、１．８ｍｇ、収率１２％）を得た。
1H-NMR (400MHz,DMSO-d6): δ 8.34 (d,J=13.7Hz,1H),8.23 (d,J=13.7Hz,1H),8.06 (d, J=7.8Hz,2H),7.52(d,J=8.2Hz,2H),2.65(s,6H),1.53 (s,6H); HRMS (ESI-) : Calcd. for [M-H]-, 554.06747; Found, 554.06589 (-1.58 mDa)
　精製後のＨＰＬＣ（溶離液；Ａ／Ｂ＝４分で９５／５～５／９５）クロマトグラムを示す。５００ｎｍでの吸光度を検出した。溶離液Ａ（１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含むＨ２Ｏ）と溶離液Ｂ（１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含む８０％アセトニトリルと２０％Ｈ２Ｏ）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
［合成実施例３］
化合物４（２－ＣＯ２ＨニトロオレフィンＢＯＤＩＰＹ）の合成
　以下のスキーム２により、化合物４を合成した。
（スキーム２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000052
（１） 化合物３（２－ホルミルニトロオレフィンＢＯＤＩＰＹ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000053
　ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）にオキシ塩化リン（２ｍＬ）をＡｒ雰囲気下で５分間氷バッチ中に滴下した。溶液を室温まで温め、３０分間かき混ぜた。ジクロロエタン（１０ｍＬ）に８－（ｐ－ニトロオレフィン）－ＢＯＤＩＰＹ（２０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）を加え、５０℃まで温度を上げ、反応混合物を３０分間撹拌した。その後、反応混合物を室温まで冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。次に水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機抽出物を塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物をＭＰＬＣ（シリカゲル、８０／２０～０／１００ヘキサン／ＡｃＯＥｔ）で精製して化合物３（赤色固体、１２ｍｇ、収率５６％）を得た。
1H-NMR (400 MHz,CDCl3) : δ10.02 (s,1H), 8.08 (d, J=13.7 Hz,1H), 7.75 (d, J=7.8Hz, 2H), 7.69 (d, J=13.7Hz, 1H), 7.44 (d, J=8.2Hz, 2H), 6.19 (s, 1H), 2.83 (s, 3H), 2.63 (s, 3H), 1.68 (s, 3H), 1.45 (s, 3H); HRMS (ESI-) : Calcd. for [M-H]- , 422.14875; Found, 422.15008 (1.33mDa) 
（２） 化合物４（２－ＣＯ２ＨニトロオレフィンＢＯＤＩＰＹ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000054
　ＴＨＦ（６ｍＬ）と水（２ｍＬ）の混合物に化合物３（１４ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）を加えた後、ＮａＣｌＯ２（６ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）とＮＨ２ＳＯ３Ｈ（２９ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を３０分間攪拌した後、ＡｃＯＥｔで希釈し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液で洗浄した。有機層を塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物をＭＰＬＣ（シリカゲル、８０／２０～０／１００ヘキサン／ＡｃＯＥｔ）で精製して化合物４（ピンク赤色固体、５ｍｇ、収率３４％）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) : δ 8.33 (d, J=13.7Hz, 1H), 8.21 (d, J=13.7Hz, 1H), 8.04 (d, J=8.2Hz, 2H), 7.53 (s, 2H), 6.35 (s, 1H), 2.64 (s, 3H), 2.48 (s, 3H), 1.57 (s, 3H), 1.34 (s, 3H); HRMS (ESI-) : Calcd. for [M-H]- , 438.14367; Found, 438.14181 (-1.86 mDa) 
［合成実施例４］
化合物９（２，６－ｄｉＣＯ２ＨニトロオレフィンＢＯＤＩＰＹ）の合成
　以下のスキーム３により、化合物９を合成した。
（スキーム３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000055
（１） 化合物５（２，６－ｄｉＣＯ２ＢｚｌアセトキシメチルＢＯＤＩＰＹ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000056
　２，４－ジメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボン酸エチルエステル（２５０ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）と（４－ホルミルフェニル）酢酸メチル（９６ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解した。Ａｒ雰囲気下でトリフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）を加え、室温で１２時間撹拌した。２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（ＤＤＱ；１２２ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した後、反応物を塩水で３回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残った赤色固体をろ過カラム（アルミナ）で精製した。得られた粗ジピロメテンをトルエンとＮ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｎ－エチルアミン（ＤＩＥＡ；２ｍＬ）に溶解した。Ａｒ雰囲気下でＢＦ３－ＯＥｔ２（１．５ｍＬ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。次に、ＡｃＯＥｔを加え、混合物を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。得られた残渣をＭＰＬＣ（シリカゲル、８０／２０～０／１００ヘキサン／ＡｃＯＥｔ）で精製して化合物５（オレンジ色の固体、１２０ｍｇ、収率３３％）を得た
1H-NMR (400MHz, CDCl3) : δ7.51-7.24 (m, 14H), 5.26 (s, 4H), 5.21 (s, 2H), 2.82 (s, 6H), 2.17 (s, 3H), 1.64 (s, 6H); 13C-NMR (101MHz, CDCl3) : δ170.9, 164.1, 160.0, 147.9, 145.5, 138.0, 135.9, 134.1, 131.5, 129.0, 128.7, 128.4, 128.0, 122.3, 66.3, 65.5, 21.1, 15.3, 14.0; HRMS (ESI+) : Calcd. for [M+H]+ , 665.26345 ; Found, 665.26588 (2.43 mDa) 
（２） 化合物６（２，６－ｄｉＣＯ２ＢｚｌヒドロキシメチルＢＯＤＩＰＹ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000057
　化合物５（２００ｍｇ、０．２９８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２／メタノール、２：１　（２０ｍＬ）に溶解した。２ＮＮａＯＨ水溶液（２ｍＬ）を加え、溶液を室温で３時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、２ＮＨＣｌ水溶液と塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残渣をＭＰＬＣ（シリカゲル、８０／２０～０／１００ヘキサン／ＡｃＯＥｔ）で精製して６（オレンジ色の固体、１７０ｍｇ、収率９３％）を得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) : δ7.54-7.24 (m, 14H), 5.31 (s, 1H), 5.27 (s, 4H), 4.84 (s, 2H), 2.83 (s, 6H), 1.65 (s, 6H); 13C-NMR (101MHz, CDCl3) : δ164.1, 159.9, 148.0, 145.9, 142.8, 135.9, 133.4, 131.6, 128.7, 128.4, 127.9, 127.8, 122.2, 66.3, 64.7, 15.3, 14.1; HRMS (ESI+) : Calcd. for [M+H]+, 623.25288; Found, 623.25423 (1.35 mDa) 
（３） 化合物７（２，６－ｄｉＣＯ２ＨヒドロキシメチルＢＯＤＩＰＹ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000058
　化合物６（４０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２／メタノール、２：１（２０ｍＬ）に溶解した。少量の１０％Ｐｄ－Ｃを加えた後、混合物をＨ２雰囲気下で３時間撹拌した。ＴＬＣモニタリング（シリカ；ＣＨ２Ｃｌ２－０．１％（ｖ／ｖ）ＡｃＯＨ）によって生成物の形成が完了したことが示されると、Ｐｄ－Ｃをろ過して除去し、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残渣をＨＰＬＣ（溶離液Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含むＨ２Ｏ、Ｂ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含む８０％アセトニトリルと２０％Ｈ２Ｏ；勾配：Ａ／Ｂ＝９５／５～０／１００、１５分）で精製した。得られた溶液を脱塩し、減圧下で蒸発させ、凍結乾燥して化合物７（赤色固体、８ｍｇ、収率２８％）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6):δ7.53 (d, J=8.2Hz, 2H), 7.36 (d, J=8.2Hz, 2H), 5.42 (s, 1H), 4.63 (s, 2H), 2.70 (s, 6H), 1.59 (s, 6H); HRMS (ESI-) : Calcd. for [M-H]-, 441.14333; Found, 441.14091 (-2.42 mDa) 
（４）化合物８（２，６－ｄｉＣＯ２ＨホルミルＢＯＤＩＰＹ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000059
　ＤＭＳＯを１０％含む化合物７（８ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２ｍＬ）　溶液に、Ｄｅｓｓ－Ｍａｒｔｉｎ　ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ（６．１ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌し、蒸発させた。粗精製の化合物８をさらに精製することなく、次のステップで使用した。
（５）化合物９（２，６－ｄｉＣＯ２ＨニトロオレフィンＢＯＤＩＰＹ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
　ニトロメタン（１０μＬ、０．２ｍｍｏｌ）とメタノール（０．５ｍＬ）中化合物８の混合物を、０℃で撹拌した。２ＮＮａＯＨ水溶液（１ｍＬ）を３０分かけて加えた。撹拌を０℃でさらに３０分間続けた。混合物を水（３ｍＬ）で希釈し、３ｍＬの濃ＨＣｌを含むクラッシュアイスに注いだ。３０分の撹拌後、反応物を蒸発させた。残りの液体をＨＰＬＣ（溶離液Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含むＨ２Ｏ、Ｂ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含む８０％アセトニトリルと２０％Ｈ２Ｏ；勾配：Ａ／Ｂ＝９５／５～０／１００、１５分）で精製した。得られた溶液を脱塩し、減圧下で蒸発させ、凍結乾燥して化合物９（赤色固体、３．４ｍｇ、２段階で収率３．３％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, MeOD): δ8.15 (d, J=13.7Hz, 1H), 8.04(d, J = 13.7 Hz, 1H), 7.93 (d, J=7.8Hz, 2H), 7.50 (d, J=7.8Hz, 2H), 2.75 (s, 6H), 1.68 (s, 6H); HRMS (ESI-) : Calcd. for [M-H]- , 482.13350; Found, 482.13229 (-1.21 mDa)
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
　精製後のＨＰＬＣ（溶離液；４分でＡ／Ｂ＝９５／５～５／９５）クロマトグラムを示す。５００ｎｍでの吸光度を検出した。溶離液Ａ（０．０１Ｍギ酸アンモニウムを含むＨ２Ｏ）と溶離液Ｂ（０．０１Ｍギ酸アンモニウムを含む８０％アセトニトリルと２０％Ｈ２Ｏ）を用いた。
［参考合成実施例１］
化合物１３（２，６－ｄｉＰＯ３Ｈ２－ＢＯＤＩＰＹ）の合成
　以下のスキーム４により、化合物１３を合成した。
（スキーム４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000062
（１）化合物１０（ｔｅｒｔ－ブチル２－ヒドロキシミノ－３－オキソ酪酸塩）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000063
　ｔｅｒｔ－ブチル－３－オキソブタン酸（８　ｍＬ、４８ｍｍｏｌ）を丸底フラスコで酢酸（２０ｍＬ）に溶かし、氷浴中で約１０℃に冷却した。１５℃以下に保ったまま亜硝酸ナトリウム（３．６ｇ、５２ｍｍｏｌ）を３０分かけて加えた。冷水浴を外して室温で３．５時間攪拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液と塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。次のステップでは、さらなる精製を行わずに粗精製の化合物１０を使用した。
（２） 化合物１１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000064
　ホスホン酸ジエチル（２－オキソプロピル）の撹拌混合物（３．５ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）に亜鉛ダスト（１．３ｇ、２０ｍｍｏｌ）を一部添加した。この混合物を６０℃に加熱した。この温度では、酢酸（３ｍＬ）中の粗精製の化合物１０（３．６ｇ、２０ｍｍｏｌ）がゆっくりと沈殿した。その後、温度を７５℃に上げ、１時間保持した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残渣をＨＰＬＣ（溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ含有Ｈ２Ｏ、Ｂ：０．１％ＴＦＡ含有の８０％アセトニトリルと２０％Ｈ２Ｏ；勾配：Ａ／Ｂ＝９５／５～０／１００、１５分）で精製して化合物１１（淡褐色の油、４５８ｍｇ、収率７％）を得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) : δ9.01 (s, 1H), 4.12-4.01 (m, 4H), 2.49 (s, 2H), 2.41 (s, 2H), 1.57 (s, 9H), 1.33-1.30 (m, 6H); 13C-NMR (101MHz, CDCl3) ; δ160.9, 140.5, 131.3, 120.6, 107.5, 81.4, 61.7, 28.5, 16.3, 13.5, 11.8; HRMS (ESI-) : Calcd. for [M-H]- , 330.14703; Found, 330.14519 (-1.85 mDa) 
（３） 化合物１２（２，６－ｄｉＰＯ３Ｅｔ２－ＢＯＤＩＰＹ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000065
　化合物１１（２１４ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）とベンズアルデヒド（３５μＬ、０．３２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解した。Ａｒ雰囲気下でトリフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）を加え、室温で１２時間撹拌した。ＤＤＱ（７２．６ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌後、反応物を塩水で三回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残った赤色固体をろ過カラム（アルミナ）で精製した。得られた粗ジピロメテンをトルエンとＤＩＥＡ（２ｍＬ）に溶解した。Ａｒ雰囲気下でＢＦ３－ＯＥｔ２（１．５ｍＬ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。次に、ＡｃＯＥｔを加え、混合物を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。粗生成物をＭＰＬＣ（シリカゲル、８０／２０～０／１００ヘキサン／ＡｃＯＥｔ）で精製して化合物１２（オレンジ色の固体、３２ｍｇ、収率１６％）を得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) : δ7.54 (m, 3H), 7.26 (m, 2H), 4.07 (m, 8H), 2.81 (s, 6H), 1.63 (s, 6H), 1.30 (m, 12H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3): δ161.2, 161.0, 151.3, 151.2, 145.4, 134.2, 132.4, 132.2, 129.9, 129.8, 127.5, 118.9, 116.9, 61.8, 61.7, 16.4, 14.7, 13.9; HRMS (ESI+) : Calcd. for [M+H]+ , 597.22662; Found, 597.22734 (0.72 mDa) 
（４）化合物１３（２，６－ｄｉＰＯ３Ｈ２－ＢＯＤＩＰＹ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000066
　化合物１２（３２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）に溶解した。Ａｒ雰囲気下でヨウ化トリメチルシリル（６６μＬ、０．４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間撹拌した。Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液を添加した。３０分間攪拌後、反応物を蒸発させた。残りの液体をＨＰＬＣ（溶離液Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含むＨ２Ｏ、Ｂ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含む８０％アセトニトリルと２０％Ｈ２Ｏ；勾配：Ａ／Ｂ＝９５／５～０／１００、１５分）で精製した。得られた溶液を脱塩し、減圧下で蒸発させた後、凍結乾燥して化合物１３（オレンジ色の固体、４ｍｇ、収率１６％）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ7.51- 7.22 (m, 4H), 4.62 (s, 2H), , 2.43 (s, 6H), 1.48 (s, 6H) 
［合成実施例５］
化合物１７（２，６－ｄｉＰＯ３Ｈ２ニトロオレフィンＢＯＤＩＰＹ）の合成
　以下のスキーム４により、化合物１７を合成した。
（スキーム４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000067
（１） 化合物１４（２，６－ｄｉＰＯ３Ｅｔ２アセトキシメチルＢＯＤＩＰＹ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000068
　化合物１１（３７９ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）と（４－ホルミルフェニル）酢酸メチル（１０１．５ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）に溶解した。Ａｒ雰囲気下でトリフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）を加え、室温で１２時間撹拌した。ＤＤＱ（１２９．４ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌後、反応物を塩水で三回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残った赤色固体をろ過カラム（アルミナ）で精製した。得られた粗ジピロメテンをトルエンとＤＩＥＡ　（２ｍＬ）に溶解した。Ａｒ雰囲気下でＢＦ３－ＯＥｔ２（１．５ｍＬ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。次に、ＡｃＯＥｔを加え、混合物を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。粗生成物をＭＰＬＣ（シリカゲル、８０／２０～０／１００ヘキサン／ＡｃＯＥｔ）で精製し、化合物１４（オレンジ色の固体、１５８ｍｇ、収率１８％）を得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) : δ7.53 (d, J=8.2Hz, 2H), 7.28 (d, J=8.2Hz, 2H), 5.20 (s, 2H), 4.16-3.98 (m, 8H), 2.82 (s, 6H), 2.16 (s, 3H), 1.63 (s, 6H), 1.32-1.28(m, 12H); 13C-NMR(101MHz, CDCl3) : δ161.2, 161.0, 151.3, 151.2, 145.5, 143.4, 133.0, 132.5, 132.3, 127.9, 127.6, 118.7, 116.7, 64.3, 61.9, 61.8, 29.8, 16.4, 16.3, 14.7, 14.0; HRMS (ESI+) : Calcd. for [M+H]+ , 669.24775; Found, 669.24394 (-3.80 mDa) 
（２）化合物１５（２，６－ｄｉＰＯ３Ｈ２ヒドロキシメチルＢＯＤＩＰＹ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000069
　化合物１４（５０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）に溶解した。Ａｒ雰囲気下でヨウ化トリメチルシリル（９７μＬ、０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間攪拌した。その後混合物を、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液でクエンチした。次に、２ＮＮａＯＨａｑ．（１ｍＬ）を添加した。３０分の撹拌後、反応物を蒸発させた。残りの液体をＨＰＬＣ（溶離液Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含むＨ２Ｏ、Ｂ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含む８０％アセトニトリルと２０％Ｈ２Ｏ；勾配：Ａ／Ｂ＝９５／５～０／１００、１５分）で精製した。得られた溶液を脱塩し、減圧下で蒸発させた後、凍結乾燥して化合物１５（オレンジ色の固体、５ｍｇ、収率１４％）を得た。
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ7.51 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.22 (ｍ, 2H), 4.62 (s, 2H), 2.43 (s, 6H), 1.48 (s, 6H); HRMS (ESI-) : Calcd. for [M-H]- , 513.09634; Found, 513.09675 (0.41 mDa) 
（３） 化合物１６（２，６－ｄｉＰＯ３Ｈ２ホルミルＢＯＤＩＰＹ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000070
　ＤＭＳＯを１０％含むＭｅＣＮ（２ｍＬ）　中の化合物１５（５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｄｅｓｓ－Ｍａｒｔｉｎ　ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ（６．２ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌し、蒸発させて粗精製化合物１６を得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
（４）化合物１７（２，６－ｄｉＰＯ３Ｈ２ニトロオレフィンＢＯＤＩＰＹ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000071
　ニトロメタン（１μＬ、０．０２ｍｍｏｌ）と化合物１６の混合物をメタノール（０．５ｍＬ）中、０℃で撹拌した。２ＮＮａＯＨ水溶液（１ｍＬ）を３０分かけて加えた。撹拌を０℃でさらに３０分間続けた。混合物を水（３ｍＬ）で希釈し、３ｍＬの濃ＨＣｌを含むクラッシュアイスに注いだ。３０分の撹拌後、反応物を蒸発させた。残りの液体をＨＰＬＣ（溶離液Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含むＨ２Ｏ、Ｂ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを含む８０％アセトニトリルと２０％　Ｈ２Ｏ；勾配：Ａ／Ｂ＝９５／５～０／１００、１５分）で精製した。得られた溶液を脱塩し、減圧下で蒸発させた後、凍結乾燥して化合物１７（オレンジ色の固体、１．２ｍｇ、２段階収率２０％）を得た。
1H-NMR (400MHz, METHANOL-d4): δ8.16 (d, J=13.7Hz, 1H), 8.04 (d, J=13.7Hz, 1H), 7.93 (d, J=8.2Hz, 2H), 7.49 (d, J=7.8Hz, 2H), 2.72 (s, 6H), 1.67 (s, 6H); HRMS (ESI-) : Calcd. for [M-H]- , 554.08650; Found, 554.08845 (1.95 mDa)
［実施例１］
（１）化合物１及び２の光学特性
　合成実施例１で得た化合物１と、合成実施例２で得た化合物２の光学特性を評価した。結果を図４に示す
　図４の（ａ）は、化合物１及び２の吸収スペクトルと発光スペクトルをそれぞれ示す。これらのスペクトルは、共溶媒として０．１％のＤＭＳＯを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ７．４で測定した。グルタチオン（ＧＳＨ；１００μＭ）をモデルチオールとして添加した。蛍光スペクトルを４６０ｎｍの励起下で測定した。
　図４の（ｂ）は、化合物１及び２の吸光度と発光最大波長および量子収量を示す。すべてのデータはｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で測定した。
（２）化合物１及び２のマイクロデバイス適合性
　化合物１及び２のマイクロデバイス適合性の検討を行った結果を図５に示す。
　図５の（ａ）は、２，６位無置換のＢＯＤＩＰＹを含む３種類の各プローブとＧＳＨでオクタノールと水を補充した様子の写真を示す。図５の（ｂ）は、プローブを搭載し、チオールと反応させたマイクロデバイスの蛍光画像を示す。
　図５の（ｃ）は、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）活性の検出のためのアセチルチオコリン系のカップルドアッセイ（ｃｏｕｐｌｅｄ　ａｓｓａｙ）の模式図を示す。
　図５の（ｄ）は、ＨＥＰＥＳ－緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４、０．１％ＣＨＡＰＳ含有）に蛍光プローブ（３０μＭ）を入れ、３７℃で１．５時間インキュベートしたヒト血漿を含むマイクロデバイスの蛍光画像を示す。上図は、ヨウ化アセチルチオコリンを含まない血漿サンプル（１０００倍希釈）の結果を、下図は、ヨウ化アセチルチオコリン（１ｍＭ）を加えた血漿サンプル（１０００倍希釈）の結果を示す。
　２，６位無置換のＢＯＤＩＰＹでは脂溶性が高く、オイルに溶け込んでしまうことによって蛍光シグナルが得られなくなる一方で、モノスルホン酸体、ジスルホン酸体両方においてマイクロデバイス内でウェルに封入されオイルへの漏出が抑制できていることが確認された。一方、モノスルホン酸体では反応容器の蛍光像がドーナツ状に観察された（図４の（ｂ））。これは、モノスルホン酸体の水溶性が十分ではないために、ＣＹＴＯＰで作られている反応容器の内壁にプローブが吸着してしまった結果と考えられる）。ジスルホン酸体ではこのような吸着は見られなかった。
［実施例２］
（１） 化合物４及び化合物９の光学特性
　合成実施例３で得られた化合物４、合成実施例４で得られた化合物９の光学特性を評価した。結果を図６に示す
　図６に、化合物４及び９の吸収スペクトルと発光スペクトルをそれぞれ示す。これらのスペクトルは、共溶媒として０．１％のＤＭＳＯを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ７．４で測定した。ＧＳＨ（１００μＭ）をモデルチオールとして添加した。蛍光スペクトルを４６０ｎｍの励起下で測定した。また、各プローブの吸収及び発光の最大波長を示す。
（２）化合物４及び９のマイクロデバイス適合性
　化合物４及び９のマイクロデバイス適合性の検討を行った結果を図７に示す。
　図７の（ａ）は、各プローブとＧＳＨでオクタノールと水を補充した様子の写真（水－オクタノールへの分配実験）を示す。図７の（ｂ）は、プローブを搭載し、チオールと反応させたマイクロデバイスの蛍光画像を示す。
　化合物４及び９について、実施例１よりもＳ／Ｎは改善したが、ウェルへの吸着は実施例１と同様な結果であった。モノカルボン酸体は特に脂溶性が高く、水－オクタノールへの分配実験ではオクタノール（脂溶性溶媒）側に多く分配される様子が観察され、ジカルボン酸体においても一部オクタノールへの分配が観察された。
［実施例３］
（１） 化合物１７の光学特性
　図８の（ａ）に、化合物１７の吸収スペクトルと発光スペクトルをそれぞれ示す。これらのスペクトルは、共溶媒として０．１％のＤＭＳＯを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ７．４で測定した。ＧＳＨ（１００μＭ）をモデルチオールとして添加した。蛍光スペクトルを４７０ｎｍの励起下で測定した。
　図８の（ｂ）は、プローブの吸光度、発光最大波長、および量子収率を示す。全てのデータはｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で測定した。
　ｐＨ７．４バッファー中のＳ／Ｎはジスルホン酸体（化合物２）より大幅に上昇した。これは、ＰＯ３Ｈ－及びＰＯ３ ２－の平衡（ｐＨ７．４では存在比はおおよそ１：３と見積もられる）にあるＢＯＤＩＰＹにおいて、その電子求引性がスルホン酸よりも低いことによって、チオールとの反応前の状態で十分にｄ－ＰｅＴが起こるためと考えられる。　
（２）化合物１７のマイクロデバイス適合性
　化合物１７のマイクロデバイス適合性の検討を行った結果を図８に示す。
　図９は、ヒト血漿（３０００倍希釈）を蛍光プローブ（化合物１７；３０μＭ）と混合し、ヨウ化アセチルチオコリン（１ｍＭ）の有無にかかわらずＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４、０．１％ＣＨＡＰＳ含有）に入れたマイクロデバイスの蛍光画像を示す。２５℃で３０分間インキュベートした後に画像を取得した。
　水溶性の高さによって、マイクロデバイスへの吸着も観察されず、酵素活性の１分子検出に利用可能であることが分かった。実施例１～３で開発したプローブの水溶性の比較を　ＬＣ－ＭＳの溶出時間の違いによって評価すると（Ｃ１８担体への保持されやすさによって水溶性を見積もることができることが知られている）、ジホスホン酸体において水溶性が大きく向上していることが改めて示唆される結果となった（図１０）。
　図１０は、５つの化合物の混合物をＬＣ－ＭＳで分析し、各化合物の抽出物イオンクロマトグラムを表示色で示した。左から、ジホスホン酸体、ジカルボン酸体、ジスルホン酸体、モノスルホン酸体、モノカルボン酸体の結果を示す。
　５００ｎｍ（溶離液Ａ：１０ｍＭギ酸アンモニウムを含むＨ２Ｏ；溶離液Ｂ：アセトニトリル８０％、ギ酸アンモニウム１０ｍＭを含むＨ２Ｏ２０％）で検出された０．５分でＡ／Ｂ＝１００／０、３分で１００／０から０／１００の線形勾配で溶出した。
　また、実施例１～３で行った化合物１、２、４、９及び１７のマイクロデバイス適合性の結果をまとめて図１１に示す。
［実施例４］
　次に、実施例３で検討した化合物１７（２，６－ｄｉＰＯ３Ｈ２ニトロオレフィンＢＯＤＩＰＹ）を用いて、マイクロデバイスを用いてヒト血液中の酵素活性の検出が可能かについて検証をおこなった。
　まず、様々なパラメーターをふり、以下の条件を最適条件として設定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000072
（１）血液中酵素の検出
　図１２にマイクロデバイスを用いた血液中酵素の検出の模式図を示す。
　測定した結果を図１３に示す。図１３は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４、０．１％ＣＨＡＰＳ含有）中で蛍光プローブ（化合物１７；３０μＭ）およびヨウ化アセチルチオコリン（１ｍＭ）と混合したヒト血漿（３０００倍および１万倍希釈）を含むマイクロデバイスの蛍光画像である。２５℃で３０分間インキュベートした後に画像を取得した。
　血液を１／１０，０００まで希釈した状態で１分子レベルの酵素活性が検出され、λ＝０．０３（総酵素濃度１ｐＭ相当）となった。血中の酵素を１分子ごとに分離し、酵素活性を検出できることが示唆された。
（２） 蛍光強度の比較
　ここまででマイクロデバイス中の輝点数から、血中酵素を１分子ごとに分離できることが分かった。酵素活性の評価には蛍光強度も重要になる。ヒト血液サンプルを用いて、タイムコースで血中の酵素の観察を行った。結果を図１４に示す。
　図１４は、ヒト血漿を含むマイクロデバイスの蛍光像の経時解析を示す。
　上段の図は、プローブ（３０μＭ）、アセチルチオコリン（１ｍＭ）、および健康なヒト被験者の１万分の１希釈血漿サンプルを搭載したマイクロデバイスの蛍光画像である。シーリングの２～１０分後に画像を取得した。白い矢印は反応速度の速い酵素を含むチャンバーを示し、白い矢尻は反応速度の遅い酵素を含むチャンバーを示す。
　下段の図は、１０分後の画像に白線で示されているＲＯＩに沿ったラインスキャン分析によるデバイスの正規化蛍光強度を示す。
　２ｍｉｎの段階で、蛍光強度の高い輝点と低い輝点が存在し、反応速度が非常に速いために、１０ｍｉｎ程度でどちらもシグナルが飽和し反応完結を示唆する結果が得られた。ここから、血液中に少なくとも２つの異なる時定数をもってアセチルチオコリンと反応する酵素が存在することが確かめられた。タイムコースイメージングの場合には褪色（約５％／撮像）の影響が無視できないため、以降、操作時間を含めて安定してシグナルが取得でき、かつ両者のシグナルが分離できる反応時間として５ｍｉｎを設定して活性パターンの測定を行った。
（３） 活性パターンの確認
　ヒト血液サンプルを用いて、取得した画像についてＮｉｋｏｎ　ＮＩＳのＧＡ３　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　上で輝点抽出をおこない輝点数および輝点強度の解析をおこなった。
　得られたヒト血漿を含むマイクロデバイスの蛍光画像を図１５に示す、
　上段の図は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４、０．１％ＣＨＡＰＳ含有）中で蛍光プローブ（化合物１７；３０μＭ）およびヨウ化アセチルチオコリン　（１ｍＭ）と混合したヒト血漿（１万倍希釈）　を含むマイクロデバイスの蛍光画像である。２５℃で５分間インキュベートした後に画像を取得した。
　図の下段は、プロットされたチャンバーの数と蛍光の増加を示すヒストグラムを示す。
　血液サンプルの輝点について分析すると、大きく２つの活性値を有する山（図１５）左の矢印および矢頭）を確認することができた。存在比の少なさや反応速度の高さから、活性値の高い酵素はＡＣｈＥに相当することが予想される。
［実施例５］
Ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ２（ＧＬＯ２）の検出実験
　ＧＬＯ２は、２－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ代謝系を担うグリオキサラーゼ代謝経路の一角を担い、多くのがんで活性異常が起こることが知られている。ＧＬＯ２は、Ｓ－Ｄ－ラクトイル－グルタチオンを代謝するため（下記反応式参照）、本発明のプローブを用いてこれを使ったcoupled assayを構築することが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000073
　　グルタチオンのエステルを加水分解する活性（ＧＬＯ２と考えられる）を血液中で検出した結果を図１６に示す。
　ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４、０．１％ＣＨＡＰＳ含有）中で蛍光プローブ（化合物１７；３０μＭ）およびＳ－Ｄ－ラクトイル－グルタチオン（１ｍＭ）と混合したヒト血漿（１０００倍希釈）を含むマイクロデバイスの蛍光画像である。２５℃で１晩インキュベートした後に画像を取得した。
［実施例６］
　本発明の蛍光プローブは、基質アナログと反応する反応点として、実施例１～４で示したニトロオレフィンの他に、ニトロフェノール類、マレイミドなどの高求電子性化合物又はその基を用いることができる。ニトロフェノール類について、１分子計測への適用可能性を検証した結果と、マレイミド類についてカップルドアッセイへの適用可能性を検証した結果を以下に示す。
（１） 図１７は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４、０．１％ＣＨＡＰＳ含有）中で以下の式で表される本発明の蛍光プローブ（２．４－ジニトロ ｓＴＭ、１μＭ）およびヨウ化アセチルチオコリン（１ｍＭ）と混合したヒト血漿（１０００倍希釈）を含むマイクロデバイスの蛍光画像である。３７℃で９０分間後に画像を取得した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000074
　図１７で示すように、ニトロフェノール構造を有する本発明のプローブを用いることで血液中のアセチルコリンエステラーゼの活性を検出することができた。
（２）図１８は、マレイミド構造を有するプローブを用いたＡＣｈＥ及びホスホリパーゼ（ＰＬＡ２）の活性検出結果を示す。
　この実験では、Ｐ基質アナログとして以下の式で表されるチオリン脂質をＬＡ２のカップルドアッセイに使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000075
　図１８は、上記に記載の含硫黄脂質アナログとホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）を反応させた溶液に、図中に記載のマレイミド基を有するプローブを添加し蛍光スペクトルを計測したものを示す。ＰＬＡ２の存在下で蛍光強度の上昇が観察され、本発明に係るカップルドアッセイによってＰＬＡ２の活性を計測可能であることを示唆する結果が得られた。

Claims (27)

  1. 　マイクロデバイスを用いて、生体試料中の酵素の活性を検出する方法であって、
    　生体試料と、基質アナログ又は天然基質と、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを接触させる工程であって、
    　ここで、前記基質アナログ又は天然基質は、酵素と反応することにより、チオール基（Ｒ－ＳＨ）、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）又はポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）を有する化合物Ａ（Ｒは、水素原子又はアルキル基であり、ｎは、１～５である）を生成し、及び
    　該一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩がチオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応することにより生成する蛍光性生成物から発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含む、
    　当該方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    （式中、
    Ｔは、チオール基（Ｒ－ＳＨ）、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）、ポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）と反応する反応性部位であり；
    Ｓは、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基であり；
    ｎ１は、１～１０の整数を表し；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    は、蛍光団を表し、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩がチオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応することにより、当該化合物の分子全体として光学特性が変化する分子設計がなされており；
    Ｓ、Ｔは、リンカーを介して前記蛍光団に結合していてもよい。）
  2. 　前記基質アナログは、チオエステル、又はセレノエステル様の構造を有し，酵素反応によって対応するチオール基又はセレノール基を生成する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記蛍光団が、ＢＯＤＩＰＹ系の蛍光団、ローダミン系の蛍光団、フルオレセイン系の蛍光団、ロドール類縁体の蛍光団、シアニン系の蛍光団、レゾルフィン系の蛍光団、クマリン系の蛍光団からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記反応性部位が、置換基を有してもよいニトロオレフィン基、マレイミド類、電子欠損アリール基、アルキル又はアリールスルホン酸基（Ｒ’－ＳＯ３－；Ｒ’は、置換基を有してもよいアルキル基又は置換基を有してもよいアリール基を示す）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記基質アナログが、アセチルチオコリン、ブチルチオコリン、又は含硫黄脂質からなる群から選択される１以上である、請求項２に記載の方法。
  6. 　検出対象の酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、グリオキシラーゼ、ＳＡＨヒドラーゼ、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニンγリアーゼ、Ｓ－アデノシルホモシステイン加水分解酵素及びシスタチオニンβシンターゼからなる群から選択される１以上である、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記酵素が、アセチルコリンエステラーゼ、ホスホリパーゼＡ２又はグリオキシラーゼ２である、請求項６に記載の方法。
  8. 　マイクロデバイスを用いて、生体試料中の酵素の活性を検出する方法に用いる蛍光プローブであって、該方法は、
    　生体試料と、基質アナログ又は天然基質と、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを接触させる工程であって、
    　ここで、前記基質アナログ又は天然基質は、酵素と反応することにより、チオール基（Ｒ－ＳＨ）、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）又はポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）を有する化合物Ａ（Ｒは、水素原子又はアルキル基であり、ｎは、１～５である）を生成し、及び
    　該一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩がチオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応することにより生成する蛍光性生成物から発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含み、
    　前記基質アナログは、酵素と反応することにより、チオール基、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）又はポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）を有する化合物Ａを生成する方法であって、
    　前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、当該蛍光プローブ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    （式中、
    Ｔは、チオール基（Ｒ－ＳＨ）、セレノール基（Ｒ－ＳｅＨ）、ポリ硫黄原子（Ｒ－（Ｓ）ｎ－Ｈ）と反応する反応性部位であり；
    Ｓは、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基であり；
    ｎ１は、１～１０の整数を表し；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
    は、蛍光団を表し、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩がチオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応することにより、当該化合物の分子全体として光学特性が変化する分子設計がなされており；
    Ｓ、Ｔは、リンカーを介して前記蛍光団に結合していてもよい。）
  9. 　前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、
    　スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基を１～５個有し、チオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応する反応性部位を１～３個有する、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩である、請求項８に記載の蛍光プローブ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
    （式中、
    Ｒａは、それぞれ独立に、水素原子、一価の置換基、前記親水性基、前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基又は前記反応性部位であり；
    Ｒｂは、それぞれ独立に、水素原子、一価の置換基、前記親水性基、前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基又は前記反応性部位であり；
    Ｒｃは、それぞれ独立に、水素原子、一価の置換基、前記親水性基、前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基又は前記反応性部位であり、
    Ｘは、それぞれ独立に、フッ素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基から選択される。）
  10. 　前記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩が、以下の一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩である、請求項９に記載の蛍光プローブ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
    （式中、
    Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し、当該置換基は前記親水性基を有してもよく；
    ｍは、０～４の整数であり、ｍが２以上の場合は、各々のＲ１は同じであっても異なっていてもよく；
    Ｔ１は、チオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応する反応性部位であり、Ｔ１は、ベンゼン環上に２以上結合していてもよく；
    Ｒ２～Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基であり；
    Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立に、フッ素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基から選択される。）
  11. 　前記一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩が、以下の一般式（ＩＩｂ）で表される化合物又はその塩である、請求項１０に記載の蛍光プローブ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
    （式中、
    Ｒ１～Ｒ７、Ｘ１、Ｘ２及びｍは、般式（ＩＩａ）で定義した通りであり；
    Ｒ８は、水素原子又は炭素数１～１０の置換又は無置換のアルキル基を示し、
    置換基を有してもよいニトロオレフィン部位は、ベンゼン環上に２以上結合していてもよく；
    ただし、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは前記親水性基である。）
  12. 　前記一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩が、以下の一般式（ＩＩｃ）で表される化合物又はその塩である、請求項１０に記載の蛍光プローブ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
    （式中、
    Ｒ１～Ｒ７、Ｘ１、Ｘ２及びｍは、般式（ＩＩａ）で定義した通りであり；
    マレイミド基は、ベンゼン環上に２以上結合していてもよく；
    ただし、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは前記親水性基である。）
  13. 　前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、
    　スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基を１～５個有し、チオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応する反応性部位を１～３個有する、以下の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩である、請求項８に記載の蛍光プローブ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
    （式中、
    Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し；
    ｓは、０～４の整数であり、ｓが２以上の場合は、各々のＲ１は同じであっても異なっていてもよく；
    Ｓ３は、スルホン酸基、カルボキシル基又はホスホン酸基から選択される親水性基であり；
    ｔは、０～５であり：
    Ｒ２～Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基であり；
    Ｔ２は、チオール基、セレノール基又はポリ硫黄原子と反応する反応性部位であり；
    Ｘ１及びＸ２は、（Ｏ、Ｏ）、（Ｏ、ＮＲ８）、（ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ８）、（ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ８）の組み合わせから選択され、ここで、Ｒ８～Ｒ１０は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６の置換または無置換のアルキル基、炭素数１～６の置換または無置換のアルケニル基、前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基、又は前記親水性基を有する炭素数１～６のアルケニル基であり；
    Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ、Ｓ（Ｒｄ）２、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、テルル原子又はビスマス原子から選択され、
    ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のアリール基であり、
    Ｒｃは、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基であり、
    Ｒｄは、同一又は異なる、置換又は無置換のアリール基であり、
    Ｒａ～Ｒｄの前記アルキル基、前記アリール基、前記フェニル基は、前記親水性基で置換されていてもよい。）
  14. 　Ｔ２の反応性部位が、以下のいずれかである、請求項１３に記載の蛍光プローブ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
    （式中、＊は、結合箇所を表す。）
  15. 　前記基質アナログは、チオエステル、又はセレノエステル様の構造を有し，酵素反応によって対応するチオール基又はセレノール基を生成する、請求項８に記載の蛍光プローブ。
  16. 　前記基質アナログが、アセチルチオコリン、ブチルチオコリン、及び含硫黄脂質誘導体からなる群から選択される１以上である、請求項１５に記載の蛍光プローブ。
  17. 　検出対象の酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、グリオキシラーゼ、ＳＡＨヒドラーゼ、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニンγリアーゼ、Ｓ－アデノシルホモシステイン加水分解酵素及びシスタチオニンβシンターゼからなる群から選択される１以上である、請求項８に記載の蛍光プローブ。
  18. 　前記酵素が、アセチルコリンエステラーゼ、ホスホリパーゼＡ２又はグリオキシラーゼ２である、請求項１７に記載の蛍光プローブ。
  19. 　血液などの生体サンプル中のアセチルコリンエステラーゼの活性を検出するために用いられる、請求項１８に記載の蛍光プローブ。
  20. 　以下の一般式（ＩＩｂ）で表される化合物又はその塩。
    （Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
    （式中、
    Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し、当該置換基は、スルホン酸基、カルボキシル基及びホスホン酸基からなる群から選択される親水性基を有してもよく
    ｍは、０～４の整数であり、ｍが２以上の場合は、各々のＲ１は同じであっても異なっていてもよく；
    Ｒ２～Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基であり；
    Ｒ８は、水素原子又は炭素数１～１０の置換又は無置換のアルキル基を示し；
    但し、Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、スルホン酸基、カルボキシル基又はホスホン酸基であり：
    Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立に、フッ素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はアリール基、前記親水性基又は前記親水性基を有する炭素数１～６個のアルキル基から選択される。）
  21. 　Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、スルホン酸基である、請求項２０に記載の化合物又はその塩。
  22. 　Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、カルボキシル基である、請求項２０に記載の化合物又はその塩。
  23. 　Ｒ３及びＲ６の少なくとも１つは、ホスホン酸基である、請求項２０に記載の化合物又はその塩。
  24. 　ｍが１～２であり、Ｒ１が、炭素数１～６のアルコキシル基である、請求項２０に記載の化合物又はその塩。
  25. 　ニトロオレフィン部位がベンゼン環の２位又は４位に結合している、請求項２０に記載の化合物又はその塩。
  26. 　Ｒ３～Ｒ６は、いずれもメチル基である、請求項２２に記載の化合物又はその塩。
  27. 　以下から選択される化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
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