WO2013024843A1 - セラミド誘導体およびこれを用いたゴルジ体標識化蛍光プローブ - Google Patents

セラミド誘導体およびこれを用いたゴルジ体標識化蛍光プローブ Download PDF

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WO2013024843A1
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golgi
golgi apparatus
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西田　篤司
中村　浩之
智彦 牧山
俊彦 村山
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国立大学法人 千葉大学
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Definitions

  • the present invention relates to a ceramide derivative and a Golgi-labeled fluorescent probe using the same.
  • the Golgi apparatus is an intracellular organelle located at the center of the vesicle transport pathway and is present in most eukaryotic cells.
  • the main functions of the Golgi apparatus are protein modification and selective transport, but they are important organelles that also synthesize some lipids and glycolipids.
  • the function of the Golgi apparatus is very important, and more than 90% of the sphingolipid, which is an important lipid in vivo, is synthesized in the Golgi apparatus.
  • studying the functions of the Golgi apparatus and the proteins that function in the Golgi apparatus is very important in understanding life phenomena.
  • the intracellular localization is often observed with a fluorescence microscope.
  • Golgi labeled probe Golgi labeled probe
  • Non-Patent Document 1 describes a ceramide derivative called NBD-C6-ceramide as a conventional Golgi-labeled fluorescent probe.
  • This NBD-C6-ceramide is obtained by fluorescently labeling endogenous ceramide (N-acyl sphingosine).
  • N-acyl sphingosine N-acyl sphingosine
  • a fluorescent chromophore is introduced at the N-acyl site of ceramide. ing. Due to such a chemical structure, NBD-C6-ceramide is taken up into the cell when added to the cell and can selectively stain the Golgi apparatus.
  • the Golgi apparatus using the above-described conventional ceramide derivative (NBD-C6-ceramide) as a fluorescent probe has a problem that the staining cannot be continued for a long time. It turned out to be. That is, since NBD-C6-ceramide has a cytotoxic effect, the cell itself is killed within 24 hours after being taken into the cell, and further cell observation becomes impossible. Endogenous ceramide is metabolized to glucosylceramide by addition of oligosaccharides in the Golgi apparatus, or metabolized to sphingomyelin following the transfer of phosphocholine from phosphatidylcholine, and sent to the cell membrane for its constituents. Become.
  • NBD-C6-ceramide like endogenous ceramide, is metabolized to glucosylceramide and sphingomyelin in the Golgi, and transported from the Golgi to the cell membrane after a few hours. It is difficult.
  • an object of the present invention is to provide means for selectively fluorescently labeling the Golgi apparatus with low cytotoxicity and excellent intracellular stability.
  • the present inventors have conducted intensive research in view of the above-described problems in the prior art.
  • the fluorescent chromophore introduced in the N-acyl site of endogenous ceramide (N-acyl sphingosine) in NBD-C6-ceramide is introduced not at the N-acyl site but at the end of the alkyl group of the fatty acid.
  • An attempt was made to introduce an acyl group at the end of the hydroxymethyl group of endogenous ceramide.
  • the obtained compound was used as a fluorescent probe for Golgi apparatus staining, it was found that it showed little cytotoxicity and was also excellent in intracellular stability.
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms
  • n is an integer of 1 to 20.
  • a ceramide derivative represented by the formula: The ceramide derivative preferably has the following chemical formula 2:
  • R 1 , R 2 , and n are as defined above. It is represented by
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • R 2 is an alkyl group having 5 to 15 carbon atoms
  • n is an integer of 7 to 11 .
  • the ceramide derivative has the following chemical formula 3:
  • a Golgi-labeled fluorescent probe containing the ceramide derivative described above is provided.
  • the third aspect of the present invention there is provided a method for specifying the location of the Golgi apparatus in a test cell.
  • the method includes a step of bringing the Golgi-labeled fluorescent probe mentioned above into contact with a test cell and a step of measuring a fluorescent signal emitted from the fluorescent probe.
  • the fourth aspect of the present invention there is also provided a method for measuring the presence / absence or degree of localization of a test compound in a test cell to the Golgi apparatus.
  • the method comprises the steps of bringing the Golgi-labeled fluorescent probe into contact with a test cell, measuring a fluorescence signal emitted from the fluorescent probe, and contacting the fluorescently-labeled test compound with the test cell. And a step of measuring a fluorescence signal emitted from the test compound.
  • a novel ceramide derivative and a Golgi-labeled fluorescent probe using the same are provided as means for selectively fluorescently labeling the Golgi apparatus and having low cytotoxicity and excellent intracellular stability. Can be done.
  • Example it is a photograph which shows the result of having evaluated the cytotoxicity about the compound 9 synthesize
  • the results of evaluating the cellular uptake of Compound 9 synthesized in Synthesis Example are shown in comparison with NBD-C6-ceramide (negative control).
  • an Example it is a photograph which shows the result of having evaluated the metabolism by TLC about the compound 9 synthesize
  • it is a graph which digitized the result of having evaluated the metabolism by TLC about NBD-C6-ceramide (negative control).
  • it is the graph which digitized the result of having evaluated the metabolism by TLC about the compound 9 synthesize
  • the results of evaluating the localization ability of the compound 9 synthesized in the synthesis example to the Golgi apparatus are shown in comparison with NBD-C6-ceramide (negative control).
  • it is a photograph which shows the result of having evaluated the time-dependent change of the localization ability to the Golgi apparatus about the compound 9 synthesize
  • the ceramide derivative according to this embodiment has a fluorescent chromophore introduced at the end of the alkyl group of the fatty acid instead of the N-acyl moiety of endogenous ceramide (N-acyl sphingosine).
  • an acyl group R 1 —C ( ⁇ O) — is introduced into the terminal of the hydroxymethyl group of endogenous ceramide.
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms.
  • R 1 is preferably an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, more preferably an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, still more preferably a methyl group or an ethyl group, and particularly preferably a methyl group. is there.
  • examples of the alkyl group having 1 to 12 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, and pentyl.
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms.
  • R 2 is preferably an alkyl group having 2 to 18 carbon atoms, more preferably an alkyl group having 3 to 17 carbon atoms, still more preferably an alkyl group having 4 to 16 carbon atoms, particularly preferably.
  • n is an integer of 1-20. n is preferably from 2 to 18, more preferably from 3 to 16, even more preferably from 4 to 14, even more preferably from 5 to 13, particularly preferably from 6 to 12, most preferably 7-11.
  • the ceramide derivative represented by Chemical Formula 1 has two asymmetric carbon atoms. Specifically, a carbon atom (C A ) to which a nitrogen atom constituting an amide bond is bonded and a carbon atom (C B ) adjacent to the carbon atom to which a hydroxy group is bonded are asymmetric carbon atoms. It is. There are no particular restrictions on the configuration of these asymmetric carbon atoms. In other words, the configuration of C A and C B is either (R, R), (R, S), (S, R), (S, S) as (C A , C B ) Also good.
  • R 1 , R 2 , and n have the same definitions as above.
  • the ceramide derivative according to this form has the following chemical formula 3:
  • a weakly acidic cation exchange resin for example, Amberlyst (registered trademark) 15 acts on Compound 2 obtained above in the presence of a nucleophilic solvent such as methanol or ethanol.
  • a nucleophilic solvent such as methanol or ethanol.
  • a triple bond is formed by reacting Compound 3 obtained above with a reducing agent (eg, bis (2-methoxyethoxy) aluminum sodium hydride (Red-Al)). Reduction to a double bond yields a carbamate derivative such as compound 4 below.
  • a reducing agent eg, bis (2-methoxyethoxy) aluminum sodium hydride (Red-Al)
  • the Boc protecting group is removed from the amino group by heating and refluxing the compound 4 obtained above in the presence of a strong acid such as hydrochloric acid or trifluoroacetic acid (deprotection).
  • a strong acid such as hydrochloric acid or trifluoroacetic acid (deprotection).
  • a diol compound such as the following compound 5 containing a primary amino group is obtained.
  • Synthesis Example 5 a diol compound in which an amide bond is formed at the primary amino group site in Compound 5 is obtained by reacting Compound 5 obtained above with a carboxylic acid chloride. It is done. In this case, by selecting the length of the alkyl group of the carboxylic acid chloride used in the reaction, it is possible to control the R 2 in the compound 1.
  • palmitoyl chloride is used as the carboxylic acid chloride, whereby the following compound 6 corresponding to the case where R 2 in Chemical Formula 1 is a pentadecyl group is obtained.
  • a fluorescent chromophore is introduced into the alkenyl group portion of Compound 6 obtained above. Specifically, a compound in which one of the hydrogen atoms of the primary amino group of 7-nitro-2,1,3-benzooxadiazol-4-amine, which is a fluorescent coloring compound, is substituted with a terminal alkenyl group ( In Synthesis Example 6, the following compound 7) and compound 6 are reacted in the presence of a second-generation Grubbs catalyst, which is a carbene complex catalyst, to cause recombination of the bond between the two olefins. A fluorescent chromophore is introduced into the alkenyl group site.
  • a second-generation Grubbs catalyst which is a carbene complex catalyst
  • n in the compound 1 can be controlled by selecting the length of the terminal alkenyl group.
  • Synthesis Example 6 a 10-undecenyl group is employed as the terminal alkenyl group, whereby the following compound 8 corresponding to the case where n in Chemical Formula 1 is 9 is obtained.
  • the method for manufacturing the ceramide derivative according to the first embodiment has been described by taking the compound 9 as an example, it can of course be manufactured by other methods, and the present invention can be manufactured by the manufacturing method. The technical scope of the compound and its application is not affected.
  • the second aspect of the present invention is a Golgi-labeled fluorescent probe containing the ceramide derivative according to the first aspect described above.
  • a Golgi-labeled fluorescent probe (NBD-C6-ceramide) composed of a ceramide derivative described in Non-Patent Document 1 or the like has been used for a long time when used as a fluorescent probe for staining the Golgi apparatus. There was a problem that the dyeing could not be continued.
  • the ceramide derivative according to the first embodiment has low cytotoxicity and excellent intracellular stability when used as a Golgi-labeled fluorescent probe, as demonstrated in the Examples section described later. It has a very remarkable effect (staining can be continued for several days). Therefore, the Golgi-labeled fluorescent probe according to the second form can be an effective probe that contributes to elucidation of intracellular lipid metabolism mechanism and development of therapeutic agents for diseases caused by abnormal lipid metabolism.
  • the mechanism by which the ceramide derivative provided by the present invention exerts such an excellent effect as a Golgi-labeled fluorescent probe is not completely clear.
  • the fluorescent chromophore is not at the N-acyl site but at the end of the alkyl group of the fatty acid, so that the color development of the fluorescence is not affected even when it is subjected to metabolic cleavage (decomposition). I guess that.
  • an acyl group R 1 —C ( ⁇ O) —
  • the method of using the fluorescent probe according to the present invention is not particularly limited, and can be used in the same manner as a conventionally known fluorescent probe.
  • the above-mentioned ceramide derivative is dissolved in an aqueous medium such as physiological saline or buffer, or a mixture of an aqueous medium such as ethanol, acetone, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide and an aqueous medium.
  • the fluorescence intensity may be measured by adding this solution to an appropriate buffer containing a test object such as a cell or tissue and exciting it with an appropriately selected wavelength in the near-infrared region near 490 nm. .
  • the fluorescent probe according to the present invention may be used in the form of a composition in combination with an appropriate additive.
  • an appropriate additive for example, it can be appropriately combined with additives such as a buffer and a solubilizing agent.
  • a method for specifying the location of the Golgi apparatus in a test cell includes a step of bringing the Golgi-labeled fluorescent probe mentioned above into contact with a test cell and a step of measuring a fluorescent signal emitted from the fluorescent probe.
  • the type of test cell, the culture method, and the like there is no particular limitation on the type of test cell, the culture method, and the like, and conventionally known knowledge can be appropriately referred to.
  • the term “measurement” used in this specification should be interpreted in the broadest sense including quantitative and qualitative.
  • a method for measuring the presence or absence of the localization of the test compound in the test cell to the Golgi apparatus or its degree comprises the steps of bringing the Golgi-labeled fluorescent probe into contact with a test cell, measuring a fluorescence signal emitted from the fluorescent probe, and contacting the fluorescently-labeled test compound with the test cell. And a step of measuring a fluorescence signal emitted from the test compound.
  • a fluorescence signal emitted from the test compound for example, whether each of the Golgi-labeled fluorescent probe and the test compound described above is excited at different wavelengths and / or emits light at different wavelengths, and whether or not the localized sites of fluorescence emitted from each match.
  • the step of measuring the fluorescence signal in the third and fourth aspects of the present invention for example, measurement using a confocal laser microscope as used in the column of Examples described later can be employed. .
  • HMPA hexamethylphosphoric triamide
  • (S)-( ⁇ )-3-Boc-2 A solution of 2-dimethyloxazolidine-4-carboxaldehyde (Compound 1; commercially available from Aldrich) (2.0 g, 8.72 mmol) in THF (37 mL) was added. After stirring at ⁇ 78 ° C. for 1 hour, the reaction was warmed to room temperature over 2 hours. After adding saturated NH 4 Cl aqueous solution to stop the reaction, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and ether and water were added to the residue for liquid separation.
  • HMPA hexamethylphosphoric triamide
  • the reaction solution was filtered using Celite, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel column chromatography (eluent; n-hexane / ethyl acetate (2/1)) to obtain Compound 3 (1.5 g, 81%) as a colorless oil.
  • CHO cells which are hamster ovary-derived cell lines, cultured in Ham's F12 medium were used.
  • CHO cells were seeded at 2 ⁇ 10 4 cells / well in each well of a 24-well plate, and cultured in Ham's F12 (+) medium at 37 ° C. for 1 day. Thereafter, for the purpose of eliminating the influence of ceramide, sphingosine and the like, the medium was changed to Ham's F12 ( ⁇ ) medium, which is a serum-free medium, to which 0.1% BSA and 10 mM HEPES were added, and Compound 9 (10 ⁇ M) The culture was further continued in the presence for 1 day. As a negative control, the same experiment was performed using NBD-C6-ceramide described in Non-Patent Document 1.
  • CHO cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 cells / well in each well of a 24-well plate and cultured at 37 ° C. for 1 day in Ham's F12 (+) medium. The number of cells after 1 day was 1.26 ⁇ 10 4 cells / well. Thereafter, the medium was changed to a medium in which 0.1% BSA and 10 mM HEPES were added to Ham's F12 ( ⁇ ) medium, which is a serum-free medium, and cultured in the presence of Compound 9 (10 ⁇ M) for another day. As a negative control, the same experiment was performed using NBD-C6-ceramide described in Non-Patent Document 1. The same experiment was also performed for the case of no addition.
  • the ceramide derivative according to the present invention is a compound having extremely small cytotoxicity.
  • CHO cells were seeded at 2 ⁇ 10 4 cells / well in each well of a 24-well plate, and cultured in Ham's F12 (+) medium at 37 ° C. for 1 day. Thereafter, the medium was changed to Ham's F12 ( ⁇ ) medium, which is a serum-free medium, to which 0.1% BSA and 10 mM HEPES were added, and further cultured at 37 ° C. for 18 hours, then compound 9 (10 ⁇ M ) Was added. After the addition, the cells were cultured at 37 ° C. for 1, 2, 6, 24, or 48 hours and used for the assay. The same experiment was performed using NBD-C6-ceramide as a negative control.
  • serum contains ceramide, sphingosine and the like, and uptake and metabolism of these substances are constantly progressing. Therefore, in this experiment, the cells were first cultured in a serum-free medium for 18 hours to reduce the uptake and metabolism of serum-derived compounds, and then add the test compound to obtain pure uptake of the test compound itself. An experimental system was constructed to measure metabolism.
  • ceramide derivative compound 9
  • HBSS Hort's Balanced Salt Solution: pH 7.4
  • BSA Bact's Balanced Salt Solution
  • 10 mM HEPES 0.1% BSA and 10 mM HEPES
  • the cells were detached from the wells using 250 ⁇ L of HBSS.
  • 500 ⁇ L of chloroform, 500 ⁇ L of methanol, and 250 ⁇ L of water were added to make the cell extract into a two-layer state of an organic layer and an aqueous layer.
  • ceramide derivatives and other major sphingolipids are compounds that migrate to the organic layer, the organic layer only can be obtained by centrifuging the cell extract in a bilayer state at 3000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. Separated.
  • the obtained organic layer sample was added to a 96-well plate, and fluorescence emission of the ceramide derivative was detected with an image analyzer (LAS1000, manufactured by Tsubaki Fuji Film Co., Ltd.).
  • the results are shown in A) and B) of FIG. A) in FIG. 2 is a photograph taken by an image analyzer, and the part emitting fluorescence is displayed in black.
  • B) in FIG. 2 is a graph in which the uptake amount [nmol / well] of a compound determined by a calibration curve method using NBD-C6-ceramide as a standard substance is plotted on the vertical axis and the culture time is plotted on the horizontal axis. It is. There were 8 ⁇ 10 4 cells per well.
  • NBD-C6-ceramide which is a negative control, decreases the amount taken up into cells with time, whereas the ceramide according to the present invention is reduced. It was proved that the compound 9 as a derivative increased in cellular uptake with time.
  • NBD-C6-ceramide (negative control)) and D) (compound 9).
  • NBD-C6-ceramide undergoes metabolism over time, and its amount is halved at 24 hours, and most of it is separated from the organic layer fraction (aqueous layer fraction) at 48 hours. It is presumed that it became a mobile degradation product.
  • the presence of other sphingolipids such as metabolites glucosylceramide and sphingomyelin was confirmed. For example, at 6 hours, 30% of NBD-C6-ceramide was a metabolite.
  • FIG. 1 NBD-C6-ceramide undergoes metabolism over time, and its amount is halved at 24 hours, and most of it is separated from the organic layer fraction (aqueous layer fraction) at 48 hours. It is presumed that it became a mobile degradation product.
  • the presence of other sphingolipids such as metabolites glucosylceramide and sphingomyelin was confirmed. For example, at 6 hours,
  • CHO cells were seeded in each well of a 24-well plate at 0.5 ⁇ 10 4 cells / well and cultured in Ham's F12 (+) medium at 37 ° C. for 2 days. Thereafter, the medium was changed to HBSS (Hank's Balanced Salt Solution: pH 7.4) ( ⁇ ) containing 0.1% BSA and 10 mM HEPES, and compound 9 (1 ⁇ M) was further added. Cultured for 5 hours. Next, the cells were washed twice with HBSS containing 0.1% BSA and 10 mM HEPES, BODIPY-TR-Ceramide (5 ⁇ M) was added, and the cells were further cultured for 30 minutes in the same medium.
  • HBSS Hor's Balanced Salt Solution: pH 7.4
  • the cells were washed twice in the same manner as described above, and fluorescence emission from the cells was observed.
  • the reason why the cells are washed before the observation is to eliminate noise caused by detecting luminescence from the compound remaining in the medium.
  • the same experiment was performed using NBD-C6-ceramide as a negative control.
  • the time course of cell culture and compound addition is recommended by data sheets and previous reports as being able to detect BODIPY-TR-Ceramide with higher sensitivity. Observation was carried out using a confocal laser microscope.
  • NBD-C6-ceramide must remain localized in the Golgi, whether it is metabolized to sphingomyelin or glucosylceramide 30 minutes after addition to the cell or 2 hours later. has been reported (J Cell Biol. 1985 Jan; 100 (1): 27-34). Similar results have been confirmed by the inventors' investigation. On the other hand, it was confirmed that the ceramide derivative (compound 9) according to the present invention co-localizes with BODIPY-TR-Ceramide (lower right photograph in FIG. 3). From this, it was confirmed that Compound 9 can be used as a Golgi-labeled fluorescent probe.
  • FIG. 4 The results are shown in FIG.
  • the upper part of FIG. 4 is a photograph showing the observation results for NBD-C6-ceramide (negative control), which was taken using a photomultiplier tube PMT: 430.
  • the middle part of FIG. 4 is a photograph showing the observation results for Compound 9, and was taken using a photomultiplier tube PMT: 430.
  • the lower part of FIG. 4 is a photograph showing the observation results for Compound 9, and was taken using a photomultiplier tube PMT: 500.
  • “430” and “500” mean detection sensitivity (the amount of energy required to detect compound-derived luminescence), and the smaller this value, the higher the sensitivity. Therefore, if detection is not possible without increasing this value, it means that the absolute amount of luminescence is small (that is, the amount of fluorescent compound present in the cell is small).
  • NBD-C6-ceramide which is a negative control, has a decrease in fluorescence intensity over time, and its localization to the Golgi apparatus has decreased with time. This result can be said to support the results of intracellular metabolism shown in FIGS. 2A to 2C and 2E.
  • the ceramide derivative according to the present invention when used, for example, as a Golgi-labeled fluorescent probe, the ceramide derivative may exhibit a very remarkable effect of low cytotoxicity and excellent intracellular stability. Indicated.

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Abstract

【課題】ゴルジ体を選択的に蛍光標識するための、細胞障害性が低く細胞内安定性に優れた手段を提供する。 【解決手段】本発明によれば、下記化学式１： 式中、Ｒ１は、炭素原子数１～１２のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素原子数１～２０のアルキル基であり、ｎは、１～２０の整数である、 で表されるセラミド誘導体、およびこれを用いたゴルジ体標識化蛍光プローブが提供される。

Description

セラミド誘導体およびこれを用いたゴルジ体標識化蛍光プローブ
　本発明は、セラミド誘導体およびこれを用いたゴルジ体標識化蛍光プローブに関する。
　ゴルジ体は小胞輸送経路の中心に位置する細胞内小器官で、ほとんどの真核生物の細胞に存在する。ゴルジ体の主な機能は、タンパク質の修飾と選別輸送であるが、一部の脂質や糖脂質の合成をも行う重要な細胞内小器官である。タンパク質が正常に機能するためにはゴルジ体の働きが非常に重要であり、また生体内の重要な脂質であるスフィンゴ脂質はその９割以上がゴルジ体で合成される。このように、ゴルジ体の機能およびゴルジ体で機能するタンパク質を研究することは生命現象を理解する上で非常に重要である。
　ところで、タンパク質や脂質の細胞内輸送や、ゴルジ体で機能するタンパク質を解析する研究では、しばしばその細胞内局在を蛍光顕微鏡にて観察することが行われる。この際、ゴルジマーカー（ゴルジ体標識化プローブ）と目的タンパク質とを共染色することで、目的タンパク質がゴルジ体に局在していることを証明することもよく行われる。したがって、ゴルジ体を選択的に染色しうるゴルジ体標識化プローブを開発することは、これらの研究の発展にとって非常に有用である。
　ここで、例えば非特許文献１には、従来のゴルジ体標識化蛍光プローブとして、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドと称されるセラミド誘導体が記載されている。このＮＢＤ－Ｃ６－セラミドは、内在性セラミド（Ｎ－アシルスフィンゴシン）が蛍光標識されてなるものであり、下記の化学構造で示されるように、セラミドのＮ－アシル部位に蛍光発色団が導入されている。ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドは、かような化学構造に起因して、細胞に添加されると細胞内に取り込まれ、ゴルジ体を選択的に染色することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
NG Lipsky et al., Science, 228, 745-747, 1985
　しかしながら、本発明者らの検討によれば、上述した従来のセラミド誘導体（ＮＢＤ－Ｃ６－セラミド）を蛍光プローブとして用いたゴルジ体の染色では、長時間にわたって染色を継続することができないという問題があることが判明した。すなわち、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドは細胞障害作用を有することから、細胞内に取り込まれてから２４時間以内には細胞自身を死に至らしめ、それ以上継続した細胞観察は不可能となってしまう。また、内在性セラミドはゴルジ体においてオリゴ糖が付加されてグルコシルセラミドへと代謝されるか、ホスファチジルコリンからのホスホコリンの転移を受けてスフィンゴミエリンへと代謝され、細胞膜へと送られてその構成成分となる。ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドも内在性セラミドと同様に、ゴルジ体においてグルコシルセラミドやスフィンゴミエリンへと代謝され、数時間後にはゴルジ体から細胞膜へと輸送されてしまうことから、この点でも継続的な染色は困難である。
　そこで本発明は、ゴルジ体を選択的に蛍光標識するための、細胞障害性が低く細胞内安定性に優れた手段を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上述した従来技術における課題に鑑み、鋭意研究を行った。その過程で、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドでは内在性セラミド（Ｎ－アシルスフィンゴシン）のＮ－アシル部位に導入されていた蛍光発色団を、Ｎ－アシル部位ではなく脂肪酸のアルキル基の末端に導入し、かつ、内在性セラミドのヒドロキシメチル基の末端にアシル基を導入することを試みた。そして、得られた化合物をゴルジ体染色のための蛍光プローブとして用いると、細胞障害性をほとんど示さず、しかも細胞内安定性にも優れることを見出した。
　すなわち、本発明の第１の形態によれば、下記化学式１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
式中、Ｒ１は、炭素原子数１～１２のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素原子数１～２０のアルキル基であり、ｎは、１～２０の整数である、
で表される、セラミド誘導体が提供される。当該セラミド誘導体は、好ましくは、下記化学式２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびｎは、上記と同様の定義である、
で表される。
　また、他の好ましい形態において、Ｒ１は、炭素原子数１～４のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素原子数５～１５のアルキル基であり、ｎは、７～１１の整数である。
　そして、最も好ましい形態において、当該セラミド誘導体は、下記化学式３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
で表される。
　本発明の第２の形態によれば、上述したセラミド誘導体を含む、ゴルジ体標識化蛍光プローブが提供される。
　本発明の第３の形態によれば、被検細胞におけるゴルジ体の存在部位を特定する方法が提供される。当該方法は、上述したゴルジ体標識化蛍光プローブを、被検細胞に接触させる工程と、蛍光プローブの発する蛍光信号を測定する工程とを含む。
　本発明の第４の形態によれば、被検細胞における被検化合物のゴルジ体への局在化の有無またはその程度を測定する方法もまた、提供される。当該方法は、上述したゴルジ体標識化蛍光プローブを、被検細胞に接触させる工程と、蛍光プローブの発する蛍光信号を測定する工程と、蛍光標識された被検化合物を、前記被検細胞に接触させる工程と、被検化合物の発する蛍光信号を測定する工程とを含む。
　本発明によれば、ゴルジ体を選択的に蛍光標識するための、細胞障害性が低く細胞内安定性に優れた手段として、新規なセラミド誘導体とこれを用いたゴルジ体標識化蛍光プローブが提供されうる。
実施例において、合成例で合成した化合物９について、その細胞障害性を評価した結果を示す写真である。 実施例において、合成例で合成した化合物９について、その細胞内取り込みを評価した結果を、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミド（陰性対照）と対比して示す写真である。 実施例において、合成例で合成した化合物９について、その細胞内取り込みを評価した結果を、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミド（陰性対照）と対比して示すグラフである。 実施例において、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミド（陰性対照）について、その代謝をＴＬＣにより評価した結果を示す写真である。 実施例において、合成例で合成した化合物９について、その代謝をＴＬＣにより評価した結果を示す写真である。 実施例において、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミド（陰性対照）について、その代謝をＴＬＣにより評価した結果を数値化したグラフである。 実施例において、合成例で合成した化合物９について、その代謝をＴＬＣにより評価した結果を数値化したグラフである。 実施例において、合成例で合成した化合物９について、そのゴルジ体への局在化能を評価した結果を、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミド（陰性対照）と対比して示す写真である。 実施例において、合成例で合成した化合物９について、そのゴルジ体への局在化能の経時的な変化を評価した結果を、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミド（陰性対照）と対比して示す写真である。
　≪セラミド誘導体≫
　本発明の第１の形態は、下記化学式１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
で表されるセラミド誘導体である。化学式１の構造からも明らかなように、本形態に係るセラミド誘導体は、内在性セラミド（Ｎ－アシルスフィンゴシン）のＮ－アシル部位ではなく脂肪酸のアルキル基の末端に蛍光発色団が導入されてなり、かつ、内在性セラミドのヒドロキシメチル基の末端にアシル基（Ｒ１－Ｃ（＝Ｏ）－）が導入されてなるものである。
　化学式１において、Ｒ１は、炭素原子数１～１２のアルキル基である。Ｒ１は、好ましくは炭素原子数１～８のアルキル基であり、より好ましくは炭素原子数１～４のアルキル基であり、さらに好ましくはメチル基またはエチル基であり、特に好ましくはメチル基である。ここで、炭素原子数１～１２のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基などが挙げられる。
　また、化学式１において、Ｒ２は、炭素原子数１～２０のアルキル基である。Ｒ２は、好ましくは炭素原子数２～１８のアルキル基であり、より好ましくは炭素原子数３～１７のアルキル基であり、さらに好ましくは炭素原子数４～１６のアルキル基であり、特に好ましくは炭素原子数５～１５のアルキル基である。
　さらに、化学式１において、ｎは、１～２０の整数である。ｎは、好ましくは２～１８であり、より好ましくは３～１６であり、さらに好ましくは４～１４であり、いっそう好ましくは５～１３であり、特に好ましくは６～１２であり、最も好ましくは７～１１である。
　化学式１で表されるセラミド誘導体は、２つの不斉炭素原子を有するものである。具体的には、アミド結合を構成する窒素原子が結合した炭素原子（ＣＡ）、および、当該炭素原子に隣接する、ヒドロキシ基が結合した炭素原子（ＣＢ）、の２つが不斉炭素原子である。これらの不斉炭素原子の立体配置について特に制限はない。言い換えれば、ＣＡおよびＣＢの立体配置は、（ＣＡ，ＣＢ）として、（Ｒ，Ｒ）、（Ｒ，Ｓ）、（Ｓ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）のいずれであってもよい。ただし、内在性セラミドにおける（ＣＡ，ＣＢ）の立体配置は（Ｓ，Ｒ）であることから、本形態に係るセラミド誘導体においても、（ＣＡ，ＣＢ）の立体配置は（Ｓ，Ｒ）であることが特に好ましい。化学式１で表されるセラミド誘導体のうち、（ＣＡ，ＣＢ）の立体配置が（Ｓ，Ｒ）であるものは、下記化学式２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
で表される。なお、化学式２において、Ｒ１、Ｒ２、およびｎは、上記と同様の定義である。
　そして、最も好ましい形態において、本形態に係るセラミド誘導体は、下記化学式３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
で表される。
　上述したセラミド誘導体の入手経路について特に制限はない。ここで、当該セラミド誘導体を製造するための手法の一例について、後述する実施例の欄に記載の合成スキームおよび合成例に沿って、簡単に説明する。
　まず、合成例１を参照すると、出発物質として、（Ｓ）－（－）－３－Ｂｏｃ－２，２－ジメチルオキサゾリジン－４－カルボキシアルデヒド（以下の化合物１；Aldrich社より市販されている）を準備する。なお、化合物１における「－Ｂｏｃ」はアミンの保護基である「ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基」である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　化合物１の入手経路について特に制限はない。市販品を購入して用いてもよいし、公知の出発物質から公知の反応によって自ら合成したものを用いてもよい。
　続いて、ｎ－ＢｕＬｉなどの強塩基の存在下、末端アルキンを化合物１と反応させると、強塩基の作用によって末端アルキルから生成したアセチリドが、化合物１のアルデヒドのカルボニル炭素に求核付加する（参考文献：Renaud Villard, Djilali Hammache, Guillaume Delapierre, Frederic Fotiadu, Gerard Buono, JacquesFantini, ChemBioChem 2002, 3, 517-525）。合成例１では、末端アルキンとして１－ヘキシンを用いており、以下の化合物２を得ている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　次に、合成例２を参照すると、メタノール、エタノール等の求核性溶媒の存在下、上記で得られた化合物２に弱酸性陽イオン交換樹脂（例えば、アンバーリスト（登録商標）１５）を作用させることで、オキサゾリジン環が開環し、以下の化合物３のようなカルバメート誘導体が得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　次に、合成例３を参照すると、上記で得られた化合物３に、還元剤（例えば、水素化ビス（２－メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム（Ｒｅｄ－Ａｌ））を作用させることで、三重結合が二重結合へと還元され、以下の化合物４のようなカルバメート誘導体が得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　次に、合成例４を参照すると、上記で得られた化合物４を、塩酸やトリフルオロ酢酸等の強酸の存在下で加熱還流することで、Ｂｏｃ保護基がアミノ基から脱離し（脱保護）、第１級アミノ基を含む以下の化合物５のようなジオール化合物が得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　次に、合成例５を参照すると、上記で得られた化合物５をカルボン酸塩化物と反応させることで、化合物５における第１級アミノ基の部位にアミド結合が形成されてなるジオール化合物が得られる。この際、反応に用いるカルボン酸塩化物のアルキル基の長さを選択することで、化合物１におけるＲ２を制御することができる。合成例５では、カルボン酸塩化物として塩化パルミトイルを用いており、これにより、化学式１におけるＲ２がペンタデシル基である場合に相当する以下の化合物６が得られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　次に、合成例６を参照すると、上記で得られた化合物６のアルケニル基部位に、蛍光発色団を導入する。具体的には、蛍光発色化合物である７－ニトロ－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－アミンの第１級アミノ基の水素原子の１つが末端アルケニル基で置換されてなる化合物（合成例６では、以下の化合物７）と、化合物６とを、カルベン錯体触媒である第２世代Ｇｒｕｂｂｓ触媒の存在下で反応させることにより、２種のオレフィンの結合の組換えが起こり、化合物６のアルケニル基部位に、蛍光発色団が導入されるのである。この際、上記末端アルケニル基の長さを選択することで、化合物１におけるｎを制御することができる。合成例６では、上記末端アルケニル基として１０－ウンデセニル基を採用しており、これにより、化学式１におけるｎが９である場合に相当する以下の化合物８が得られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　最後に、合成例７を参照すると、上記で得られた化合物８を、－１５℃程度の低温条件下でカルボン酸塩化物と反応させることで、化合物８における第１級ヒドロキシ基にアシル基が結合し、本発明に係るセラミド誘導体の合成が完了する。この際、反応に用いるカルボン酸塩化物のアルキル基の長さを選択することで、化合物１におけるＲ１を制御することができる。合成例７では、カルボン酸塩化物として塩化アセチルを用いており、これにより、化学式１におけるＲ１がメチル基である場合に相当する以下の化合物９が得られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　以上、第１の形態に係るセラミド誘導体を製造するための手法について、一例として化合物９を例に挙げて説明したが、もちろん他の手法によって製造することも可能であるし、製造方法によって本発明の化合物やその用途の技術的範囲が影響を受けることはない。
　≪ゴルジ体標識化蛍光プローブ≫
　本発明の第２の形態は、上述した第１の形態に係るセラミド誘導体を含む、ゴルジ体標識化蛍光プローブである。
　従来、例えば非特許文献１などに記載されているセラミド誘導体からなるゴルジ体標識化蛍光プローブ（ＮＢＤ－Ｃ６－セラミド）は、ゴルジ体を染色するための蛍光プローブとして用いられた場合に、長時間にわたって染色を継続することができないという問題があった。これに対し、第１の形態に係るセラミド誘導体は、後述する実施例の欄において実証されているように、ゴルジ体標識化蛍光プローブとして用いられると、細胞障害性が低く細胞内安定性に優れる（数日間にわたって染色を継続することができる）というきわめて顕著な効果を奏するのである。したがって、第２の形態に係るゴルジ体標識化蛍光プローブは、細胞内における脂質代謝機構の解明や、脂質代謝異常に起因する疾患の治療薬開発に寄与する有効なプローブとなりうる。
　ここで、本発明により提供されるセラミド誘導体がゴルジ体標識化蛍光プローブとしてかような優れた効果を奏するメカニズムについては完全には明らかではないが、細胞内安定性に優れることについては、化学式１に示すように蛍光発色団をＮ－アシル部位ではなく脂肪酸のアルキル基の末端に有していることで、代謝による切断（分解）を受けた場合であっても蛍光の発色は影響を受けないことが推測される。また、同じく化学式１に示すように内在性セラミドのヒドロキシメチル基の末端にアシル基（Ｒ１－Ｃ（＝Ｏ）－）が導入されていることで、加水分解酵素による代謝基質として認識されなくなることで、細胞内安定性のより一層の向上に寄与し、さらには細胞毒性の低下にもつながっているのではないかと考えられる。
　本発明に係る蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、またはエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上述したセラミド誘導体を溶解し、細胞や組織などの被検対象物を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、適宜選択された４９０ｎｍ付近の近赤外領域の波長により励起して、蛍光強度を測定すればよい。
　なお、本発明に係る蛍光プローブは、適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤などの添加物と適宜組み合わせることができる。
　ここで、本発明の第３の形態としては、被検細胞におけるゴルジ体の存在部位を特定する方法が提供される。当該方法は、上述したゴルジ体標識化蛍光プローブを、被検細胞に接触させる工程と、蛍光プローブの発する蛍光信号を測定する工程とを含む。当該方法において、被検細胞の種類や培養方法などについて特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうる。また、被検細胞に蛍光プローブを接触させる際の具体的な形態についても特に制限はない。なお、本明細書において用いられる「測定」という用語については、定量および定性を含めて最も広義に解釈すべきものである。
　また、本発明の第４の形態としては、被検細胞における被検化合物のゴルジ体への局在化の有無またはその程度を測定する方法もまた、提供される。当該方法は、上述したゴルジ体標識化蛍光プローブを、被検細胞に接触させる工程と、蛍光プローブの発する蛍光信号を測定する工程と、蛍光標識された被検化合物を、前記被検細胞に接触させる工程と、被検化合物の発する蛍光信号を測定する工程とを含む。この際、例えば、上述したゴルジ体標識化蛍光プローブおよび被検化合物のそれぞれは異なる波長で励起され、および／または異なる波長で発光し、それぞれから発せられる蛍光の局在部位が一致するか否かを観測することで、被検細胞における被検化合物のゴルジ体への局在化の有無またはその程度を測定することが可能である。
　本発明の第３の形態や第４の形態における蛍光信号を測定する工程には、例えば、後述する実施例の欄において用いられているような、共焦点レーザー顕微鏡を用いた測定が採用されうる。
　以下、実施例等により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されない。
　＜合成例＞
　以下の合成スキームに従って、本発明に係るセラミド誘導体である化合物９を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　［合成例１：ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－４－（（Ｒ）－１－ヒドロキシヘプト－２－イン－１－イル）－２，２－ジメチルオキサゾリジン－３－カルボキシレート（化合物２）の合成］
　アルゴン雰囲気下、１－ヘキシン（１．１０ｇ，１３．０８ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（５０ｍＬ）溶液に、ｎ－ＢｕＬｉ溶液（７．７ｍＬ，１２．２１ｍｍｏｌ，１．５９Ｍ（ヘキサン溶液））を－２０℃にて滴下した。－２０℃にて２時間撹拌し、－７８℃に冷却した後、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ；３ｍＬ，１７．４４ｍｍｏｌ）を加え、さらに（Ｓ）－（－）－３－Ｂｏｃ－２，２－ジメチルオキサゾリジン－４－カルボキシアルデヒド（化合物１；Aldrich社より市販されている）（２．０ｇ，８．７２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３７ｍＬ）溶液を加えた。－７８℃にて１時間撹拌後、２時間かけて反応液を室温まで温めた。飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液を加えて反応を停止した後、反応液を減圧下で濃縮し、残渣にエーテルおよび水を加えて分液した。さらに水層をエーテルにて抽出し、有機層を合わせて無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。有機層を減圧下で濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ｎ－ヘキサン／酢酸エチル（９／１））にて精製し、化合物２（２．３６ｇ，８７％）を無色油状物として得た。
（参考文献：Renaud Villard, Djilali Hammache, Guillaume Delapierre, Frederic Fotiadu, Gerard Buono, JacquesFantini, ChemBioChem 2002, 3, 517-525）
　［合成例２：ｔｅｒｔ－ブチル（（２Ｓ，３Ｒ）－１，３－ジヒドロキシノン－４－イン－２－イル）カルバメート（化合物３）の合成］
　上記の合成例１の手法により合成した化合物２（２．０８ｇ，６．７ｍｍｏｌ）のメタノール（６７ｍＬ）溶液に、弱酸性イオン交換樹脂アンバーリスト（登録商標）１５（２．５ｇ）を加え、室温にて２０時間撹拌した。反応液をセライトを用いて濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ｎ－ヘキサン／酢酸エチル（２／１））にて精製し、化合物３（１．５ｇ，８１％）を無色油状物として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　［合成例３：ｔｅｒｔ－ブチル（（２Ｓ，３Ｒ）－（Ｅ）－１，３－ジヒドロキシノン－４－エン－２－イル）カルバメート（化合物４）の合成］
　上記の合成例２の手法により合成した化合物３（１００ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）のエーテル（１．３ｍＬ）溶液にＲｅｄ－Ａｌ（登録商標）（０．５６ｍＬ，１．８４ｍｍｏｌ，６５％トルエン溶液）を０℃にて滴下し、その後室温にて１０時間撹拌した。０℃にてメタノールを加えて反応を停止した後、エーテル（１０ｍＬ）および飽和酒石酸ナトリウムカリウム水溶液を加えて室温にて１２時間激しく撹拌した。生成物をエーテルにて抽出し、抽出液をさらに飽和酒石酸ナトリウムカリウム水溶液、続いて飽和食塩水にて洗浄した。抽出液を無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ｎ－ヘキサン／酢酸エチル（１／１））にて精製し、化合物４（８２ｍｇ，８２％）を白色固体として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　［合成例４：（２Ｓ，３Ｒ）－（Ｅ）－２－アミノノン－４－エン－１，３－ジオール（化合物５）の合成］
　上記の合成例３の手法により合成した化合物４（２００ｍｇ，０．７３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（７．２ｍＬ）溶液に、１Ｎ塩酸（２．４ｍＬ）を加えて反応液を２３時間加熱還流し、原料消失を確認後、室温まで冷却した。反応液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２．６ｍＬ）および飽和食塩水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ＣＨＣｌ３／メタノール／ＮＨ４ＯＨ（１３５／２５／４））にて精製し、化合物５（１２０ｍｇ，９４％）を無色油状物として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　［合成例５：Ｎ－（（２Ｓ，３Ｒ）－（Ｅ）－１，３－ジヒドロキシノン－４－エン－２－イル）パルミタミド（化合物６）の合成］
　上記の合成例４の手法により合成した化合物５（８６．９ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に酢酸ナトリウム５０％水溶液５ｍＬを加え、０℃に冷却した中に塩化パルミトイル（３３０μＬ，１．０８ｍｍｏｌ，２．２ｅｑ）を加えた。混合液を室温にて３０分間撹拌した後、水を加えて酢酸エチルにて抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ＣＨＣｌ３／メタノール（４０／１））にて精製し、化合物６（２０４．８ｍｇ，９９％）を無色油状物として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　［合成例６：Ｎ－（（２Ｓ，３Ｒ）－（Ｅ）－１，３－ジヒドロキシ－１４－（７－ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－４－イルアミノ）テトラデセ－４－エン－２－イル）パルミタミド（化合物８）の合成］
　上記の合成例５の手法により合成した化合物６（１００ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）と７－ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－４－（１０－ウンデセニル）アミン（化合物７）（８１ｍｇ，０．２４３ｍｍｏｌ）（P. Nussbaumer, P. Ettmayer, C. Peters, D. Rosenbeiger and K. Hogenauer, Chem. Commun., 2005, 5086-5087）のＣＨ２Ｃｌ２（２４ｍＬ）溶液にアルゴンガスを１時間バブリングした後、第２世代Ｇｒｕｂｂｓ触媒（５ｍｏｌ％）を加えて４時間加熱還流した。溶媒を減圧下で留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー（フジシリシアＮＨシリカ、溶出液；ｎ－ヘキサン／酢酸エチル（１／２））にて精製して化合物８（６０ｍｇ，３７％）を得て、原料である化合物６ ３３ｍｇ（３３％）を回収した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　［合成例７：（２Ｓ，３Ｒ）－（Ｅ）－３－ヒドロキシ－１４－（（７－ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－４－イル）アミノ）－２－パルミタミドテトラデセ－４－エン－１－イルアセテート（化合物９）の合成］
　上記の合成例６の手法により合成した化合物８（２０ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）のピリジン（６００μＬ）溶液に、－１５℃にて塩化アセチル（１０μＬ，０．１５ｍｍｏｌ）を加えて１時間撹拌した。反応液に飽和炭酸ナトリウム水溶液を加え、生成物をジクロロメタンにて抽出した。有機層を１Ｎ塩酸および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒を減圧下で留去した後、残渣を薄層クロマトグラフィー（展開液；ＣＨＣｌ３／メタノール（１０／１））にて精製し、化合物９（１７．５ｍｇ，８３％）をオレンジ色固体として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　＜セラミド誘導体の細胞障害性の評価（細胞の形態変化）＞
　上記で合成した化合物９について、その細胞障害性を、細胞の形態変化に及ぼす影響として評価した。
　培養細胞としては、ハムスターの卵巣由来の細胞株であるCHO細胞をHam's F12培地で培養したものを用いた。
　まず、CHO細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに２×１０４細胞／ウェルで播種し、Ham's F12(+)培地中、３７℃にて１日間培養した。その後、セラミドやスフィンゴシン等の影響を排除する目的で無血清培地であるHam's F12(-)培地に０．１％ＢＳＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加した培地へと培地交換を行い、化合物９（１０μＭ）の存在下でさらに１日間培養した。なお、陰性対照として、非特許文献１に記載のＮＢＤ－Ｃ６－セラミドを用いて同様の実験を行った。
　結果を図１に示す。図１に示すように、化合物を添加しなかった場合（Ａ）の結果と比較すると、細胞障害を引き起こすことが知られているＮＢＤ－Ｃ６－セラミドを添加した場合（Ｂ）では、細胞の形態変化（球状化: roundation）が確認された。ここで、CHO細胞は図１（Ａ）に示すように細長い扁平状の形をした繊維芽様細胞であるが、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドを投与すると、球状化によって、細胞から足が伸びない形をするのである。これに対し、本発明に係るセラミド誘導体である化合物９を投与した場合（Ｃ）には球状化は確認されず、扁平状の繊維芽様細胞のままであった。
　＜セラミド誘導体の細胞障害性の評価（細胞数の変化）＞
　続いて、上記で合成した化合物９について、その細胞障害性を、細胞数の変化に及ぼす影響として評価した。
　まず、CHO細胞を２４ウエルプレートの各ウエルに１×１０４細胞／ウェルで播種し、Ham’s F12(+)培地中、３７℃にて１日間培養した。１日後の細胞数は、１．２６×１０４細胞／ウェルであった。その後、無血清培地であるHam’s F12(-)培地に０．１％ＢＳＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加した培地へと培地交換を行い、化合物９（１０μＭ）の存在下でさらに１日間培養した。なお、陰性対照として、非特許文献１に記載のＮＢＤ－Ｃ６－セラミドを用いて同様の実験を行った。また、無添加の場合についても同様の実験を行った。
　結果を下記の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　表１に示すように、無添加の場合には細胞が増殖したことから、２４時間後の細胞数は、ばらつきはあるものの平均で添加前の１７０％に増加していた。また、化合物９（１０μＭ）が存在する場合でも、無添加の場合と同様に細胞数は１５９％に増加し、細胞の損失は見られずに無添加の場合と同等の細胞増殖が確認された。一方、NBD-C6-セラミドの存在下では、細胞数は７７％へと顕著に減少した。
　この結果から、本発明に係るセラミド誘導体は、きわめて細胞障害性の小さい化合物であることが示される。
　＜セラミド誘導体の細胞内取り込みと代謝の評価＞
　上記で合成した化合物９について、その細胞内取り込みと代謝を評価した。
　まず、CHO細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに２×１０４細胞／ウェルで播種し、Ham's F12(+)培地中、３７℃にて１日間培養した。その後、無血清培地であるHam's F12(-)培地に０．１％ＢＳＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加した培地へと培地交換を行い、さらに３７℃にて１８時間培養を行った後、化合物９（１０μＭ）を添加した。添加後、３７℃にて１、２、６、２４、または４８時間培養を行い、アッセイに供した。なお、陰性対照として、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドを用いて同様の実験を行った。ここで、血清中にはセラミドやスフィンゴシン等が含まれており、これら物質の取り込みや代謝が恒常的に進行している。よってこの実験では、まず無血清培地中で細胞を１８時間培養し、血清由来の化合物の取り込みや代謝を低下させ、その後に被検化合物を添加することで、被検化合物自身の純粋な取り込みや代謝を測定するように実験系を構築した。
　アッセイとしては、まず、セラミド誘導体（化合物９）の細胞内への取り込みを評価した。具体的には、化合物の存在下で所定時間培養した細胞を、０．１％ＢＳＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳ（Hank’s Balanced Salt Solution: pH7.4）で２回洗浄した後に、セルスクライパーと上述したＨＢＳＳ ２５０μＬを用いて細胞をウェルから剥離させた。こうして得られた細胞抽出液にクロロホルム５００μＬ、メタノール５００μＬ、および水２５０μＬを添加して、細胞抽出液を有機層と水層との二層状態とした。そして、セラミド誘導体やその他の主要なスフィンゴ脂質は有機層に移行する化合物であることから、二層状態の細胞抽出液を４℃にて３０００ｒｐｍの条件下で１０分間遠心することで、有機層のみを分離した。
　続いて、得られた有機層サンプルを９６ウェルプレートに添加し、イメージアナライザー（LAS1000, 富士フイルム株式会社製）によりセラミド誘導体の蛍光発光を検出した。
　結果を図２のＡ）およびＢ）に示す。図２におけるＡ）は、イメージアナライザーにより撮影された写真であり、蛍光発光している部位は黒色に表示されている。また、図２におけるＢ）は、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドを標準物質として用いた検量線法により求められた化合物の取り込み量［ｎｍｏｌ／ウェル］を縦軸とし、培養時間を横軸としてプロットしたグラフである。なお、１ウェルあたりには８×１０４個の細胞が存在していた。図２のＡ）およびＢ）に示す結果からわかるように、陰性対照であるＮＢＤ－Ｃ６－セラミドは時間の経過とともに細胞内への取り込み量が減少していくのに対し、本発明に係るセラミド誘導体である化合物９は、時間の経過とともに細胞内取り込みが上昇していることが証明された。
　一方、他のアッセイとして、セラミド誘導体（化合物９）の代謝を評価した。具体的には、上記で得られた有機層サンプル２０μＬをＴＬＣプレートにスポットし、展開溶媒（１－ブタノール：酢酸：水＝３：１：１）で展開を行った後にイメージアナライザー（LAS1000）によりサンプルの細胞内代謝を評価した。
　結果を図２のＣ）（ＮＢＤ－Ｃ６－セラミド（陰性対照））およびＤ）（化合物９）に示す。図２のＣ）に示すように、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドは時間の経過とともに代謝を受け、２４時間ではその量は半減し、４８時間では大半が有機層画分以外（水層画分）に移動する分解産物になったと推測される。また、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドの消失に伴って、代謝物であるグルコシルセラミドやスフィンゴミエリンといった他のスフィンゴ脂質の存在が確認された。例えば、６時間では、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドの３０％が代謝物となっていた。これに対し、図２のＤ）に示すように、化合物９では６時間における代謝物は全体の１０％程度であった。４８時間でも、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドはその９０％近くが代謝されたが、化合物９は７０％以上が代謝されずにそのまま存在していた。言い換えれば、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドは長時間細胞と接触していると細胞内で代謝（分解）を受け、長時間セラミドとして存在することはできないのである。一方、化合物９のような本発明に係るセラミド誘導体は、短時間では取り込まれる化合物の量が少ないものの、４８時間後にもそのままセラミドの形態として存在しうる化合物であることが確認された。
　さらに、フリーソフト（Image J）を用いて、各々の代謝物の存在量を数値化した。結果を図２のＥ）（ＮＢＤ－Ｃ６－セラミド（陰性対照））およびＦ）（化合物９）に示す。ただし、Ｃ１６－グルコシルセラミド－ＮＢＤ様分子およびＣ１６－スフィンゴミエリン－ＮＢＤ様分子の量の数値化については、ＴＬＣにおける移動度から判断した。
　＜セラミド誘導体のゴルジ体への局在化能の評価＞
　化合物９の細胞内への局在が本当にゴルジ体への局在化によるものであるか否かを評価した。具体的には、代謝されにくいことが知られている別のゴルジマーカーであるBODIPY-TR-Ceramide（Molecular Probes社 Cat D-7540 赤色）を用い、化合物９をこれと同時に細胞に添加して、共焦点レーザー顕微鏡により観察した。
　まず、CHO細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに０．５×１０４細胞／ウェルで播種し、Ham's F12(+)培地中、３７℃にて２日間培養した。その後、０．１％ＢＳＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳ（Hank’s Balanced Salt Solution: pH7.4）（－）へと培地交換を行い、さらに化合物９（１μＭ）を添加して、３７℃にて１．５時間培養した。次いで、０．１％ＢＳＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳで細胞を２回洗浄し、BODIPY-TR-Ceramide（５μＭ）を添加して、同様の培地中でさらに３０分間培養を行った。培養終了後、上記と同様に細胞を２回洗浄して、細胞からの蛍光発光を観察した。観察前に細胞を洗浄しているのは、培地中に残存している化合物からの発光を検出することによるノイズを排除するためである。なお、陰性対照として、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドを用いて同様の実験を行った。また、細胞培養および化合物添加のタイムコースは、BODIPY-TR-Ceramideをより感度よく検出できるものとしてデータシートや既報により推奨されているものである。観察は共焦点レーザー顕微鏡を用いて行ったが、BODIPY-TR-Ceramideからの蛍光発光の測定については、最大励起波長598nm、最大蛍光波長617nmで、「赤色」を測定した。また、化合物９またはＮＢＤ－Ｃ６－セラミド（陰性対照）からの蛍光発光の測定については、最大励起波長489nm、最大蛍光波長508nmで、「緑色」を測定した。
　結果を図３に示す。図３に示す写真のうち、左のものはＮＢＤ－Ｃ６－セラミドまたは化合物９に由来する蛍光（緑色）の発光を観察した写真であり、中央のものはBODIPY-TR-Ceramideに由来する蛍光（赤色）の発光を観察した写真であり、右のものはこれらを重ね合せた（Merge）ものである。この実験でも、従来のゴルジマーカーであるＮＢＤ－Ｃ６－セラミドは、同じくゴルジマーカーであるBODIPY-TR-Ceramideと共局在することが確認された（図３の右上の写真）。ＮＢＤ－Ｃ６－セラミドについては、細胞への添加から３０分後であっても、２時間後にスフィンゴミエリンやグルコシルセラミドへと代謝された場合であっても、ゴルジ体に局在したままであることが報告されている（J Cell Biol. 1985 Jan;100(1):27-34）。発明者らの検討によっても、同様の結果が確認されている。一方、本発明に係るセラミド誘導体（化合物９）についても、BODIPY-TR-Ceramideと共局在することが確認された（図３の右下の写真）。このことから、化合物９はゴルジ体標識化蛍光プローブとして用いられうることが確認された。
　続いて、化合物９のゴルジ体の局在が長時間にわたって維持されうるか否かを評価した。具体的には、上述したのと同様の手法により化合物９またはＮＢＤ－Ｃ６－セラミド（陰性対照）（いずれも１μＭ）を添加した後、３７℃にて１、２、６、２４、または４８時間培養を行い、化合物由来の蛍光（緑色）を観察した。
　結果を図４に示す。図４の上段は、ＮＢＤ－Ｃ６－セラミド（陰性対照）についての観察結果を示す写真であり、光電子増倍管ＰＭＴ：４３０を用いて撮影したものである。図４の中段は、化合物９についての観察結果を示す写真であり、光電子増倍管ＰＭＴ：４３０を用いて撮影したものである。図４の下段は、化合物９についての観察結果を示す写真であり、光電子増倍管ＰＭＴ：５００を用いて撮影したものである。なお、「４３０」や「５００」とあるのは検出感度（化合物由来の発光を検出するのに要するエネルギーの大きさ）を意味し、この値が小さいほど感度は高いことになる。よって、この値を大きくしないと検出ができない場合には、発光の絶対量は少ない（つまり、蛍光性化合物の細胞内の存在量も少ない）ことを意味する。
　図４の上段に示す結果から、陰性対照であるＮＢＤ-Ｃ６－セラミドは時間の経過とともに蛍光強度が減弱しており、ゴルジ体への局在が経時的に低下していることがわかる。この結果は、図２Ａ～図２Ｃ、および図２Ｅに示した細胞内代謝の結果を裏付けるものであると言える。
　一方、化合物９については、図４の中段および下段に示すように、添加初期の段階では検出機器の感度を上げないと蛍光の発光が検出できないものの、時間の経過とともに発光強度は徐々に強まっていき、添加から２４時間後には検出感度を下げても充分に蛍光の発光を確認することができた。この結果もまた、図２Ａ～図２Ｂ、図２Ｄ、および図２Ｆに示した細胞内代謝の結果を裏付けるものである。
　以上のことから、本発明に係るセラミド誘導体は、例えばゴルジ体標識化蛍光プローブとして用いられた場合に、細胞障害性が低く細胞内安定性に優れるというきわめて顕著な効果を奏するものであることが示された。

Claims (9)

  1. 　下記化学式１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     式中、Ｒ１は、炭素原子数１～１２のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素原子数１～２０のアルキル基であり、ｎは、１～２０の整数である、
    で表される、セラミド誘導体。
  2. 　下記化学式２：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     式中、Ｒ１、Ｒ２、およびｎは、上記と同様の定義である、
    で表される、請求項１に記載のセラミド誘導体。
  3. 　Ｒ１が炭素原子数１～４のアルキル基である、請求項１または２に記載のセラミド誘導体。
  4. 　Ｒ２が炭素原子数５～１５のアルキル基である、請求項１～３のいずれか１項に記載のセラミド誘導体。
  5. 　ｎが７～１１の整数である、請求項１～４のいずれか１項に記載のセラミド誘導体。
  6. 　下記化学式３：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     で表される、セラミド誘導体。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載のセラミド誘導体を含む、ゴルジ体標識化蛍光プローブ。
  8. 　請求項７に記載のゴルジ体標識化蛍光プローブを、被検細胞に接触させる工程と、
    　前記蛍光プローブの発する蛍光信号を測定する工程と、
    を含む、被検細胞におけるゴルジ体の存在部位を特定する方法。
  9. 　請求項７に記載のゴルジ体標識化蛍光プローブを、被検細胞に接触させる工程と、
    　前記蛍光プローブの発する蛍光信号を測定する工程と、
    　蛍光標識された被検化合物を、前記被検細胞に接触させる工程と、
    　前記被検化合物の発する蛍光信号を測定する工程と、
    を含む、被検細胞における被検化合物のゴルジ体への局在化の有無またはその程度を測定する方法。
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