JP6398055B2 - 新規蛍光標識スフィンゴミエリン及びその利用 - Google Patents

Description

本発明は、新規標識蛍光スフィンゴミエリン及びその利用に関する。

スフィンゴミエリン（以下、「ＳＭ」とも記す）が１８８０年代にＴｈｕｄｉｃｕｍにより脳組織中に発見されて以来、脂質膜におけるＳＭの役割を解明することを目的としてＳＭの挙動（分布、移動性、分子間相互作用など）が研究されてきた。モデル膜を用いた複数の研究によると、ＳＭの最も基本的な特徴はグリセロリン脂質よりも水素結合形成能が高いことであり、それによってコレステロールの存在の下、ＳＭクラスターの形成が引き起こされる。このようなＳＭ（及びコレステロール）が多量に含まれたミクロドメインは、脂質ラフトと呼ばれており、ウイルス感染や重篤な疾患の他にもタンパク質局在化やシグナル伝達などの重要な生物学的事象に関与していることから、科学者たちの関心を集めている。ラフト関連のウイルス感染や疾患に関しては過去の文献（例えば、非特許文献１等）にまとめられている。しかしながら、ＳＭが脂質ラフトに不可欠な構成要素であるにも関わらず、ＳＭの挙動に関する直接的な情報が、特に生体膜においてはいまだ得られていない。

最近の顕微鏡法の進歩により、人工膜における脂質の分布を直接可視化することができるようになった。例えば、ラマン分光法を用いた画像法であるＣＡＲＳ（コヒーレント反ストークスラマン散乱）では、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン）及びＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）で構成されるＬ_ｄ／Ｌ_β相分離膜において、ＳＭの代表的な類似物質の一つであるＤＳＰＣにラマンタグを付けたものの分布が明らかになった。二次イオン質量分析は、ＳＭ／ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌの組成を有する二重膜においてＧ_Ｍ１の非存在下及び存在下で同位体標識された脂質の分布を調べる際に使用されており、脂質分布及び相分離はＧ_Ｍ１の存在により強く調節されることを解明した。しかし、これらの高度な技術は、固定サンプルの調製及び凍結、超高真空下における観察、サンプルの破壊など技術的問題点があるため簡便ではない。したがって、一部の膜科学者はこの発見に懐疑的であり、これらの技術から脂質の分布以上の情報を今のところ得ることはできていない。

蛍光顕微鏡法は、脂質分布及びドメイン形成を観察するのに有用なツールである。さらに、ＳＦＭＴ（蛍光１分子追跡法）の最近の進歩により、ナノスケールでの生体分子の分布のみならず、挙動や相互作用に関する詳細情報も得られるようになった。このような顕微鏡観察においてＳＭの挙動を調べる最も単純なアプローチは、本来のＳＭと同様の挙動が確認される蛍光標識ＳＭを使用することである。既に蛍光標識ＳＭが多く合成され一部販売されているが、これらの蛍光標識ＳＭは本来のＳＭの挙動をほとんど反映しない。すなわち、相分離膜においてラフト様Ｌ_ｏ相ではなく非ラフト様Ｌ_ｄ相に優先的に結合する（非特許文献２、３）。ＳＭに結合した大きな蛍光物質（フルオロフォア）により立体障害が発生し、そのため脂質のパッキングが障害されたり、ラフト様構造のドメインから排除されたりすることが考えられる（非特許文献４）。必然的に、ラフトの見かけ上の性質は、特に生細胞では大きく変化する（非特許文献５、６）。その代わりに、ライセニンがＳＭの蛍光プローブとして使用されている。これはライセニンがＳＭのクラスターに結合し、内在のトリプトファン残基がフルオロフォアとして機能するためである（非特許文献７）。しかし、これらの著者が懸念しているとおり、脂質プローブとしてタンパク質を使用することの潜在的な問題点の一つに、脂質とタンパク質の大きさの違いがある。ライセニンの分子量は、一般的なリン脂質の分子量の３０倍であり、膜の性質を変化させる可能性がある（非特許文献８）。結局、ＳＭ挙動を直接的に観察するには、本来のＳＭと同様の挙動を示す新たな蛍光ＳＭを見出す必要がある。

また、一般的に生体膜の脂質ラフト（２００〜３００ｎｍ未満）は人工膜の脂質ラフト（１μｍ超）よりも小さいため、通常の蛍光顕微鏡法ではほとんど見えない。イメージングにおけるこのような問題により、ＳＭの挙動及びラフト形成におけるＳＭの役割に関する直接的な情報を得ることが不可能であった。

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本発明は、本来のスフィンゴミエリンと同様の挙動を示す新たな蛍光標識スフィンゴミエリンを提供することを目的とする。
本発明は、脂質ラフト可視化剤、脂質ラフト関連疾患の診断用マーカー、脂質ラフトの検出又は定量用試薬及び脂質ラフト可視化方法を提供することを目的とする。

本発明は以下の発明に関する。
〔１〕下記式（１）

（式（１）中、Ａは水溶性蛍光発色化合物の残基を、Ｂ及びＥは同一の又は異なるリンカーを、Ｒ_１〜Ｒ_４はそれぞれ独立して水素原子又は置換基を示し、Ｘは３〜５０の整数であり、ｍ及びｎはそれぞれ独立して１０〜３０の整数であり、下記式（２）

で示される基は単結合又は二重結合である。）で表される化合物。
〔２〕式（１）中、Ａが下記式（３）

（式中、Ｇ_１〜Ｇ_７はそれぞれ独立して水素原子又は水溶性官能基であり、ｐは４であり、Ｒ_５〜Ｒ_８はそれぞれ独立して水素原子又は置換基を示す。ただし、Ｇ_１〜Ｇ_６及び４つのＧ_７の少なくとも１つは水溶性官能基である。）で示される前記〔１〕に記載の化合物。
〔３〕式（１）中、Ｂが、下記式（４）

（式中、Ｂ_１ｃ及びＢ_２ｃはそれぞれ独立して−ＣＯＮＲ_９−又は−ＣＯＯ−を、Ｂ_１ｂ及びＢ_２ｂはそれぞれ独立してＣ_１−２０アルキレン基を、Ｂ３は、−ＣＯＮＲ_１０−、−ＣＯＯＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯＯ−、−Ｏ−、−ＯＣＯ−、−Ｏ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ_２−、−ＮＲ_１１−、−ＮＲ_１２ＣＯ−、−ＮＲ_１３ＣＯＮＲ_１４−、下記式（５）

で示される基、下記式（６）

で示される基、下記式（７）

で示される基、下記式（８）

で示される基、下記式（９）

で示される基、又は下記式（１０）

で示される基を示し、Ｒ_９〜Ｒ_１４はそれぞれ独立して水素原子又は置換基を示し、１ｄ、１ｅ、２ｄ及び２ｅはそれぞれ独立して０又は１であり、１ｆ及び２ｆはそれぞれ独立して０〜３の整数である）で示される基である前記〔１〕又は〔２〕に記載の化合物。
〔４〕式（１）中、Ｅが下記式（１１）

（式中、Ｅ_１ｃ及びＥ_２ｃはそれぞれ独立して−ＣＯＮＲ_１５−又は−ＣＯＯ−を、Ｅ_１ｂ及びＥ_２ｂはそれぞれ独立してアルキレン基を、Ｅ３は、−ＣＯＮＲ_１６−、−ＣＯＯＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯＯ−、−Ｏ−、−ＯＣＯ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、アルキレン基、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ_２−、−ＮＲ_１７−、−ＮＲ_１８ＣＯ−、−ＮＲ_１９ＣＯＮＲ_２０−、下記式（５）

で示される基、下記式（６）

で示される基、下記式（７）

で示される基、下記式（８）

で示される基、下記式（９）

で示される基、又は下記式（１０）

で示される基を示し、Ｒ_１５〜Ｒ_２０はそれぞれ独立して水素原子又は置換基を示し、１ｇ、１ｈ、２ｇ及び２ｈはそれぞれ独立して０又は１であり、１ｉ及び２ｉはそれぞれ独立して０〜３の整数である）で示される基である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の化合物。
〔５〕前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の化合物を含有する脂質ラフト可視化剤。
〔６〕前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の化合物又は前記〔５〕に記載の剤を含有する脂質ラフト関連疾患診断用マーカー。
〔７〕前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の化合物又は前記〔５〕に記載の剤を含有する脂質ラフト検出又は定量用試薬。
〔８〕脂質ラフト可視化剤製造のための前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の化合物の使用。
〔９〕前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の化合物と脂質ラフトを含む細胞とを混合する工程、及び、前記細胞に光を照射して蛍光を検出する工程を含有する脂質ラフト可視化方法。

本発明では、本来のスフィンゴミエリンと同様の挙動を示す新たな蛍光標識スフィンゴミエリンを提供することができる。
本発明では、脂質ラフト可視化剤、脂質ラフト関連疾患の診断用マーカー、脂質ラフトの検出又は定量用試薬及び脂質ラフト可視化方法を提供することができる。

図１は、化合物５を含むＧＵＶの蛍光顕微鏡写真を示す。 図２は、ＴＸ−ｒｅｄ ＤＨＰＥを含むＧＵＶ蛍光顕微鏡写真を示す。 図３は、図１及び図２を重ね合わせた写真を示す。 図４は、化合物６を含むＧＵＶの蛍光顕微鏡写真を示す。 図５は、Ｂｏｄｉｐｙ−ＰＣを含むＧＵＶの蛍光顕微鏡写真を示す。 図６は、図４及び図５を重ね合わせた写真を示す。 図７は、化合物５を含むＧＵＶの断面の共焦点レーザー顕微鏡写真を示す。 図８は、化合物５を含むＧＵＶの断面の蛍光強度分布を示す。 図９は、化合物６を含むＧＵＶの断面の共焦点レーザー顕微鏡写真を示す。 図１０は、化合物６を含むＧＵＶの断面の蛍光強度分布を示す。 図１１は、ＧＵＶの断面のラフト様相の蛍光強度／非ラフト様相の蛍光強度比を示す。 図１２は、化合物５と６を含む１つのＧＵＶの断面の共焦点レーザー顕微鏡写真（ＦＲＥＴ法）を示す。 図１３は、化合物５と６を含むＧＵＶの断面の蛍光強度分布（ＦＲＥＴ法）を示す。 図１４は、複数の化合物５と６を含むＧＵＶの断面の共焦点レーザー顕微鏡写真（ＦＲＥＴ法）を示す。 図１５は、１つの赤血球に化合物６を添加した際の蛍光顕微鏡写真を示す。 図１６は、１つの赤血球に化合物５と６を添加した際の蛍光顕微鏡写真（ＦＲＥＴ法）を示す。 図１７は、化合物６を複数の赤血球に添加し、人工的に形成したエキノサイト（Ｅｃｈｉｎｏｃｙｔｅ）の微分干渉顕微鏡写真を示す。 図１８は、化合物６を複数の赤血球に添加し、人工的に形成したエキノサイト（Ｅｃｈｉｎｏｃｙｔｅ）の蛍光顕微鏡写真を示す。 図１９は、図１７と図１８を重ね合わせた写真を示す。 図２０は、２分子の化合物６のＣＨＯ−Ｋ１細胞中における拡散運動の経時変化を示す。 図２１は、化合物６のラフト領域における共局在を定量した結果を示す。 図２２は、ＡＴＴＯ５９４−ＤＯＰＥのラフト領域における共局在を定量した結果を示す。 図２３は、化合物６を赤血球ゴースト膜に添加した蛍光顕微鏡写真示す。 図２４は、図２３の赤血球ゴースト膜を界面活性化剤ＴＸ−１００で処理後の蛍光顕微鏡写真を示す。 図２５は、化合物６をＣＨＯ−Ｋ１ゴースト膜に添加した蛍光顕微鏡写真を示す。 図２６は、図２５のＣＨＯ−Ｋ１ゴースト膜を界面活性化剤ＴＸ−１００で処理後の蛍光顕微鏡写真を示す。 図２７は、化合物６をＥＣＶ３０４ゴースト膜に添加した蛍光顕微鏡写真を示す。 図２８は、図２７のＥＣＶ３０４ゴースト膜を界面活性化剤ＴＸ−１００で処理後の蛍光顕微鏡写真を示す。 図２９は、一次元データ処理した化合物５のＮＭＲチャートを示す。 図３０は、二次元データ処理した化合物５のＮＭＲチャートを示す。 図３１は、化合物５のＨＲＭＳチャートを示す。 図３２は、一次元データ処理した化合物６のＮＭＲチャートを示す。 図３３は、二次元データ処理した化合物６のＮＭＲチャートを示す。 図３４は、化合物６のＨＲＭＳチャートを示す。 図３５は、エキノサイトの微分干渉顕微鏡写真を示す。 図３６は、蛍光抗体Ｃｙ３−ＩｇＧで標識したＣＤ５９の分布（共焦点レーザー顕微鏡写真）を示す。 図３７は、化合物５をエキノサイト膜に添加した共焦点レーザー顕微鏡写真を示す。 図３８は、図３６及び図３７を重ね合わせた写真を示す。 図３９は、エキノサイト初期における化合物５の分布（共焦点蛍光顕微鏡写真）を示す。 図４０は、エキノサイト初期におけるＣｙ３−ＩｇＧで標識されたＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ＣＤ５９の分布（共焦点蛍光顕微鏡画像）を示す。 図４１は、初期エキノサイトの微分干渉顕微鏡写真を示す。 図４２は、図３９〜４１を重ね合わせた写真を示す。

〔本発明の化合物〕
本発明は、下記式（１）で表される化合物（以下、本発明の化合物とも記す）を包含する。

下記式（２）で示される基は単結合又は二重結合である。

式（１）中、Ａは水溶性蛍光発色化合物の残基を示す。水溶性蛍光発色化合物は、例えば、電子の励起源が可視光より短波長の電磁波による発光するものをいう。水溶性蛍光発色化合物は、特に限定されないが、例えば、スルホン酸基（スルホ基）、カルボキシル基、４級アミン等の水溶性官能基を有する蛍光発色化合物が挙げられ、水溶性官能基はスルホン酸基（スルホ基）であることが好ましい。水溶性蛍光発色化合物が有する水溶性官能基の数は、特に限定されないが、１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましく、１〜３であることがさらに好ましく、２であることが特に好ましい。また、Ａで示される水溶性蛍光発色化合物は、例えばローダミン骨格、アクリジン骨格、シアニン骨格、フルオレセイン骨格、オキサジン骨格、フェナンスリジン骨格等を持つ化合物等が挙げられ、中でもローダミン骨格を持つ化合物が好ましい。水溶性蛍光発色化合物は、具体的には、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ ＧｍｂＨより販売されているＡＴＴＯ−４８８（商品名）、ＡＴＴＯ−５９４（商品名）等が好ましい。

Ａで示される水溶性蛍光発色化合物の残基としては、例えば、下記式（３）
（式中、Ｇ_１〜Ｇ_７はそれぞれ独立して水素原子又は水溶性官能基であり、ｐは４であり、Ｒ_５〜Ｒ_８はそれぞれ独立して水素原子又は置換基を示す。ただし、Ｇ_１〜Ｇ_６及び４つのＧ_７の少なくとも１つは水溶性官能基である。）で示される化合物であることが好ましい。
式（３）において、水溶性官能基としては、スルホン酸基などの前記例示の基が挙げられる。水溶性官能基の数もまた前記と同様の範囲（例えば、１〜１０、好ましくは１〜４程度）から選択できる。中でも、Ｇ_３及びＧ_４がスルホン酸基（スルホ基）であり、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｇ_５、Ｇ_６及びＧ_７が水素原子であることが好ましい。
Ｒ_５〜Ｒ_８において、置換基としては、例えば、脂肪族基、芳香族基などが挙げられる。脂肪族基としては、例えば、アルキル基、シクロアルキル基（例えば、シクロヘキシル基など）などが挙げられる。アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基などのＣ_１〜２０アルキル基、好ましくはＣ_１〜１０アルキル基、さらに好ましくはＣ_１〜４アルキル基などが挙げられる。
芳香族基としては、例えば、芳香族炭化水素基［例えば、フェニル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基などのアリール基（例えば、Ｃ_６〜２０アリール基、好ましくはＣ_６〜１２アリール基）など］、芳香族複素環基などが挙げられる。
脂肪族基及び芳香族基には、さらに、置換基が置換した基も含まれる。置換基を有する脂肪族基としては、例えば、芳香族基が置換したアルキル基［例えば、アラルキル基（例えば、ベンジル基、フェネチル基などのアリールアルキル基）、ハロアルキル基（例えば、クロロメチル基、ブロモエチル基など）］などの置換基を有するアルキル基などが含まれる。
置換基を有する芳香族基としては、例えば、ハロアリール基（例えば、クロロフェニル基、ブロモフェニル基などのハロＣ_６〜２０アリール基、好ましくはハロＣ_６〜１２アリール基）などが挙げられる。
好ましいＲ_５〜Ｒ_８としては水素原子、アルキル基（メチル基、エチル基などのＣ_１〜４アルキル基）、アラルキル基（例えば、ベンジル基、フェネチル基などのＣ_６〜１０アリールＣ_１〜４アルキル基）が挙げられ、Ｒ_５〜Ｒ_８のいずれもが水素原子であることがより好ましい。

Ｂ及びＥは同一の又は異なるリンカーを示す。Ｂは、Ａとポリエチレングリコール部とを結合するためのリンカーであれば特に限定されない。ポリエチレングリコール部とは、式（１）において構造式−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｘ−で示される部分をいう。Ｘは３〜５０の整数であり、５〜４０であることが好ましく、７〜３０であることがより好ましく、８〜２０であることがさらに好ましく、８〜１２であることが特に好ましい。

Ｂは、代表的には、下記式（４）
（式中、Ｂ_１ｃ及びＢ_２ｃはそれぞれ独立して−ＣＯＮＲ_９−又は−ＣＯＯ−を、Ｂ_１ｂ及びＢ_２ｂはそれぞれ独立してアルキレン基を、Ｂ３は、−ＣＯＮＲ_１０−、−ＣＯＯＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯＯ−、−Ｏ−、−ＯＣＯ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、アルキレン基、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ_２−、−ＮＲ_１１−、−ＮＲ_１２ＣＯ−、−ＮＲ_１３ＣＯＮＲ_１４−、下記式（５）
で示される基、下記式（６）
で示される基、下記式（７）
で示される基、下記式（８）
で示される基、下記式（９）

で示される基、又は下記式（１０）

で示される基を示し、Ｒ_９〜Ｒ_１４はそれぞれ独立して水素原子又は置換基を示し、１ｄ、１ｅ、２ｄ及び２ｅはそれぞれ独立して０又は１であり、１ｆ及び２ｆはそれぞれ独立して０〜３の整数である）で示される基であってもよい。
Ｂ_１ｂ、Ｂ_２ｂ及びＢ３において、アルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基などのＣ_１〜２０アルキレン基、好ましくはＣ_１〜１６アルキレン基、さらに好ましくはＣ_２〜１０アルキレン基などが挙げられる。なお、アルキレン基は、直鎖状又は分岐状のいずれであってもよく、特に直鎖状であってもよい。
Ｒ_９〜Ｒ_１４において、置換基としては、前記Ｒ_５〜Ｒ_８と同様の置換基［例えば、アルキル基（メチル基、エチル基など）、アリール基、ハロアルキル基、ハロアリール基、アラルキル基など］が挙げられる。代表的なＲ_９〜Ｒ_１４としては、水素原子、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基などのＣ_１〜４アルキル基）、アラルキル基（例えば、ベンジル基、フェネチル基などのＣ_６〜１０アリールＣ_１〜４アルキル基）などが挙げられる。
なお、１ｆが２又は３であるとき、Ｂ_１ｂ、Ｂ_１ｃ、１ｄ、１ｅはそれぞれ異なっていてもよい。２ｆが２又は３であるとき、Ｂ_２ｂ、Ｂ_２ｃ、２ｄ、２ｅはそれぞれ異なっていてもよい。２ｆは０であることが好ましい。通常１ｅが１のとき、１ｄであることが多い。

Ｂの具体例を表１に示す。
なお、上記表中、ｐ_１、ｐ_２及びｐ_３は１以上の整数を示し、好ましくは１〜２０、さらに好ましくは１〜１２、特に２〜８であってもよい。Ｂは、中でも−ＣＯＮＲ_９−（ＣＨ_２）ｐ_３ＣＯＮＲ_１０−であることが好ましい。この場合において、Ｒ₉、ｐ_３及びＲ_１０はそれぞれ独立して、上記同様に説明される。

Ｅは、前記ポリエチレングリコール部と下記式（１２）で示されるスフィンゴミエリン部とを結合するためのリンカーであれば特に限定されない。

Ｒ_１〜Ｒ_４はそれぞれ独立して水素原子又は置換基を示す。置換基としては、前記Ｒ_５〜Ｒ_８と同様の置換基［例えば、アルキル基（メチル基、エチル基など）、アリール基、ハロアルキル基、ハロアリール基、アラルキル基など］が挙げられる。代表的なＲ_１〜Ｒ_４としては、水素原子、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基などのＣ_１〜４アルキル基）、アラルキル基（例えば、ベンジル基、フェネチル基などのＣ_６〜１０アリールＣ_１〜４アルキル基）などが挙げられる。
ｍは１０〜３０の範囲内であれば特に限定されないが、１０〜２５であることが好ましく、１０〜２０であることがより好ましく、１１〜１５であることがさらに好ましく、１３であることが特に好ましい。ｎは１０〜３０の範囲内であれば特に限定されないが、１４〜２５であることが好ましく、１５〜２０であることがより好ましく、１６〜１８であることがさらに好ましく、１７であることが特に好ましい。

Ｅは、代表的には、下記式（１１）
（式中、Ｅ_１ｃ及びＥ_２ｃはそれぞれ独立して−ＣＯＮＲ_１５−又は−ＣＯＯ−を、Ｅ_１ｂ及びＥ_２ｂはそれぞれ独立してアルキレン基を、Ｅ３は、−ＣＯＮＲ_１６−、−ＣＯＯＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯＯ−、−Ｏ−、−ＯＣＯ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、アルキレン基、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ_２−、−ＮＲ_１７−、−ＮＲ_１８ＣＯ−、−ＮＲ_１９ＣＯＮＲ_２０−、下記式（５）
で示される基、下記式（６）
で示される基、下記式（７）
で示される基、又は下記式（８）
で示される基、下記式（９）

で示される基、又は下記式（１０）

で示される基を示し、Ｒ_１５〜Ｒ_２０はそれぞれ独立して水素原子又は置換基を示し、１ｇ、１ｈ、２ｇ及び２ｈはそれぞれ独立して０又は１であり、１ｉ及び２ｉはそれぞれ独立して０〜３の整数である）で示される基であってもよい。１ｉが２又は３であるとき、Ｅ_１ｂ、Ｅ_１ｃ、１ｇ、１ｈはそれぞれ異なっていてもよい。２ｉが２又は３であるとき、Ｅ_２ｂ、Ｅ_２ｃ、２ｇ、２ｈはそれぞれ異なっていてもよい。スフィンゴミエリン部のＮの塩基性を保持するために、２ｇ及び２ｉは１であることが好ましい。

Ｅの具体例を表２に示す。
なお、上記表中、ｑは１以上の整数を示し、ｑは好ましくは１〜２０、さらに好ましくは１〜１２、特に１〜８であってもよい。Ｅは、中でも表２のＥ−１の組み合わせであることが好ましい。

本発明の化合物は、脂質ラフト領域に特異的に移行することができる。本発明の化合物は、脂質ラフト領域を可視化することができ、例えば、脂質ラフト関連疾患を診断するのに非常に有用である。

〔製造方法〕
本発明の化合物は、特に限定されないが、例えば、後述の実施例を参照することにより製造される。本発明の化合物は、例えば、下記の様にして得られる。
官能基を有する水溶性蛍光発色化合物(イ)とポリエチレングリコール部の誘導体（ロ）とを下記反応式１のように反応させる。

すなわち、上記式の例では、化合物（イ）のＢ_１ａと、化合物（ロ）のＢ_２ａとが反応することによりＢ３が形成される。このような官能基Ｂ_１ａ及びＢ_２ａとしては、Ｂ３の種類に応じて適宜選択でき、例えば、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アルキルアミノ基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、−ＮＣＯ基、チオール基（−ＳＨ）、アジ基（−Ｎ_３）、アセチレン基（−Ｃ≡ＣＨ）、ビニル基（−ＣＨ＝ＣＨ_２）、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子など）、−ＣＯＯ−Ｎ−スクシンイミド基、マレイミド基、トシルオキシ基（−ＯＴｓ）、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、シアノ基などが挙げられる。

Ｂ_１ａ、Ｂ_２ａ及びＢ３の代表的な組み合わせを表３に示す。
（表中、Ｘはハロゲンを示す。）

反応式１で得られた（ハ）とスフィンゴミエリン部を含む化合物（ニ）とを下記反応式２の様に反応させる。反応式２における（ハ）の代わりにポリエチレングリコール部の誘導体（ロ）を用いて反応式２の反応を行い、得られた化合物を、反応式１における化合物（ロ）の代わりに用いて、官能基を有する水溶性蛍光発色化合物(イ)と反応させてもよい。すなわち、化合物(イ)及び（ロ）を反応させた後に化合物（ニ）を反応させてもよく、化合物(ロ)及び（ニ）を反応させた後に化合物（イ）を反応させてもよい。化合物(イ)、（ロ）、（ニ）は同時に反応させてもよい。溶媒等は当業者により適宜選択可能である。
すなわち、上記式の例では、化合物（ハ）のＥ_１ａと、化合物（二）のＥ_２ａとが反応することによりＥ３が形成される。このような官能基Ｅ_１ａ及びＥ_２ａとしては、Ｅ３の種類に応じて適宜選択でき、例えば、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アルキルアミノ基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、−ＮＣＯ基、チオール基（−ＳＨ）、アジ基（−Ｎ_３）、アセチレン基（−Ｃ≡ＣＨ）、ビニル基（−ＣＨ＝ＣＨ_２）、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子など）、−ＣＯＯ−Ｎ−スクシンイミド基、マレイミド基、トシルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基などが挙げられる。

Ｅ_１ａ、Ｅ_２ａ及びＥ３の代表的な組み合わせを表４に示す。

溶媒等は当業者により適宜選択可能である。化合物（ハ）は、特に限定されないが、例えば、化合物（イ）をＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）に溶解し、これに、トリエチルアミン、ポリエチレングリコール部を含む化合物（ロ）を順に加え、室温で７時間攪拌し、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー及びゲル浸透クロマトグラフィーにより精製することにより得られる。

本発明の化合物は、特に限定されないが、例えば、化合物（ハ）をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ_２Ｏに溶解し、硫酸銅とアスコルビン酸ナトリウムを加え、次にメタノール１００μＬに溶解させたスフィンゴミエリン部を含む化合物（ニ）を加え室温で１日攪拌した溶媒を留去し、残渣を薄層クロマトグラフィー及びゲル浸透クロマトグラフィーにより分離精製することにより得られる。

〔脂質ラフト可視化剤〕
本発明は、本発明の化合物を含有する脂質ラフト可視化剤（以下、本発明の剤とも記す）を包含する。本発明の剤は、本発明の化合物を含有していればよく、本発明の効果を奏する限り他の成分を含んでいてもよい。本発明の剤は、本発明の化合物を表す式（１）中のＡの水溶性蛍光発色化合物の吸収波長、励起光の種類等に応じて、当業者により適宜選択可能である。水溶性蛍光発色化合物が、ＡＴＴＯ−４８８、ＡＴＴＯ−５９４等又はこれらの組み合わせである場合、４００〜６００ｎｍの波長の励起光を照射することにより４５０ｎｍ以上、好ましくは４８０〜８００ｎｍ、特に好ましくは４８０〜６７０ｎｍの波長の蛍光を発する。本発明の剤は、脂質ラフト領域に特異的に移行するので、脂質ラフト領域を可視化することができる。本発明の剤は、ＦＲＥＴ（Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）法を用いることにより、蛍光部分と非蛍光部分とのコントラストを強くすることができる。なお、ＦＲＥＴとは、蛍光共鳴エネルギー移動のことで、近接した２個の色素分子の間で励起エネルギーが、電磁波にならず電子の共鳴により直接移動する現象のことをいう。

本発明の剤の使用態様は生体に適用するものに限定されることはなく、生体外に摘出した細胞、組織、標本等にも適用され得る。

本発明の剤は、生体組織やＤＮＡの損傷を惹起することがないので有用である。また、本発明の剤は、脂質ラフト領域に特異的に移行するので、脂質ラフト領域を可視化することができ、例えば、脂質ラフト関連疾患を診断するのに非常に有用である。

本発明の剤は、静脈注射、経口服用等により投与し、生体内における標的生体物質に対する特異的結合により疾病を診断することができる。

〔脂質ラフト関連疾患診断用マーカー〕
本発明は、本発明の化合物又は本発明の剤を含有する脂質ラフト関連疾患診断用マーカー（以下、本発明の診断用マーカーという）を包含する。本発明の診断用マーカーは、本発明の化合物を含有していればよく、本発明の効果を奏する限り他の成分を含んでいてもよい。本発明の診断用マーカーは、１又は２以上の本発明の剤を含んでいてもよい。本発明の診断用マーカーは、本発明の化合物を表す式（１）中のＡの水溶性蛍光発色化合物の吸収波長、励起光の種類等に応じて、当業者により適宜選択可能である。水溶性蛍光発色化合物が、ＡＴＴＯ−４８８、ＡＴＴＯ−５９４等又はこれらの組み合わせである場合、４００〜６００ｎｍの波長の励起光を照射することにより４５０ｎｍ以上、好ましくは４８０〜８００ｎｍ、特に好ましくは４８０〜６７０ｎｍの波長の蛍光を発する。本発明の診断用マーカーは、脂質ラフト領域に特異的に移行するので、脂質ラフト領域を可視化することができ、脂質ラフト関連疾患を診断するのに非常に有用である。

本明細書において、脂質ラフト関連疾患とは脂質ラフト領域の増減が、その疾患の増悪に関連することが知られている疾患、脂質ラフト領域の増減がその疾患の増悪に関連する可能性がある疾患等を包含する。脂質ラフト関連疾患とは、例えば、全身性エリテマトーデス、中枢性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病等）、炎症性疾患（自己免疫性関節炎、アトピー性皮膚炎、喘息、肺気腫、ベーチェット病、多発性硬化症、脊髄小脳変性症、ブドウ膜炎、ギランバレー症候群、フィッシャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、多発性筋炎、強皮症、自己免疫性肝炎、サルコイドーシス、慢性膵炎、炎症性腸炎、クローン病、固形癌、多発性骨髄腫、血管線維腫、粥状動脈硬化、動静脈奇形、肉芽、血管腫、肥大性瘢痕、ケロイド、早老、乾癬、発熱性肉芽腫、疣、出血性関節、非結合骨折、リウマチ様関節炎（例えば、悪性関節リウマチ等）、変形性関節症、卵胞嚢胞、卵巣肥大症候群、多嚢胞卵巣、加齢性黄班変性症、糖尿病性網膜症、新生血管緑内障、トラコーマ、肺気腫、慢性気管支炎、肥満症、歯周病、角膜移植片の血管新生、動脈瘤等）、生活習慣病（糖尿病、高血圧、高脂血症等）、ウイルス感染、感染症等が挙げられる。例えば、全身性エリテマトーデスは、脂質ラフト領域の増大がその疾患の増悪に関連することが知られていることから、本発明（本発明の化合物、本発明の剤、本発明の診断用マーカー、後述する本発明の試薬、本発明の使用及び本発明の方法を含む）は、全身性エリテマトーデス等の脂質関連疾患の診断、予防等に非常に有用である。

本発明の診断用マーカーは、例えば、本発明の化合物又は本発明の剤を生理食塩水、リン酸緩衝液等の水系媒体に溶解した溶液剤、微粒子状粉末、凍結乾燥粉末等の固形剤等として提供される。本発明の診断用マーカーの形態は、特に限定されず、当業者が使用目的等に応じて適宜選択可能である。

本発明の診断用マーカーは、薬理学的、製剤学的に許容しうる添加物を添加することができる。例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、ハードファット等の基剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基、有機塩基等のｐＨ調節剤；ビタミンＡ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ等安定化に寄与しうる薬剤等の製剤用添加物を添加してもよい。

本発明の診断用マーカーは、例えば、生体外に摘出した組織、標本等に適用され得る。

本発明の診断用マーカーは、例えば、共焦点レーザー顕微鏡を用いた検査に使うことが出来る。脂質ラフト関連疾患の病巣の存在が疑われる組織、細胞等に、本発明の試薬を接触させ、適宜洗浄した後、近赤外線ないし遠赤外線を照射して蛍光を検出することで病巣を見つけ出すことができる。

〔脂質ラフト検出又は定量用試薬〕
本発明は、本発明の化合物又は本発明の脂質ラフト可視化剤を含有する脂質ラフト検出又は定量用試薬（以下、本発明の試薬とも記す）を包含する。

本発明の試薬は、例えば、共焦点レーザー顕微鏡を用いた検査に使うことが出来る。脂質ラフト関連疾患の病巣の存在が疑われる組織、細胞等に、本発明の試薬を接触させ、適宜洗浄した後、近赤外線ないし遠赤外線を照射して蛍光を検出することで病巣を見つけ出すことができ、蛍光を定量することで、疾患の有無、進行度および重症度などを知ることができる。

〔使用〕
本発明は、脂質ラフト可視化剤製造のための本発明の化合物の使用（以下、本発明の使用とも記す）を包含する。

〔脂質ラフト可視化方法〕
本発明は、本発明の化合物と脂質ラフトを含む細胞とを混合する工程、及び、前記細胞に光を照射して蛍光を検出する工程を含有する脂質ラフト可視化方法（以下、本発明の方法とも記す）を包含する。

本発明の方法において、脂質ラフトを含む細胞とは、脂質ラフトを含有することがわかっている細胞、脂質ラフトを含有するかどうか不明の細胞等を包含する。脂質ラフトを含む細胞は、特に限定されないが、例えば、赤血球細胞、白血球細胞、ヒト膀胱癌細胞等が挙げられる。赤血球細胞として、ウニ状赤血球（エキノサイト、Ｅｃｈｉｎｏｃｙｔｅ）等が挙げられる。本発明の方法は、ウニ状赤血球上の突起を可視化、検出等できる点で非常に有用である。

本発明の方法において、本発明の化合物と脂質ラフトを含む細胞とを混合する工程は、特に限定されず、例えば、本発明の化合物と脂質ラフトを含む細胞とが接触するように溶媒等を適宜選択し使用することができる。

本発明の方法において、脂質ラフトを含む細胞に光を照射して蛍光を検出する工程は、特に限定されないが、例えば、脂質ラフトを含む細胞に可視光又は近赤外光を照射してカメラ、ＣＣＤ等で観察する赤外光観察、蛍光顕微鏡、蛍光内視鏡、多光子励起蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、共焦点内視鏡等によって、脂質ラフトを含む細胞に対して励起光光源から光を照射して、それによって発光している本発明の化合物の水溶性蛍光発色化合物の蛍光を検出すること等が挙げられる。検出する方法は、特に限定されないが、例えば、ウエスタンブロッティング、プロテインアレイ、フローサイトメトリー、蛍光ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫染色、ＦＲＥＴ、ｉｎ ｖｉｖｏイメージング等が挙げられる。

本発明で用いられる励起するための波長は、本発明の化合物と脂質ラフトを含む細胞に影響を与えなければ特に制限はされないが、使用する本発明の化合物の水溶性蛍光発色化合物によって異なる。本発明の化合物の水溶性蛍光発色化合物が効率よく蛍光を発すれば特に限定はされない。水溶性蛍光発色化合物が、ＡＴＴＯ−４８８、ＡＴＴＯ−５９４等又はこれらの組み合わせである場合、４００〜６００ｎｍの波長の励起光を照射することにより４５０ｎｍ以上、好ましくは４８０〜８００ｎｍ、特に好ましくは４８０〜６７０ｎｍの波長の蛍光を発する。

本発明の方法で用いられる光源としては、本発明の化合物と脂質ラフトを含む細胞に影響を与えなければ特に制限はされず、例えば、色素レーザー、半導体レーザー、イオンレーザー、ファイバーレーザー、ハロゲンランプ、キセノンランプ、エバネッセント波、タングステンランプ等が挙げられる。また、各種光学フィルターを用いて、好ましい励起波長を得たり、蛍光のみを検出したりする事ができる。

本発明の方法において、例えば、脂質ラフトを含む細胞に光を照射して、脂質ラフトを含む細胞の脂質ラフト領域で本発明の化合物の水溶性蛍光発色化合物を発光させ、脂質ラフトを含む細胞を撮像することにより、発光している脂質ラフト領域を容易に検出することができ、脂質ラフトの状態、局在、変化等を画像とし捉えることができる。

本発明は、本発明の効果を奏する限り、本発明の技術的範囲内において、上記の構成を種々組み合わせた態様を含む。

次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。

［製造例１］化合物５の合成
まず、下記工程を経て、反応中間体（化合物３）を得た。

ＡＴＴＯ−４８８ＮＨＳ−ester（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ）である６−アミノ−３−（１４−アザニリジン）−９−（２−（（２−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−２−オキソエチル）（メチル）カルバモイル）フェニル）−３Ｈ−キサンテン−４，５−ジスルホン酸（化合物１）１．４５μｍｏｌをＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）４５０μＬに溶解した。これに、トリエチルアミン３．７１μＬ（１８．３μｍｏｌ）を加え、引き続き３２−アジド−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０−デカオキサドトリアコンタン−１−アミン（化合物２）（O-(2-Aminoethyl)-O'-(2-azidoethyl)nonaethylene glycol, Aldrich 社から購入）を１．４５μｍｏｌ加え、室温で７時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（移動相；クロロホルム、メタノール及び水の混合液（ＣＨＣｌ_３：ＣＨ_３ＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝１３：９：２（容量比））及びゲル浸透クロマトグラフィー（ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ、溶媒ＣＨ_３ＯＨ）により精製し６−アミノ−３−（１４−アザニリジン）−９−（２−（（３５−アジド−２−オキソ−６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−デカオキサ−３−アザペンタトリアコンチル）（メチル）カルバモイル）フェニル）−３Ｈ−キサンテン−４，５−ジスルホン酸（化合物３）を得た。

次に、下記工程を経て、化合物５を得た。

得られた化合物３（１．０μｍｏｌ）をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ_２Ｏ（４／１、４００μＬ）に溶解し、硫酸銅（０．５μｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウム（１．５ｕμｍｏｌ）を加え、次にメタノール１００μＬに溶解させた２−（エチニルジメチルアンモニオ）エチル（（２Ｓ，３Ｒ，Ｅ）−３−ヒドロキシ−２−ステアルアミドオクタデク−４−エン−１−イル）リン酸塩（化合物４）（Sarah A. Goretta, Masanao Kinoshita, Shoko Mori, Hiroshi Tsuchikawa, Nobuaki Matsumori, Michio Murata Bioorg. Med. Chem.20, 4012-4019 (2012)に記載の方法により製造）を加え室温で１日攪拌した。溶媒を留去し、残渣を薄層クロマトグラフィー（展開溶媒ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＝１３／９／１）及びゲル浸透クロマトグラフィー（ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ、溶媒ＣＨ_３ＯＨ）により分離精製し、２−（（（１−（１−（２−（６−アミノ−３−（１４−アザニリジン）−４，５−ジスルホ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル）−２−メチル−１，４−ジオキソ−８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−デカオキサ−２，５−ジアザペンタトリアコンタン−３７−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）ジメチルアンモニオ）エチル（（２Ｓ，３Ｒ，Ｅ）−３−ヒドロキシ−２−ステアルアミドオクタデク−４−エン−１−イル）（化合物５）を０．２９μｍｏｌ（総収率１９％）得た。

化合物５のＮＭＲについて、ＮＭＲデータ処理プログラム（Delta 5.0.0）を用いて一次元データ処理、二次元データ処理した結果をそれぞれ図２９、３０に示した。化合物５のＨＲＭＳチャート（Xcalibur）を図３１に示した。

（化合物５）
ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ０．９０（ｔ，Ｊ＝６．６４Ｈｚ，６Ｈ），１．０７−１．５０（ｍ，５０Ｈ），１．５２−１．６９（ｍ，２Ｈ），１．９４−２．０８（ｍ，２Ｈ），２．１１−２．２４（ｍ，２Ｈ），２．８７（ｓ，３Ｈ），３．１７（ｓ，６Ｈ），３．４４−３．７６（ｍ，４０Ｈ，ＰＥＧ），３．８２−４．１６（ｍ，４Ｈ），４．２２−４．４１（ｍ，２Ｈ），４．５８−４．７０（ｍ，１Ｈ），５．４０−５．５１（ｍ，１Ｈ），５．６１−５．７８（ｍ，１Ｈ），６．９４−７．０３（ｍ，２Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．２３−７．２８（ｍ，２Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．３３−７．８１（ｍ，４Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），８．３６−８．６０（ｍ，１Ｈ）．
ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_９０Ｈ_１５１Ｎ_９Ｏ_２５ＰＳ_２ ^＋ ［Ｍ］^＋１８５２．９９９５， ｆｏｕｎｄ： １８５２．９９７２．

［製造例２］化合物６の合成
ＡＴＴＯ−４８８Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体の代わりに、ＡＴＴＯ−５９４Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ）を用いた以外は、製造例１と同様の方法で合成し化合物６を０．３４μｍｏｌ（総収率２２％）得た。

化合物６のＮＭＲについて、ＮＭＲデータ処理プログラム（Delta 5.0.0）を用いて一次元データ処理、二次元データ処理した結果をそれぞれ図３２、３３に示した。化合物５のＨＲＭＳチャート（Xcalibur）を図３４に示した。

（化合物６）
ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ０．９０（ｔ，Ｊ＝６．７３Ｈｚ，６Ｈ），１．２０−１．４５（ｍ，５０Ｈ），１．５１−１．６６（ｍ，６Ｈ），１．７８（ｔ，Ｊ＝５．８０Ｈｚ，１Ｈ），１．９７−２．０９（ｍ，２Ｈ），２．１３−２．２３（ｍ，２Ｈ），２．６４（ｓ，１Ｈ），２．７２（ｓ，１Ｈ），３．１９（ｓ，６Ｈ），３．４３−３．５２（ｍ，２Ｈ），３．５４−３．７０（ｍ，４０Ｈ，ＰＥＧ），３．７０−３．７８（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｄ，Ｊ＝１５．７５Ｈｚ，１Ｈ），３．９０−４．０１（ｍ，２Ｈ），４．０３−４．０９（ｍ，１Ｈ），４．１０−４．１８（ｍ，１Ｈ），４．３３−４．３９（ｍ，１Ｈ），４．５８（ｓ，１２Ｈ），４．６４−４．６８（ｍ，１Ｈ），４．７６（ｓ，２Ｈ），５．４１−５．４８（ｍ，１Ｈ），５．６６−５．７４（ｍ，１Ｈ），５．８９（ｓ，１Ｈ），６．７９（ｓ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝１５．３２Ｈｚ，１Ｈ），７．４６−７．５３（ｍ，１Ｈ），７．５７−７．６４（ｍ，１Ｈ），７．６８−７．７６（ｍ，２Ｈ），８．４１（ｓ，１Ｈ）．
ＨＲＭＳ ｆｏｕｎｄ：［Ｍ＋２Ｎａ］^２＋ １０５６．５７２４．

［製造例３］人工膜リポソーム（ＧＵＶ）の作製
スフィンゴミエリン（ＳＭ）とＤＯＰＣは、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ （Ａｌａｂａｓｔｅｒ ＡＬ）から購入した。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ （Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＬＯ）から購入した。ＳＭ、ＤＯＰＣ及びコレステロールから成る３成分系巨大脂質膜リポソーム（ＧＵＶ： Ｇｉａｎｔ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ）は、Ｄｉｍｉｔｒｏｖ， Ｄ． Ｓ． Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｅｌｅｃｔｒｏ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． ３０３−３１１（１９８６）に従いエレクトロフォーメーション法を用いて作製した。具体的には、適量の蛍光プローブを添加したＳＭ／ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）５〜１０μＬを電極（白金線、直径＝１００μｍ）の表面上に塗り広げた。この電極を真空下で２４時間乾燥させた後、薄い脂質膜でコーティングした。次に、平行に配置した電極を、四角い枠の形をしたゴム製スペーサー（厚さ１ｍｍ）を使って２枚のカバーガラス（２４ｍｍ×６０ｍｍ、厚さ０．１２〜０．１７ｍｍ）で挟んだ約４００μＬのミリＱ水の中に入れた。このチャンバーは、温度制御されたサンプルステージ（サーモプレート、東海ヒット社、静岡、日本）の上に固定した。その後、サンプルは、純粋なＳＭ二重層のＴｍよりも十分に高い温度である５０℃で６０分間インキュベートし、ファンクションジェネレータ（２０ＭＨｚ，Ａｇｉｌｅｎｔ社、カリフォルニア州サンタクララ）を使って低周波交流（ＡＣ）（正弦波関数、１０Ｖｐｐ、１０Ｈｚ）を印加した。エレクトロフォーメーション後、その後の観察のためにＧＵＶを２５℃に冷却し、１５分間平衡化してから、２８．５℃まで加熱した。バルク溶液の温度は、別途にＫタイプ温度計（ＡＤ−５６０２ａ、株式会社三商（ＳＡＮＳＹＯ Ｃｏ．，ＬＴＤ）東京、日本）を用いて測定し、サンプルステージとサンプルの温度差を較正した。

［実施例１］化合物５及び化合物６を含む３成分系巨大脂質膜リポソーム（ＧＵＶ）におけるラフト様相への移行（蛍光顕微鏡観察）
０．２％ｍｏｌの化合物５又は０．２％ｍｏｌのＴＸ−ｒｅｄ ＤＨＰＥを含むＳＭ／ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ（１／１／１ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）で形成されるＧＵＶを２８．５℃で共焦点蛍光顕微鏡観察した。なお、ＧＵＶは、この条件下において、ラフト様の秩序相と非ラフト様の無秩序相とに相分離することが知られている。またそれぞれの相では脂質組成が異なり、とりわけラフトの主要成分であるＳＭは秩序相に豊富に分布することが報告されている。

蛍光顕微鏡観察の結果を図１〜６に示す。図１及び図５の白い部分は、青色蛍光部分であり、図２及び図４の白い部分は、赤色蛍光部分である。図３、図６はそれぞれ、図１及び図２、図４及び図５を重ね合わせた写真である。化合物５が、無秩序相（非ラフト様相）に結合することで知られるＴＸ−ｒｅｄ ＤＨＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ， ＵＳＡ）と反対の分布を示すことがわかった（図１〜３）。このことは化合物５が通常のＳＭと同様に秩序相（ラフト様相）に優先的に取り込まれることを示している。同様に化合物６も、無秩序相（非ラフト様相）に結合するＢｏｉｐｙ−ＰＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）と反対の分布を示すことより、秩序相（ラフト様相）に優先的に分布することがわかった（図４〜６）。

［実施例２］化合物５と６のラフト様相及び非ラフト様相への分布の割合（共焦点レーザー顕微鏡観察）
ＳＭ／ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ（１／１／１ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）からなるＧＵＶにおける秩序相（Ｌｏ、ラフト様相）と非秩序相（Ｌｄ、非ラフト様相）でのＳＭの分布を、０．２ｍｏｌ％化合物５又は化合物６を加えて調べた。それぞれの励起は、共焦点レーザー（λｅｘ＝４７３±２ｎｍ及び５５９±２ｎｍ）を用いた。それぞれの放射は、４８５ｎｍ−５８５ｎｍと５７０ｎｍ−６７０ｎｍで調べた。レーザーパワーは、９ｍＷ／ｃｍ^２、６ｍＷ／ｃｍ^２で、スキャン速度は、化合物５を含むＧＵＶと、化合物６を含むＧＵＶでそれぞれ２μｓ／ｐｉｘ、４μｓ／ｐｉｘで、共焦点イメージは、１０２４ｐｉｘ×１０２４ｐｉｘで得た。

化合物５と化合物６の秩序相及び非秩序相の分布を蛍光強度で調べた。ＧＵＶの断面を図７及び９に示す。図７の白い部分は、青色蛍光部分を、図９の白い部分は、赤色蛍光部分を示す。球状のＧＵＶを２０個選び、その断面周辺の強度をプロットした（図８及び１０）。化合物５と化合物６の秩序相の蛍光強度はともに、非秩序相の蛍光強度の４倍であり（図１１）、化合物５と化合物６は秩序相へ多く分布していることが示された。

［実施例３］ＦＲＥＴ法による化合物６の秩序相Ｌｏ移行領域の検出
０．２ｍｏｌ％ 化合物５又は化合物６をＳＭ／ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌの混合物（１：１：０．５ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）に加えて、ＧＵＶを作成した。化合物５を含むＧＵＶに４７３±２ｎｍの波長のレーザーを照射した。化合物５から化合物６へのエネルギー移行後、化合物６からの放射を波長６１０−６３０ｎｍで検出した。レーザーパワー７１ｍＷ／ｃｍ^２及び８９ｍＷ／ｃｍ^２、スキャンスピード４μｓ／ｐｉｘ及び８μｓ／ｐｉｘで得たＦＲＥＴイメージ（１０２４ｐｉｘ×１０２４ｐｉｘ）を図１２及び１４（スケールバーは１０μｍ）に示す。図１２及び図１４の白い部分は、赤色蛍光部分を示す。

同じ大きさのＧＵＶを２１個選び、ＧＵＶ表面（図１２参照）に沿った化合物６からのみの放射を波長（λｅｍ＝６１０−６３０ｎｍ）で検出した結果から得られるＦＲＥＴ強度のプロファイルを図１３に示した。その結果、秩序相（Ｌｏ、ラフト様相）と非秩序相（Ｌｄ、非ラフト様相）の平均的強度比は５．９±１．１であり、ＦＲＥＴ現象によりコントラストが強くなっていることが確認された。

［実施例４］赤血球の突起構造におけるＳＭクラスターの標識
大阪大学の診療所にて看護師により注射で血液を採取した。１ｍＬの血液を、４ｍＬ燐酸バッファ溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で懸濁し、遠心分離した。この操作を２回繰り返し、得られた赤血球１０μＬを９９０ｍＬのＰＢＳに懸濁した。これに、化合物５及び６のエタノール溶液（０．５ｍＭ）５μＬを加え、７分間室温でインキュベートした。赤血球膜に化合物５及び６を添加する方法は既知の方法（Mikhalyov, I. & Samsonov, A. Lipid raft detecting in membranes of live erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta 1808, 1930-9 (2011).）を参考にした。その後直ちに、１０倍量のＰＢＳで５回洗浄し、赤血球膜外にある化合物５及び６を完全に除いた。化合物５及び６が挿入された赤血球をＰＢＳで１％（ｖ／ｖ）以下になるように希釈した。この希釈溶液をカバーグラス（広さ２４ｍｍ×６０ｍｍ、厚さ０．１２−０．１７ｍｍ）に乗せ蛍光顕微鏡及び共焦点顕微鏡観察した。

λｅｘ＝５５９±２ｎｍ（１７８ｍＷ／ｃｍ^２）のレーザーで化合物６を励起しλｅｍ＝６１０−６３０ｎｍの発光を検出した蛍光顕微鏡観察の結果を図１５に示す。λｅｘ＝４７３±２ｎｍ（１７８ｍＷ／ｃｍ^２)のレーザーで化合物５を励起し、化合物６からの発光（λｅｍ＝６１０−６３０ｎｍ）を側方走査速度８μｓ／ｐｉｘで検出した共焦点顕微鏡観察（１０２４ｐｉｘ．×１０２４ｐｉｘ．）の結果を図１６に示す。図１５及び図１６の白い部分は、赤色蛍光部分を示す。なお、この領域で、化合物５と化合物６のクロストーク(発光波長の重複)が生じないことを確認した。共焦点顕微鏡像（１０２４ｐｉｘ．×１０２４ｐｉｘ．）は側方走査速度１００μｓ／ｐｉｘで共焦点顕微鏡像を取得した。通常の蛍光顕微鏡像にくらべ、ＦＲＥＴ法では長時間の露光が必要となるため比較的大きなバックグラウンド(デジタルノイズ)を被る。そのため、図１６にはそのバックグラウンドを差し引いた写真を示した。

図１５及び図１６において、コントラストが比較しやすいように、輝度はＳＭ−ｒｉｃｈ領域の明るさで規格化した(矢尻)。後者では前者では見られなかった新しいドメインが現れていることから（図１６矢印)、ＦＲＥＴを用いることでＳＭ−ｒｉｃｈ／ＳＭ−ｐｏｏｒ領域間でのコントラストが強調されていることがわかる。一方、これらの蛍光観察で得られたＳＭ−ｒｉｃｈ領域（〜１μｍ）は、通常知られているラフト（＜２００ｎｍ）よりも大きいことが確認された。

そこで、ここで得られたＳＭの凝集は赤血球上の突起（Ｅｃｈｉｎｏｃｙｔｅ）の形成に関与しているのではないかと考え、化合物５及び６の赤血球上の突起への取り込みについて調べた。より高濃度の化合物６を加えることで人工的に誘起させた赤血球上の突起の微分干渉顕微鏡像、化合物６の蛍光顕微鏡像をそれぞれ図１７、図１８に示す。図１８の白い部分は、赤色蛍光部分である。図１７及び図１８を重ね合わせた写真を図１９に示す（スケールバーは５μｍ）。これらの結果より化合物６が、赤血球上の突起に局在することがわかった。この結果はＳＭが赤血球上の突起に局在することを直接的に可視化した初めての例である。このことから、脂質の埋込みにより生じた膜曲率の変化が化合物６の凝集を引き起こしたと考えられる。

また、これまでの研究で、ラフトの主要成分であるＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄタンパク質は赤血球上の突起に局在し、赤血球上の突起を介して細胞間でのタンパク質のやりとりが行われることが示唆されていることを考慮すると、図１５〜１９の結果から、赤血球におけるタンパク質のやりとりにはＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄタンパク質だけではなくＳＭも関与していることが示唆される。タンパク質の選択ややりとりは、生体膜におけるラフトの代表的な機能の一つであることを考慮すると、興味深い結果である。

［実施例５］ＣＨＯ−Ｋ１細胞中における化合物６の拡散運動の経時変化
チャイニーズハムスター卵巣由来培養細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１細胞株）中における化合物６の拡散運動の経時変化をＳＦＭＴ法（１蛍光分子追跡法)で調べた。２分子の化合物６に注目した４ｍｓ／フレームの結果を図２０上欄に、２分子の化合物６の拡散運動の軌跡を図２０下欄に示す。図２０の結果から、当初独立にブラウン運動していた２分子の化合物６が９フレーム目で共局在し、その後、２９フレームまで共拡散を続けるが、３０フレーム目で共局在が解消されたことがわかった。ここで述べた共局在とは、化合物６が顕微鏡の分解能以下（＜２４０ｎｍ）の距離まで近接していることを意味する。また、この自由拡散、共拡散、自由拡散の繰り返しプロセスは他の化合物６でも観察された。

そこで、化合物６の共局在を定量的に評価するため、共局在の数を共局在時間の関数としてプロットした（図２１）。さらに、異なる分子間での共局在時間の差を明示するため、得られたヒストグラムを一次の指数関数でフィッティングすることにより見かけのダイマー寿命（緩和時間）を見積もった（図２１中の線）。その結果化合物６の見かけのダイマー寿命は５０ｍｓとなり、ラフトに親和性を持たないことが知られているＡＴＴＯ５９４−ＤＯＰＥのダイマー寿命（３４ｍｓ）（図２２）より、有意義に長いことを示す結果が得られた。おそらく、複数個の化合物６がラフト領域に取り込まれることで、その共局在が安定化されているのではないかと考えられる。この結果は生体膜内におけるＳＭの挙動を一分子レベルで可視化した初めての例である。

［実施例６］化合物６の赤血球ゴースト膜ラフト相への特異的分布の確認
赤血球ゴースト膜は、非特許文献（Tsuji, a, Kawasaki, K., Ohnishi, S., Merkle, H. & Kusumi, a. Regulation of band 3 mobilities in erythrocyte ghost membranes by protein association and cytoskeletal meshwork. Biochemistry 27, 7447-52 (1988).）に従い作製した。
すなわち、大阪大学の診療所にて看護師により注射で採取した５０μＬの血液を、４５０ｍＬ燐酸バッファ溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で懸濁し、遠心分離した。この操作を３回繰り返し、得られた赤血球を１ｍＬの５Ｐ８バッファ溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ Ｎａ_３ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４，及び２０ｍＭｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ（ｐＨ８．０））に懸濁し、２０分間氷冷下インキュベートした。次に、５Ｐ８バッファで懸濁し、遠心分離した。この操作を４回行った。

得られた赤血球ゴースト膜の溶液１０μＬを１ｍＬのＰＢＳバッファ（ｐＨ７．４）で懸濁した。続いて、これに化合物５と６およびＡＴＴＯ−ＤＯＰＥを、実施例４に記載した方法で添加した。これを適当量（約３μＬ）ｐｏｌｙ−Ｌｌｙｓｉｎｅでコートされたガラスに乗せた。
カバーガラスに固定した赤血球ゴースト膜に２００μＬの１％ＴＸ−１００（界面活性剤トリトンＸ−１００）を加え１５分間氷冷下インキュベートした。その後、ＰＢＳバッファで２回洗浄し、界面活性剤を取り除いた。

化合物６を赤血球ゴースト膜に添加した蛍光顕微鏡写真を図２３に、図２３の赤血球ゴースト膜を界面活性化剤ＴＸ−１００で処理後の蛍光顕微鏡写真を図２４に示した。化合物６は、界面活性化剤ＴＸ−１００で処理後も赤血球ゴースト膜に残っていることから、化合物６は、赤血球ゴースト膜のラフト相に選択的に移行していることが確認された。

［実施例７］化合物６のＣＨＯ−Ｋ１ゴースト膜又はＥＣＶ３０４ゴースト膜のラフト相への特異的分布の確認
赤血球の代わりに、ＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞）又はＥＣＶ３０４（ヒト膀胱がん由来細胞）を用いた以外は実施例６と同様の方法によりのゴースト膜を作製した。実施例６と同様の方法で化合物６の分布を調べた。

化合物６をＣＨＯ−Ｋ１ゴースト膜に添加した蛍光顕微鏡写真を図２５に、図２５のＣＨＯ−Ｋ１ゴースト膜を界面活性化剤ＴＸ−１００で処理後の蛍光顕微鏡写真を図２６に示した。化合物６は、界面活性化剤ＴＸ−１００で処理後もゴースト膜に残っていることから、化合物６は、ＣＨＯ−Ｋ１ゴースト膜のラフト相に選択的に移行していることが確認された。

化合物６をＥＣＶ３０４ゴースト膜に添加した蛍光顕微鏡写真を図２７に、図２７のＥＣＶ３０４ゴースト膜を界面活性化剤ＴＸ−１００で処理後の蛍光顕微鏡写真を図２８に示した。化合物６は、界面活性化剤ＴＸ−１００で処理後もＥＣＶ３０４ゴースト膜に残っていることから、化合物６は、ＥＣＶ３０４ゴースト膜のラフト相に選択的に移行していることが確認された。

上記結果から、化合物５及び化合物６は、脂質ラフト領域を選択的に標識することが確認できた。

［実施例８］赤血膜のタンパク質（ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ＣＤ５９）の存在領域の検出
ラフト特異的なタンパク質ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ＣＤ５９が凝集することが知られているエキノサイト(棘状赤血球)の棘（図３７の白い領域）において、化合物５がＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ＣＤ５９と共局在することを、共焦点レーザー顕微鏡を用いて調べた。

大阪大学の診療所にて看護師により注射で血液を採取した。５００μＬの血液を１０倍量のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄することで、赤血球を抽出した。抽出した赤血球５μＬを４５０μＬの緩衝液に懸濁することで１０倍希釈した。次に、１０μＬのＣｙ３−ＩｇＧ（Suzuki, K. G. N., Fujiwara, T. K., Sanematsu, F., Iino, R., Edidin, M., Kusumi, A. GPI-anchored receptor clusters transiently recruit Lyn and Galpha for temporary cluster immobilization and Lyn activation:single-molecule tracking study 1. J. Cell Biol. 177, 717-730 (2007) に記載の方法で作製）（１５０μｇ／ｍＬ）を希釈した赤血球懸濁液に加え、３７℃で１時間温置することで、ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ＣＤ５９を標識化した。次に、１μgの化合物５を含む２００μＬのＰＢＳ緩衝液を加え室温で７．５分放置した。その後、サンプルはＰＢＳ緩衝液で５回洗浄することにより、膜に取り込まれていない蛍光物質を除去した。最後に、赤血球にＰＢＳ緩衝液を加え、〜１％（ｖ／ｖ）に希釈した。試料はカバーガラス（２４ｍｍ×６０ｍｍ、厚さ０．１２ｍｍ〜０．１７ｍｍ）上に置き、共焦点顕微鏡観察を行った。採取した血液は３日以内に使用した。標識化は観察の直前に行った。

蛍光抗体Ｃｙ３−ＩｇＧで標識したＣＤ５９の分布を図３６に示した。図３６より、Ｃｙ３はエキノサイトの棘に凝集することを示す結果を得た。興味深いことに、化合物５も棘に凝集しており（図３７）、その分布はＣＤ５９と重複することがわかった（図３８）。

前記赤血球のエキノサイト初期における化合物５、Ｃｙ３−ＩｇＧで標識されたＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ＣＤ５９の分布を示す共焦点蛍光顕微鏡画像を、それぞれ図３９、４０に示した。微分干渉顕微鏡像を図４１に、図３９〜４１の重ねあわせを図４２に示した。
４７３±２ｎｍ（８．９μＷ／ｃｍ^２)のレーザーでＡＴＴＯ４８８、５５９±２ｎｍ（１２０μＷ／ｃｍ^２）のレーザーでＣｙ３を励起した。それぞれの発光は４８５−５１５ｎｍ及び５９０−６９０ｎｍで検出した。そのようなスペクトル領域においてＡＴＴＯ４８８とＣｙ３のクロストーク（励起光の波長の重複）は十分に小さい。１０μｓ／ｐｉｘでレーザーを走査することにより１０２４ｐｉｘ×１０２４ｐｉｘの画像を得た。それぞれの分布を明示するため、明るさとコントラストはＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで調整した。

エキノサイトが出来かけの状態においても、化合物５とＣｙ３−ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ＣＤ５９の共局在が観察できた。このことより、僅かな曲率の変化が引き金となり、ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ＣＤ５９とＳＭが〜１μＭサイズのラフト様領域を形成することが示唆される。

本発明の化合物は、脂質ラフト関連疾患の診断用マーカー及び診断用組成物、脂質ラフトの検出又は定量方法、脂質ラフトの検出又は定量用試薬を提供でき、産業上有用である。また、本発明は、赤血球上のラフト領域を可視化することができ、産業上有用である。さらに本発明は、ＳＦＭＴ（１蛍光分子追跡法）を使用してラフトにおけるＳＭの挙動及び一時的な捕捉を可視化することができ、産業上有用である。

Claims (6)

1. 下記式（１）
   （式（１）中、Ａは、ローダミン骨格を持ち、かつ２個以上の水溶性官能基を有する水溶性蛍光発色化合物の残基を示し、
   Ｂは−ＮＨ−であり、
   Ｅは
   であり、
   Ｒ _１ 及びＲ _２ はメチル基であり、
   Ｒ _３ 及びＲ _４ は水素原子であり、
   Ｘは８〜２０の整数であり、
   ｍは１３であり、
   ｎは１４〜２５の整数であり、
   下記式（２）
   で示される基は単結合又は二重結合である。）で表される化合物。
2. 請求項１に記載の化合物を含有する脂質ラフト可視化剤。
3. 請求項１に記載の化合物又は請求項２に記載の剤を含有する脂質ラフト関連疾患診断用マーカー。
4. 請求項１に記載の化合物又は請求項２に記載の剤を含有する脂質ラフト検出又は定量用試薬。
5. 脂質ラフト可視化剤製造のための請求項１に記載の化合物の使用。
6. 請求項１に記載の化合物と脂質ラフトを含む細胞とを混合する工程、及び、前記細胞に光を照射して蛍光を検出する工程を含有する脂質ラフト可視化方法。