KR101261791B1 - 생체 세포 내 알칼리 인산분해효소의 활성도 탐지를 위한 형광 프로브 - Google Patents
생체 세포 내 알칼리 인산분해효소의 활성도 탐지를 위한 형광 프로브 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 이미노쿠마린-벤조티아졸 형광 유도체의 새로운 센싱 메커니즘에 의해서 생체 내의 주요 여러 질병에 관련된 진단 물질로서 활용되는 알칼리 인산분해 효소(ALP)와 반응하는 형광 프로브를 개발함으로서 인산 분해효소를 정확하게 정량적으로 탐지해 낼 수 있으며, 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 세포 내 효소의 활성도를 광학적 영상을 통해서 구현할 수 있다. 또한, 인산 분해효소의 저해제로서 알려져 있는 p-브로모테트라미졸 및 레바미졸의 정량적인 검사에도 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 (E)-2-(2-(벤조[d]티아졸-2-일)-2-시아노비닐)-5-(다이에틸아미노)페닐 포스페이트 형광 유도체 또는 8-포스포릴-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라하이드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진 형광 유도체를 포함하는 생체 세포 내 알칼리 인산분해효소의 활성도 탐지를 위한 형광 프로브에 관한 것이다.
가수분해 및 다양한 종류의 일인산에스테르의 인산전이반응을 촉진하는 알칼리 인산분해 효소(Alkaline phosphatases(ALPS)는 포유동물의 조직에 널리 퍼져있는 동질 효소 군으로 구성된다((1) M. Syakalima et al.; Jpn. J. Vet. Res., 1998; 46: 3, (2) J. E. Coleman; Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.; 1992; 21: 441). 인간 유전자는 네 가지의 다른 ALP 효소 동질형상, 즉, 간, 골 및 신장을 포함하는 대부분의 조직에 퍼져있는 ALP 비특이적 조직 및 ALP 특이적 조직( 장, 태반, 및 조직 세포 ALP)을 암호화 한다(N. J. Fermandez and B. A. Kidney; Vet. Clin. Pathol.; 2007; 36: 223).
ALP 활성은 다양한 인간 질병, 골관련 질병(골아세포 골 암, Paget의 질병, 골연화증) 및 간 관련 질병( 암, 간염, 폐색성 황달)의 진단 지시제로 빈번하게 사용된다((1) D. Goltzman and D. Miao; Encyclopedia Endocr. Dis.; 2004; 1: 164, (2) K. Ooi et al., J. Clin. Lab. Anal.; 2007; 21: 133, (3) P. L. Wolf, J; Clin. Lab. Anal.; 1994; 8: 172; R. E. Gyurcsanyi et al., Analyst; 2002; 127: 235.). ALP에 대한 다양한 연구에도, 그것의 다양한 생리학적 및 병리학적 기능은 완전히 밝혀지지 않았다. 장내의 항상성의 유지 및 보호에 있어서 ALP 중추의 생물학적 기능은 최근에서야 밝혀지기 시작했다. 그러나, 발병했을 때의 ALP 활성 조절의 구체적인 메커니즘은 여전히 밝혀지지 않았다. 이것은 생명 시스템에서 ALP 활성의 실-시간 추적을 위한 적당한 프로브가 없기 때문이다. 따라서, ALP의 연구를 위해서는 적당한 세포 내에 반응하며 민감하고 생체적합성이 있는 프로브의 개발이 요구된다.
종래에는 몇가지 플루오레세인(fluorescein)- 및 쿠마린(coumarin)-기반이 되는 기질이 개발되었고, 마이크로플레이트(microplate)-기반 ALP 분석 및 ALP-대상 단백질 및 핵산을 포함하는 적용에 사용되었다((1) S. Berg, E. Luneberg and M. Frosch, Mol; Cell. Probes; 1996; 10: 7, (2) T. Hasegawa et al.; Bull. Chem. Soc. Jpn.; 2006; 79: 1211, (3) M. Kamiya et al.; Angew. Chem. Int. Ed., 2005; 44: 5439.). 이러한 형광 성질은 인산염 군의 효소적 분해의 결과로서 변화한다. 비록 이러한 형광 기질이 널리 사용되기는 하지만, 이것은 간세포에 있어서, ALP 활성의 혈소판의 측정 또는 현미경의 이미지를 위해서 좀처럼 적용되지 않았다.
이러한 종래의 많은 프로브들은, 수용성 가수 분해 생성물의 세포 밖으로의 분비 및 프로브의 높은 배경 형광으로 인해 낮은 신호대 잡음비 및 낮은 감광도를 나타낸다. 상업적으로 활용가능한, 최근의 이미 개발된 ALP 프로브 ELF-97은 불용성 생성물을 효소 분해에 의해서 생산한다. 따라서, 선행의 예들의 결점을 극복할 수 있다((1) I. Johnson and M. T. Z. Spence; The molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies; 2010: p. 203, (2) Z. Huang et al; Anal. Biochem.; 1992; 207: 32.). ELF-97의 가수분해 생성물의 신호는 그러나, 360nm의 단파장 발광에서 가장 시각화된다.
반면에, 공초점 레이저-주사 현미경 및 유세포 분석기는 장파장 488nm에서 주로 아르곤(Ar) 이온 레이저를 사용한다. 따라서, 실제 생체 세포 내에 광학적 영상을 위한 응용이 이루어지지 않고 있다는 문제점이 있다. 따라서 생리학적으로 관련된 조건에서 양립가능한, 고 신호대 잡음비를 가지는, ALP 측정을 위한 새로운 형광 프로브가 필요하다.
이에 본 발명자는, 생체 세포 내의 적용을 위하여 이미노쿠마린-벤조티아졸 형광 유도체를 채택하면 공초점 레이저-주사 현미경을 사용하기 위해서 필요한 488nm의 아르곤 이온 레이저를 사용할 수 있다는 것을 확인하였고, 이에 따라 제조된 형광 프로브는 생체 세포에서 ALP 활성을 관찰하는데 있어서 유용하게 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 이미노쿠마린-벤조티아졸 형광 유도체의 새로운 센싱 메커니즘에 의해서 생체 내의 주요 여러 질병에 관련된 진단 물질로서 활용되는 알칼리 인산분해 효소(ALP)와 반응하는 형광 프로브를 제공하기 위한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 인산기가 도입된 이미노쿠마린-벤조티아졸 형광 유도체를 제공한다.
[화학식 1]
상기 R1 및 R2는 독립적으로 C1 - 4알킬기이다. 바람직하게는 R1 및 R2는 에틸인 (E)-2-(2-(벤조[d]티아졸-2-일)-2-시아노비닐)-5-(다이에틸아미노)페닐 포스페이트 형광 유도체를 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 8-포스포릴-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라하이드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진 형광 유도체를 제공한다.
[화학식 2]
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 인산기가 도입된 이미노쿠마린-벤조티아졸 형광유도체, 상기 화학식 1로 표시되는 인산기가 도입된 이미노쿠마린-벤조티아졸 형광 유도체에서 R1 및 R2는 에틸인, (E)-2-(2-(벤조[d]티아졸-2-일)-2-시아노비닐)-5-(다이에틸아미노)페닐 포스페이트 형광 유도체 또는 상기 화학식 2로 표시되는 8-포스포릴-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라하이드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진 형광 유도체를 포함하는 형광 프로브를 제공한다.
본 발명의 형광 프로브는 인산분해효소의 활성을 탐지하는 것을 특징으로 한다. 상기 형광 유도체가 형광을 나타내는 메커니즘은 하기와 같다.
이미노쿠마린-벤조티아졸 형광 유도체에 단일 결합으로 연결된 인산기가 알칼리 인산분해효소와 선택적으로 반응함으로서 인산기의 절단이 유도되고, 절단된 후 남은 산소가 전자가 부족한 시아노기를 친핵성 공격반응을 일으키게 되어 높은 형광성질을 갖는 구조를 형성한다.
[반응식 1]
구체적으로 설명하면, 상기 반응식 1에서 (E)-2-(2-(벤조[d]티아졸-2-일)-2-시아노비닐)-5-(다이에틸아미노)페닐 포스페이트 형광 유도체(1) 및 8-포스포릴-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라하이드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진 형광 유도체(2)는 단일 결합을 많이 가지고 있어서 내부 결합 회전을 통해서 촉진되는 단일 기여 상태의 빠른 비-방사성 분해에 의해서 약한 형광을 나타낸다. 상기 형광 유도체(1) 및 (2)가 각각 인산분해효소와 반응하여 형광 유도체(1) 및 (2)에 있어서, P-O 결합의 분해를 기폭하고, 따라서 페놀 산소(phenol-oxygen)의 시아노기(-CN)로의 분자 내 친핵성 공격은 고리화된 이미노쿠마린-벤조티아졸 (9) 및 (10)을 각각 형성한다. 화합물 (9) 및 (10)은 불용성이고, 광여기에 대해서 고 방사성이다.
본 발명의 형광 프로브는 생체 세포내 적용을 위하여 상기 형광 유도체를 사용함으로서 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하기 위하여 필요한 488nm의 Ar 이온 레이저를 사용할 수 있다. 본 발명에서의 인산분해효소(akaline phosphatase)는 생체 세포 내에서 다양한 종류의 단일 인산기의 절단에 관련되어 있는 기본적인 촉매로서 그 활성도는, 뼈에 관련된 질병 뿐만 아니라 간에 관련된 질병 등 인간의 중요한 질병을 진단할 때 사용된다. 본 발명의 형광 프로브는 인산분해효소를 특이적으로 탐지해냄으로써 생체 세포 내 인산분해효소의 광학적인 영상을 얻을 수 있고 그 물질을 정량할 수 있다.
또한 본 발명의 형광 프로브는 p-브로모테트라미졸 및 레바미졸의 정량적 검사에도 활용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
[반응식 2]
본 발명의 제조방법은 상기 반응식 2로 나타낼 수 있으며, 구체적으로, 1) 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 염기 존재하에 다이에틸클로로포스페이트와 반응시켜 상기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 2) 상기 화학식 4로 표시되는 화합물을 피페리딘을 첨가하여 2-(벤조[d]티아졸-2-일)아세토니트릴과 반응시켜 상기 화학식 5로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및 3) 상기 화학식 5로 표시되는 화합물을 브로모트리메틸실레인과 반응시킨 후 염기를 추가하여 pH를 조절하는 하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 1)은 사용되는 염기로서 NaH, 피리딘, 트라이에틸아민, 2,6-루티딘 또는 K2CO3를 사용할 수 있으며, NaH를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 반응온도는 20℃~30℃인 것이 바람직하고, 반응 시간은 20~30시간으로 하는 것이 바람직하다. 반응용매로는 아르곤 환경 속에서 THF, DMF 또는 CH2Cl2 용매를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 단계 2)는 반응용매로는 에탄올 또는 메탄올 용매를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 단계 3)은 반응용매로는 이염화탄소 또는 클로로포름 용매를 사용하는 것이 바람직하다.
반응의 pH는 염기를 첨가하여 9 내지 10으로 조절하는 것이 바람직하다. 이 때 사용하는 염기는 NaOH를 사용하는 것이 바람직하다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 8-포스포릴-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라히드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진 형광 유도체의 제조방법을 제공한다.
[반응식 3]
본 발명의 제조방법은 상기 반응식 3으로 나타낼 수 있으며, 구체적으로, 1) 2,3,6,7-테트라하이드로-8-하이드록시-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-9-카르복스알데하이드를 염기 존재하에 다이에틸클로로포스페이트와 반응시켜 2,3,6,7-테트라하이드로-8-(다이에틸 포스포릴옥시)-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-9-카르복스알데하이드를 제조하는 단계; 2) 2,3,6,7-테트라하이드로-8-(다이에틸 포스포릴옥시)-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-9-카르복스알데하이드를 피페리딘을 첨가하여 2-(벤조[d]티아졸-2-일)아세토니트릴과 반응시켜 8-다이에틸포스포릴옥시-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라하이드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진을 제조하는 단계; 및 3) 8-다이에틸포스포릴옥시-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라하이드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진을 먼저 브로모트리메틸실레인과 반응시킨 후 염기를 추가하여 pH를 조절하는 하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 1)은 사용되는 염기로서 NaH, 피리딘, 트라이에틸아민, 2,6-루티딘 또는 K2CO3를 사용할 수 있으며, NaH를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 반응온도는 20℃~30 ℃인 것이 바람직하고, 반응 시간은 20~30시간으로 하는 것이 바람직하다. 반응용매로는 아르곤 환경 속에서 THF, DMF 또는 CH2Cl2 용매를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 단계 2)는 반응용매로는 에탄올, 메탄올 용매를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 단계 3)은 반응용매로는 이염화탄소, 클로로포름 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 반응의 pH는 염기를 첨가하여 9 내지 10으로 조절하는 것이 바람직하다. 이때 사용하는 염기는 NaOH를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 형광 유도체는 인산 분해효소와 반응하여 높은 형광특징을 지니는 구조로 변화할 수 있으므로, 이를 포함하는 형광 프로브는 인산 분해효소를 정확하게 정량적으로 탐지해 낼 수 있으며, 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 세포 내 효소의 활성도를 광학적 영상을 통해서 구현할 수 있다. 또한, 인산 분해효소의 저해제로서 알려져 있는 p-브로모테트라미졸 및 레바미졸의 정량적인 검사에도 활용할 수 있다.
하기의 용어 "프로브 1"은 (E)-2-(2-(벤조[d]티아졸-2-일)-2-시아노비닐)-5-(다이에틸아미노)페닐 포스페이트 형광 유도체를 포함하는 형광 프로브를 의미하고 "프로브 2"는 8-포스포릴-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라하이드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진 형광 유도체를 포함하는 형광 프로브를 의미한다.
도 1에서, 도 (a) 및 (b)는 37 ℃에 있어서 다양한 시간 간격 (0-40분)에서의 ALP(350 nM)로 처리한 프로브 1(10 μM)의 방출 스펙트럼(b) 및 흡수 스펙트럼(a)을 나타낸 것이다. 스펙트럼은 매 5분 마다 얻어진다.
도 (c)는 ALP로 처리하지 않은 프로브 1의 HPLC 크로마토그래피(맨 위); 37℃(중간)에 있어서 1시간 동안 ALP로 처리한 경우(중간); 화합물 9만의 HPLC 크로마토그래피(맨 아래)를 나타낸 것이다.
도 (d)는 UV 빛 (365 nm) 조명하에서 30분 동안 배양한 후의 37 ℃에서의 ALP (350 nM)가 존재하지 않을 때(왼쪽) 존재할 때 (오른쪽)의 프로브 1(10 μM)의 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 37 ℃에서 Tris HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4)에서의 다앙한 농도의 ALP(0-350 nM)에서의 프로브 1의 실시간 측정을 중심으로 하는 매 2분 간격으로 측정된(왼쪽) 525 nm에서의 형광 강도의 증가를 나타낸 것이다. ALP의 존재와 결여에 있어서 각각 F/F0 는 프로브 1의 형광 강도와 일치한다.
(오른쪽) p-BT 및 레바미솔에 의한 ALP 활성의 억제를 측정한 것이다. 억제제의 농도의 기능에 따른 프로브 1의 방출 강도를 나타낸 것이다. ALP는 10 μM 의 최종 농도에서 프로브 1의 첨가 전에 25 ℃에서 2분 동안 저해제와 함께 배양되었다. 37 ℃에서 2분 간의 배양 후에 525 nm의 방출 강도가 기록되었다(λex=460nm). 각각의 점은 세 번의 측정의 평균 값으로 얻어진다.
도 3은 간 세포 연구를 위한 ALP 프로브 1의 적용을 나타낸 것이다.
도 (a)는 2분 동안 (80×확대) 프로브 1로 배양된 대표적인 HeLa 세포 공초점 형광 이미지를 나타낸 것이다. 저해제 처리된 세포를 위해서, 프로브 1(10 μM)로 배양되기 전에 레바미졸(10 mM)이 15분 동안 선-배양되었다. 아래 줄: 이전된 빛 이미지는 상기 형광 이미지와 합쳐졌다. 왼쪽: 비염색된 대조군, 중간: 프로브 1로 처리된 세포. 오른쪽: 레바미졸 및 프로브 1로 처리된 세포. Ex. 488 nm, Em. 505-530nm.
도 (b)는 단일 세포 단계에 있어서 효소 활성의 저해제 및 HeLa 세포에 있어서 내생의 ALP 활성의 정량적인 분석을 위한 FACS 연구를 나타낸 것이다. Ex. 488 nm, Em. 515-545nm.
도 4 는 25 ℃에서 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 프로브 1의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기를 나타낸 것이다.
도 5는 25 ℃에서 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4) 에서 프로브 2의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기를 나타낸 것이다.
도 6은 25 ℃에서 0.5% DMSO를 공동용매로 포함하는 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 화합물 9의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기를 나타낸 것이다.
도 7은 25 ℃에서 0.5% DMSO를 공동용매로 포함하는 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 화합물 10의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기를 나타낸 것이다.
도 8은 25 ℃에서 0.5% DMSO를 공동용매로 포함하는 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 프로브 1(적색)의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기. [1] = [9] = 5 μM를 나타낸 것이다.
도 9는 25 ℃에서 0.5% DMSO를 공동용매로 포함하는 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 프로브 2(적색)의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기. [2] = [10] = 5 μM를 나타낸 것이다.
도 10은 25 ℃에서 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 프로브 1(검정색) 및 프로브 2(적색)의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기. [1] = [2] = 5 μM를 나타낸 것이다.
도 11은 25 ℃에서 0.5% DMSO를 공동용매로 포함하는 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 화합물 9(검정) 및 10(적색)의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기. [9] = [10] = 5 μM를 나타낸 것이다.
도 12는 25 ℃에서 공동용매로서 다양한 pH완충 시스템에서 프로브 1(10 μM)의 흡수(왼쪽) 및 방출(오른쪽) 스펙트럼. pH 3 및 pH 4에서 10 mM시트르산 완충용액; pH 5 및 pH 6에서 10 mM 소듐 아세테이트 완충용액; pH 7 및 pH 8에서 10 mM HEPES 완충용액; pH 9에서 10 mM 카보네이트 완충용액을 나타낸 것이다.
도 13은 25 ℃에서 공동용매로서 1% DMSO를 포함하는 다양한 pH완충 시스템에서 화합물 9의 (10 μM)의 흡수(왼쪽) 및 방출(오른쪽) 스펙트럼. pH 3 및 pH 4에서 10 mM시트르산 완충용액; pH 5 및 pH 6에서 10 mM 소듐 아세테이트 완충용액; pH 7 및 pH 8에서 10 mM HEPES 완충용액; pH 9에서 10 mM 카보네이트 완충용액을 나타낸 것이다.
도 14는 25 ℃에서 프로브 1의 형광 강도(적색) 및 화합물 9의 형광 강도 (청색)의 pH효과. [1] = [9] = 10 μM를 나타낸 것이다.
도 15는 37 ℃에서 10 mM Tris-HCl 완충용액 (pH = 7.4)에서 프로브 1의 화학적 안정도를 나타낸 것이다. 460 nm에서 여기. 스펙트럼은 매 2분마다 (0 - 30 분) 얻어진다. 내부 그림은 형광 강도 대 배양시간을 나타낸 것이다. 형광 강도는 542 nm에서 측정되었다.
도 16은 25 ℃에서 10 mM Tris-HCl 완충용액 (pH = 7.4, 1% DMSO)에서 화합물 9(10 μM)의 화학적 안정도를 나타낸 것이다. 460 nm에서 여기. 스펙트럼은 매 2분마다 (0 - 30분) 얻어진다. 내부 그림은 형광 강도 대 배양시간을 나타낸 것이다. 형광 강도는 529 nm에서 측정되었다.
도 17은 0.5% DMSO를 공동용매로서 포함하는 Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4, 25 ℃)에서 프로브 1-2 및 화합물 9-10의 광안정도를 나타낸 것이다. 방출 시간이 지남에 따라 남아있는 형광 방출 강도를 나타낸 것이다. 460 nm에서 방사. [1] = [2] = [9] = [10] = 10 μM.
도 18은 다양한 완충 시스템 37 ℃에서 ALP (350 nM)로 배양한 프로브 1(10 μM)의 형광 강도를 나타낸 것이다. 460 nm에서 여기되고, 형광강도는 525 nm에서 측정되었다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30분) 얻어졌다. A: Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4), B: HEPES 완충용액 (10 mM, pH 7.4), C: Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4, 2 mM MgCl2), D: PBS 완충용액 (10 mM, pH 7.4).
도 19는 다양한 pH조건에서 10 mM Tris-HCl 완충용액 37 ℃에서 ALP (350 nM)에 의한 배양에 의한 프로브 1 (10 μM)의 형광 반응을 나타낸 것이다. 460 nm에서 여기. 형광 강도는 525 nm에서 측정되고, 스페트럼은 매 2분 마다 (0 - 30 분) 얻어졌다.
도 20은 Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 다양한 ALP의 양에 따른 프로브 1(10 μM)의 형광 반응을 나타낸 것이다. 460 nm에서 여기되고, 형광 강도는 525nm에서 측정되었다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30분) 얻어졌다.
도 21은 Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH = 7.4, 37℃)에서 ALP의 양의 기능에 따른 프로브 1(10 μM)의 형광 강도의 증가를 나타낸 것이다. 배양 시간: 2분. 460 nm에서 여기. 형광 강도는 525 nm에서 측정되었다.
도 22는 Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 다양한 ALP의 양에 따른 배양에 의한 프로브 2(10 μM)의 형광 반응을 나타낸 것이다. 460 nm에서 여기. 형광 강도는 540 nm에서 측정되었다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30분) 얻어졌다.
도 23은 10 mM Tris-HCl (10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 과량의 ALP와 함께 다른 농도에서 프로브 1의 표준 형광 커브를 나타낸 것이다.
도 24는 ALP에 의한 프로브 1의 촉매적 가수분해. (a) Tris-HCl buffer (10 mM, pH 7.4, 37 ℃)에서 ALP (50 nM)로 배양하여 (0.1 - 25 μM)의 단계적 농도에서 프로브 1의 가수분해의 단계적 커브를 나타낸 것이다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30분) 얻어졌다. 형광 강도는 460 nm에서 여기되고 525 nm에서 측정되었다. (b) ALP에 의한 프로브 1의 가수분해의 최초 속도 v0 대 프로브 1의 농도의 그래프를 나타낸 것이다. 내부 그림은 이중 역 함수(Lineweaver-Burk)를 나타낸다.
도 25는 10 mM Tris-HCl (10 mM, pH = 9.0, 37 ℃)에서 과량의 ALP와 함께 다른 농도에서 프로브 1의 표준 형광 커브를 나타낸 것이다. 525 nm에서 형광 강도가 측정되었다. 460 nm에서 여기.
도 26은 ALP에 의한 프로브 1의 촉매적 가수분해. (왼쪽) Tris-HCl buffer (10 mM, pH 9.0, 37 ℃)에서 ALP (50 nM)로 배양하여 0.1 - 25 μM의 단계적 농도에서 프로브 1의 가수분해의 단계적 커브를 나타낸 것이다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30분) 얻어졌다. 형광 강도는 460 nm에서 여기되고 525 nm에서 측정되었다. (오른쪽) ALP에 의한 프로브 1의 가수분해의 최초 속도 v0 대 프로브 1의 농도의 그래프를 나타낸 것이다. 내부 그림은 이중 역 함수(Lineweaver-Burk)를 나타낸다.
도 27은 10 mM Tris-HCl (10 mM, pH = 9.0, 37 ℃)에서 과량의 ALP와 함께 다른 농도에서 프로브 2의 표준 형광 커브를 나타낸 것이다. 540 nm에서 형광 강도가 측정되었다. 460 nm에서 여기.
도 28은 ALP에 의한 프로브 2의 촉매적 가수분해. (왼쪽) Tris-HCl buffer (10 mM, pH 9.0, 37 ℃)에서 ALP (50 nM)로 배양하여 0.1 - 25 μM의 단계적 농도에서 프로브 2의 가수분해의 단계적 커브를 나타낸 것이다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30분) 얻어졌다. 형광 강도는 460 nm에서 여기되고 540 nm에서 측정되었다. (오른쪽) ALP에 의한 프로브 2의 가수분해의 최초 속도 v0 대 프로브 2의 농도의 그래프를 나타낸 것이다. 내부 그림은 이중 역 함수(Lineweaver-Burk)를 나타낸다.
도 29는 10 mM Tris-HCl (10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 과량의 ALP와 함께 다른 농도에서 4-MUP의 표준 형광 커브를 나타낸 것이다. 440 nm에서 형광 강도가 측정되었다. 360 nm에서 여기.
도 30은 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 다양한 양의 ALP(0 부터 350 nM)로 배양한 4-MUP (10 μM)의 형광 반응을 나타낸 것이다. 360 nm에서 여기. 440 nm에서 형광강도가 측정되었다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30 분) 얻어졌다.
도 31은 ALP에 의한 4-MUP의 촉매적 가수분해를 나타낸 것이다. (a) Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 9.0, 37 ℃)에서 ALP (50 nM)로 배양하여 0.1 - 25 μM의 단계적 농도에서 4-MUP의 가수분해의 단계적 커브를 나타낸 것이다. 스펙트럼은 매 2 분 마다(0 - 30분) 얻어졌다. 형광 강도는 360 nm에서 여기되고 440 nm에서 측정되었다. (b) ALP에 의한 4-MUP의 가수분해의 최초 속도 v0 대 4-MUP의 농도 그래프를 나타낸 것이다. 내부 그림은 이중 역 함수(Lineweaver-Burk)를 나타낸다.
도 32는 10 mM Tris-HCl (10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 과량의 ALP와 함께 다른 농도에서 ELF-97의 표준 형광 커브를 나타낸 것이다. 530 nm에서 형광 강도가 측정되었다. 345 nm에서 여기.
도 33은 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 다양한 양의 ALP(0 부터 350 nM)로 배양한 ELF-97 (10 μM)의 형광 반응을 나타낸 것이다. 345 nm에서 여기. 530 nm에서 형광강도가 측정되었다. 스펙트럼은 매 2초 마다(0 - 30 초) 얻어졌다.
도 34는 ALP에 의한 ELF-97의 촉매적 가수분해를 나타낸 것이다. (a) Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 9.0, 37 ℃)에서 ALP (50 nM)로 배양하여 (0.25 - 25 μM)의 단계적 농도에서 ELF-97의 가수분해의 단계적 커브를 나타낸 것이다. 스펙트럼은 매 20 초 마다(0 - 300 초) 얻어졌다. 형광 강도는 345 nm에서 여기되고 530 nm에서 측정되었다. (b) ALP에 의한 ELF-97의 가수분해의 최초 속도 v0 대 ELF-97의 농도의 그래프를 나타낸 것이다. 내부 그림은 이중 역 함수(Lineweaver-Burk)를 나타낸다.
도 35는 Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4, 37 ℃)에 있어서 프로브 1을 사용하여 ALP 활성의 저해제 검사를 나타낸 것이다. ALP 용액의 첨가 후에 프로브 1(10 μM)의 역학적 프로파일은 (a) 다양한 농도 (0-1000 μM)에서 p-BT 및 (b) 다양한 농도(0- 5000 μM)에서 레바미졸로 선처리되었다. 460 nm에서 여기. 525 nm에서 형광 강도는 매 2분 마다 기록되었다.
도 36은 2분 시점에서 ALP의 상대적인 활성 대 p-BT 및 레바미졸의 농도를 나타낸 것이다. [ALP] = 350 nM. p-BT의 36 μM 및 레바미졸의 75 μM로서 IC50값이 측정되었다.
도 37은 ALP 처리가 없는 프로브 1의 HPLC 크로마토그래피 (위) 1시간 동안 ALP 처리한 프로브 1의 HPLC 크로마토그래피 (중간) 화합물 9의 HPLC 크로마토그래피(아래)를 나타낸 것이다. 샘플은 직선 구배 용출법에 의한 LC-MS에 의해서 분석되었다. (0 부터 50% B, A: 1%의 포름산으로 비이온화된 물, B: 아세토나이트릴, 유속 0.3 mL/min, UV: 340 nm). 5.5분에서 체류시간의 MW는 430.1, 이것은 프로브 1의 [M+H]+와 일치한다. 그리고 3.4분에서 체류시간의 MW는 350.1, 이것은 화합물 9의 [M+H]+와 일치한다. [1] = [9] = 10 μM, [ALP] = 350 nM.
도 38은 효소 처리 없이 프로브 1의 ESI-MS 스펙트럼 (a), 1시간 동안 ALP 로 처리한 후의 프로브 1의 ESI-MS 스펙트럼 (b), 화합물 9의 스펙트럼 (c)을 나타낸 것이다. 5.5분에서 체류시간의 MW는 프로브 1의 [M+H]+와 일치한다. 그리고 3.4분에서 체류시간의 MW는 350.1이고, 이것은 화합물 9의 [M+H]+ 와 일치한다. [1] = [9] = 10 μM, [ALP] = 350 nM.
도 39는 2, 5 및 10 분 동안 각각 (배율: 80×) 프로브 1로 처리한 HeLa세포의 공초점 형광 이미지를 나타낸 것이다. 이러한 샘플의 이미지 획득 조건은 형광 시그널의 포화를 피하기 위해서 그리고, 샘플 사이의 형광 발생의 질적인 비교를 위해서 10분 동안 처리된 세포에 적용되었다. Ex. 488 nm, Em. 505~530 nm.
도 40은 HeLa 세포에서 ALP 활성의 세포 독성 검사의 흐름을 나타낸 것이다(Ex. 488 nm, Em. 515~545 nm). 프로브 1의 다양한 처리 시간의 샘플에 대한 형광 강도 vs. 세포 수의 히스토그램을 나타낸 것이다. 검은 선: 비염색된 대조 세포, 빨간 선: 저해제 및 프로브 1로 처리된 세포, 초록 선: 2, 5 또는 10 분 동안 프로브 1로 처리된 세포. (b) 샘플의 Geo 평균 형광 강도를 요약한 그래프. 4×105 세포를 12개의 웰 플레이트 심었다 그리고 나서, 각각 2, 5, 10분 동안 10 μM 프로브 1로 처리하였다. 검사 저해를 위해서, 10 mM 레바미졸을 프로브 1에 첨가하기 전에 15분 동안 선처리하였다.
도 41은 ALP-음성 대조 세포 연구를 나타낸 것이다. (a) 30분 동안 (배율: 80×) 프로브 1로 배양된 살아있는 HT-29 세포의 대표적인 공초점 형광 이미지. Ex. 488 nm, Em. 505-530 nm. (b) HT-29세포에서 ALP 활성의 FACS 연구. Ex. 488 nm, Em. 515-545 nm. (c) HeLa 및 HT-29 세포에 ALP 표현의 웨스턴 블롯 분석.
도 42는 다양한 농도에서의 5 분 (■) 또는 10 분 (□) 동안 프로브 1로 처리된 HeLa 세포의 세포 활성도를 나타낸 것이다. 중간-처리된 대조 군과 비교하여 세포 활성도에 있어서 통계학적으로 중요한 차이는 별표(*p < 0.05)로서 표시된다. 5분 동안의 처리 후에 50 μM의 농도까지 프로브 1로 처리된 HeLa 세포의 관측에 있어서 세포독성 효과는 관측되지 않았고, 10분간의 배양 동안 동일한 농도에서 87.5%의 세포가 살아남았다.
도 43은 다양한 시간 간격 동안 10 μM 프로브 1로 처리한 HeLa 세포의 세포 활성도를 나타낸 것이다. 1시간 동안 프로브 1로 배양된 세포에서는 어떠한 세포 독성 효과도 관찰되지 않았고 4시간 동안의 처리 후에 92.8%의 세포가 생존하였다. 24시간 동안 세포를 처리하였을 때, 세포 생존도는 28.7%로 감소하였다. 중간-처리된 대조군과 비교하여 세포의 생존도에 있어서 통계학적으로 중요한 차이가 별표로 표시된다(*p < 0.05, **p < 0.01).
도 44는 프로브 1 처리된 농도에 따른 세포 활성도를 나타낸 것이다. 세포 활성도는 프로브 1을 24시간 동안 HT-29 세포로 처리하여 측정된다. 24시간 동안 처리하더라도 50 μM 농도까지 세포 독성이 관찰되지 않았다.
도 1에서, 도 (a) 및 (b)는 37 ℃에 있어서 다양한 시간 간격 (0-40분)에서의 ALP(350 nM)로 처리한 프로브 1(10 μM)의 방출 스펙트럼(b) 및 흡수 스펙트럼(a)을 나타낸 것이다. 스펙트럼은 매 5분 마다 얻어진다.
도 (c)는 ALP로 처리하지 않은 프로브 1의 HPLC 크로마토그래피(맨 위); 37℃(중간)에 있어서 1시간 동안 ALP로 처리한 경우(중간); 화합물 9만의 HPLC 크로마토그래피(맨 아래)를 나타낸 것이다.
도 (d)는 UV 빛 (365 nm) 조명하에서 30분 동안 배양한 후의 37 ℃에서의 ALP (350 nM)가 존재하지 않을 때(왼쪽) 존재할 때 (오른쪽)의 프로브 1(10 μM)의 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 37 ℃에서 Tris HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4)에서의 다앙한 농도의 ALP(0-350 nM)에서의 프로브 1의 실시간 측정을 중심으로 하는 매 2분 간격으로 측정된(왼쪽) 525 nm에서의 형광 강도의 증가를 나타낸 것이다. ALP의 존재와 결여에 있어서 각각 F/F0 는 프로브 1의 형광 강도와 일치한다.
(오른쪽) p-BT 및 레바미솔에 의한 ALP 활성의 억제를 측정한 것이다. 억제제의 농도의 기능에 따른 프로브 1의 방출 강도를 나타낸 것이다. ALP는 10 μM 의 최종 농도에서 프로브 1의 첨가 전에 25 ℃에서 2분 동안 저해제와 함께 배양되었다. 37 ℃에서 2분 간의 배양 후에 525 nm의 방출 강도가 기록되었다(λex=460nm). 각각의 점은 세 번의 측정의 평균 값으로 얻어진다.
도 3은 간 세포 연구를 위한 ALP 프로브 1의 적용을 나타낸 것이다.
도 (a)는 2분 동안 (80×확대) 프로브 1로 배양된 대표적인 HeLa 세포 공초점 형광 이미지를 나타낸 것이다. 저해제 처리된 세포를 위해서, 프로브 1(10 μM)로 배양되기 전에 레바미졸(10 mM)이 15분 동안 선-배양되었다. 아래 줄: 이전된 빛 이미지는 상기 형광 이미지와 합쳐졌다. 왼쪽: 비염색된 대조군, 중간: 프로브 1로 처리된 세포. 오른쪽: 레바미졸 및 프로브 1로 처리된 세포. Ex. 488 nm, Em. 505-530nm.
도 (b)는 단일 세포 단계에 있어서 효소 활성의 저해제 및 HeLa 세포에 있어서 내생의 ALP 활성의 정량적인 분석을 위한 FACS 연구를 나타낸 것이다. Ex. 488 nm, Em. 515-545nm.
도 4 는 25 ℃에서 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 프로브 1의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기를 나타낸 것이다.
도 5는 25 ℃에서 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4) 에서 프로브 2의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기를 나타낸 것이다.
도 6은 25 ℃에서 0.5% DMSO를 공동용매로 포함하는 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 화합물 9의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기를 나타낸 것이다.
도 7은 25 ℃에서 0.5% DMSO를 공동용매로 포함하는 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 화합물 10의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기를 나타낸 것이다.
도 8은 25 ℃에서 0.5% DMSO를 공동용매로 포함하는 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 프로브 1(적색)의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기. [1] = [9] = 5 μM를 나타낸 것이다.
도 9는 25 ℃에서 0.5% DMSO를 공동용매로 포함하는 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 프로브 2(적색)의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기. [2] = [10] = 5 μM를 나타낸 것이다.
도 10은 25 ℃에서 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 프로브 1(검정색) 및 프로브 2(적색)의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기. [1] = [2] = 5 μM를 나타낸 것이다.
도 11은 25 ℃에서 0.5% DMSO를 공동용매로 포함하는 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 화합물 9(검정) 및 10(적색)의 흡수(점선) 및 방출(직선)스펙트럼. 460 nm에서 여기. [9] = [10] = 5 μM를 나타낸 것이다.
도 12는 25 ℃에서 공동용매로서 다양한 pH완충 시스템에서 프로브 1(10 μM)의 흡수(왼쪽) 및 방출(오른쪽) 스펙트럼. pH 3 및 pH 4에서 10 mM시트르산 완충용액; pH 5 및 pH 6에서 10 mM 소듐 아세테이트 완충용액; pH 7 및 pH 8에서 10 mM HEPES 완충용액; pH 9에서 10 mM 카보네이트 완충용액을 나타낸 것이다.
도 13은 25 ℃에서 공동용매로서 1% DMSO를 포함하는 다양한 pH완충 시스템에서 화합물 9의 (10 μM)의 흡수(왼쪽) 및 방출(오른쪽) 스펙트럼. pH 3 및 pH 4에서 10 mM시트르산 완충용액; pH 5 및 pH 6에서 10 mM 소듐 아세테이트 완충용액; pH 7 및 pH 8에서 10 mM HEPES 완충용액; pH 9에서 10 mM 카보네이트 완충용액을 나타낸 것이다.
도 14는 25 ℃에서 프로브 1의 형광 강도(적색) 및 화합물 9의 형광 강도 (청색)의 pH효과. [1] = [9] = 10 μM를 나타낸 것이다.
도 15는 37 ℃에서 10 mM Tris-HCl 완충용액 (pH = 7.4)에서 프로브 1의 화학적 안정도를 나타낸 것이다. 460 nm에서 여기. 스펙트럼은 매 2분마다 (0 - 30 분) 얻어진다. 내부 그림은 형광 강도 대 배양시간을 나타낸 것이다. 형광 강도는 542 nm에서 측정되었다.
도 16은 25 ℃에서 10 mM Tris-HCl 완충용액 (pH = 7.4, 1% DMSO)에서 화합물 9(10 μM)의 화학적 안정도를 나타낸 것이다. 460 nm에서 여기. 스펙트럼은 매 2분마다 (0 - 30분) 얻어진다. 내부 그림은 형광 강도 대 배양시간을 나타낸 것이다. 형광 강도는 529 nm에서 측정되었다.
도 17은 0.5% DMSO를 공동용매로서 포함하는 Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4, 25 ℃)에서 프로브 1-2 및 화합물 9-10의 광안정도를 나타낸 것이다. 방출 시간이 지남에 따라 남아있는 형광 방출 강도를 나타낸 것이다. 460 nm에서 방사. [1] = [2] = [9] = [10] = 10 μM.
도 18은 다양한 완충 시스템 37 ℃에서 ALP (350 nM)로 배양한 프로브 1(10 μM)의 형광 강도를 나타낸 것이다. 460 nm에서 여기되고, 형광강도는 525 nm에서 측정되었다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30분) 얻어졌다. A: Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4), B: HEPES 완충용액 (10 mM, pH 7.4), C: Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4, 2 mM MgCl2), D: PBS 완충용액 (10 mM, pH 7.4).
도 19는 다양한 pH조건에서 10 mM Tris-HCl 완충용액 37 ℃에서 ALP (350 nM)에 의한 배양에 의한 프로브 1 (10 μM)의 형광 반응을 나타낸 것이다. 460 nm에서 여기. 형광 강도는 525 nm에서 측정되고, 스페트럼은 매 2분 마다 (0 - 30 분) 얻어졌다.
도 20은 Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 다양한 ALP의 양에 따른 프로브 1(10 μM)의 형광 반응을 나타낸 것이다. 460 nm에서 여기되고, 형광 강도는 525nm에서 측정되었다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30분) 얻어졌다.
도 21은 Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH = 7.4, 37℃)에서 ALP의 양의 기능에 따른 프로브 1(10 μM)의 형광 강도의 증가를 나타낸 것이다. 배양 시간: 2분. 460 nm에서 여기. 형광 강도는 525 nm에서 측정되었다.
도 22는 Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 다양한 ALP의 양에 따른 배양에 의한 프로브 2(10 μM)의 형광 반응을 나타낸 것이다. 460 nm에서 여기. 형광 강도는 540 nm에서 측정되었다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30분) 얻어졌다.
도 23은 10 mM Tris-HCl (10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 과량의 ALP와 함께 다른 농도에서 프로브 1의 표준 형광 커브를 나타낸 것이다.
도 24는 ALP에 의한 프로브 1의 촉매적 가수분해. (a) Tris-HCl buffer (10 mM, pH 7.4, 37 ℃)에서 ALP (50 nM)로 배양하여 (0.1 - 25 μM)의 단계적 농도에서 프로브 1의 가수분해의 단계적 커브를 나타낸 것이다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30분) 얻어졌다. 형광 강도는 460 nm에서 여기되고 525 nm에서 측정되었다. (b) ALP에 의한 프로브 1의 가수분해의 최초 속도 v0 대 프로브 1의 농도의 그래프를 나타낸 것이다. 내부 그림은 이중 역 함수(Lineweaver-Burk)를 나타낸다.
도 25는 10 mM Tris-HCl (10 mM, pH = 9.0, 37 ℃)에서 과량의 ALP와 함께 다른 농도에서 프로브 1의 표준 형광 커브를 나타낸 것이다. 525 nm에서 형광 강도가 측정되었다. 460 nm에서 여기.
도 26은 ALP에 의한 프로브 1의 촉매적 가수분해. (왼쪽) Tris-HCl buffer (10 mM, pH 9.0, 37 ℃)에서 ALP (50 nM)로 배양하여 0.1 - 25 μM의 단계적 농도에서 프로브 1의 가수분해의 단계적 커브를 나타낸 것이다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30분) 얻어졌다. 형광 강도는 460 nm에서 여기되고 525 nm에서 측정되었다. (오른쪽) ALP에 의한 프로브 1의 가수분해의 최초 속도 v0 대 프로브 1의 농도의 그래프를 나타낸 것이다. 내부 그림은 이중 역 함수(Lineweaver-Burk)를 나타낸다.
도 27은 10 mM Tris-HCl (10 mM, pH = 9.0, 37 ℃)에서 과량의 ALP와 함께 다른 농도에서 프로브 2의 표준 형광 커브를 나타낸 것이다. 540 nm에서 형광 강도가 측정되었다. 460 nm에서 여기.
도 28은 ALP에 의한 프로브 2의 촉매적 가수분해. (왼쪽) Tris-HCl buffer (10 mM, pH 9.0, 37 ℃)에서 ALP (50 nM)로 배양하여 0.1 - 25 μM의 단계적 농도에서 프로브 2의 가수분해의 단계적 커브를 나타낸 것이다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30분) 얻어졌다. 형광 강도는 460 nm에서 여기되고 540 nm에서 측정되었다. (오른쪽) ALP에 의한 프로브 2의 가수분해의 최초 속도 v0 대 프로브 2의 농도의 그래프를 나타낸 것이다. 내부 그림은 이중 역 함수(Lineweaver-Burk)를 나타낸다.
도 29는 10 mM Tris-HCl (10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 과량의 ALP와 함께 다른 농도에서 4-MUP의 표준 형광 커브를 나타낸 것이다. 440 nm에서 형광 강도가 측정되었다. 360 nm에서 여기.
도 30은 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 다양한 양의 ALP(0 부터 350 nM)로 배양한 4-MUP (10 μM)의 형광 반응을 나타낸 것이다. 360 nm에서 여기. 440 nm에서 형광강도가 측정되었다. 스펙트럼은 매 2분 마다(0 - 30 분) 얻어졌다.
도 31은 ALP에 의한 4-MUP의 촉매적 가수분해를 나타낸 것이다. (a) Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 9.0, 37 ℃)에서 ALP (50 nM)로 배양하여 0.1 - 25 μM의 단계적 농도에서 4-MUP의 가수분해의 단계적 커브를 나타낸 것이다. 스펙트럼은 매 2 분 마다(0 - 30분) 얻어졌다. 형광 강도는 360 nm에서 여기되고 440 nm에서 측정되었다. (b) ALP에 의한 4-MUP의 가수분해의 최초 속도 v0 대 4-MUP의 농도 그래프를 나타낸 것이다. 내부 그림은 이중 역 함수(Lineweaver-Burk)를 나타낸다.
도 32는 10 mM Tris-HCl (10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 과량의 ALP와 함께 다른 농도에서 ELF-97의 표준 형광 커브를 나타낸 것이다. 530 nm에서 형광 강도가 측정되었다. 345 nm에서 여기.
도 33은 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH = 7.4, 37 ℃)에서 다양한 양의 ALP(0 부터 350 nM)로 배양한 ELF-97 (10 μM)의 형광 반응을 나타낸 것이다. 345 nm에서 여기. 530 nm에서 형광강도가 측정되었다. 스펙트럼은 매 2초 마다(0 - 30 초) 얻어졌다.
도 34는 ALP에 의한 ELF-97의 촉매적 가수분해를 나타낸 것이다. (a) Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 9.0, 37 ℃)에서 ALP (50 nM)로 배양하여 (0.25 - 25 μM)의 단계적 농도에서 ELF-97의 가수분해의 단계적 커브를 나타낸 것이다. 스펙트럼은 매 20 초 마다(0 - 300 초) 얻어졌다. 형광 강도는 345 nm에서 여기되고 530 nm에서 측정되었다. (b) ALP에 의한 ELF-97의 가수분해의 최초 속도 v0 대 ELF-97의 농도의 그래프를 나타낸 것이다. 내부 그림은 이중 역 함수(Lineweaver-Burk)를 나타낸다.
도 35는 Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4, 37 ℃)에 있어서 프로브 1을 사용하여 ALP 활성의 저해제 검사를 나타낸 것이다. ALP 용액의 첨가 후에 프로브 1(10 μM)의 역학적 프로파일은 (a) 다양한 농도 (0-1000 μM)에서 p-BT 및 (b) 다양한 농도(0- 5000 μM)에서 레바미졸로 선처리되었다. 460 nm에서 여기. 525 nm에서 형광 강도는 매 2분 마다 기록되었다.
도 36은 2분 시점에서 ALP의 상대적인 활성 대 p-BT 및 레바미졸의 농도를 나타낸 것이다. [ALP] = 350 nM. p-BT의 36 μM 및 레바미졸의 75 μM로서 IC50값이 측정되었다.
도 37은 ALP 처리가 없는 프로브 1의 HPLC 크로마토그래피 (위) 1시간 동안 ALP 처리한 프로브 1의 HPLC 크로마토그래피 (중간) 화합물 9의 HPLC 크로마토그래피(아래)를 나타낸 것이다. 샘플은 직선 구배 용출법에 의한 LC-MS에 의해서 분석되었다. (0 부터 50% B, A: 1%의 포름산으로 비이온화된 물, B: 아세토나이트릴, 유속 0.3 mL/min, UV: 340 nm). 5.5분에서 체류시간의 MW는 430.1, 이것은 프로브 1의 [M+H]+와 일치한다. 그리고 3.4분에서 체류시간의 MW는 350.1, 이것은 화합물 9의 [M+H]+와 일치한다. [1] = [9] = 10 μM, [ALP] = 350 nM.
도 38은 효소 처리 없이 프로브 1의 ESI-MS 스펙트럼 (a), 1시간 동안 ALP 로 처리한 후의 프로브 1의 ESI-MS 스펙트럼 (b), 화합물 9의 스펙트럼 (c)을 나타낸 것이다. 5.5분에서 체류시간의 MW는 프로브 1의 [M+H]+와 일치한다. 그리고 3.4분에서 체류시간의 MW는 350.1이고, 이것은 화합물 9의 [M+H]+ 와 일치한다. [1] = [9] = 10 μM, [ALP] = 350 nM.
도 39는 2, 5 및 10 분 동안 각각 (배율: 80×) 프로브 1로 처리한 HeLa세포의 공초점 형광 이미지를 나타낸 것이다. 이러한 샘플의 이미지 획득 조건은 형광 시그널의 포화를 피하기 위해서 그리고, 샘플 사이의 형광 발생의 질적인 비교를 위해서 10분 동안 처리된 세포에 적용되었다. Ex. 488 nm, Em. 505~530 nm.
도 40은 HeLa 세포에서 ALP 활성의 세포 독성 검사의 흐름을 나타낸 것이다(Ex. 488 nm, Em. 515~545 nm). 프로브 1의 다양한 처리 시간의 샘플에 대한 형광 강도 vs. 세포 수의 히스토그램을 나타낸 것이다. 검은 선: 비염색된 대조 세포, 빨간 선: 저해제 및 프로브 1로 처리된 세포, 초록 선: 2, 5 또는 10 분 동안 프로브 1로 처리된 세포. (b) 샘플의 Geo 평균 형광 강도를 요약한 그래프. 4×105 세포를 12개의 웰 플레이트 심었다 그리고 나서, 각각 2, 5, 10분 동안 10 μM 프로브 1로 처리하였다. 검사 저해를 위해서, 10 mM 레바미졸을 프로브 1에 첨가하기 전에 15분 동안 선처리하였다.
도 41은 ALP-음성 대조 세포 연구를 나타낸 것이다. (a) 30분 동안 (배율: 80×) 프로브 1로 배양된 살아있는 HT-29 세포의 대표적인 공초점 형광 이미지. Ex. 488 nm, Em. 505-530 nm. (b) HT-29세포에서 ALP 활성의 FACS 연구. Ex. 488 nm, Em. 515-545 nm. (c) HeLa 및 HT-29 세포에 ALP 표현의 웨스턴 블롯 분석.
도 42는 다양한 농도에서의 5 분 (■) 또는 10 분 (□) 동안 프로브 1로 처리된 HeLa 세포의 세포 활성도를 나타낸 것이다. 중간-처리된 대조 군과 비교하여 세포 활성도에 있어서 통계학적으로 중요한 차이는 별표(*p < 0.05)로서 표시된다. 5분 동안의 처리 후에 50 μM의 농도까지 프로브 1로 처리된 HeLa 세포의 관측에 있어서 세포독성 효과는 관측되지 않았고, 10분간의 배양 동안 동일한 농도에서 87.5%의 세포가 살아남았다.
도 43은 다양한 시간 간격 동안 10 μM 프로브 1로 처리한 HeLa 세포의 세포 활성도를 나타낸 것이다. 1시간 동안 프로브 1로 배양된 세포에서는 어떠한 세포 독성 효과도 관찰되지 않았고 4시간 동안의 처리 후에 92.8%의 세포가 생존하였다. 24시간 동안 세포를 처리하였을 때, 세포 생존도는 28.7%로 감소하였다. 중간-처리된 대조군과 비교하여 세포의 생존도에 있어서 통계학적으로 중요한 차이가 별표로 표시된다(*p < 0.05, **p < 0.01).
도 44는 프로브 1 처리된 농도에 따른 세포 활성도를 나타낸 것이다. 세포 활성도는 프로브 1을 24시간 동안 HT-29 세포로 처리하여 측정된다. 24시간 동안 처리하더라도 50 μM 농도까지 세포 독성이 관찰되지 않았다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실험에 사용되는 물질
무수 CH2Cl2 와 THF를 Aldrich Co. Inc. (Milwaukee, WI)에서 병으로 구매하였다. 실리카 겔(40 μm)를 Merck Inc로부터 구매하였다. 수용액은 물 정수 시스템((Human Corp. Korea)에 의해서 비이온화하여 준비하였다. 4-(다이에틸아미노)-살리실알데하이드, 2,3,6,7-테트라하이드로-8-하이드록시-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-9-카르복스알데하이드, (-)-p-브로모테트라미졸옥살레이트, 및 레바미졸 하이드로클로라이드는 Aldrich (Milwaukee, WI)로부터 구매하였다. 신장으로부터 알칼리 인산분해효소(ALP, EC 3.1.3.1, 100 U/mg) 그리고 4-메틸엄벨리페릴 포스페이트(4-MUP)는 Molecular Probes, Inc (Eugene, OR)로부터 얻어진 Sigma. ELF-97 phosphate substrate로부터 취득하였다.
실험에 사용되는 일반적인 방법, 기구 및 측정
내부 기체를 필요로 하는 합성 방법은 표준 Schlenk기술을 사용하여 아르곤기체하에서 수행되었다. NMR (1H, 13C, 및 31P)스펙트럼은 Varian Oxford NMR 200 MHz 또는 Bruker Advance 500 MHz 스펙트로미터를 사용하여 기록하였다. 각각의 신호의 화학이동데이터는 δ (TMS) = 0일 때로부터 테트라메틸실레인(TMS)에 대한 상대적인 δ(ppm)의 값으로 주어지고 나머지는 용매 공명을 참조하였다. 스플릿팅 패턴은 s (singlet), d (doublet), t (triplet), q (quartet), m (multiplet), 및 br (broad)로 기록되었다.
31P NMR 화학이동은 참조에 의해서 H3PO4에 상대적으로 기록된다. 고-분해 화학스프레이 이온화(ESI) 또는 빠른 원자 방해(FAB) 질량 스펙트럼은 내부-환경 연구 도구로서 국제 센터에서 얻었다. 흡수 스펙트럼은 Shimadzu UV-2501 스펙트로포토미터에서 얻었다. 형광 측정은 1 cm 의 길이의 10 mm quartz cuvette을 사용하여 Hitachi F-7000 형광 스펙트로미터에 의해서 기록하였다. 형광 양자률은 표준으로서 플루오레세인 (ΦF = 0.95 in 0.1 N NaOH)을 사용하여 표준 방법에 의해서 측정되었다. 고성능액체크로마토그래피(HPLC)는 SPD-20A 검측기를 부착한 Shimadzu LC-20A에 의해서 수행되었다. ALP와의 반응은 Synergy Mx Microplate Reader (BioTek, USA)를 사용하여 형광 강도의 변화를 검측하여 측정하였다.
실시예
1 : (E)-2-(2-(
벤조[d]티아졸
-2-일)-2-
시아노비닐
)-5-(
다이에틸아미노
)
페닐
포스페이트의
제조
1) 단계 1
4-( 다이에틸아미노 )-2-( 다이에틸 포스포릴 ) 벤즈알데하이드의 제조: 시판되는 4-(다이에틸아미노)-살리실알데하이드 (3.0 g, 15.5 mmol) 및 NaH (유지에서 60% 확산)를 아르곤 환경에서 100mL 건조 THF에 녹였다. 그리고 다이에틸 클로로포스페이트(2.7mL, 18.6 mmol)을 첨가하였다. 그리고 용액을 상온에서 24시간 동안 교반하였다. H20(10mL)에서 냉각하고 감압하에서 용매를 증발하였다. 그리고 순수한 혼합물을 CH2Cl2에 의해서 추출하였다. 결합된 유기층을 MgSO4에 의해서 건조하고 필터링 하였다. 용매는 감압하에서 증발하였다. 순수한 생성물은 실리카 겔에 의한 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제되었다. 이동상으로서 10:1 내지 1:1의 비율로 헥세인:에틸아세테이트를 사용하였다. 87%의 수율로 4-(다이에틸아미노)-2-(다이에틸 포스포릴)벤즈알데하이드 4.58g을 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 10.07 (s, 1H), 7.73 (d, J = 9 Hz, 1H), 6.61 (s, 1H), 6.47 (d, J = 9 Hz, 1H), 4.26-4.20 (m, 4H), 3.43-3.39 (q, J = 7 Hz, 4H), 1.34 (t, J = 7 Hz, 6H), 1.21 (t, J=7 Hz, 6H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 186.4, 155.5, 155.4, 153.6, 130.7, 115.7, 108.3, 101.8, 65.1, 45.1, 16.4, 12.7; 31P-NMR (202 MHz, CDCl3): δ = -5.61 (s, 1P); HR-MS (ESI): calcd. C15H24NO5P [M+H]+ 330.1470, 330.1469 발견됨.
2) 단계 2
(E)-2-(2-( 벤조[d]티아졸 -2-일)-2- 시아노비닐 )-5-( 다이에틸아미노 ) 페닐 다이 에틸 포스페이트 : 아르곤환경, 상온, 에탄올 (20mL)에서 상기의 교반된 화합물 4-(다이에틸아미노)-2-(다이에틸 포스포릴)벤즈알데하이드(1.15g, 3.48 mmol) 및 2-(벤조[d]티아졸-2-일)아세토나이트릴(0.1g, 3.48 mmol)에 피페리딘 한 방울을 첨가하였다. 혼합된 반응물은 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매는 감압하에서 증발되었다. 순수한 생성물은 실리카 겔에 의한 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제되었다. 이동상으로서 10:1 내지 3:1의 비율로 헥세인:에틸 아세테이트를 사용하였다. 66%의 수율로 (E)-2-(2-(벤조[d]티아졸-2-일)-2-시아노비닐)-5-(다이에틸아미노)페닐 다이에틸 포스페이트 1.12g을 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 8.47 (d, J = 9 Hz, 1H), 8.45 (s, 1H), 7.99 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.47 (t, J = 15.5 Hz, 1H), 7.37 (t, J = 15.5 Hz, 1H), 6.71 (s, 1H), 6.57 (d, J = 9 Hz, 1H), 4.31-4.27 (q, J = 7 Hz, 4H), 3.47-3.43 (q, J = 7 Hz, 4H), 1.41-1.37 (q, J = 7 Hz, 6H), 1.24 (t, J = 7 Hz, 6H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 164.9, 153.8, 152.8, 152.7, 152.0, 140.1, 134.5, 130.1, 126.5, 125.2, 123.0, 121.4, 118.0, 111.2, 108.7, 102.3, 98.2, 65.1, 45.0, 16.3, 12.6; 31P-NMR (202 MHz, CDCl3): δ = -6.80 (s, 1P); HR-MS (FAB): calcd. C24H28N3O4PS [M+H]+ 486.1616, 486.1614 발견됨.
3) 단계 3
소듐 (E)-2-(2-(
벤조[d]티아졸
-2-일)-2-
시아노비닐
)-5-(
다이에틸아미노
)
페닐
포스페이트(
프로브
(1)):
상온, 건조 CH2Cl2(5ml)에서, 상기의 교반된 화합물 (E)-2-(2-(벤조[d]티아졸-2-일)-2-시아노비닐)-5-(다이에틸아미노)페닐 다이에틸 포스페이트(102 mg, 0.21 mmol)을 브로모트리메틸실레인(135μL, 1.04 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물은 8시간 동안 상온, 아르곤환경에서 교반하였다. 그리고 MeOH (3mL)로 냉각하였다. 30분 동안 상온에서 혼합물을 교반한 후에, 용매는 감압하에서 제거되었다. 반응 혼합물은 H20(1mL)에 다시 녹이고, pH를 9 내지 10으로 0.01 N NaOH로 조절하였다. 그리고 증발시켰다. 순수한 고체는 H2O에서 MeOH 0 내지 20% 증가된 농도로 용출하여 역-상 C-18 컬럼 크로마토그래피(물 10g RPC 18 카트리지)를 이용하여 44%의 수율로 소듐 (E)-2-(2-(벤조[d]티아졸-2-일)-2-시아노비닐)-5-(다이에틸아미노)페닐 포스페이트 42mg을 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 8.11 (s, 1H), 7.80 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.19 (t, J = 7.5, 1H), 7.06 (t, J = 8 Hz, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.09 (d, J = 9 Hz, 1H), 3.16-3.14 (q, J = 7 Hz, 4H), 0.99-0.96 (t, J = 7 Hz, 6H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 167.9, 157.5, 153.3, 152.4, 143.6, 133.6, 129.5, 126.8, 125.2, 121.9, 121,3, 119.2, 11.5, 107.1, 102.0, 92.6, 44.6, 12.2; 31P-NMR (202 MHz, CDCl3): δ = -4.31 (s, 1P); HR-MS (FAB): calcd. C20H18N3Na2O4PS [M+2H-Na]+ 452.0810, 452.0811 발견됨.
실시예
2 : 8-
포스포릴
-9-[2-(2-
벤조티아졸일
)-2-
시아노에텐일
]-2,3,6,7-
테
트라하이드로-1H, 5H-
벤조[ij]퀴놀리진의
제조
1) 단계 1
2,3,6,7- 테트라하이드로 -8-( 다이에틸 포스포릴옥시 )-1H, 5H- 벤조[ij]퀴놀리진 -9- 카르복스알데하이드: 아르곤 환경, 상온, THF (40 mL)에서 시판되는 2,3,6,7-테트라하이드로-8-하이드록시-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진-9-카르복스알데하이드 (500 mg, 2.30 mmol) 및 NaH (유지에서 60% 확산, 110mg, 2.76 mmol)를 다이에틸클로로포스페이트 (400μL, 2.76 mmol)에 첨가하였다. 그리고 반응 혼합물은 24시간 동안 실온에서 교반하였다. H2O(5 mL)로 냉각하였고 용매는 감압조건에서 증발되었다. 혼합물을 CH2Cl2에 의해서 추출하였다. 결합된 유기층을 MgSO4에 의해서 건조하고 필터링 하였다. 용매는 감압하에서 증발하였다. 순수한 생성물은 실리카 겔에 의한 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제되었다. 이동상으로서 10:1 내지 1:1의 비율로 헥세인:에틸아세테이트를 사용하였다. 53%의 수율로 2,3,6,7-테트라하이드로-8-(다이에틸 포스포릴옥시)-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진-9-카르복스알데하이드 435 mg을 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 10.00 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 4.21-4.16 (m, 4H), 3.26 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 2.85 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.69 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.93-1.90 (m, 4H), 1.33 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 187.5, 150.2, 149.1, 126.5, 118.4, 116.3, 112.3, 65.2, 50.3, 27.6, 21.9, 21.4, 16.4; 31P-NMR (202 MHz, CDCl3): δ = -5.04(s); HR-MS (FAB): calcd. for C17H24NO5P [M]+ 353.1392, 353.1391 발견됨.
2) 단계 2
8- 다이에틸포스포릴옥시 -9-[2-(2- 벤조티아졸일 )-2- 시아노에텐일 ]-2,3,6,7- 테 트라하이드로-1H, 5H- 벤조[ij]퀴놀리진:
아르곤환경, 상온, 에탄올 (20mL)에서 상기의 교반된 화합물 2,3,6,7-테트라하이드로-8-(다이에틸 포스포릴옥시)-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진-9-카르복스알데하이드(1.34 g, 3.79 mmol) 및 2-(벤조[d]티아졸-2-일)아세토나이트릴(660 mg, 3.48 mmol)에 피페리딘 한 방울을 첨가하였다. 혼합된 반응물은 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매는 감압하에서 증발되었다. 순수한 생성물은 실리카 겔에 의한 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제되었다. 이동상으로서 10:1 내지 3:1의 비율로 헥세인:에틸 아세테이트를 사용하였다. 54%의 수율로 8-다이에틸포스포릴옥시-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라하이드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진 1.05g을 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 8.34 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.01 (d, J = 10 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 10 Hz, 1H), 7.46 (m, 1H), 7.35 (m, 1H), 4.28-4.23 (q, J = 10 Hz, 4H), 3.33-3.30 (m, 4H), 2.89 (t, J = 5 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 5 Hz, 2H), 1.98-1.95 (t, J = 5 Hz, H), 1.34 (t, J = 5 Hz, 6H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 166.7, 153.9, 147.9, 141.9, 134.4, 126.5, 126.4, 125.0, 123.4, 122.9, 121.4, 118.7, 118.1, 112.9, 111.9, 97.3, 65.1, 50.2, 49.6, 27.6, 22.2, 21.2, 20.7, 16.2; 31P-NMR (202 MHz, CDCl3): δ = -6.11 (s, 1P); HR-MS (FAB): calcd. C26H28N3O4PS [M+H]+ 510.1616, 510.1615 발견됨.
3) 단계 3
소듐 8- 포스포릴 -9-[2-(2- 벤조티아졸일 )-2- 시아노에텐일 ]-2,3,6,7- 테트라하 이드로-1H, 5H-벤조[ ij ] 퀴놀리진 ( 프로브 (2)): 상온, 건조 CH2Cl2(5ml)에서, 화합물 8-다이에틸포스포릴옥시-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라하이드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진(90 mg, 0.17 mmol)을 브로모트리메틸실레인(110μL, 0.86 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물은 8시간 동안 상온, 아르곤환경에서 교반하였다. 그리고 MeOH (3mL)로 냉각하였다. 30분 동안 상온에서 혼합물을 교반한 후에, 용매는 감압하에서 제거되었다. 반응 혼합물은 H20(1mL)에 다시 녹이고, pH를 9 내지 10으로 0.01 N NaOH로 조절하였다. 그리고 증발시켰다. 순수한 고체는 H2O에서 MeOH 0 내지 20% 증가된 농도로 용출하여 역-상 C-18 컬럼 크로마토그래피(물 10g RPC 18 카트리지)를 이용하여 45%의 수율로 소듐 8-포스포릴-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라하이드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진 38 mg을 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 8.95 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.90 (d, J = 15 Hz, 2H), 7.43 (t, J = 15 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 15 Hz, 1H), 3.03 (t, J = 5Hz, 2H), 2.73 (t, J = 5 Hz, 2H), 1.96-1.91 (m, 4H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 169.3, 154.5, 149.4, 135.4, 126.9, 126.2, 125.5, 122.7, 122.3, 119.6, 116.9, 115.2, 114.8, 106.3, 50.6, 50.4, 28.4, 22.9, 22.4, 21.7; 31P-NMR (202 MHz, CDCl3): δ = -1.05 (s, 1P); HR-MS (FAB): calcd. for C22H18N3Na2O4PS [M+H-Na]+ 475.0810, 475.0812 발견됨.
제조예
: 화합물 (9) 및 화합물 (10) 의 제조
화합물 (9)
아르곤환경, 상온, 건조 MeOH (20 mL)에서 4-(다이에틸아미노)-살리실알데하이드 (220 mg, 1.15 mmol) 및 2-(벤조[d]티아졸-2-일)아세토니트릴 (200 mg, 1.15 mmol) 용액에 피페리딘(1.14 mL, 11.5 mmol)을 첨가하였다. 결과물을 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 침전물이 거름기에 의해서 걸러졌다. 순수 고체는 실리카 겔에 의한 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제되었다. 이동상으로서 10:1 내지 1:1의 비율로 헥세인:에틸아세테이트를 사용하였다. 50%의 수율로 화합물 (9) 200 mg을 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ = 8.01 (br, 1H), 7.90 (d, J = 0.5 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 0.5 Hz, 1H), 7.41 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.33-7.31 (t, J = 5 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 5 Hz, 1H), 6.40 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 3.43-3.38 (q, J = 7 Hz, 4H), 1.14 (t, J = 7 Hz, 6H); 13C-NMR (125 MHz, CD3OD and CDCl3): δ = 155.5, 153.1, 152.1, 138.4, 130.1, 126.2, 125.2, 122.4, 121.1, 108.4, 107.5, 96.4, 44.7, 12.0.; HR-MS (FAB): calcd. C20H19N3OS [M+H]+ 350.1327; 350.1327 발견됨.
화합물 (10)
아르곤환경, 상온, 건조 MeOH (20 mL)에서 2,3,6,7-테트라하이드로-8-(다이에틸 포스포릴)-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진-9-카르복스 알데하이드 (200 mg, 0.92 mmol) 및 2-(번조[d]티아졸-2-일)아세토니트릴 (160 mg, 0.92 mmol)의 용액에 피페리딘(0.9 mL, 9.2 mmol)을 첨가하였다. 결과물을 상온에서 5시간 동안 교반하였다. 침전물은 거름기에 의해서 걸러졌다. 순수한 고체는 실리카 겔에 의한 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제되었다. 이동상으로서 10:1 내지 1:1의 비율로 헥세인:에틸 아세테이트를 사용하였다. 76%의 수율로 화합물 (10) 260 mg을 얻었다.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 8.01 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.46 (t, J = 7 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 7 Hz, 1H), 6.87 (s, 1H), 3.3-2.9 (m, 4H), 2.86 (t, J = 6 Hz, 2H), 2.73 (t, J = 6 Hz, 2H), 2.00-1.96 (m, 4H); HR-MS (FAB): calcd. C22H19N3OS [M+H]+ 374.1327, 374.1328 발견됨.
실험예
1:
실시예
1 (
프로브
1) 및 2 (
프로브
2)와 화합물 (9) 및 (10)의
광역학
연구
실시예 1 및 2는 상기 실시예의 3가지 단계에 따라서 합성되었다. 프로브 1 및 2는 물에 완전히 녹았다. 제안된 단계의 실현가능성을 증명하기 위해서, 이미노쿠마린-벤조티아졸 화합물 (9) 및 (10)을 상기 제조예의 방법으로 제조하였다.
스펙트럼의 UV-Vis 흡수 및 방출은 수용성 완충 용액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.4)에서 측정되었다(표 1 및 도 4-5).
| Compounda | λabs,max [nm] |
εb [M-1cm-1] |
λem, maxc [nm] |
φFL d |
| 1 | 472 | 1.7 ×104 | 542 | 0.002 |
| 2 | 493 | 2.2 ×104 | 545 | 0.03 |
| 9 | 485 | 2.9 ×104 | 529 | 0.10 |
| 10 | 500 | 3.2 ×104 | 542 | 0.63 |
| a) 1 과 2 데이터는 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)에서 얻어졌고 9 와 10 데이터는 0.5% DMSO를 포함하는 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)에서 얻어졌다. b) 각각의 흡수 최대치에서 측정된다. c) 460 nm 에서 여기된다. d) 0.1 N NaOH에서 양자수율 대 플루오레세인 (ΦF = 0.95). |
||||
프로브 1 및 2는 λmax,abs = 472 nm (ε= 1.7 × 104 M-1cm-1) 및 493 nm (ε= 2.2 × 104 M-1cm-1)로 각각 강한 전기적 이전을 나타냈다. 프로브 1 및 2의 방출 스펙트럼은 542 nm 및 545 nm에서 각각 최대치의 값을 보여주었다. 수용액에서의 방출량(φF )은 프로브 1에서는 0.002 이고 프로브 2에서는 0.03이고 이것은 비닐렌 기에 대한 자유 회전을 통한 빠른 비방출성, 비활성과 일치한다.
이미노쿠마린-벤조티아졸 유도체 화합물(9) 및 (10)의 광역학적 성질은 0.5 % DMS를 용매로 포함하는 수용성 완충 용액에서 측정되었다(10 mM Tris-HCL, pH 7.4)(도 6-7). 화합물 (9) 및 (10)의 흡수와 방출 스펙트럼의 약간의 스펙트럼 변화는 프로브 1 및 2에서 각각 관찰되는 것과 같은 측면에서 관찰되었다. 흡수에 있어서는 적색이동(bathochromic shift) 및 방출 최대치에 있어서는 청색이동(hypsochromic shift)을 나타내었다. 화합물 (9) 및 (10)의 가수분해된 생성물의 높은 형광 방출 양을 전구체 프로브와 비교하였을 때 화합물 (9): φF 0.10, 화합물 (10): φF 0.63 을 나타냈다. 프로브 1 및 2 와 화합물 (9) 및 (10)의 양자수율을 비교하면 프로브 2 보다는 프로브 1을 사용해서 높은 신호대 잡음비를 얻을 수 있었다. 따라서, 프로브 1의 효과가 더 뛰어나다는 것을 알 수 있었다.
최적화된 측정 조건(10 mM Tris-HCL, pH 7.4, 3.7℃)에서 ALP와 함께 프로브 1(10 μM)의 배양에 의해서, 흡수 스펙트럼은 472 nm 에서 485 nm 로의 선명한 적색이동(bathochromic shift)을 보여주며, 화합물 9(도 1a)의 고리화의 형성을 지시한다. 또한, 529 nm 에서 화합물 9의 형광 시그널의 특징이 나타나고 안정기에 다다르기 전 30분 동안 시간이 지나감에 따라 형광도가 직선적으로 증가한다(도 1b). 프로브 1을 ALP와 함께 30 분 동안 배양함에 따라서 형광 강도에 있어서 약 90배 증가가 얻어졌다. 측정 용액의 LC-MS 분석은 형광은 효소적 반응이 일어나는 동안에 증가한다는 것을 확인시켰다. 이것은 예상된 화합물 9의 형성 때문이다(도 1c). 프로브 1의 비-방출성 성질과 ALP-처리된 프로브 1의 형광은 선명하게 나타났다(도 1d).
실험예
2:
프로브의
pH
효과 및 안정도 연구
프로브 1의 흡수 및 방출 스펙트럼과 화합물 9의 pH에 따른 기능을 도 12 내지 도 14에 나타내었다. 25 ℃에서 공동용매로서 다양한 pH완충 시스템에서 프로브 1(10 μM)의 흡수 및 방출 스펙트럼을 측정하였다. 다양한 pH완충 시스템으로서 pH 3 및 pH 4에서 10 mM시트르산 완충용액; pH 5 및 pH 6에서 10 mM 소듐 아세테이트 완충용액; pH 7 및 pH 8에서 10 mM HEPES 완충용액; pH 9에서 10 mM 카보네이트 완충용액을 사용하였다.
도 13은 25 ℃에서 공동용매로서 1% DMSO를 포함하는 다양한 pH완충 시스템에서 화합물 9의 흡수 (왼쪽) 및 방출(오른쪽) 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 14는 25 ℃에서 프로브 1의 형광 강도(적색) 및 화합물 9의 형광 강도(청색)의 pH효과를 나타낸 것이다.
프로브 1 및 화합물 9의 수용액에서의 화학적 안정도를 측정하였다. 프로브 1의 화학안정도는 Tris-HCl 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 측정되었다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 30분 동안의 배양이 있은 후 542 nm에서 프로브 1의 형광 강도(< 5%)의 약한 감소가 관측되었다. 그러나 529 nm 에서 새로운 방출 신호(화살표로 지시)는 관측되지 않았다. 따라서, 비-효소적 가수분해와 경쟁하기 때문에 발생하는 배경 형광은 최소화되었다.
또한, 수용액에서의 프로브 1-2 및 화합물 9-10의 광안정도를 테스트하였다.화합물 1, 2, 9 및 10의 광안정도를 측정하였다. 광산화 연구는 호기성의 조건에서 방사원으로서 150 W steady-state Xe 램프를 사용하여 25 ℃에서 Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4, 0.5% DMSO)에서 각각의 화합물의 계속되는 UV방출에 의해서 수행되었다. 도 17에 따르면 경과된 광분해 시간의 기능에 따라서 화합물 1, 2, 9 및 10 형광 강도의 감소의 검측에 의해서 광유도 분해를 정량화 하였다. 화합물 1, 2, 9 및 10의 형광 강도의 무시해도 좋은 변화는 460 nm에서 2 시간의 방사의 후에 관측되었다.
실험예
3: 알칼리 인산분해효소(
ALP
)를 이용한
프로브의
효소적
가수분해.
3-1.
ALP
분석을 위한 최적화 조건
다양한 완충시스템에서의 프로브 1의 효소 분석을 도 18에 나타내었다. 그리고 프로브 1의 효소분석에서의 pH효과를 도 19에 나타내었다.
3-2.
ALP
의 농도의 기능에 따른
프로브
1의
효소적
검사
Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4)에 ALP를 녹였다. 그리고 다양한 ALP 농도를 만들기 위해서 완충용액을 희석하였다. ALP 용액 (20 μL)을 Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4, 160 μL)에서 기질(20 μL)용액과 혼합하였다. 용액에서의 마지막 프로브 농도는 10 μM이고, ALP농도는 각각 0, 0.35, 1.75, 3.5, 17.5, 35, 87.5, 175, 262, 350 nM이다. 525nm에서 형광강도는 컴퓨터-조절 형광판 리더를 사용하여 37 ℃에서 30분 동안 매 2분 마다 측정되었다(도 20, 21).
3-3.
ALP
의 농도의 기능에 따른
프로브
2의
효소적
검사
상기의 3-2와 동일한 방법으로 프로브 2에 대해서 실험하였다(도 22).
3-4.
프로브
1의 알칼리 인산분해효소(
ALP
)를 이용한
프로브의
효소적
가수분해.
다양한 효소 농도를 사용한 배양 시간에 따라 프로브 1의 ALP-촉진화된 가수분해를 연구하였다. 다양한 ALP 농도(0-350 nM)에 있어서 형광 강도를 매 2분 마다 측정하였고 525 nm 에서의 형광 강도의 증가를 도 2에 나타내었다. 상기 농도 범위 내에서 ALP가 증가함에 따라서 형광 강도가 증가하였다. 현지외 측정을 적용하여, 형광강도의 증가는 화합물 9의 증가와 관련하여 정량학적으로 되었다. 따라서 실시간 검측되는 효소 활성을 얻을 수 있었다. 그 후에 라인웨어-버크식(lineweaver-Burk 식)분석을 적용하여 프로브 1의 효소적 가수분해 반응을 위한 역학적 파라미터를 측정하였다. KM=19.2 μM 및 kcat = 0.27 s-1의 값이 생산된다. 프로브 1의 효소적 효율은 kcat/KM=1.4 ×104M-1s-1에 의해서 측정하였고 두 가지의 상업적으로 얻을 수 있는 ALP 형광의 기질, 4-MUP (kcat/KM=7.7 ×103 M-1s-1) 및 ELF-97 (kcat/KM=3.0 ×104 M-1s-1) 사이에서 동일한 측정조건에서 측정되었다.
3-5.
프로브의
역학적 연구
역학적 상수를 측정하기 위해서, 마지막 농도(0.1 - 25 μM )의 시리즈에서 프로브 1 및 프로브 2는 ALP (50 nM)에 의해서 가수분해되었다. 표준화에 따라서, 4-MUP 및 ELF-97의 가수분해, 상업적으로 사용가능한 ALP 프로브는 또한 비슷한 조건에서 측정되었다. 반응은 37 ℃에서 525 nm에서 프로브 1( 460 nm에서 여기)로, 반응은 540nm에서 프로브 2(460nm에서 여기)로, 440 nm 에서 4-MUP (360 nm에서 여기)로 및 530 nm에서 ELF-97 (345 nm에서 여기)로 형광 변화를 측정하여서 검측되었다,
최초의 속도는 각각의 진행 커브의 기울기로부터 측정되었다. 프로브 1, 프로브 2, 4-MUP 및 ELF-97은 ALP와 함께, KM 및 kcat 과 같은 측정치는 Lineweaver-Burk plot에 의해서 측정되었고 표 2에 기입하였다. 예를 들어, 도 24(B)는 ALP에 의한 가수분해에 의한 프로브 1의 상대적인 최초 속도의 평균 값을 보여주었다. 프로브 1의 KM, kcat, 및 kcat/KM 값은 각각 19.3 μM, 0.27 s-1, 및 1.4 x 104 M-1s-1이었다. pH 7.4에서 프로브 1의 역학적 상수의 결정은 도 23, 도 24에 나타내었다. pH 9.0에서 프로브 1의 역학적 상수의 결정은 도 25, 도 26에 나타내었다. 프로브 2의 역학적 상수의 결정은 도 27, 도 28에 나타내었다. 4-MUP의 역학적 상수의 결정은 도 29 내지 도 31에 나타내었다. ELF-97의 역학적 상수의 결정은 도 32 내지 도 34에 나타내었다. 표 2는 기질 프로브 1-2, 4-MUP 및 ELF-97의 역학적 데이터를 나타낸 것이다.
| 기질 | KM (μM) | kcat (s-1) | kcat/Km (M-1s-1) |
| 프로브 1(pH 7.4) | 19.2 | 0.27 | 1.4 × 104 |
| 프로브 1(pH 9.0) | 29 | 0.44 | 1.5 × 104 |
| 프로브 2(pH 7.4) | 9.0 | 0.10 | 1.1 × 104 |
| 4-MUP (pH 7.4) | 18.3 | 0.14 | 7.7 × 103 |
| ELF-97 (pH 7.4) | 20.0 | 0.60 | 3.0 × 104 |
3-6.
ALP
활성의 저해 검사
효소적 활성의 억제 검사를 위해서, ALP의 마지막 농도 및 프로브 1이 350 nM 및 10 μM로 각각 고정되었다. 두 가지 잠정적 ALP 저해제, (-)-p-브로모테트라미졸 옥살레이트(p-BTO) 및 레바미졸을 다양한 농도에서 20 μL Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4)에 녹였다. 그리고 나서, 각각 Tris-HCl 완충용액 (10 mM, pH 7.4)에 ALP 용액 20 μL와 혼합하였다.
혼합 용액에서 p-BT의 마지막 농도는 0 ~ 1000 μM 이고 혼합용액에서 레바미졸의 마지막 농도는 0 ~ 5000 μM이었다. 혼합 용액은 실온에서 20분 동안 효소 활성을 저해하기 위해서 배양되었다. 저해제 처리된 ALP용액에 프로브 1 용액 20 μL를 첨가하였다. 효소적 반응이 배양에 의해서 수행되었다. 컴퓨터-조절 형광 판 리더기를 사용하여 37 ℃에서 30분 동안 매 2분 마다 525 nm 에서 형광을 기록하였다. IC50값(효소 활성을 50%로 감소시키기 위해서 필요한 저해제 농도)은 2분 시점에 상대적 활성 대 저해제 농도의 그래프에 의해서 얻어졌다(도 35 내지 38).
실험예
4: 세포 연구(도 39 내지 44)
4-1. 세포 배양
HeLa(자궁경부 암) 및 HT-29 (human colon adenocarcinoma) 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD)에서 얻었다. 그리고 37℃에서 5% CO2 를 포함하는 습기가 있는 배양기에서 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS), 1% antibiotic-antimycotic으로 보충되는 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)에서 배양하였다. DMSO (10 mM)에서 프로브 1의 stock 용액을 세포 배양액으로 희석하였다. 세포에 적용되는 프로브 1의 마지막 농도는 10 μM이다.
4-2.
공초점
형광 현미경
공초점 형광 영상 연구를 위해서, HeLa 세포를 4개의 well LabTek-II chambered cover glass (Nalge Nunc International Corp., USA)에 1×105 cells/well의 밀도로 심었다. 그리고, 24 시간 동안 세포 부착을 위해서 배양하였다. 24시간의 배양 후에, 세포는 세척되었고 2~10분 동안 프로브 1을 포함하는 신선한 배양액으로 처리하였다. 억제 검사를 위해서, 추가적인 세포는 15분 동안 ALP 저해제 레바미졸(10 mM)로 선배양하였다. 그리고 나서 2분 동안 프로브 1로 처리하였다. 모든 세포는 선-가열된 포스페이트 완충된 살린 용액(100 mM, pH 7.4, 138 mM NaCl)으로 3시간 세척하였다. 그리고 신선한 배양액이 각각의 well에 첨가되었다. 공초점 형광 이미지 (Ex. 488 nm, Em. 505-530 nm)는 공초점 레이저 주사 현미경(C-Apochromat 40×/1.2 W, 및 2× scan zoom, Zeiss LSM 510 META, Zeiss, Germany)으로 관찰되었다. HT-29 세포의 경우에는, 세포는 30분 동안 프로브 1로 처리되었고, 3시간 세척하였고, 공초점 레이저 주사 현미경으로 관찰되었다.
4-3.
FACS
분석
세포는 12개의 well plate에 1×106 cells/well의 밀도로 심었다. 그리고 세포 부착을 위해서 24 시간 동안 배양하였다. 24시간 동안의 배양 후에, HeLa 세포는 세척되었고, 각각 2, 5, 10분 동안 프로브 1을 포함하는 배양액으로 처리하였다. 억제 검사를 위해서, HeLa 세포의 3가지 추가적인 세트는 레바미졸(10 mM)로 선배양되었고 그 후 각각 2, 5, 10분 동안 프로브 1로 처리되었다.
비염색된 대조군의 경우엔, 세포는 각각 2, 5, 10분 동안 프로브 1 없이 신선한 배양액으로 처리되었다. 모든 세포는 티롭신/EDTA를 사용하여 기판으로부터 분리되었고, 원심분리되고, PBS용액으로 3시간 세척하였다. 세포 펠렛은 PBS 용액에서 재현탁되었고, FACS 분석(BD, FACSCalibur, Flow Cytometer, USA)을 위해서 튜브로 이동시켰다. 그리고 나서 형광 강도 (Ex. 488 nm, Em. 515-545 nm)를 측정하였다. HT-29 세포의 경우에는, 세포는 신선한 배양액으로 처리되거나 또는 30분 동안 프로브 1을 포함하는 배양액으로 처리되었다. 티롭신/EDTA를 사용하여 판으로부터 분리하고 PBS용액으로 3시간 동안 세척하였다. 그리고 나서 셀 펠렛은 PBS 용액에서 재현탁되고, FACS 분석을 위해서 튜브로 이동시켰다.
4-4. 세포 활성도 검사
세포는 96개의 well plate에 1×104 cells/well의 밀도로 심었다. 그리고 세포 부착을 위해서 24 시간 동안 배양하였다. 프로브 1의 stock 용액은 10% FBS를 포함하는 세포 배양액으로 희석하고 각각 0, 10, 20 및 50 μM 의 마지막 농도를 갖도록 하였다. 존재하는 배양액은 프로브 1을 포함하는 100 μL의 신선한 것으로 대체되었다.
HeLa세포는 각각 5분 및 10분 동안 프로브 1을 포함하는 배양액으로 처리되었다. 프로브 1에 의한 배양 시간의 효과를 측정하기 위해서, 추가적인 HeLa 세포는 각각 0.5, 1, 및 4, 24 시간 동안 10 μM의 프로브 1로 처리되었다. HT-29 세포의 경우에는, 세포는 24 시간 동안 프로브 1을 포함하는 배양액으로 처리되었다. 세포를 두 번 세척한 후에, 세포 활성도는 세포 카운팅 kit-8을 사용하여 측정되었다(Dojindo Laboratories, Japan).
세포는 배양액을 포함하는 CCK-8로 배양되었고 추가적인 4시간 동안 배양되었다. 흡광도는 마이크로 플레이트 리더 (Tecan Safire 2, Switzerland)를 사용하여 450 nm(참조= 650 nm) 에서 측정되었다. 세포 활성도는 배양액-처리 대조군 세포와 비교하여 퍼센트로서 측정되었다.
데이터는 평균 ± 표준 편차로서 표현되었다. 중간-처리 대조 세포와 비교하여 통계학적인 중요성은 t-test를 사용하여 p 값을 측정하여 계산되었다. 세포 활성도 검사로부터, 5분의 처리시간 후에 50 μM의 농도까지 프로브 1로 처리된 HeLa 세포에서 어떠한 세포독성 효과도 검측되지 않았다. 그리고 10분 배양 동안 동일한 농도로 생존하였다. 그러나, 프로브 1을 장시간(예를 들어, 24시간) 배양하더라도 HT-29 세포에서 프로브 1의 50 μM 농도까지 어떠한 세포독성 효과도 관찰되지 않았다.
세포 활성도 검사는 1시간의 처리시간 후에 10μM농도에서 프로브 1이 세포에 세포독성 효과가 없다는 것을 보여주었다. 따라서 프로브 1은 매우 생체적합성이 있음을 보여주었다. 10μM의 프로브 1로 처리된 ALP-음성 HT-29 세포의 경우에는 30분의 배양 후에 공초점 현미경 이미지로부터 의미 있는 형광이 관찰되지 않았다. 이것은 세포 내부간의 흡수에 따른 비특정 형광의 증가가 없다는 것을 나타낸다. 게다가, 프로브 1-처리된 HT-29 세포의 FACS 분석은 Geo mean 형광 강도는 단지 144임을 보여주었다. 상기 결과는 ALP의 효소적 활성 때문에 HeLa 세포에 있어서 형광이 배타적으로 증가한다는 것을 뒷받침한다.
4-5.
웨스턴
블롯
검사
세포는 5×106의 밀도로 100-pi 판에 심었다. 그리고 더 나아가서 2-3일 동안 배양하였다. 세포 증식이 70-80%에 이르렀을 때, 세포는 10분 동안 3,000 rpm 에서 트립신처리 및 원심분리에 의해서 분리되었다.
세포의 용해 완충액 100 μL에 세포를 재현탁시킨 후에 전체-세포 용해물은 Misonix Sonicator 3000 (Misonix, Inc., USA)를 사용하여 초음파 분해에 의해서 준비되었다. BCA 검사 (Micro BCATM Protein Assay Kit, Thermo scientific, USA)를 사용하여 정량적인 검사에 의해 측정된 32μg 단백질은 4×SDS 샘플 완충액으로 혼합하고, 10분 동안 70 ℃로 열을 가하였고 1시간 동안 200 V에서 NuPAGE? 4-12% 기울기 Bis-Tris 겔 (Invitrogen, USA)에 의해서 측정하였다.
SDS-PAGE 겔은 1시간 동안 170 mA에서 나이트로셀룰로오스 막에서 전자-이동되었고, 4 ℃에서 1시간 동안 5% (wt/vol) BSA로 저해되었다. 블랏은 사람의 장의 알칼리 인산분해효소 항원 (Rabbit polyclonal IgG 항원, 1:10,000 dilutions, Abcam, England)의 존재하에 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양된 후에 5×5 min 동안 1× PBST (1% Tween 20)로 세척되었다. Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA)는 RT 에서 1시간 동안 1 : 5000 의 비율로 이차 항원으로 사용되었고, ALP는 ECL kit (SuperSignal? West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo scientific, USA)를 사용하여 검측되었다.
실험예
5:
ALP
저해제의 검사를 위한
프로브
1의 활용
ALP 저해제의 검사를 위한 프로브 1의 활용이 연구되었다. ALP 활성의 저해제는 두 가지 일반적인 ALP-저해제를 사용하여 측정되었다. pH 7.4 에서 p-브로모테트라미졸(p-BT) 및 레바미졸(levamisole)이 사용되었다. ALP는 25℃에서 2분 동안 다양한 농도의 저해제와 함께 선-배양되었다. ALP 용액에 선 처리된 저해제는 그 후 수용액에서 프로브 1에 첨가되었다. 효소적 반응을 535nm에서 형광 강도를 측정하여 관측하였다.
도 2에서 보여주는 바와 같이, 프로브 1의 형광강도의 강화는 투여양-의존 방식에 따라서 저해되었다. 특히, 100 μM p-BT의 첨가는 완전히 형광의 증가를 방해하였고, ALP 효소적 활성은 프로브 1의 가수분해를 요구한다는 것을 확인할 수 있었다. IC50은 p-BT 36μM, 레바미졸 75μM이 되도록 측정되었다. 상기의 결과는 ALP 활성 분석과 저해제의 검사를 위해서 프로브 1의 적용이 가능하다는 것을 보여준다.
실험예
6: 생체세포에서의 내생의
ALP
의 검측.
생체세포에서의 내생의 ALP의 검측을 위한 프로브 1의 적용가능성을 측정하였고, 공초점 형광 현미경 및 형광-활성 세포 분급(FACS) 분석에 의해서 단일 세포단계에서 ALP활성의 분석의 양을 측정하였다. 태반의 ALP를 나타내는 것으로 알려져 있는 자궁경부암세포(HeLa human cervical carcinoma cell) 및 장내의 ALP의 추적 단계만을 나타내는 것으로 알려져 있는 결장선암세포(HT-29 Human colon adenocarcinoma cell)는 ALP-양성 및 ALP-음성 대조군으로 각각 시험되었다.
HeLa 세포의 공초점의 형광 현미경 이미지는 ALP 활성의 지시제로서(도 3a) 오직 2분 동안 10 μM 프로브 1로 처리되었고 세포 내에 초록색의 형광이 선명하게 증가하는 것을 보여주었다. 반면에 프로브 1로 처리하지 않은 세포의 경우에는 형광이 관찰되지 않았다.
세포를 10 mM의 프로브 1로 처리된 레바미졸과 선-배양했을 때, HeLa 세포에서 형광 강도의 놀라운 감소가 관찰되었다(도 3a). 이러한 형광 이미지는 프로브 1이 세포에 배어든다는 것, ALP에 의해서 활성화 된다는 것, 세포에 축적된다는 것을 밝혔다.
따라서, 프로브 1은 ALP활성의 FACS 분석에 적용되었다. 프로브 1로 처리된 HeLa 세포는 비염색된 대조세포와 비교하였을 때 특별한 막대그래프를 보였다. 프로브 1로 처리된 HeLa 세포에서 관찰된 평균 형광세기는 2144 이고 염색하지 않은 대조군의 경우 평균 형광 세기는 2 이다(도 40).
반면에, 레바미솔로 선 처리되고 프로브 1로 처리된 세포는 그들의 막대그래프에서 주요한 이동을 보여준다. 프로브 1-처리된 세포의 형광 강도 보다 약 11배 보다 작은 평균 형광 강도를 보여준다(도 3b). 공초점 형광 현미경을 사용한 ALP활성의 시각화와 함께 상기의 결과는 단일-세포 단계에 있어서 ALP활성의 정량적인 분석과 빠른 분석을 위해서 프로브 1이 유용하다는 것을 보여주었다.
Claims (13)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
[화학식 1]
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬기이다.
- 제1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 에틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 하기 화학식 2로 표시되는 화합물:
[화학식 2]
.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 형광 프로브.
- 제4항에 있어서, 상기 형광 프로브는 인산분해효소의 활성을 탐지하는 것을 특징으로 하는 형광 프로브.
- 1) 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 염기 존재하에 다이에틸클로로포스페이트와 반응시켜 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;
2) 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 피페리딘을 첨가하여 2-(벤조[d]티아졸-2-일)아세토니트릴과 반응시켜 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및
3) 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 브로모트리메틸실레인과 반응시킨 후 염기를 추가하여 pH를 조절하는 하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법:
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 1]
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬기이다.
- 1) 2,3,6,7-테트라하이드로-8-하이드록시-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-9-카르복스알데하이드를 염기 존재하에 다이에틸클로로포스페이트와 반응시켜 2,3,6,7-테트라하이드로-8-(다이에틸 포스포릴옥시)-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-9-카르복스알데하이드를 제조하는 단계;
2) 2,3,6,7-테트라하이드로-8-(다이에틸 포스포릴옥시)-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-9-카르복스알데하이드를 피페리딘을 첨가하여 2-(벤조[d]티아졸-2-일)아세토니트릴과 반응시켜 8-다이에틸포스포릴옥시-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라하이드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진을 제조하는 단계; 및
3) 8-다이에틸포스포릴옥시-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라하이드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진을 먼저 브로모트리메틸실레인과 반응시킨 후 염기를 추가하여 pH를 조절하는 하는 단계를 포함하는, 8-포스포릴-9-[2-(2-벤조티아졸일)-2-시아노에텐일]-2,3,6,7-테트라히드로-1H, 5H-벤조[ij]퀴놀리진 형광 유도체의 제조방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 단계 1)의 반응은 THF, DMF 또는 CH2Cl2 용매하에 수행되는 것인 제조방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 단계 2)의 반응은 에탄올 또는 메탄올 용매하에 수행되는 것인 제조방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 단계 3)의 반응은 이염화탄소 또는 클로로포름 용매하에 수행되는 것인 제조방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 단계 1)의 염기는 NaH, 피리딘, 트라이에틸아민, 2,6-루티딘 또는 K2CO3를 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 단계 3)의 pH는 9 내지 10인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 단계 3)의 염기는 NaOH를 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101776551B1 (ko) | 2016-11-30 | 2017-09-11 | 한국생명공학연구원 | Ａｌｐ 검출용 근적외선 형광 프로브 및 이의 제조방법 |
| KR20200045803A (ko) | 2018-10-23 | 2020-05-06 | 아주대학교산학협력단 | 카르복실에스터라제-2 검출용 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암세포에서 카르복실에스터라제-2의 정량적 검출 방법 |
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| CN112710838A (zh) * | 2020-11-26 | 2021-04-27 | 华东理工大学 | 喹啉腈衍生物在蛋白质印记法检测蛋白质的应用及其制备方法 |
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2011
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Bulletine of Chemical Society of Japan, 2006, vol.79, pp.1211-1214 |
| Molecular and Cellular Probes, 1996, vol.10(1), pp.7-14 |
Cited By (2)
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| KR20130020853A (ko) | 2013-03-04 |
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