KR20200045803A - 카르복실에스터라제-2 검출용 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암세포에서 카르복실에스터라제-2의 정량적 검출 방법 - Google Patents

카르복실에스터라제-2 검출용 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암세포에서 카르복실에스터라제-2의 정량적 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카르복실에스터라제-2 검출용 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암세포에서 카르복실에스터라제-2의 정량적 검출 방법에 관한 것으로, 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2)의 선택적 검출이 가능한 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하여, 암세포 내 CE2 활성의 직접 측정 및 정량적 검출이 가능하며, 이로써 이리노테칸과 같은 항암제의 반응성 예측이 가능하여 항암제 반응성 예측 키트로서 유용하게 활용될 수 있는 효과가 있다.

Description

카르복실에스터라제-2 검출용 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암세포에서 카르복실에스터라제-2의 정량적 검출 방법{Two-photon fluorescence probe for detecting carboxylesterase-2 and quantitative detection method of carboxylesterase-2 in cancer cells using the same}
본 발명은 카르복실에스터라제-2 검출용 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암세포에서 카르복실에스터라제-2의 정량적 검출 방법에 관한 것이다.
카르복실에스터라제(Carboxylesterase; CE)는 몸 전체에 널리 분포되어 있으며, 에스테르(ester), 아미드(amide), 티오에스테르(thioester) 및 카바메이트(carbamate)의 가수분해를 촉진시킨다. 인간에는 카르복실에스터라제의 두개의 주된 동형체인 CE1, CE2가 있다. 이들은 인체 내 장기 전체에 이질적으로 분포하는데, 간에서 CE1 수준(level)은 CE2 수준을 초과하는 반면, 소장에서는 CE2 만이 높게 발현된다. 또한, 이전 연구는 많은 종양 조직에서 CE2의 발현이 감소된다고 보고되고 있다. CE2는 대장암에서 하향 조절되며, 난소암의 초기 단계에서도 CE2의 감소된 혈청 농도가 검출되었다. 반면에, 췌장암 조직에서는 정상 췌장 조직에 비해 높은 CE2 발현이 보고되고 있다.
CE2는 많은 프로드러그(prodrug)의 대사 활성화에 중요한 역할을 한다. 카르복실에스터라제 중에, CE2는 프로드러그 이리노테칸(irinotecan)을 활성 대사산물인 SN-38로 활성화 시키는데 가장 효과적이며, 결과적으로 CE2는 대장암, 악성 뇌교종, 다발성 골수종 및 췌장암을 포함하는 다양한 종류의 암 치료를 위한 항암 치료제의 감재적인 역할로 인해 주목을 받고 있다. 특히, CE2의 과발현은 다발성 골수종에 대한 이리노테칸의 효능을 증진시켰다. 게다가, CE2의 활성은 췌장암의 활성성분으로 이리노테칸을 포함하는 FOLFIRINOX 치료제에 대한 민감도에 중요한 기여를 한다. 이러한 결과로 CE2 평가는 이리노데칸을 기반으로 하는 암 치료에 반응할 가능성이 있는 환자의 하위 집합을 정의하는데 사용될 수 있을 것이다. 그러나, 아직 CE2의 세포 수준과 근본적인 치료 메커니즘 및 부작용에 대한 자료는 부족한 실정이다.
한편, CE2 유전자의 몇 가지 일반적인 유전 변이가 약물 대사 및 임상 결과에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 이에 따라 면역블로팅(immunoblotting), RT-PCR 및 LC-MS와 같은 실험적 기술이 CE2의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 데에 사용될 수 있지만, CE2 활성에 대한 정보를 제공하지 못하고 있다.
이에, 최근에 CE1 또는 CE2를 검출할 수 있는 형광 프로브에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 대부분의 프로브는 단일 검출 영역에서의 형광 세기 변화에 의존하기 때문에 효소 활성을 정량적으로 측정하기는 어려우며, 단파장 광에 의한 여기(excitation)는 샘플을 손상시키고 반응성 종(reactive species)을 생성 시킬 수 있다.
따라서 세포에서 CE2 활성의 직접 측정 및 양적 측정이 가능한 이광자 형광 프로브 개발에 관한 연구가 필요한 실정이다.
1. 대한민국 등록특허 제10-1261791호
본 발명의 목적은 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase2; CE2)의 선택적 검출이 가능한 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 카르복실에스터라제-2의 선택적 검출이 가능한 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 카르복실에스터라제-2 검출용 조성물, 카르복실에스터라제-2 검출용 이광자 형광 프로브, 카르복실에스터라제-2 검출용 키트, 항암제 반응성 예측 키트를 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 카르복실에스터라제-2의 선택적 검출이 가능한 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이용하여 카르복실에스터라제-2를 검출하는 방법, 카르복실에스터라제-2의 활성을 정략적으로 검출하는 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서,
R은 벤조일기(benzoyl), 숙시네이트 에스테르(succinate ester), 숙신산 (succinic acid) 및 바이피페리딘(bipiperidine)으로 이루어진 군에서 선택됨.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 검출용 이광자 형광 프로브를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 항암제 반응성 예측 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2)와 반응 시키는 단계; 및 상기 반응 시킨 반응물의 형광 파장, 형광 세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 측정하는 단계를 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 세포 내 주입하여 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2)와 반응 시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물의 형광신호를 이광자 현미경(TPM)으로 이미지를 관측하는 단계를 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 활성의 정량적 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규 화합물은 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase2; CE2)의 존재에 형광색이 변화하는 반응을 통해 CE2를 검출할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 신규 화합물은 CE1 뿐만 아니라 생물학적으로 관계된 ROS(H2O2, TBHP, OCl-, O2 -, NO, ·OtBu, ·OH, ONOO-), 아미노산(Gly, Ala, Val, Cys, Pro, Leu, Ile, Met, Trp, Phe, Ser, Thr, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp, Glu), 글루코스, 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 인간 혈장, 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase;AChE), 부티릴콜린에스테라제(butyrylcholinesterase;BChE)와 같은 간섭물과 함께 반응하여도 선택적으로 CE2를 검출할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 신규 화합물은 세포에 선택적 표지가 가능하며, 광안정성이 뛰어나고, 세포 독성이 없어 세포 내 CE2 활성 검출에 용이한 효과가 있다.
게다가, 암세포 내 CE2 활성의 직접 측정 및 정량적 검출이 가능하며, 이로써 이리노테칸과 같은 항암제의 반응성 예측이 가능하여 항암제 반응성 예측 키트로서 유용하게 활용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 PBS 버퍼 (10 mM, pH 7.4) 중 (a, b)프로브 1 및 (c, d)프로브 2에 대한 (a, c)단일 광자 형광 스펙트럼 및 (b, d)농도에 따른 형광 세기 플롯을 나타낸 도면이다. 프로브 1 여기 파장 = 348nm, 프로브 1 여기 파장 = 342 nm.
도 2는 (a)PBS 버퍼 (10 mM, pH 7.4) 중 (a)프로브 1 및 (b)프로브 2의 노멀라이즈된 단일 광자 흡수 및 형광 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 3은 120s마다 10 μg mL-1 hCE2를 첨가하기 전과 후에 PBS에서 (a)프로브 1 (1.0 μM)과 (c)프로브 2 (1.0 μM)의 hCE2 형광 스펙트럼과 함께 프로브 1과 프로브 2의 효소 반응을 나타낸 도면이며, 0에서 10 분까지 60 초 간격으로 10 μg mL-1 hCE2를 첨가한 후 (b)프로브 1 및 (d)프로브 2의 V0 대 농도의 플롯이다. (삽입된 도면) 이와 상응하는 이디-호프스티(Eadie-Hofstee) 플롯이다. V0는 초기 반응 속도이며, 여기서 S는 프로브 농도이다. 여기 파장= 373 nm.
도 4는 프로브 2와 화합물 3의 구조 및 프로브 2와 카르복실에스터라제-2의 반응 메커니즘을 나타낸 도면이다.
도 5는 프로브 1 및 프로브 2의 선택성 실험으로, ROS (H2O2, TBHP, OCl-, O2 -, NO, ·OtBu, ·OH, ONOO-), 아미노산(Gly, Ala, Val, Cys, Pro, Leu, Ile, Met, Trp, Phe, Ser, Thr, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp, Glu), 글루코스, BSA, HSA, 인간 혈장, AChE, BChE, hCE1, 및 hCE2 에 대한 (a)프로브 1 (1.0 μM), (b)프로브 2 (1.0 μM)의 형광 반응을 나타낸 도면이다. 막대는 각 종의 첨가 후 0 ~ 1 시간 후 통합된 형광 비율 (Fyellow / Fblue)을 나타낸다. 여기 파장= 373 nm.
도 6은 PBS 버퍼 (10 mM, pH 7.4) 중 (a)프로브 1 및 (b)프로브 2 대 hCE2에 대한 평균 Fyellow / Fblue 비율의 플롯을 나타낸 도면이다. 각 데이터는 37 ℃에서 hCE2 첨가 후 40분에 얻어졌다. 프로브 1과 프로브 2의 검출 한계는 각각 1.6 nM과 7.7 nM으로 3σ/k로 계산되었다. 여기서 σ는 블랭크 측정의 표준 편차, k는 기울기이다. 여기 파장= 373 nm.
도 7은 시간 경과에 따른 (a, c)(a)프로브 1 및 (c)프로브 2로 표지된 RKO 세포의 TPM 이미지 (Fyellow / Fblue), (b, d)패널 a와 c의 상대적 TPEF 세기를 나타낸 도면이다. 디지털화된 세기는 xyt 모드를 사용하여 2.00초 간격으로 1시간 동안 기록되었다. 이미지는 740 nm 여기 및 400-450 nm (청색), 500-600 nm (노란색)의 방출 창을 사용하여 수집되었다. 스케일 바 = 50 μm.
도 8은 CCK-8 키트를 이용하여 측정된 프로브 1과 프로브 2의 존재하에 RKO 세포의 세포 생존율을 나타낸 도면이다. 세포들은 0 - 20 μM의 프로브와 2시간동안 반응시켰다.
도 9는 (a)2시간 동안 프로브 2로 표지된 RKO 세포의 비율계량 TPM 이미지 (Fyellow / Fblue); 세포를 LPA (100 μM)로 20 분간, 5-Fu (10 μM)으로 48 시간 동안 전처리 한 후, 프로브 2(2.0 μM)로 표지스케일 바 = 25 μm, (c)프로브 2로 2시간 동안 표지된 RKO, HCT 116 및 SW 837 세포의 비율계량 TPM 이미지 (Fyellow / Fblue)스케일 바 = 25 μm, (b, d) TPM 이미지의 평균 Fyellow / Fblue 세기 비율, (e) CE1 및 CE2의 웨스턴 블롯 분석 (CE2의 밴드 세기는 각각 β-액틴 밴드에 대해 표준화되었다.)을 나타낸 도면이다.
도 10은 (a)프로브 2로 2시간 동안 표지된 MCB-10A, MDA-MB 468, MDA-MB 231 및 MCF-7 세포의 비율계량 TPM 이미지(Fyellow / Fblue), 스케일 바 = 25 μm, (b)TPM 이미지의 평균 Fyellow / Fblue 세기 비율, (c)CE1 및 CE2의 웨스턴 블랏 분석(CE2의 밴드 세기는 각각 β-액틴 밴드에 대해 표준화되었다.)을 나타낸 도면이다.
도 11은 (a-c) MDA-MB 468 및 MDA-MB 231 세포를 마크(mock) 벡터 또는 MYC-DDK- 표지된 CE2 플라스미드로 24시간 동안 트렌스펙션 시켰으며, (a)트렌스펙션 후 세포의 비율계량 TPM 이미지(Fyellow / Fblue), 스케일 바 = 25 μm, (b)TPM 이미지의 평균 Fyellow / Fblue 세기 비율, (c)Myc 및 β- 액틴의 웨스턴 블랏 분석, (d)마크(mock) 벡터 또는 CE2 플라스미드로 트렌스펙션된 MDA-MB 468 세포의 이리노테칸 처리 후의 세포 생존율을 나타낸 도면이다.
이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase2; CE2)의 선택적 검출이 가능한 이광자 형광 신규 화합물을 합성하였으며, 이러한 화합물은 CE2에 선택적으로 반응하여 형광색을 청색에서 노란색으로 변화시켜 CE2의 검출이 가능함을 확인하였다. 특히, 프로브 2는 암세포 내 CE2 활성의 직접 측정 및 정량적 검출이 가능함을 확인하였으며, 이로써 이리노테칸과 같은 항암제의 반응성 예측이 가능하여 항암제 반응성 예측 키트로서 유용하게 활용될 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 화학식 1에서,
R은 벤조일기(benzoyl), 숙시네이트 에스테르(succinate ester), 숙신산 (succinic acid) 및 바이피페리딘(bipiperidine)으로 이루어진 군에서 선택됨.
이때, 상기 R은 숙시네이트 에스테르(succinate ester)로 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 2]
Figure pat00003
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 검출용 이광자 형광 프로브를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 항암제 반응성 예측 키트를 제공한다.
여기서, 상기 항암제는 전구체(prodrug) 형태의 항암제인 것을 특징으로 하며, 상기 항암제는 이리노테칸(irinotecan), 카페시타빈(capecitabine), 독소루비신(doxorubicin)의 전구체 및 젬시타빈(gemcitabine)의 전구체으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항암제 반응성 예측 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2)와 반응 시키는 단계; 및 상기 반응 시킨 반응물의 형광 파장, 형광 세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 측정하는 단계를 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 검출 방법을 제공한다.
이때, 상기 지표 측정으로 비율계량(ratiometric) 형광 변화를 확인하기 위해 420 ~ 470nm (Fblue) 및 520 ~ 570nm (Fyellow)에서 형광 세기 비율 (Fyellow / Fblue)을 측정하여 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2)를 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 세포 내 주입하여 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2)와 반응 시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물의 형광신호를 이광자 현미경(TPM)으로 이미지를 관측하는 단계를 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 활성의 정량적 검출 방법을 제공한다.
이때, 상기 이미지 관측으로 비율계량(ratiometric) 형광 변화를 확인하기 위해 420 ~ 470nm (Fblue) 및 520 ~ 570nm (Fyellow)에서 형광 세기 비율 (Fyellow / Fblue)을 측정하여 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 활성의 정량적 검출을 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 이광자 형광 프로브1 및 프로브 2의 합성
프로브 1과 프로브 2의 합성과정은 하기 반응식 1에 나타내었다. 화합물 3과 4는 공지된 방법(Anal. Chem.2014, 86, 10001-10005., New J. Chem. 2010, 34, 594-598.)에 의해 제조되었다.
[반응식 1]
Figure pat00004
1. 이광자 형광 프로브 1의 합성
1-1. 화합물 5a의 제조
화합물 4의 혼합물(500 mg, 1.55 mmol), 벤조산 무수물 (1753 mg, 7.75 mmol) 및 트리에틸아민 (2 mL) 중 4-디메틸 아미노 피리딘 (189 mg, 1.55 mmol)의 혼합물을 질소대기하에서 하룻밤동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 디클로로 메탄 (10 mL)으로 추출하고, 물 (5 mL) 및 염수 (5 mL × 2)로 헹궈냈다. 유기상을 감압하에서 농축하고, 칼럼 크로마토그래피 (헥산 / 에틸 아세테이트 = 20 : 1)로 정제하여 무색의 오일로서 화합물 5a (443 mg)를 수득 하였다. 수율 : 67 %.
1-2. 화합물 6a의 제조
화합물 5a (440 mg, 1.03 mmol)를 THF (10 mL) 및 탈 이온수 (5 mL)의 공용 매에 용해시킨 후, 아이스 욕에서 30분 동안 교반하였다. 빙초산 (10 mL)을 상기 용액에 첨가하고 0 ℃에서 하룻밤동안 교반 하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔여물을 에틸 아세테이트 (50 mL)에 용해시키고, 물 (30 mL), 10 % 중탄산 나트륨(30 mL) 및 염수 (30mL × 2)로 헹궈냈다. 유기상을 무수 황산나트륨상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜 무색의 오일로서 화합물 6a (257 mg)를 얻었다. 수율 : 92 %.
1-3. 화합물 7a의 제조
화합물 6a (420 mg, 1.34 mmol)를 디클로로메탄 (10 mL)에 용해시켰다. 그 후, 피리딘 클로로크로메이트 (pyridine chlorochromate;PCC, 580 mg, 2.69 mmol)를 상기 용액에 첨가 한 후, 실온에서 질소 대기하에 3 시간 동안 교반 하였다. 용리액을 모으기 위해 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 감압하에 증발시켰다. 용매를 증발시킨 후, 컬럼 크로마토 그래피 (헥산 / 에틸 아세테이트 = 4 : 1)로 정제하여 화합물 7a (233 mg)를 무색 오일로서 수득하였다. 수율 : 75 %.
1-4. 화합물 8a의 제조
화합물 7a (200 mg, 0.644 mmol)를 아세톤 (5 mL) 및 탈이온수 (5 mL)의 공용매에 용해시켰다. 그 후, 아세톤 (5 ㎖) 및 탈이온수 (5 ㎖)의 공용매 중 과망간산 칼륨 (Ⅶ) (102 mg, 0.644 mmol)의 용액을 상기 용액에 한방울씩 떨어트려 첨가한 후, 실온하에 하룻밤동안 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 디클로로 메탄 (30 mL)에 용해시키고 물 (10 mL) 및 염수 (10 mL × 2)로 세척 하였다. 유기상을 무수 황산나트륨상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜 화합물8a (191 mg)를 무색 오일로서 수득하였다. 수율 : 91 %.
1-5. 프로브 1의 제조
N,N-디메틸 포름 아미드 (5 mL)와 피리딘 (5 mL)의 공용매에 화합물 7a (200 mg, 0.613 mmol) 및 N-(3-디메틸 아미노 프로필)-N'-에틸 카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 235 mg, 1.23 mmol) 을 용해시킨 다음, 실온에서 1 시간 동안 교반 하였다. 그 후, 화합물 3 (160 mg, 0.306 mmol)을 상기 용액에 첨가 한 후, 실온에서 질소 대기하에 2일 동안 교반 하였다. 용매를 증발시킨 후, 에틸 아세테이트 (30 mL)에 용해시키고 물 (10 mL) 및 염수 (10 mL × 2)로 세척 하였다. 유기상을 감압하에 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피 (클로로포름 / 메탄올 = 10 : 1)로 정제하여 백색 반고체로서 프로브 1 (46mg)을 수득하였다. 수율 : 18 %.
2. 이광자 형광 프로브 2의 합성
2-1. 화합물 5b의 제조
디클로로메탄 (5 mL) 중 모노-메틸 수소 숙시네이트 (82 mg, 0.620 mmol) 및 N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC, 154 mg, 0.744 mmol)의 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 디클로로메탄 (5 mL) 중 용액 4 (200 mg, 0.620 mmol) 및 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 154 mg, 0.744 mmol)을 상기 용액에 한방울씩 첨가한 후, 질소 분위기하에 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 석출된 디사이클로헥실우레아를 여과하여 제거하고, 여과액을 염수 (10 mL × 3)로 세척 하였다. 유기상을 감압 농축하고, 칼럼 크로마토그래피 (헥산 / 에틸 아세테이트 = 9 : 1)로 정제하여 화합물 5b (236 mg)를 무색 오일로서 수득 하였다. 수율 : 87 %.
2-2. 화합물 6b의 제조
상기 화합물 6a의 제조 방법을 따랐다. 화합물 6b를 화합물 5b로부터 무색의 오일로서 수득하였다. 수율 : 97 %.
2-3. 화합물 7b의 제조
상기 화합물 7a의 제조 방법을 따랐다. 화합물 7b를 화합물 6b로부터 무색의 오일로서 수득하였다. 수율 : 89 %.
2-4. 화합물 8b의 제조
상기 화합물 8a의 제조 방법을 따랐다. 화합물 8b를 화합물 7b로부터 무색의 오일로서 수득하였다. 수율 : 98 %.
2-5. 프로브 2의 제조
상기 프로브 1의 제조 방법을 따랐다. 프로브 2는 백색 반고체로서 화합물 및 화합물 8b로부터 수득 하였다. 수율 : 11 %.
<실시예 2> 분광 측정
형광 스펙트라는 FluoroMate FS-2 형광 분광 측정기를 이용하여 얻어졌으며, 흡광 스펙트라는 S-3100 UV-Vis 분광 측정기를 이용하여 1-cm의 쿼츠 셀로 측정되어 얻어졌다. 양자(quantum) 형광 수율은 9,10-디페닐안트라센(9,10-diphenylanthracene) (Φ = 사이클로 헥산 중 0.93)을 사용하여 알아냈다.
<실시예 3> 이광자 단면 측정
이광자 단면(δ)은 펨토초(femtosecond;fs) 형광측정 기술을 이용하여 얻어졌다. 10% DMF를 포함하는 PBS 버퍼에(10 mM, pH 7.4) 프로브(1.0 x 10-6 M)를 용해시키고, 이광-유도된 형광 세기는 720 - 880nm에서 레퍼런스(reference)로 로다민 6G를 이용함으로써 측정되었다. 같은 여기 파장에서 방출된 샘플 및 레퍼런스의 형광 세기를 측정하였다. 이광자 동작(two-photon action;TPA) 단면은 δ = δr (SsФr∮rcr) / (SrФs ∮scs)를 사용하여 계산되었으며, 아래 첨자 r 및 s는 레퍼런스 및 샘플 분자를 나타내며, δr은 레퍼런스 분자의 TPA 단면이다. CCD 검출기에 모아진 신호 세기는 S로 표시되고, Ф는 양자 형광 수율이며,∮는 실험 장치의 전체 형광 수집 효율이다. c는 용액에서 분자 수 밀도를 나타낸다.
<실시예 4> 효소 반응속도(kinetics) 분석
96-웰 플레이트를 갖는 Varioskan Flash 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 효소 반응속도 분석을 얻었다. 다양한 농도의 프로브 1과 프로브 2 (0-60 μM)를 PBS 버퍼 (10 mM, pH 7.4)을 이용하여 준비하였다. 인간 카르복실에스터라제(Human carboxylesterase) 효소를 10 μg mL-1의 농도로 첨가하고, 37 ℃에서 60 초 간격으로 프로브 1은 440 nm, 프로브 2는 455 nm에서 형광 세기를 각각 모았다 (λex = 373 nm). 반응의 초기 속도 (V0)는 0 ~ 10 분의 선형 지속 시간을 이용하여 결정되었다. Michaelis-Menten 방정식 반응속도 파라미터는 OriginPro 8.0으로 계산되었다.
<실시예 5> 선택성 분석
각 종들 (200 μM ROS, 1 mM 아미노산 및 글루코스, 50 μg mL-1 BSA, 50 μg mL-1 HSA, 0.1 % 인간 혈장, 10 μg mL-1 AChE, 10 μg mL-1 BChE, 10 μg mL-1 hCE1 및 hCE2)를 PBS 버퍼 (10 mM, pH 7.4) 중의 1 μM 프로브에 투여하고, 시간에 따라 형광 스펙트럼을 측정하였다. 아미노산 (LAA21), 글루코스 (G7528), 소 혈청 알부민 (BSA, A2154), 인간 혈청 알부민 (HSA, A1653), 인간 혈장 (H4522), 아세틸콜린에스터라제 (AChE, C2888, 1000 units mg-1), 부티릴콜린에스터라제 (BChE, C7512, 10 units mg-1) 및 인간 카르복실에스터라제-2 (hCE2, E02, 500 units mg-1)는 시그마 알드리치로부터 구입 하였다.
<실시예 6> 세포배양
모든 세포들은 유리-바닥 디쉬(NEST)에서 배양되었으며, 37℃에서 공기 중5 % CO2의 가습 분위기에서 2일 동안 이미징 전에 배양 하였다. 세포를 2 μM 프로브로 처리하고, 2시간 동안 반응시킨 후, 무-혈청 배지를 사용하여 2회 세척 하였다. 각 세포 배양 배지에는 10 % FBS (WelGene), 페니실린 (100 units mL-1) 및 스트렙토마이신 (100 μg mL-1)을 추가적으로 첨가하였다. RKO 세포(대장암 세포), HCT 116 세포(대장암 세포), SW 837 세포(대장암 세포) 및 MCF-7 세포(유방암 세포)의 배양 배지로 DMEM을 이용하였다. MCF-10A 세포(유방상피세포)의 배양 배지로 MEGM를 이용하였다. MDA-MB 468 세포(유방암 세포) 및 MDA-MB 231 세포(유방암 세포)의 배양 배지로 RPMI1640을 이용하였다.
<실시예 7> 이광자 형광 현미경
이광자 형광 현미경 이미지는 x40 오일 대물렌즈, 개구 수(numerical aperture;NA)=1.30을 갖춘 다광자 현미경 (Leica TCS SP8 MP) 으로 740nm의 파장과 초점면에 4.14 x 108 mW cm-2의 평균 출력에 해당하는 2490mW의 출력의 모드-락(mode-locked) 티타늄 사파이어 레이저 소스로 프로브를 여기시킴으로써 얻어졌다. 400-450nm(Fblue)와 500-600nm(Fyellow)의 범위에서 이미지를 얻었으며, 비율적 이미지 처리 및 분석은 MetaMorph 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
<실시예 8> 광안정성
프로브의 광 안정성은 편향 없이 선택된 프로브 표지된 (2.0 μM) RKO 세포의 3 개의 지정된 위치에서 시간에 따른 TPEF 세기의 변화를 모니터링함으로써 확인되었다.
<실시예 9> 웨스턴 브롯팅(Western blotting)
세포를 PBS 버퍼로 세척하고, SDS-PAGE 샘플 버퍼 (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10 % 글리세롤, 1 % SDS 및 5 % β- 머캅토에탄올)를 용해시켰다. 용해물을 5분동안 가열하고, SDS-PAGE로 분리한 후, 이모빌론(Immobilon) 멤브레인 (Millipore, Bredford, MA, USA)으로 옮겼다. 5 % 탈지유를 30분 동안 반응시켜 비특이적 결합 사이트를 차단한 후, 멤브레인을 특정 항체와 함께 2시간 동안 반응시켰다. 항체는 CES2 (Santa Cruz biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), β- 액틴(β-actin) 및 Myc (Abcam, Cambridge, MA, USA)를 이용하였다. 그 후, 멤브레인을 TBST로 3회 세척하고, 1시간 동안 호스래디시(horseradish) 퍼옥시다아제-결합된 항-토끼 항체 또는 항-마우스 항체로 반응시켰다. 단백질 밴드의 확인은 ECL (Advansta, Menlo Park, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 각 단백질 밴드는 NIH ImageJ 프로그램을 사용하여 농도 측정 분석에 의해 정량화되었다. β- 액틴과 비교하여 단백질 수준의 변화는 농도 측정 분석에 의해 입증되었다.
<실시예 10> 트렌스펙션(transfection)에 의한 CE2의 과발현
MDA-MB 468 및 MDAMB 231 세포를 1 x 105 cells/well 농도로 20 mm 유리 바닥 세포 배양 디쉬에 도말하였다. 24시간 후, TransIT®-2020 시약 (Mirus, San Diego, CA, USA)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 CE2 (CES2 human tagged (MYC-DDK) ORF 클론, OriGene Technologies, Rockville, MD, USA)를 암호화하는 플라스미드로 세포를 트렌스펙션 하였다. 트렌스펙션된 세포를 48시간 동안 배양하고 프로브 2로 염색 하였다. CE2의 발현을 더 확인하기 위해, 표지된 MYC의 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
<실시예 11> 세포 생존율 측정
세포 (5 × 104 cells)를 24-웰 플레이트에서 배양하고, 10μmolL-1 의 이리노테칸으로 24시간 동안 처리하였다. 세포 생존율의 측정을 위해, 세포(live) 내 에스테라아제 활성의 지표인 녹색 형광 칼세인(calcein)-AM (분자 프로브, Eugene, OR, USA) 2 μmol L-1 와 멤브레인에 손상 세포 (죽은 세포)의 지표인 적색 형광EthD-1(분자 프로브) 4 μmol L-1 을 각 웰에 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO2에서 5 분간 배양하였다. Zeiss 필터 세트 # 46 및 # 64HE가 장착된 형광 현미경 (Axiovert 200M, Carl Aeiss) 으로 세포를 관찰하여 녹색 세포만 생존한 것으로 계산되었다. 각 실험은 적어도 세 번 반복되었으며, 살아있는 세포의 백분율은 아무 처리도 되지 않은 대조군 세포의 백분율 (100 %)로 표준화되었다.
<실시예 12> 통계 분석
모든 데이터는 평균±표준평균오차(SEM)로 표현되었다. 통계분석은 Prism 5.03 소프트웨어(GraphPad Prison, Lajolla CA, USA)를 이용하여 수행되었다. 통계적 차이는 스튜던트 t-test를 이용하여 확인되었다. p <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
<실험예 1> 물 용해도 분석
프로브 1과 프로브 2의 원액(1.0 x 10-2M)을 제조하기 위해 프로브를 DMSO에 용해시켰다. 상기 원액을 6.0 × 10-6 ~ 5.0 × 10-8M 으로 희석하고, 마이크로 실린지를 사용하여 PBS 버퍼(10mM, pH 7.4) 3.0mL를 함유하는 큐벳에 첨가 하였다. 모든 경우에, 버퍼 중의 DMSO 농도는 0.1%로 유지되었다. 프로브 농도에 대한 형광 세기의 플롯은 저농도에서는 선형이었으며, 고농도에서는 하향 곡률을 보였다(도 1). 선형 영역의 최대 농도를 용해도로 정하였다. 프로브 1과 프로브 2의 용해도 값은 각각 1μM, 2μM이었으며, 이로써 각 프로브는 생체에 잘 용해되며, 세포들을 염색하기에 충분함을 확인하였다.
<실험예 2> 프로브 1, 프로브 2 및 화합물 3의 광 물리적 특성
PBS 버퍼(10mM, pH 7.4, 37℃)에서 프로브 1은 348nm에서 최대 흡광(λabs)(ε = 2.16 x 10-4 M-1cm-1)과 440nm에서 최대 발광(λfl)을 보여주었다. 또한, PBS 버퍼(10mM, pH 7.4, 37℃)에서, 프로브 2는 342nm에서 최대 흡광(λabs)(ε = 2.61 x 10-4 M-1cm-1)과 455nm에서 최대 발광(λfl)으로 강한 청색 형광을 방출했다(표 1, 도 2). 그 후, hCE2가 첨가되면 화합물 3이 형성되면서 프로브의 형광은 점차적으로 더 긴 파장 범위로 이동했다(최대 형광 파장 540 nm, 도 3a, c). 이러한 결과는 도 4와 같이 효소 반응 후에 트리메틸 락 링커가 빠르게 제거 되었기 때문이다. 결과적으로, 강한 전자 공여체를 함유하는 반응된 형태가 생성되므로, 분자 내 전하 이동 특성이 향상된다. 이광자 동작 단면적(two-photon action cross section,
Figure pat00005
δmax)은 로다민 6G(rhodamine-6G)를 레퍼런스로 하여 TPEF(two-photon excited fluorescence) 스펙트럼을 분석하여 얻어졌다. 프로브 1과 프로브 2는 740nm, 화합물 3은 750nm에서 큰 이광자 형광 효율을 보였으며,
Figure pat00006
δmax 값은 각각 11, 15, 72GM 으로 나타났다(표 1).
화합물 λabs max(10-4ε) (ac) λfl max (ad)
Figure pat00007
(ae)		 λ(2) max (bd)
Figure pat00008
δ(2) max (bg)
프로브 1 348(2.16) 440 0.23 740 14
프로브 2 342(2.61) 455 0.57 740 15
화합물 3 378(2.50) 540 0.16 750 72
(a): PBS 버퍼(10mM, pH 7.4, 37℃), (b) 10% DMF를 포함하는 PBS 버퍼, (C): 흡광 스펙트럼에서의 λmax[nm]. 괄호 안의 숫자는 몰 흡광 계수 M-1 cm-1이다., (d): 형광 스펙트럼에서의 λmax[nm], (e): 형광 양자(quantum) 수율, ±10%, (f): 이광자 형광 스펙트럼의 λmax[nm], (e): 이광자 동작 단면적[GM](1 GM = 10-50 cm4s photon-1).
<실험예 3> 프로브의 선택성 분석
CE2에 대한 프로브의 선택성을 조사하였다. CE2가 첨가되었을 때 420-470nm (Fblue)와 520-570nm (FYellow)의 범위에서 프로브 2의 비율 (FYellow / Fblue)이 70 배 증가했다(도 5). 반면에, CE1 첨가 후, 프로브 2의 스펙트럼 변화는 매우 작았다. 프로브 1도 이와 유사하게 나타났다.
반응-기반 프로브와 효소의 반응속도 분석은 정량적 응용에 중요한 정보를 제공한다. 프로브 2의 효소 반응 속도는 미카엘리스 - 멘텐 (Michaelis-Menten) 방법에 따라 계산되었고, 이와 상응하는 이디-호프스티(Eadie-Hofstee) 플롯에 의해 확인되었다(도 3). 프로브 1의 CE2에 대한 겉보기 특이 상수는 kcat / Km = 5.7 × 103 M-1 s-1이었으며, 여기서 Km = 6.2 ± 0.3 μM 였다. 프로브 2의 CE2에 대한 겉보기 특이 상수는 kcat / Km = 3.8 × 103 M-1 s-1이었으며, 여기서 Km = 8.8 ± 0.4 μM이었으나, hCE1의 변화 간격에서 계산된 값은 프로브 1과 2에서 각각 kcat / Km = 1.6 × 103 M-1 s-1 , kcat / Km = 1.9 × 103 M-1 s-1 으로 더 작았다. 이러한 결과는 프로브가 CE1 보다 CE2를 더 선호한다는 것을 보여주며, 이로써 프로브 1과 2는 CE2의 선택성이 우수함을 확인하였다. 또한, Fyellow / Fblue 대 hCE2 농도 0 ~ 170nM의 범위의 플롯은 선형 관계를 나타냈으며 (도 6), 이것으로 프로브 1과 프로브 2가 각각 1.6nM, 7.7nM 농도의 hCE2를 검출 할 수 있음을 확인하였다.
이후, 다른 생체활성(bioactive) 종에 대한 선택성 시험을 수행하였다. 프로브 1과 2는 ROS(H2O2, TBHP, OCl-, O2 -, NO, ·OtBu, ·OH, ONOO-), 아미노산(Gly, Ala, Val, Cys, Pro, Leu, Ile, Met, Trp, Phe, Ser, Thr, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp, Glu), 글루코스, 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 인간 혈장, 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase;AChE), 부티릴콜린에스테라제(butyrylcholinesterase;BChE)와 같은 기타 가수 분해 효소에도 민감하지 않았으며, 같은 양 (10 ㎍ mL-1) 및 활성 (5 units mL-1) 조건 하에서도 약한 반응을 보였다(도 5).
<실험예 4> 세포 내 프로브의 특성 분석
1. 프로브의 세포 선택성 분석
RKO 대장암 세포를 이용하여 장에서 높게 발현된다고 보고되는 CE2에 대해 프로브의 이광자 현미경(two-photon microscope;TPM) 이미징 기능을 시험하였다. 살아있는 RKO 세포를 프로브로 염색하고, 740nm의 이광자 여기(excitation) 소스(source)로 관찰 하였다. 온도(37℃), 습도(90%) 및 CO2(5%)를 일정 수준으로 유지하기 위해 항온 처리 챔버에서 이미징을 관찰했다. 그 결과, 명확한 TPM이미지가 얻어졌으며, 이것으로 프로브는 세포에 잘 염색될 수 있음을 확인하였다(도 7a, c)
2. 세포 내 세포독성 분석
RKO 세포에서 프로브 1과 프로브 2의 세포독성 을 분석하기 위해, CCK-8 키트(Cell Counting Kit-8, Dojindo, Japan)를 이용하여 제조사의 실험방법에 따라 세포 생존율을 분석하였다. 그 결과, 도 8에서도 알 수 있듯이, 프로브 1과 프로브 2는 이미징 조건(프로브 농도 2μM)에서 무시할만한 세포독성을 보였다.
3. 세포 내 광안정성 분석
청색(400-450 nm, Fblue)와 노란색(500-600 nm, FYellow) 범위를 비율 이미지(FYellow / Fblue)에 대한 적절한 검출 영역으로 선택했다. 형광 세기는 프로브의 광안정성을 측정하기 위해 매 2s 마다 연속적으로 기록하였다(도 7b, d). 프로브 2의 형광 세기는 거의 일정했으며, 이것은 강한 광안정성과 빠른 효과 반응 거동을 반영한 것이다. 반면에 프로브 1은 불안정한 것으로 나타났는데, 시간에 따라 Fblue의 감소와 함께 FYellow의 형광은 증가함을 보여주었다 (도 7b).
이러한 결과로, 프로브 2는 이광자 형광 현미경 이미지에 적절함을 확인하였으며, 하기의 추가적인 실험은 프로브 2를 이용하여 수행하였다.
<실험예 5> 프로브 2를 이용한 CE2 활성 측정
프로브 2를 이용한 CE2의 활성 측정이 CE2의 억제제 또는 유도제로 처리된 살아있는 세포에서의 활성 변화를 나타낼 수 있는지 여부를 시험하였다. RKO 대장암 세포를 프로브 2(2.0μM)로 염색한 후 촬영한 이광자 이미지는 핵을 제외한 세포 전반에 걸쳐 프로브가 존재함을 나타내었으며, 평균 Fyellow/ Fblue 비율 값은 1.09로 계산되었다(도 9a). 로페라미드(loperamide;LPA, CE2의 억제제, 100μM)와 5-플루오로 우라실 (5-fluorouracil;5-Fu, CE2 유도제, 10μM)로 처리한 후, 비율 값은 각각 0.48과 2.28로 바뀌었다(도 9b).
이러한 결과로 프로브 2를 사용한 TPM 결과가 억제제 또는 활성화제에 대한 반응으로 살아 있는 세포 내 CE2 활성의 변화를 정확하게 나타낼 수 있음을 알아냈다.
다음으로, 몇 가지 대장암 세포주에서 CE1과 CE2에 대한 특이 항체를 사용한 웨스턴 블럿팅(western blotting) 결과와 TPM 결과를 비교하였다. 프로브 2를 사용하여 CE2 활성을 측정한 결과, RKO 세포에서의 비율 값은 HCT 116 세포보다 높았고, SW 837 세포에서 가장 낮음을 확인하였다(도 9d). 또한, CE2의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석 결과 대장암 세포주에서 CE2 단백질 수준의 순서는 RKO> HCT 116> SW 837 세포 순인 것으로 나타났으며(도 9e), 이는 대장암 세포에서 프로브 2 기반 CE2 활성과 CE2 단백질 수준 간에 매우 좋은 상관관계를 보여 주었다(도 9d 및 9e). 그러나, CE1의 발현은 검출되지 않았으며, 이는 장에서 CE2만이 높게 발현된다는 이전의 보고와 일치했다. 이러한 결과로 다른 유형의 암 세포에서 CE2 활성을 측정할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구로서 프로브 2의 잠재적인 적용 가능성을 확인하였다.
<실험예 6> 유방암 세포에서 CE2의 활성 측정
다른 유형의 암 세포에 비해 유방암 세포에서 CE2의 발현 및 활성에 대한 정보는 매우 제한적이다. 따라서, 프로브 2가 유방암 세포와 정상 유방 세포에서 CE2의 활성을 평가하는데 사용될 수 있는지 여부를 시험하였다. 그 결과, MDA-10A 정상 유방 세포에서 프로브 2의 TPM 비율은 1.72로 현저히 높았지만, 유방암 세포인 MDA-MB 468, MDA-MB 231 및 MCF-7 세포에서는 훨씬 낮은 값을 갖음을 확인하였다(도 10a, b). 이러한 결과로 유방암 세포의 CE2 활성은 정상적인 유방 세포보다 훨씬 낮음을 알아냈다. 또한, 웨스턴 블랏 분석에서 MCF-10A 세포에서는 CE2의 매우 높은 단백질 수준을 나타냈지만, MDA-MB 468 세포에서 CE2는 매우 약하게 발현되었다 (도 10c). MDA-MB 231 및 MCF-7 세포에서는 CE2 단백질 수준을 검출할 수 없었다(도 10c). 이러한 결과로 프로브 2를 사용하여 측정된 CE2 활성은 유방 세포의 단백질 수준과 좋은 상관관계를 보여주었다.
<실험예 7> 유방암 세포에서 항암제의 반응성 예측
내인성 CE2 단백질 수준이 낮은 유방암 세포에서 CE2를 외인성으로 발현함으로써 CE2 활성을 측정할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구인 프로브 2의 잠재적인 적용 가능성을 확인하였다. Myc-DDK-표지된 CE2를 암호화하는 플라스미드로의 트렌스펙션(transfection)은 MDA-MB 468 및 MDA-MB 231 세포 모두에서 CE2의 활성뿐만 아니라 단백질 수준을 매우 증가시켰으나, 마크(mock) 벡터에서는 이러한 변화가 보이지 않았다(도 11a-c).
췌장암 세포에서 이리노테칸의 CE2 활성과 반-최대 억제 농도(IC50)의 반비례 관계가 보고되었으므로 CE2의 강제 발현이 유방암 세포의 이리노테칸 민감성을 향상시킬 수 있는지 여부를 더 시험하였다. MDA-MB 468 및 MDA-MB-231 세포를 Myc-DDK-표지 CE2 플라스미드로 트렌스펙션(transfection)한 다음 10μM 이리노테칸으로 24시간동안 처리하였다. 이후, 세포 생존율의 측정은 MDA-MB 468 및 MDA-MB-231 세포에서 CE2 과발현에 의해 이리노테칸으로 매개된 세포 사멸이 유의하게 향상되었음을 보여 주었다 (도 11d). 이러한 결과로 프로브 2가 이리노테칸 기반 암 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 도구로 잠재적인 응용 가능성이 있음을 확인하였다.
상기와 같이 CE2의 단백질 수준과 활성이 정상 세포보다 유방암 세포에서 현저히 낮음을 알아냈다. 또한, 프로브 2가 세포 내에서 CE2 활성의 차이를 정량적으로 평가하고, 직접 검출하는데 유용함을 명확하게 보여주었다. 따라서 고형(solid) 종양에서 CE2 활성을 쉽고, 정확하게 측정할 수 있는 도구로서 프로브 2의 이용은 이리노테칸 치료의 임상 결과를 개선시키고, 이의 부작용을 피할 수 있는 중요한 정보를 제공할 수 있을 것이다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure pat00009

    상기 화학식 1에서,
    R은 벤조일기(benzoyl), 숙시네이트 에스테르(succinate ester), 숙신산 (succinic acid) 및 바이피페리딘(bipiperidine)으로 이루어진 군에서 선택됨.
  2. 제1항에 있어서,
    하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
    [화학식 2]
    Figure pat00010
  3. 제 1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 검출용 조성물.
  4. 제 1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 검출용 이광자 형광 프로브.
  5. 제 1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 검출용 키트.
  6. 제 1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 항암제 반응성 예측 키트.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 항암제는 전구체(prodrug) 형태의 항암제인 것을 특징으로 하는 항암제 반응성 예측 키트.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 항암제는 이리노테칸(irinotecan), 카페시타빈(capecitabine), 독소루비신(doxorubicin)의 전구체 및 젬시타빈(gemcitabine)의 전구체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항암제 반응성 예측 키트.
  9. 제 1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2)와 반응 시키는 단계; 및
    상기 반응 시킨 반응물의 형광 파장, 형광 세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 측정하는 단계를 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 검출 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 지표 측정으로 비율계량(ratiometric) 형광 변화를 확인하기 위해 420 ~ 470nm (Fblue) 및 520 ~ 570nm (Fyellow)에서 형광 세기 비율 (Fyellow / Fblue)을 측정하는 것을 특징으로 하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 검출 방법.
  11. 제 1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 세포 내 주입하여 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2)와 반응 시키는 단계; 및
    상기 반응시킨 반응물의 형광신호를 이광자 현미경(TPM)으로 이미지를 관측하는 단계를 포함하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 활성의 정량적 검출 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 이미지 관측으로 비율계량(ratiometric) 형광 변화를 확인하기 위해 420 ~ 470nm (Fblue) 및 520 ~ 570nm (Fyellow)에서 형광 세기 비율 (Fyellow / Fblue)을 측정하는 것을 특징으로 하는 카르복실에스터라제-2(Carboxylesterase-2) 활성의 정량적 검출 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102427539B1 (ko) * 2021-02-04 2022-08-01 아주대학교산학협력단 사이클로옥시게나아제-2 검출용 이광자 형광 프로브 및 이의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101261791B1 (ko) 2011-08-17 2013-05-09 단국대학교 산학협력단 생체 세포 내 알칼리 인산분해효소의 활성도 탐지를 위한 형광 프로브
KR20170120360A (ko) * 2016-04-21 2017-10-31 아주대학교산학협력단 카르복실에스터라제에 선택적으로 감응하는 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 생체 내 카르복실에스터라제의 정량적 영상화 방법
CN107502652A (zh) * 2016-06-14 2017-12-22 中国科学院大连化学物理研究所 一种酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒及其使用方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101261791B1 (ko) 2011-08-17 2013-05-09 단국대학교 산학협력단 생체 세포 내 알칼리 인산분해효소의 활성도 탐지를 위한 형광 프로브
KR20170120360A (ko) * 2016-04-21 2017-10-31 아주대학교산학협력단 카르복실에스터라제에 선택적으로 감응하는 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 생체 내 카르복실에스터라제의 정량적 영상화 방법
CN107502652A (zh) * 2016-06-14 2017-12-22 中国科学院大连化学物理研究所 一种酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒及其使用方法与应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102427539B1 (ko) * 2021-02-04 2022-08-01 아주대학교산학협력단 사이클로옥시게나아제-2 검출용 이광자 형광 프로브 및 이의 용도

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