CN114262272B

CN114262272B - 萘-茚二酮给受体类化合物及其制备方法与其在脂滴免洗荧光探针中的应用

Info

Publication number: CN114262272B
Application number: CN202111603640.8A
Authority: CN
Inventors: 牛广乐; 冯璐; 朱婷; 赵梦莹
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-02-17
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: CN114262272A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及萘‑茚二酮给受体类化合物及其制备方法与其在脂滴免洗荧光探针中的应用。其化学结构如式I所示：

其中，R₁、R₂分别独立为氢、低级烃基、醚基、取代烷基或酰基；R₃、R₄、R₅、R₆分别独立为氢、甲基、氟、氯、溴、碘、氰基、三卤甲基、硝基、苯基或吡啶基。以本发明提供的萘‑茚二酮给受体类化合物作为脂滴荧光探针，在高极性溶剂中表现出非常微弱的荧光，但在低极性环境中却显著增加了荧光发射，可以以免洗的方式高选择性和高对比度地点亮脂滴，同时能够成功实现脂肪肝组织的选择性区分。与现有油红O染色比，本发明的荧光探针具有灵敏度高、选择性好、省时、操作简单、孵育浓度低等优点。

Description

萘-茚二酮给受体类化合物及其制备方法与其在脂滴免洗荧光探针中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及萘-茚二酮给受体类化合物及其制备方法与其在脂滴免洗荧光探针中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

据发明人研究了解，目前，油红O染色是一种广泛使用的脂肪肝病诊断方法，通过对脂滴进行组织学染色。但是，这种方法存在化学结构不稳定、选择性和灵敏度低、步骤复杂耗时等缺点。荧光探针可以用于脂滴成像和动态跟踪，然而，发明人研究发现，目前大多数脂滴探针不适用于脂肪肝疾病诊断，其原因可能在于对组织的渗透性有限，以及体外和体外样品之间的染色差异。同时，目前的诊断型探针的一些关键成像参数，比如光稳定性和成像对比度等方面，仍有待进一步改进和完善。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供萘-茚二酮给受体类化合物及其制备方法与其在脂滴荧光探针中的应用，研究表明，该类化合物作为脂滴特异性免洗荧光探针，对生物样品具有高透过性、高成像对比度及更高的光稳定性。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种萘-茚二酮给受体类化合物，其化学结构如式I所示：

其中，R₁、R₂分别独立为氢、低级烃基、醚基、取代烷基或酰基；R₃、R₄、R₅、R₆分别独立为氢、甲基、氟、氯、溴、碘、氰基、三卤甲基、硝基、苯基或吡啶基。

另一方面，一种上述萘-茚二酮给受体类化合物的制备方法，包括按照如下反应路线获得式I所示化合物；

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆分别如上所述。

第三方面，一种组合物，其含有上述的萘-茚二酮给受体类化合物或其药学上可接受的盐。

第四方面，一种制剂，包括上述萘-茚二酮给受体类化合物或其药学上可接受的盐或组合物和药学上可接受的载体。

第五方面，一种上述萘-茚二酮给受体类化合物、组合物和/或制剂在脂滴免洗荧光探针中的应用。

本发明提供的萘-茚二酮给受体类化合物具有扭曲分子内电荷转移(TICT)效应，利用该效应能够构建溶致变色的脂滴荧光探针，从而能够用于脂肪细胞中脂滴的免洗染色，由于TICT效应，该探针在极性溶剂中具有可忽略的荧光，而在非极性溶剂中荧光剧烈增强，该探针同时具有优异的光稳定性和生物兼容性。

从临床表现来看，脂肪肝病变的突出病理特征是肝细胞内脂滴中脂肪过度堆积，故过度表达和膨胀的脂滴可能成为诊断脂肪肝的潜在靶点。由于本发明提供的萘-茚二酮给受体类化合物可以用于脂滴荧光探针，因而第六方面，一种上述萘-茚二酮给受体类化合物、组合物和/或制剂在诊断脂肪肝或制备诊断脂肪肝试剂中的应用。

当以本发明提供的萘-茚二酮给受体类化合物作为脂滴荧光探针时，该荧光探针以萘为给体，1,3-茚二酮为受体基团，由于1,3-茚二酮具有很强的吸电子性能，荧光探针对不同极性的溶剂表现出明显的溶致变色效应。由于TICT效应，荧光探针在极性溶剂中发射的微弱发光可以忽略不计。而在低极性环境(如脂滴)中，TICT效应受到抑制，荧光明显增强。正常肝组织和脂肪肝组织中的极性差异使得本发明所述的新型溶致变色荧光探针ANI能够在小鼠模型中诊断脂肪肝。

实验结果证实，本发明提供的萘-茚二酮给受体类化合物作为脂滴荧光探针，可实现脂肪肝模型小鼠肝组织中脂滴过度积累的高信噪比区分。

本发明提供的萘-茚二酮给受体类化合物作为脂滴荧光探针在细胞上的选择性经过了严格的证明。在本发明所述的脂滴荧光探针在细胞染色的基础上，通过与商业化的脂滴探针(BODIPY 493/503)进行复染实验，证实其具有较高的共定位系数(可达0.88)，进而确认本发明提供的脂滴荧光探针特异性染色脂滴。

本发明利用TICT效应构建免洗溶致变色荧光脂滴探针在高极性溶剂中表现出非常微弱的荧光，在低极性溶剂中荧光显著增强，可高选择性定位细胞中的脂滴。

其中：活细胞为3T3-L1前脂肪细胞；所述脂滴荧光探针的激发光是488nm时，脂滴荧光探针在绿色通道中几乎没有荧光，所述脂滴荧光探针的激发光是561nm时，脂滴荧光探针在红色通道(570-670nm)中显示出很强的发射。

第七方面，一种上述萘-茚二酮给受体类化合物、组合物和/或制剂在鉴别脂肪肝病组织与正常组织中的应用或制备鉴别脂肪肝病组织与正常组织的试剂中的应用。

采用3T3-L1前脂肪细胞作为活细胞进行检测实验时，与对照组相比，脂肪肝病模型组小鼠肝组织中脂滴大量积聚，大小明显增大，萘-茚二酮给受体类化合物作为脂滴荧光探针的亮红色荧光清晰可见。

实验证实：本发明提供的萘-茚二酮给受体类化合物作为脂滴荧光探针可以区分脂肪肝病组织和正常肝组织。在正常肝组织中，经ANI染色可见弱的背景荧光；在脂肪肝病组织中，经ANI染色脂滴明显增多且增大，荧光显著增强。这证实了该探针可以区分脂肪肝病组织和正常肝组织。

第八方面，一种脂肪肝检测试剂盒，包括脂滴荧光探针和溶剂，所述脂滴荧光探针为上述萘-茚二酮给受体类化合物、组合物和/或制剂。

本发明的有益结果是：相比于商用探针尼罗红和BODIPY，本发明提供的的萘-茚二酮给受体类化合物作为溶致变色脂滴荧光探针具有高透过性和高成像对比度。该探针的毒性低，生物相容性好，且具有良好的光稳定性。孵育时间较短，免洗染色，高对比度脂滴成像。此外，可以通过脂滴的大小和数量来区分脂肪肝病变组织和正常肝组织，使得该探针在手术中对脂肪肝疾病的精确诊断和评估具有重要的应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1制备ANI的合成路线及结构表征图；(A)ANI的合成路线；(B)ANI的单晶X射线结构；(C)在B3LYP/6-31G(d，p)水平上计算的ANI分子HOMO和LUMO的空间电子云分布。

图2为本发明实施例1制备ANI的光谱表征图；(A)ANI在不同有机溶剂中的(A)吸收光谱；(B)ANI在不同有机溶剂中的荧光光谱；(C)ANI在不同有机溶剂中的归一化荧光光谱；(D)在365nm紫外光下拍摄的ANI在不同有机溶剂中的荧光强度值和荧光照片；(E)荧光强度(I/I₀)与甘油/PBS混合物组成的曲线图；插图为在365nm紫外光下拍摄的甘油/水混合物中不同甘油组分的ANI荧光照片；(F)在365nm紫外光下拍摄的ANI在PBS和油酸(OA)中的荧光光谱和荧光照片；浓度：5μM。

图3为本发明实施例1制备ANI(5μM)在不同甘油组分的甘油/PBS混合物中的荧光光谱。

图4为本发明实施例4中ANI在分化的3T3-L1前脂肪细胞中的成像图片；(A)用分化的3T3-L1前脂肪细胞与ANI孵育并使用不同的激发激光共聚焦激光扫描显微镜图像；(B)用ANI和BODIPY 493/503孵育分化的3T3-L1前脂肪细胞的共聚焦激光扫描显微镜图像；浓度：1μM；比例尺：20μm。

图5为本发明实施例4中分化的3T3-L1前脂肪细胞ANI的原位荧光光谱。

图6为本发明实施例6中区分正常肝组织和脂肪肝病组织表征图；用油红O(12mM)和ANI(2μM)分别染色的正常和高脂喂养豚鼠肝组织的(A)明场图像和(B)荧光图像；(C)不同浓度油红O染色的高脂喂养豚鼠肝组织的明场图像；油红O染色，细胞核用苏木精染色；比例尺：100μm。

图7为本发明实施例6中(A)正常和(B)高脂喂养豚鼠肝组织中脂滴的大小分布图。

图8为本发明实施例中毒性测试和光稳定性测试的检测结果图；(A)ANI对3T3-L1前脂肪细胞的细胞毒性；(B)ANI、尼罗红和BODIPY 493/503对分化的3T3-L1前脂肪细胞在连续照射下的光稳定性；辐照条件：ANI和尼罗红：561nm激光，激光功率＝4％；BODIPY 493/503：488nm激光，激光功率＝4％。

图9为本发明实施例1制备的ANI在氘代氯仿中的氢谱。

图10为本发明实施例1制备的ANI在氘代氯仿中的碳谱。

图11为本发明实施例1制备的ANI的高分辨质谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，鉴于现有诊断型探针存在对组织的渗透性有限、体外和体外样品之间的染色差异、光稳定性和成像对比度有待提高等缺陷，本发明提出了萘-茚二酮给受体类化合物及其制备方法与其在脂滴免洗荧光探针中的应用。

本发明的一种典型实施方式，提供了一种萘-茚二酮给受体类化合物，其化学结构如式I所示：

该实施方式的一些实施例中，所述低级烃基为1-10个碳原子的直链、支链或环状的烃基基团。例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、环丙基、环丁基等。

该实施方式的一些实施例中，所述取代烷基为为ω-甲酸酯基取代1-6个碳原子烷基、ω-甲酰胺基取代1-6个碳原子烷基、ω-卤素取代1-6个碳原子烷基、ω-羟基取代1-6个碳原子烷基、ω-氨基取代1-6个碳原子烷基或ω-巯基取代1-6个碳原子烷基；其中，所述ω-甲酸酯基取代1-6个碳原子烷基中甲酸酯基为2-5个碳原子烷基甲酸酯基；所述ω-甲酰胺基取代1-6个碳原子烷基中甲酰胺基为2-5个碳原子烃基甲酰胺基。取代烷基为可以为直链，也可以为支链。

该实施方式的一些实施例中，所述酰基为2-6个碳原子烷基酰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、1-6个碳原子取代苯甲酰基或卤素取代苯甲酰基。

该实施方式的一些实施例中，所述化合物为

本发明的另一种实施方式，提供了一种上述萘-茚二酮给受体类化合物的制备方法，包括按照如下反应路线获得式I所示化合物；

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆分别如上所述。

具体过程为：化合物1和化合物2发生亲核反应合成产物，以己烷/AcOEt(体积比为10：1，6：1，至1：1)为洗脱液，用硅胶层析法获得产物纯化，即得。

该实施方式的一些实施例中，反应条件为：温度为85～95℃，反应时间为4～10h。反应体系中添加哌啶作为催化剂。反应体系中以乙醇作为溶剂。

本发明的第三种实施方式，提供了一种组合物，其含有上述的萘-茚二酮给受体类化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的第四种实施方式，提供了一种制剂，包括上述萘-茚二酮给受体类化合物或其药学上可接受的盐或组合物和药学上可接受的载体。

本发明所述的载体可以为水、缓冲液(磷酸盐等)等。

本发明的第五种实施方式，提供了一种上述萘-茚二酮给受体类化合物、组合物和/或制剂在脂滴免洗荧光探针中的应用。

本发明的第六种实施方式，提供了一种上述萘-茚二酮给受体类化合物、组合物和/或制剂在诊断脂肪肝或制备诊断脂肪肝试剂中的应用。

本发明的第七种实施方式，提供了一种上述萘-茚二酮给受体类化合物、组合物和/或制剂在鉴别脂肪肝病组织与正常组织中的应用或制备鉴别脂肪肝病组织与正常组织的试剂中的应用。

本发明的第八种实施方式，提供了一种脂肪肝检测试剂盒，包括脂滴荧光探针和溶剂，所述脂滴荧光探针为上述萘-茚二酮给受体类化合物、组合物和/或制剂。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

下述实施例中，除非另有说明，否则所有化学品均按收到的原样直接使用，不经任何纯化。胰岛素、地塞米松和异丁基甲基黄嘌呤购自Sigma-Aldrich。1,3-茚二酮购自TCI。哌啶购自国药化学试剂有限公司，BODIPY493/503和尼罗红购自Invitgen。用无水溶剂对其荧光性质进行了研究。在整个研究过程中都使用去离子水。Hartley豚鼠常规饲料和高脂饲料由北京博泰宏达生物科技有限公司提供。以四甲基硅烷为内标，¹H NMR(400MHz)和¹³CNMR(100MHz)谱在BrukerAvance III型波谱仪上获得。高分辨质谱在AgilentTechnologies 6510Q-TOF LC/MS仪器上以ESI模式获得。以罗丹明B在甲醇中的相对荧光量子产率为标准测定荧光量子产率。

实施例1：探针ANI的合成

化合物1和化合物2发生亲核反应得到探针ANI(图1A)。化合物1(115mg，0.5mmol)，化合物2(88mg，0.6mmol)和几滴哌啶在无水乙醇(10mL)中于90℃回流8h，冷却至室温，减压脱除溶剂，以己烷/AcOEt(体积比为10：1，6：1，至1：1)为洗脱液，用硅胶层析法纯化残留物，得到绿色固体(质量133mg，产率74％)。¹H NMR谱、¹³C NMR谱和高分辨质谱分别如图9、图10和图11所示。并且X-射线单晶衍射证明了ANI的结构(图1B)，相应的晶胞参数和精修数据见表1。

详细表征数据如下：¹H NMR(400MHz,CDCl₃),δ(ppm):9.02(d,J＝9.0Hz,1H),8.52(s,1H),8.07(d,J＝9.3Hz,1H),8.02–7.95(m,2H),7.81–7.74(m,2H),7.43(d,J＝9.0Hz,1H),7.11(dd,J₁＝9.3Hz,J₂＝2.6Hz,1H),6.86(d,J＝2.5Hz,1H),4.08(s,3H),3.15(s,6H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ(ppm):191.38,189.82,162.96,150.97,142.54,141.37,140.69,140.19,134.92,134.72,129.69,126.10,125.67,123.00,122.94,122.29,119.63,119.33,115.48,106.07,65.45,40.42.HRMS(ESI)m/zcalcd for[C₂₃H₂₀NO₃]⁺358.1438([M+H]⁺),found 358.1434。

表1ANI的晶胞参数和精修数据

实施例2：基本光物理性质

首先，通过密度泛函理论计算了探针ANI的HOMO和LUMO电子云分布(图1C)，HOMO的电子云基本上离域在取代的萘环部分，而LUMO的电子云主要分布在1,3-茚二酮部分。这种明显的电子分离显示了强的电荷转移效应和窄的能隙。接着，测试了ANI详细的光物理性质。配制了含5μM不同极性溶剂(甲苯、乙醚、四氢呋喃、丙酮、二甲基亚砜、PBS)的测试溶液，将上述溶液用紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪测试其吸收光谱和荧光发射光谱(图2和图3)。最大吸收峰(λ_abs)在492-523nm的小范围内，随着极性从甲苯到二甲基亚砜的增加，λ_abs值略有红移(图2A)。相应地，从低极性甲苯到高极性DMSO，ANI的荧光最大值(λ_em)呈现类似的红移趋势(图2B和2C)，λ_em最大值红移了约68nm。由于强烈的电荷转移效应，ANI在高极性溶剂(如丙酮和DMSO)中的荧光强度显著降低(图2D)。这种红移的荧光波长和在高极性溶剂中发射强度的显著降低表明了ANI具有典型的TICT效应。值得注意的是，ANI表现出高达104nm的大Stokes位移，并且从低极性溶剂到高极性溶剂的Stokes位移也相应增大。由于存在双键柔性结构，ANI在PBS中显示出无法检测到的荧光(QY<0.1％)，并通过添加高甘油成分逐渐增强了高粘度混合物中的发射(图2E和图3)。相反，ANI在油酸中具有高度增强的发射(QY为6.8％)，以模拟细胞中的脂滴环境，比在PBS中的荧光高557倍(图2F)，这也表明ANI的荧光对极性比粘度更敏感。综合这些数据，具有很强TICT效应的溶剂变色荧光探针ANI可以在脂滴等低极性亲脂结构中无需洗涤步骤就能发光，从而获得高成像对比度。

实施例3：分化的3T3-L1前脂肪细胞的培养

加入含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的DMEM，在37℃、5％CO₂/空气的共聚焦皿中孵育3T3-L1前脂肪细胞24h，传代次数控制在10代以下。待细胞生长汇合至95％后，加入10μg/mL胰岛素、1μM的新鲜DMEM培养液。培养2d后，用pH＝7.4的PBS洗涤，并替换为含10μg/mL胰岛素的新鲜DMEM培养液。然后，每隔2d更换一次培养基。处理8d后，大部分前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，并用于进一步的实验。在分化的3T3-L1前脂肪细胞培养液中加入含1μM ANI的新鲜DMEM培养液，在37℃、5％CO₂中孵育20min后用于细胞成像。将分化后的3T3-L1前脂肪细胞进一步与1μM BODIPY493/503孵育，用于共染色成像。

实施例4：探针ANI在分化的3T3-L1前脂肪细胞中的成像实验

首先，用DMSO配制浓度为1mM的探针母液。待3T3-L1细胞爬片长满盖玻片后，将活性3T3-L1细胞在含1μM ANI的培养液中孵育20min后进行细胞成像(图4A)。从图中可以看出在没有任何洗涤步骤的情况下，在561nm激光下，ANI在红色通道中显示出很强的发射，而在488nm激光下，在绿色通道中几乎没有发射信号。原位荧光光谱与低极性溶剂相似(图5)。由于ANI在不同溶剂中具有高度的环境敏感性荧光变化，高对比度和明亮发光的圆点可以被ANI染色清晰获得，并且在细胞质中其他区域几乎没有荧光。考虑到分化的3T3-L1前脂肪细胞中大量脂滴形成以及ANI脂溶性结构，我们推测ANI很可能染色3T3-L1前脂肪细胞中的脂滴中，接着又进行了共定位实验。向含1μM ANI的已孵育20min的3T3-L1前脂肪细胞中加入1μMBODIPY493/503后再孵育10min，用pH＝7.4的PBS洗涤细胞后使用荧光共聚焦显微镜对细胞进行共定位成像。如图4B所示，在分化的3T3-L1细胞中，ANI的染色模式与BODIPY 493/503的染色模式显示出很好的重叠，计算出相应的皮尔逊系数为0.88。这些数据证实，探针ANI在分化的3T3-L1细胞中以免洗的方式高信噪比和选择性地染色脂滴。

实施例5：豚鼠肝组织的制备

雄性Hartley豚鼠(300±30g)购自广东实验动物中心(佛山)。动物实验在广州中医药大学实验动物中心(SYXK(粤)2018-0085)完成。所有豚鼠均置于恒温(20-25℃)、湿度65-70％的环境中，在独立的通风笼内进行12小时的光/暗循环。动物可以自由饮用去离子水，并喂食相应的常规或高脂肪饮食。所有豚鼠在适应性喂养一周后随机分为空白组(5只)和模型组(5只)。空白组给予普通饲料，模型组给予高脂饲料。饲养5周后，用10％水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉豚鼠，取肝脏。取部分肝组织切片，油红O染色，剩余肝组织保存于-80℃的冰箱中。这些实验经院委会批准，符合相关法律和机构指南进行。

实施例6：探针ANI区分正常肝组织和脂肪肝病组织

探针ANI染色：将空白组和模型组豚鼠肝组织仔细切成10μm厚，用含ANI(2μM)的培养基在5％CO₂/空气加湿培养箱中37℃染色30min，然后直接进行荧光成像。油红染色：取正常和高脂喂饲豚鼠肝组织切片，室温风干20min，复水，不同浓度油红O(0.5％，m/v，溶于异丙醇)染色20min。玻片用60％异丙醇仔细漂洗1min，苏木精复染50s，自来水漂洗2min。最后，用奥林巴斯BX-53生物显微镜光学显微镜拍摄染色的组织切片。

结果如图6所示，与对照组相比，脂肪肝病模型组小鼠肝组织中脂滴大量积聚，大小明显增大，油红O的红色和ANI的亮红色发射清晰可见(图6A和6B)。由于ANI的TICT效应和增强的脂滴发射，ANI在脂滴中也显示出很强的荧光信号，具有较高的信噪比。仔细观察对照组，正常肝组织ANI染色也可见极少量小脂滴，油红O染色未见明显脂滴，表明荧光显微镜灵敏度高。使用这种基于ANI的荧光方法，利用统计数据进一步估计了正常肝组织和脂肪肝组织中的脂滴大小(图7)。据计算，脂肪肝组织中最大的脂滴比对照组的平均脂滴大9倍以上。除了优异的灵敏度，基于探针ANI的荧光方法也比传统油红O染色的下述优点：(1)ANI的染色时间短(30min)，而油红O染色需要长达50min左右的时间，且步骤处理复杂；(2)ANI的工作浓度低(2μM)，而油红O则在摩尔浓度下实现满意的染色(图6C)。综上，可见探针ANI在鉴别正常肝组织和脂肪肝病组织方面具有很大的应用潜力。

实施例7：探针ANI的毒性测试

用标准MTT法测定活细胞的细胞毒性。将对数期生长的3T3-L1前脂肪细胞接种于96孔板(约1×10⁴个细胞/孔)，用无细胞的培养基填充小孔作为空白组。将接种的细胞置于37℃，5％CO₂培养箱内孵育24h，然后将2、4、6、8、10μM浓度的ANI加入到孔中作为实验组。此外，加入不含ANI的新鲜的DMEM培养液作为对照组。细胞在37℃，5％CO₂下孵育12小时。然后每孔加入MTT(5mg/mL)。37℃孵育4h后，加入100μL的DMSO。再孵育20分钟后，使用酶标仪测试每个孔在570nm处的吸光度，细胞毒实验重复3次。

细胞存活率可通过下述公式计算得到：

其中，A_sample为实验组吸光度，A_c为对照组吸光度，A_b为空白组的吸光度。

结果见图8A，用不同浓度的探针ANI孵育3T3-L1细胞12小时的细胞存活率。实验结果显示用10μM的ANI孵育3T3-L1细胞12小时后，细胞存活率仍高达82％，说明探针的毒性很低。

实施例8：探针ANI的光稳定性测试

用共聚焦激光(探针ANI和尼罗红，561nm，激光功率4％；BODIPY 493/503，488nm，激光功率4％)连续照射含不同染料的分化的3T3-L1前脂肪细胞。图像大约每1.27s扫描一次。

结果见图8B，在连续激光照射下，60次扫描后ANI的荧光强度略有下降，尼罗红和BODIPY 493/503的荧光强度明显降低，尤其是尼罗红。实验结果表明，荧光探针ANI具有很高的耐光漂白性能。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种萘-茚二酮给受体类化合物，其特征是，所述化合物为

。

2.一种权利要求1所述的萘-茚二酮给受体类化合物的制备方法，其特征是，包括按照如下反应路线获得萘-茚二酮给受体类化合物；

。

3.如权利要求2所述的萘-茚二酮给受体类化合物的制备方法，其特征是，反应条件为：温度为85~95 ℃，反应时间为7.5~8.5 h。

4.如权利要求3所述的萘-茚二酮给受体类化合物的制备方法，其特征是，反应体系中添加哌啶作为催化剂。

5.如权利要求3所述的萘-茚二酮给受体类化合物的制备方法，其特征是，反应体系中以乙醇作为溶剂。

6.一种组合物，其特征是，其含有权利要求1所述的萘-茚二酮给受体类化合物或其药学上可接受的盐。

7.一种制剂，其特征是，包括权利要求1所述的萘-茚二酮给受体类化合物或其药学上可接受的盐或权利要求6所述的组合物和药学上可接受的载体。

8.一种权利要求1所述的萘-茚二酮给受体类化合物、权利要求6所述的组合物和/或权利要求7所述的制剂在脂滴免洗荧光探针中的应用。

9.一种权利要求1所述的萘-茚二酮给受体类化合物、权利要求6所述的组合物和/或权利要求7所述的制剂在制备诊断脂肪肝试剂中的应用。

10.一种权利要求1所述的萘-茚二酮给受体类化合物、权利要求6所述的组合物和/或权利要求7所述的制剂在制备鉴别脂肪肝病组织与正常组织的试剂中的应用。

11.一种脂肪肝检测试剂盒，包括脂滴荧光探针和溶剂，其特征是，所述脂滴荧光探针为权利要求1所述的萘-茚二酮给受体类化合物、权利要求6所述的组合物和/或权利要求7所述的制剂。