CN101921587B - 一种具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针及其制备方法。所述的具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针,是在联苯衍生物Ta-dD的一个或两个酚羟基上连接荧光发色团,所述的荧光发色团为香豆素型、吲哚型、罗丹明型或荧光素型。联苯衍生物Ta-dD和酚羟基连接的功能分子保持对肿瘤细胞增殖抑制活性,而指示性的荧光是由荧光发色团发出的。本发明公开的荧光探针既保持了对肿瘤细胞增殖抑制活性,又具有一定的荧光性能。作为一种靶向工具分子,可与肿瘤细胞直接作用,通过其荧光性能的变化,来进行药物作用机制和作用效果研究。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域,涉及一种具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针及其制备方法。
背景技术
目前,肿瘤已经成为当今世界危害人类健康的重大疾病,抗肿瘤药物的研究越来越受到人们的重视。近年来,随着分子肿瘤学、分子药理学的发展,肿瘤疾病的本质已逐步被揭示。
在药物研究中,气相色谱、液相色谱以及紫外光谱是进行药物分析的基本技术。20世纪70年代以来,特别是近年来相继出现的各种灵敏度高的荧光分析法已有效地用于药物制剂以及生物体液中药物的分析。如同步扫描荧光技术可用于违禁品中苯丙胺和吗啡加奎宁的测定;荧光偏振免疫分析法可用于血清中的庆大霉素、地答新、茶叶碱、戊巴比妥、苯巴比妥等多种药物的检测,还可进行烧伤患者体内萘替米星的药代动力学研究;特异性荧光偏振免疫法可用来监测肾移植后环孢素A的全血浓度;荧光猝灭法用来测定苦参碱和氧化苦参碱的含量;固体表面荧光测定法用于血清中茶叶碱,以及其它多种抗菌药、抗气喘病药、抗惊风病药等的临床荧光分析;电解荧光光度法测定片剂中卡马西平的含量等等。其中,荧光探针技术已经发展成为借助荧光显微镜在分子水平上进行实时检测的重要手段。这种技术灵敏度高,可视性强,而且对研究的生物大分子或细胞干扰少,因此得到广泛应用。
分子荧光探针对金属离子、生物小分子和生物大分子的响应,使得人们能够用荧光显微镜、荧光光谱,特别是荧光成像技术来实时检测活细胞内分子或离子浓度以及生物大分子结构的变化过程。其中,应用绿色荧光蛋白(GFP)及其变体(如CFP、YEP等)或者小分子荧光染料标记的蛋白质探针在各种细胞事件的实时可视化及示踪细胞内蛋白质表达和定位等方面已经得到广泛的应用。由于绿色荧光蛋白具有分子小、荧光稳定、检测方便、对活细胞无伤害等优点,因此用其对目的物进行标记,分析目的物在细胞中的变化情况,如酶分子分布状态、生物活性、受体、离子通道等变化,从而,在众多的化合物中筛选出与体内信号分子功能相似的“潜力”化合物,这样的方法简便易行。因此绿色荧光蛋白作为一种荧光探针成为了药物筛选及药物作用机制研究中的有力工具。实际上,许多药物或具有药物活性的小分子自身都是受体的外源性配体。因此,它们也理所当然地可被用作探针的配体部分,从而对药物在体内的代谢过程进行跟踪,而且也可以通过实时成像技术来监测病变组织。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种具有肿瘤细胞增殖抑制活性及荧光特性的双功能探针的制备方法,该荧光探针可作为一种靶向工具分子,与肿瘤细胞直接作用,通过其荧光性能的变化,进行药物作用机制和作用效果研究。
本发明是通过以下技术方案来实现:
一种具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针,是在联苯衍生物Ta-dD的一个或两个酚羟基上连接荧光发色团;所述的联苯衍生物Ta-dD的结构式为:
所述的荧光发色团为香豆素类、吲哚类、罗丹明类或荧光素类,其结构式分别为:
香豆素类 吲哚类
罗丹明类 荧光素类
其中,R1为羟基或氨基;R2为氢原子、甲基或乙基;R3为氯原子、溴原子或氟原子。
所述的荧光发色团是含有羟基的荧光发色团,通过碳原子数为2~6的直链烃基与Ta-dD连接;或者是含有羧基的荧光发色团,通过酰基与Ta-dD连接或者是含有氨基的荧光发色团,通过酰亚胺基与Ta-dD连接。
所述在联苯衍生物Ta-dD的一个或两个酚羟基上连接荧光发色团得到的荧光探针为F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD-NH2、F-Ta-dD-Rod、F-Ta-dD-Fluo或F-Ta-dD-indo。
所述的联苯衍生物Ta-dD的一个酚羟基与荧光发色团连接,另一个酚羟基与2-氯-N-(3-氯-4-氟苯)乙酰胺连接。
所述在联苯衍生物Ta-dD的一个酚羟基上连接荧光发色团得到的荧光探针为F-Ta-dD-dOH或F-Ta-dD-dNH2。
一种具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
a、联苯衍生物Ta-dD的合成:
1)3-羟基-4-甲氧基苯甲醛在铁粉催化作用下,与液溴在醋酸缓冲液中反应得到2-溴3-羟基-4-甲氧基苯甲醛;
2)以氯化苄作为保护试剂,对2-溴3-羟基-4-甲氧基苯甲醛的酚羟基进行保护,得到3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛;
3)以过氧化氢-亚氯酸钠体系作为氧化剂,将3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛氧化得到3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸;
4)先将3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸溶解在无水二氯甲烷中,通过酰化反应制成3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酰氯,然后再与甲胺水溶液反应得到3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺;
5)3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺通过Ullmann反应制得苄基保护的联苯双酰胺化合物:6’6-二苄氧基-5’5-二甲氧基联苯-2’2-二N-甲基甲酰胺;
6)5,5’-二甲氧基-6,6’-二苄氧基联苯-2,2’-二苯甲酰甲胺通过催化氢化脱去苄基保护基,得到带有两个酚羟基的联苯衍生物Ta-dD;
b、荧光发色团衍生物的合成:
利用荧光发色团中含有的羟基与二卤代烷发生醚化反应,生成带有卤代直链烃的荧光发色团衍生物;
或者利用荧光发色团中含有的羧基发生酰氯化反应,生成带有酰氯结构的荧光发色团衍生物;
或者利用荧光发色团中含有的氨基发生酰胺化反应,生成带有酰胺结构的荧光发色团衍生物;
c、荧光探针的合成:
向有机溶剂中按照联苯衍生物Ta-dD:荧光发色团衍生物:无水碳酸钾=1∶(1~2)∶(3~6)的摩尔比,首先加入联苯衍生物Ta-dD和无水碳酸钾,60~80℃充分混合后,然后加入荧光发色团衍生物,60~80℃回流充分反应;反应完成后转移到冰水中,待固体完全析出后,抽滤,并将所得固体物干燥后,进行硅胶柱层析,以乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂,或者乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂进行洗脱,得到具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针。
所述的二卤代烷为碳原子个数为2~6的直链卤代烃,两个卤原子分别连接于首位碳原子上,含羟基的荧光发色团与二卤代烷的摩尔比为1∶1;
含羧基的荧光发色团与氯化亚砜发生酰氯化反应,两者的摩尔比为1∶1;
含氨基的荧光发色团与氯乙酰氯发生酰胺化反应,两者的摩尔比为1∶1。
所述的荧光发色团衍生物为7-(2-溴乙氧基)-4-甲基香豆素、2-氯-N-(4-甲基-2-氧杂-2-氢-苯并吡喃-7-基)-乙酰胺、2-氯-N-(5-氯-1-氢-吲哚-6-基)乙酰胺、罗丹明B酰氯或荧光素酰氯;
所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或丙酮。
所述的用于柱分离的洗脱溶剂,以体积比计,乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂为乙酸乙酯∶甲醇=30∶1~10∶1,乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂为乙酸乙酯∶石油醚=1∶3。
与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:
本发明构建的具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针,以联苯衍生物Ta-dD作为基础分子结构,在其酚羟基上通过醚化或者酰胺化与荧光发色团进行连接;而由于联苯衍生物Ta-dD具有两个酚羟基,那么其中的一个酚羟基连接荧光发色团,而另外一个酚羟基还可以连接其他具有特定功能的分子结构。
现有的荧光示踪剂,以绿色荧光蛋白为例,仅仅作为一种报告基因,转染肿瘤细胞后,通过判断肿瘤细胞荧光消失与否,来确定肿瘤细胞是否死亡,从而达到对抗癌药物疗效的评价。而与现有的荧光示踪剂相比,本发明公开的荧光探针既保持了对肿瘤细胞增殖抑制活性,又具有一定的荧光性能。作为一种靶向工具分子,可与肿瘤细胞直接作用,通过其荧光性能的变化,来进行药物作用机制和作用效果研究。
联苯衍生物Ta-dD和酚羟基连接的功能分子保持对肿瘤细胞增殖抑制活性,而指示性的荧光是由荧光发色团发出的。在制备荧光探针的时候荧光发色团是以荧光发色团衍生物的形式与联苯衍生物Ta-dD的酚羟基醚化或者酰胺化,从而形成连接,这就要求荧光发色团具有活性的羟基、羧基或者氨基。联苯衍生物Ta-dD是由本发明公开的方法合成,荧光发色团可以是合成的或者是购买的,具体可以为香豆素类、吲哚类、罗丹明类和荧光素类。
附图说明
图1为荧光探针F-Ta-dD-OH的荧光吸收图谱;
图2为荧光探针F-Ta-dD-NH2的荧光吸收图谱;
图3为荧光探针F-Ta-dD-dOH的荧光吸收图谱;
图4为荧光探针F-Ta-dD-dNH2的荧光吸收图谱;
图5为荧光探针F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD-NH2对乳腺肿瘤细胞细胞株MCF-7、MDA-MB-231增殖抑制率直方图;
图6为荧光探针F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD-NH2对乳腺肿瘤细胞细胞株ZR-75-30、SK-BR-3增殖抑制率直方图;
图7为荧光探针F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD-dNH2对乳腺肿瘤细胞胞株MCF-7、MDA-MB-231增殖抑制率直方图;
图8为荧光探针F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD-NH2对乳腺肿瘤细胞细胞株ZR-75-30、SK-BR-3增殖抑制率直方图。
具体实施方式
下面具体结合实例和其制备方法对具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针的合成、荧光性能及对乳腺肿瘤细胞不同细胞株增殖抑制作用,对本发明作进一步详细的说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明提供的具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针,是在联苯衍生物Ta-dD的一个或两个酚羟基上连接荧光发色团,其结构通式表示为:
1)碳原子数为2~6的直链烃基:-(CH2)n-,n=2、3、4、5、6;荧光发色团的羟基通过取代连接带有卤素取代的直链烃基,再与Ta-dD的酚羟基发生卤素取代而连接,两者形成醚的结构;
2)酰基:C=O,荧光发色团的羧基生成酰氯结构,再与Ta-dD的酚羟基发生卤素取代而连接,两者形成酯的结构;
3)酰亚胺基:-NH-C=O,荧光发色团的氨基生成酰胺结构,再与Ta-dD的酚羟基发生取代而连接,两者形成酰胺的结构。
实施例1具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针的合成
1)联苯衍生物Ta-dD的合成,其合成路线图如下:
其具体的合成步骤为:
①化合物2-溴3-羟基-4-甲氧基苯甲醛(中间产物2)的合成
向装有滴液漏斗、温度计的三颈瓶中加入25g(0.164mol)3-羟基-4-甲氧基苯甲醛(化合物1)、26.94g(0.325mol)醋酸钠及0.75g(0.015mol)铁粉,用150mL冰醋酸溶解,室温搅拌30min;将9mLBr2与40mL冰醋酸混合,滴入到上述混合液中,控温23℃~25℃。滴加完毕,将混合液室温搅拌,TLC监测反应进程,3h后倒入冰水混合液中,继续搅拌1h。静置后抽滤、洗涤沉淀,粗品用乙醇重结晶,得灰白色固体。产率为81%,m.p.214~215℃。
核磁1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):10.26(s,1H),7.58(d,J=8.5Hz,1H),6.93(d,J=8.5Hz,1H),6.07(s,1H),4.01(s,3H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:3235,2890,1669,1593.
②化合物3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛(中间产物3)的合成
将15.0g(0.065mol)2-溴3-羟基-4-甲氧基苯甲醛加入到250mL圆底烧瓶中,用150mL无水乙醇溶解,加入27g(0.196mol)无水K2CO3。搅拌30min后,加入11.3mL(0.098mol)氯化苄,回流搅拌4h。冷却,蒸除部分溶剂(1/4~1/2体积)后,倒入冰水混合物中,有黄色固体析出。静置后抽滤、洗涤沉淀,粗品用乙醇重结晶,得淡黄色针状固体。产率72%,m.p.82~83℃。
核磁1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):10.27(s,1H),7.76(d,J=8.4Hz,1H),7.54~7.35(m,5H),6.98(d,J=9.2Hz,1H),5.03(s,2H),3.96(s,3H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:2940,2839,1626.9,1713,1593.
③化合物3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸(中间产物4)的合成
20.87g(0.065mol)3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛加入到200mL四氢呋喃中,再加入60mL蒸馏水和4.68g(0.039mol)NaH2PO4,混合液室温搅拌10min后,向上述混合液中缓慢滴加含19.40g(0.215mol)NaClO2的30%H2O2溶液。滴加完毕,室温继续搅拌3h后,减压蒸除四氢呋喃,残渣用乙酸乙酯(150mL×2)萃取,萃取所得有机相再用水(50mL×3)洗涤,然后再用2mol/LNaOH(50mL×5)萃取,所得水相用盐酸酸化,收集产生的固体。产率78%,m.p.172~173℃。
核磁1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):7.87(d,J=9.1Hz,1H),7.56~7.37(m,5H),6.93(d,J=9.2Hz,1H),5.03(s,1H),3.94(s,3H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:2940,2639,1695.
④化合物3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酰氯(中间产物5)的合成
3.37g(0.01mol)3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸溶于60mL无水二氯甲烷中,将3mL SOCl2溶于20mL无水二氯甲烷中,于20min内滴加到上述混合液中。室温搅拌4h,蒸除溶剂后,得到液体产物。
⑤化合物3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺(中间产物6)的合成
50mL甲胺水溶液置于冰浴中冷却,将步骤④合成的3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酰氯溶于35mL无水二氯甲烷中,缓慢滴入甲胺水溶液中,滴加完后,冰浴搅拌,TLC监测反应进程。反应完毕,产物用二氯甲烷稀释,并依次用2mol/L HCl、H2O、饱和Na2CO3、饱和NaCl萃取,有机相用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂后,收集产生的白色固体。产率77%,m.p.147~148℃。
核磁1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):7.55(d,J=7.0Hz,1H),7.37-7.56(m,5H),6.91(d,J=7.2Hz,1H),6.13(br,1H),5.01(s,2H),3.89(s,3H),3.00(d,J=4.3Hz,3H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:3272,1635,1295,1029,977,695.
⑥化合物6’6-二苄氧基-5’5-二甲氧基联苯-2’2-二N-甲基甲酰胺(中间产物7)的合成
22.34g(0.064mol)3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺溶于150mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中,加入40.96g(0.64mol)活化的铜粉,氮气保护下,150~160℃,回流4小时。待反应液冷却至室温后,过滤,滤液倾倒入冰水中,收集产生的固体,干燥。粗品经硅胶柱分离,5cm×40cm色谱柱,石油醚装柱。采用乙酸乙酯∶石油醚=1∶3进行洗脱,收集产生的白色固体。产率62%,m.p.174~175℃。
核磁1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):7.33(d,J=8.4Hz,2H),6.94-7.19(m,12H),4.82(d,J=10.8Hz,1H),4.73(d,J=10.9Hz,1H),3.87(s,6H),2.65(d,J=4.6Hz,6H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:3269,2935,1628,1561,1324,989.
⑦taspine联苯衍生物Ta-dD的合成
10.53g(0.019mol)6’6-二苄氧基-5’5-二甲氧基联苯-2’2-二N-甲基甲酰胺溶于300mL无水甲醇中,加入0.1g 10%Pd/C作为催化剂。在H2氛围下,室温搅拌,TLC监测反应进程,直至无初始原料。过滤除去Pd/C,并反复用甲醇洗涤,收集滤液,蒸除溶剂,收集产生的白色固体。产率93%,m.p.143~144℃。
核磁1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):7.16(d,J=8.5Hz,2H),6.89(d,J=8.4Hz,2H),3.92(s,6H),2.74(d,J=4.2Hz,6H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:3370,3114,1622,1552,1479,1276,1230,1019.
在上述合成方法中,所述TLC监测所用溶剂为石油醚、乙酸乙酯、甲醇或三氯甲烷。
2)荧光发色团及其衍生物的合成
根据荧光发色团种类及活性位点不同,选取不同链接结构,采用不同方法进行合成。
①荧光发色衍生物含碳链结构的合成:
向无水丙酮中,加入含活性羟基的荧光发色团、无水K2CO3,加热至回流后,加入二卤代烷,其中含活性羟基的荧光发色团:无水K2CO3:二卤代烷的反应摩尔比为1∶3∶1.2。继续回流搅拌12h,倒入冰水中,待固体完全析出,抽滤,干燥。干燥所得粗品进行柱分离得到带有卤代直链烃的荧光发色团衍生物。
②荧光发色衍生物含酰氯结构的合成:
向无水二氯甲烷中,加入含活性羧基的荧光发色团,将其置于冰浴中冷却待用。与荧光发色团摩尔比为1∶1的氯化亚砜溶于适量的无水二氯甲烷中,于20min内滴加到上述混合液中。室温搅拌4h,蒸除溶剂后,得带有酰氯结构的荧光发色团衍生物。
③荧光发色衍生物含酰胺结构的合成:
向无水二氯甲烷中,加入含活性氨基的荧光发色团,将其置于冰浴中冷却待用。与荧光发色团摩尔比为1∶1的氯乙酰氯溶于适量的无水二氯甲烷中,缓慢滴入上述冷却液中。滴完后,冰浴搅拌,TLC监测反应进程。反应完毕,产物用二氯甲烷稀释,并依次用2mol/L HCl、H2O、饱和Na2CO3、饱和NaCl萃取,有机相用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂后,收集产生的灰白色固体,得到带有酰胺结构的荧光发色团衍生物。
3)功能性探针化合物的合成
向有机溶剂中按照联苯衍生物Ta-dD:荧光发色团衍生物:无水碳酸钾=1∶(1~3)∶(3~6)的摩尔比,首先加入联苯衍生物Ta-dD和无水碳酸钾,60~80℃充分混合后,然后加入荧光发色团衍生物,60~80℃回流充分反应;反应完成后转移到冰水中,待固体完全析出后,抽滤,并将所得固体物干燥后,进行硅胶柱层析(53~75μm的柱层析硅胶),以乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂,或者乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂进行洗脱,得到具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针。
实施例2香豆素型功能性探针化合物F-Ta-dD-OH的合成(荧光发色团为香豆素类结构,其中R1为OH,R2为CH3;荧光发色团通过碳原子为2的直链烷烃与Ta-dD连接)
1)联苯衍生物Ta-dD的合成与实施例1相同。
2)荧光发色团7-羟基-4-甲基香豆素的合成步骤如下:
5.5g(0.05mol)间苯二酚溶于50mL浓硫酸中,待完全溶解后,缓慢滴入6.4mL(0.05mol)乙酰乙酸乙酯,室温搅拌30min,然后转移冰水中,抽滤收集形成的固体。粗品用95%乙醇重结晶,得白色针状晶体。产率85%,m.p.184~185℃。
3)荧光发色团衍生物7-(2-溴乙氧基)-4-甲基香豆素的合成,合成步骤如下:
3.53g(0.02mol)7-羟基-4-甲基香豆素溶于50mL丙酮中,加入8.34g(0.06mol)无水K2CO3,60℃回流30min后,加入3mL(0.03mol)1,2-二溴乙烷,继续回流搅拌12h,倒入冰水中,待固体完全析出,静置后抽滤,真空干燥。将干燥所得的粗品进行硅胶柱分离,5cm×40cm色谱柱,石油醚装柱。采用乙酸乙酯∶石油醚=1∶3进行洗脱,得白色固体,产率75%。m.p.117~118℃。
核磁1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.522(d,J=8.4Hz,1H),6.895(d,J=9.2Hz,1H),6.822(d,J=2.4Hz,1H),6.164(s,1H),4.374~4.344(t,J=6Hz,2H),3.696~3.666(t,J=6Hz,2H),2.411(s,3H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:3412,1716,1614,1388,1263,1067,850.
4)香豆素型功能性探针化合物F-Ta-dD-OH的合成,合成步骤如下:
3.60g(0.01mol)Ta-dD溶于100mL丙酮中,加入4.17g(0.03mol)无水K2CO3,60℃回流30min后,再加入6.77g(0.024mol)7-(2-溴乙氧基)-4-甲基香豆素,60℃继续回流搅拌反应18h,然后转移倒入冰水中,待固体完全析出,静置后抽滤,真空干燥。将干燥所得的粗品进行硅胶柱分离,5cm×40cm色谱柱,乙酸乙酯装柱。采用乙酸乙酯与甲醇按体积比30∶1~10∶1进行梯度洗脱,得淡黄色固体,产率58%。m.p.212~214℃。
上述合成反应式表示如下:
所得荧光探针的鉴定为:核磁1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.408(d,J=8.8Hz,2H),7.299(d,J=8.4Hz,2H),6.899(d,J=8.4Hz,2H),6.715(d,J=6.8Hz,2H),6.599(s,2H),6.113(s,2H),4.251~3.848(m,12H),2.681(d,J=4.8Hz,4H),2.379(s,4H),1.586(s,6H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:3414,2938,1721,1617,1294,1264,1145,1068.
实施例3香豆素型荧光探针化合物F-Ta-dD-NH2的合成(荧光发色团为香豆素类结构,其中R1为NH2,R2为CH3;荧光发色团通过酰胺结构与Ta-dD连接)
1)联苯衍生物Ta-dD的合成与实施例1相同。
2)荧光发色团为7-氨基-4-甲基香豆素,在此基础上进行化合物2-氯-N-(4-甲基-2-氧杂-2-氢-苯并吡喃-7-基)乙酰胺的合成,合成步骤如下:
3.60g(0.02mol)7-氨基-4-甲基香豆素溶于50mL无水二氯甲烷中,置于冰浴中冷却,然后缓慢滴入溶解有10mL氯乙酰氯的无水二氯甲烷溶液(10mL氯乙酰氯溶于35mL无水二氯甲烷)滴完后,冰浴搅拌,TLC监测反应进程。反应完毕,产物用二氯甲烷稀释,并依次用2mol/L HCl、H2O、饱和Na2CO3、饱和NaCl萃取,有机相用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂后,收集产生的灰白色固体。产率62%,m.p.283~284℃。
核磁1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.692(s,1H),7.591~7.538(m,2H),6.235(s,1H),4.245(s,2H),1.582(s,3H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:3430,2979,2947,2603,2495,1686,1478,1395,1174,1037.
3)香豆素型功能性探针化合物F-Ta-dD-NH2的合成,合成步骤如下:
3.60g(0.01mol)Ta-dD溶于100mL丙酮中,加入4.17g(0.03mol)无水K2CO3,60℃回流30min后,再加入6.0g(0.024mol)2-氯-N-(4-甲基-2-氧杂-2-氢-苯并吡喃-7-基)乙酰胺,60℃继续回流搅拌20h,然后转移倒入冰水中,待固体完全析出,静置后抽滤,真空干燥。将干燥所得的粗品进行硅色谱分离,5cm×40cm色谱柱,乙酸乙酯装柱。采用采用乙酸乙酯与甲醇按体积比30∶1~10∶1进行梯度洗脱,得白色固体,产率55%。m.p.152~153℃。
核磁1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):9.022(s,2H),7.733(s,2H),7.602~7.523(m,6H),7.346(d,J=8.4Hz,2H),6.892(d,J=8.8Hz,2H),4.462(d,J=14.8Hz,4H),4.214(d,J=14.4Hz,4H),3.861(s,6H),2.768(d,J=4.8Hz,6H),2.418(s,6H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:3342,2939,1731,1692,1617,1526,1147,1064,1025.
实施例4香豆素型功能性探针化合物F-Ta-dD-dOH的合成(荧光发色团为香豆素类结构,其中R1为OH,R2为CH3;荧光发色团与Ta-dD通过碳原子为2的碳链连接)
1)联苯衍生物Ta-dD、化合物7-(2-溴乙氧基)-4-甲基香豆素的合成,与实施例2相同;
2)2-氯-N-(3-氯-4-氟苯)乙酰胺的合成,合成步骤如下:
2.91g(0.02mol)3-氯-4-氟苯胺溶于50mL无水二氯甲烷中,置于冰浴中冷却。1.92mL氯乙酰氯溶于10mL无水二氯甲烷中,缓慢滴入上述溶液中,滴完后,室温搅拌过夜,TLC监测反应进程。反应完毕,产物用二氯甲烷稀释,并依次用2mol/L HCl、H2O、饱和Na2CO3、饱和NaCl萃取,有机相用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂后,收集产生的黄白色固体。产率76%,m.p.95~96℃。
核磁1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):8.219(s,1H),7.753~7.732(m,1H),7.399~7.368(m,1H),7.155~7.112(m,1H),4.200(s,2H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:3459,3311,2927,1670,1614,1557,1497,1398.
3)6-(2-(3-氯-4-氟-苯胺)-2-羰乙氧基)-6’-羟基-5,5’-二甲氧基-2,2’-二甲酰甲胺的合成,合成步骤如下:
3.60g(0.01mol)Ta-dD溶于100mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中,加入2.08g(0.015mol)无水K2CO3,80℃搅拌30min后,加入2.65g(0.012mol)2-氯-N-(3-氯-4-氟苯)乙酰胺,保持80℃温度,继续搅拌24h,然后转移倒入冰水中,待固体完全析出,静置后抽滤,真空干燥。将干燥所得粗品进行硅胶柱色谱分离,5cm×40cm色谱柱,乙酸乙酯装柱。采用乙酸乙酯∶甲醇=15∶1进行洗脱,得淡黄色固体,产率72%。m.p.110~112℃。
核磁1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):8.92(s,1H),8.00(d,J=6.3Hz,1H),7.26-7.29(m,3H),7.08(d,J=8.7Hz,1H),6.95(d,J=7.9Hz,1H),6.72(d,J=7.8Hz,1H),6.33(br,1H),5.72(br,1H),4.64(s,1H),4.59(s,1H),3.91(s,3H),3.83(s,3H),2.84(s,3H),2.63(s,3H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:3332,2938,1680,1635,1268,1024.
4)香豆素型功能性探针化合物F-Ta-dD-dOH的合成,合成步骤如下:
5.45g(0.01mol)6-(2-(3-氯-4-氟-苯胺)-2-羰乙氧基)-6’-羟基-5,5’-二甲氧基-2,2’-二甲酰甲胺溶于100mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中,加入2.08g(0.015mol)无水K2CO3,80℃搅拌30min后,加入3.38g(0.012mol)7-(2-溴乙氧基)-4-甲基香豆素。保持80℃继续搅拌24h,然后转移倒入冰水中,待固体完全析出,静置后抽滤,真空干燥。粗品进行柱色谱分离,5cm×40cm色谱柱,乙酸乙酯装柱。采用乙酸乙酯∶甲醇=20∶1进行洗脱,得白色固体,产率61%。m.p.108~109℃。
核磁1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.683(s,2H),7.477(d,J=8.8Hz,1H),7.306(d,J=8.8Hz,1H),7.195(d,J=8.4Hz,1H),7.106~7.062(t,J=8.8Hz,1H),6.842~6.820(m,1H),6.728(d,J=8.4Hz,1H),6.640(s,1H),6.425(d,J=4.8Hz,1H),6.168(s,1H),4.132(s,2H),4.132~4.095(d,J=7.6Hz,2H),4.006~3.970(d,J=7.2Hz,2H),3.816(s,3H),3.759(s,3H),2.803(d,J=4.8Hz,3H),2.629(d,J=4.8Hz,3H),1.602(s,3H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:3326,2938,1723,1618,1294,1263,1145,1021.
实施例5香豆素型功能性探针化合物F-Ta-dD-dNH2的合成(荧光发色团为香豆素结构,其中R1为OH,R2为CH3;链接结构为酰胺结构)
1)联苯衍生物Ta-dD、化合物2-氯-N-(4-甲基-2-氧杂-2-氢-苯并吡喃-7-基)-乙酰胺的合成与实施例3相同。
2)化合物2-氯-N-(3-氯-4-氟苯)乙酰胺、化合物6-(2-(3-氯-4-氟-苯胺)-2-羰乙氧基)-6’-羟基-5,5’-二甲氧基-2,2’-二甲酰甲胺的合成与实施例4相同。
3)香豆素型功能性探针化合物F-Ta-dD-dNH2的合成,合成步骤如下:
5.45g(0.01mol)6-(2-(3-氯-4-氟-苯胺)-2-羰乙氧基)-6’-羟基-5,5’-二甲氧基-2,2’-二甲酰甲胺溶于100mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中,加入2.08g(0.015mol)无水K2CO3,80℃搅拌30min后,加入3.01g(0.012mol)2-氯-N-(4-甲基-2-氧杂-2-氢-苯并吡喃-7-基)乙酰胺;保持80℃温度,继续搅拌24h,然后转移倒入冰水中,待固体完全析出,静置后抽滤,真空干燥。将干燥所得粗品进行硅胶柱色谱分离,5cm×40cm色谱柱,乙酸乙酯装柱。采用乙酸乙酯∶甲醇=25∶1进行洗脱,得灰白色固体,产率56%。m.p.179~180℃。
核磁1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.765~7.717(m,1H),7.617~7.524(m,2H),7.343~7.306(m,2H),7.129~7.068(m,3H),6.888(d,J=8.4Hz,2H),6.211(s,1H),4.457~4.405(m,2H),4.204(d,J=14.8Hz,2H),3.872(s,6H),2.761(d,J=3.2Hz,6H),2.420(s,3H).红外FT-IR(KBr),υ/cm-1:3373,2935,1703,1621,1528,1499,1407,1146,1020.
实施例6吲哚型功能性探针化合物F-Ta-dD-indo的合成(荧光发色团为吲哚类结构,其中R1为NH2,R3为氯原子;链接结构为酰胺结构)
1)联苯衍生物Ta-dD的合成与实施例1相同。
2)2-氯-N-(5-氯-1-氢-吲哚-6-基)乙酰胺的合成,合成步骤如下:
3.32g(0.02mol)5-氯-6-氨基吲哚溶于30mL无水二氯甲烷中,置于冰浴中冷却;2mL氯乙酰氯溶于10mL无水二氯甲烷中,缓慢滴入到上述冷却后的溶液中,滴完后,室温搅拌过夜,TLC监测反应进程。反应完毕后,产物用二氯甲烷稀释,并依次用2mol/L HCl、H2O、饱和Na2CO3、饱和NaCl萃取,有机相用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂后,收集所得固体产物。
3)吲哚型功能性探针化合物F-Ta-dD-indo的合成,合成步骤如下:
3.60g(0.01mol)Ta-dD溶于100mL丙酮中,加入4.17g(0.03mol)无水K2CO3,60℃回流30min后,再加入5.8g(0.024mol)2-氯-N-(5-氯-1-氢-吲哚-6-基)乙酰胺,60℃继续回流搅拌20h,然后转移倒入冰水中,待固体完全析出,静置后抽滤,真空干燥,粗品进行硅胶柱色谱分离后得到荧光探针F-Ta-dD-indo。
实施例7罗丹明型功能性探针化合物F-Ta-dD-Rod的合成(荧光发色团为罗丹明B结构,其中R2为甲基,R3为氢原子;链接结构为酰氯结构)
1)联苯衍生物Ta-dD的合成与实施例1相同。
2)罗丹明B酰氯的合成,合成步骤如下:
4.42g(0.01mol)罗丹明B溶于100mL无水三氯甲烷中,将3mL SOCl2溶于20mL无水三氯甲烷中,于20min内滴加到罗丹明B混合液中。室温搅拌4h,蒸除溶剂后,收集所得固体产物。
3)罗丹明型功能性探针化合物F-Ta-dD-Rod的合成,合成步骤如下:
1.80g(0.01mol)Ta-dD溶于100mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中,加入2.10g(0.15mol)无水K2CO3,80℃搅拌30min后,加入9.08g(0.02mol)罗丹明B酰氯,80℃下继续搅拌36h,TLC监测反应进程,反应完毕,将混合液倒入冰水中,待固体完全析出后,抽滤,将固体产物干燥,将干燥所得粗品进行硅胶柱色谱分离得到荧光探针F-Ta-dD-Rod。
上述合成反应式表示如下:
实施例8荧光素型功能性探针化合物F-Ta-dD-Fluo的合成(荧光发色团为荧光素结构,其中R3为氢原子;链接结构为酰氯结构)
1)联苯衍生物Ta-dD的合成与实施例1相同。
2)荧光素酰氯的合成,合成步骤如下:
3.32g(0.01mol)荧光素溶于60mL无水四氢呋喃中,将3mL SOCl2溶于20mL无水四氢呋喃中,于20min内滴加到上述荧光素混合液中。室温搅拌4h,蒸除溶剂后,收集所得固体产物。
3)荧光素型功能性探针化合物F-Ta-dD-Fluo的合成,合成步骤如下:
1.80g(0.01mol)Ta-dD溶于100mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中,加入2.10g(0.15mol)无水K2CO3,80℃搅拌30min后,加入5.25g(0.015mol)荧光素酰氯,80℃下继续搅拌36h,TLC监测反应进程,反应完毕,将混合液倒入冰水中,待固体完全析出后,抽滤,真空干燥,将干燥所得粗品进行硅胶柱色谱分离得到荧光探针F-Ta-dD-Fluo。
具有肿瘤细胞增殖抑制活性与荧光特性的功能性荧光探针荧光光谱测定的具体步骤如下:
1)待测物储备液的配制
分别准确称取上述制备的F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD-NH2、F-Ta-dD-dOH和F-Ta-dD-dNH2作为待测物,用甲醇或DMSO溶解,以甲醇为溶剂,配成1.0×10-5mol/L的储备液。
2)待测物荧光光谱的测定
应用F-4500型分光光度计对上述储备液做荧光光谱的测量,同时以Ta-dD、Coumarin-NH2、Coumarin-NH2-Cl作为比较。测试条件:室温,调整激发波长λex(275~375nm),样品池为1cm×1cm×4cm石英比色皿,狭缝宽度10nm,灵敏度为2。F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD-NH2、F-Ta-dD-dOH、和F-Ta-dD-dNH2的荧光光谱图分别如图1~4所示,其中横坐标为波长、纵坐标为相对荧光强度。
可以明显看出,助色团不同的两种香豆素型荧光发色团的引入使功能型探针化合物具有相同的变化趋势:香豆素类荧光基团7-羟基-4-甲基香豆素(Coumarin-OH)、7-氨基-4-甲基香豆素(Coumarin-NH2)本身具有优良的荧光性能,衍生化后所的产物7-(2-溴乙氧基)-4-甲基香豆素(Coumarin-OH-Br)、2-氯-N-(4-甲基-2-氧杂-2-氢-苯并吡喃-7-基)乙酰胺(Coumarin-NH2-Cl),荧光强度有所降低。当将其衍生物引入到不具有荧光特性的联苯衍生物Ta-dD的结构中后,所得探针化合物F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD-NH2、F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD-dNH2均衍生具有了一定的荧光特性,其最大吸收波长分别为410nm、408nm、403nm、408nm。而其他荧光发生团的衍生物引入不具有荧光特性的联苯衍生物Ta-dD的结构中后,所得探针化合物也相应的具有一定的荧光特性。
具有肿瘤细胞增殖抑制活性与荧光特性的功能性荧光探针对乳腺肿瘤细胞不同细胞株增殖的抑制作用,方法采用MTT比色法,具体步骤如下:
1)将适宜浓度的乳腺肿瘤细胞的悬液混匀后以每孔180μl接种于96孔板中,其中,各细胞株的具体浓度为MCF-7=3×10-4M、MDA-MB-231=4×10-4M、ZR-75-30=3×10-4M、SK-BR-3=5×10-4M。
2)将乳腺肿瘤细胞在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养24h,加入功能性荧光探针,使每种荧光探针的终浓度分别为5×10-5M、1×10-5M、1×10-6M。
3)继续培养48h后,换无血清的培养基(具体为MCF-7:PRMI1640,MDA-MB-231:PRMI1640,ZR-75-30:RPMI1640,SK-BR-3:DMEM)。各孔中加入5mg/mL的MTT工作液20μL,继续培养4h,弃培养液,每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO),在室温下震荡溶解15min后,酶联免疫检测仪测定波长490nm时各孔的紫外吸收值(OD值),每个浓度设5个复孔。
4)与阳性药吉非替尼进行对照比较
上述合成得到的功能性探针F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD-NH2与F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD-dNH2不同浓度时(5×10-5M、1×10-5M、1×10-6M)对乳腺肿瘤细胞细胞株MCF-7、MDA-MB-231、ZR-75-30、SK-BR-3增殖的抑制率的直方图如图5~6、图7~8所示,其中横坐标表示应用的阳性对照吉非替尼、荧光探针及所选的乳腺肿瘤细胞不同的细胞株,纵坐标表示抑制率。可以看出荧光探针F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD-NH2、F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD-dNH2对不同乳腺肿瘤细胞细胞株MCF-7、MDA-MB-231、ZR-75-30、SK-BR-3的增殖均有不同程度的抑制作用;并且随着荧光探针化合物的浓度增加,荧光探针对乳腺肿瘤细胞增殖的抑制率也相应的增加,针对不同的细胞株增加程度会存在区别;而当荧光探针化合物的浓度达到5×10-5M的浓度时,都对乳腺肿瘤细胞的增殖表现了明显的抑制,抑制率最高达到了60%,除了F-Ta-dD-dNH2对ZR-75-30细胞株的抑制率,最低也达到了10%;但是F-Ta-dD-dNH2对ZR-75-30细胞株的抑制率在1×10-6M低浓度时,甚至超过了阳性对照吉非替尼的抑制率。
Claims (6)
1.一种具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针,其特征在于,是在联苯衍生物Ta-dD的一个或两个酚羟基上连接荧光发色团;所述的联苯衍生物Ta-dD的结构式为:
所述的荧光发色团为含有羟基的荧光发色团,通过碳原子数为2~6的直链烃基与Ta-dD连接;
或者为含有羧基的荧光发色团,通过酰基与Ta-dD连接;
或者为含有氨基的荧光发色团,通过酰亚胺基与Ta-dD连接;
在联苯衍生物Ta-dD的一个酚羟基上连接荧光发色团得到的荧光探针为F-Ta-dD-dOH或F-Ta-dD-dNH2;
在联苯衍生物Ta-dD的一个或两个酚羟基上连接荧光发色团得到的荧光探针为F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD-NH2、F-Ta-dD-Rod、F-Ta-dD-Fluo或F-Ta-dD-indo;
所述F-Ta-dD-dOH的结构式为:
所述F-Ta-dD-dNH2的结构式为:
所述F-Ta-dD-OH的结构式为:
所述F-Ta-dD-Fluo的结构式为:
所述F-Ta-dD-indo的结构式为:
2.如权利要求1所述的具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针,其特征在于,所述的联苯衍生物Ta-dD的一个酚羟基与荧光发色团连接,另一个酚羟基与2-氯-N-(3-氯-4-氟苯)乙酰胺连接。
3.一种具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
a、联苯衍生物Ta-dD的合成:
1)3-羟基-4-甲氧基苯甲醛在铁粉催化作用下,与液溴在醋酸缓冲液中反应得到2-溴3-羟基-4-甲氧基苯甲醛;
2)以氯化苄作为保护试剂,对2-溴3-羟基-4-甲氧基苯甲醛的酚羟基进行保护,得到3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛;
3)以过氧化氢-亚氯酸钠体系作为氧化剂,将3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛氧化得到3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸;
4)先将3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸溶解在无水二氯甲烷中,通过酰化反应制成3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酰氯,然后再与甲胺水溶液反应得到3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺;
5)3-苄氧基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺通过Ullmann反应制得苄基保护的联苯双酰胺化合物:6’6-二苄氧基-5’5-二甲氧基联苯-2’2-二N-甲基甲酰胺;
6)6’6-二苄氧基-5’5-二甲氧基联苯-2’2-二N-甲基甲酰胺通过催化氢化脱去苄基保护基,得到带有两个酚羟基的联苯衍生物Ta-dD,其结构式为:
b、荧光发色团衍生物的合成:
利用荧光发色团中含有的羟基与二卤代烷发生醚化反应,生成带有卤代直链烃的荧光发色团衍生物;
或者利用荧光发色团中含有的羧基发生酰氯化反应,生成带有酰氯结构的荧光发色团衍生物;
或者利用荧光发色团中含有的氨基发生酰胺化反应,生成带有酰胺结构的荧光发色团衍生物;
所述的荧光发色团为香豆素类、吲哚类、罗丹明类或荧光素类,其结构式分别为:
其中,R1为羟基或氨基;R2为氢原子、甲基或乙基;R3为氯原子、溴原子或氟原子;
c、荧光探针的合成:
向有机溶剂中按照联苯衍生物Ta-dD:荧光发色团衍生物:无水碳酸钾=1:(1~3):(3~6)的摩尔比,首先加入联苯衍生物Ta-dD和无水碳酸钾,60~80℃充分混合后,然后加入荧光发色团衍生物,60~80℃回流充分反应;反应完成后转移到冰水中,待固体完全析出后,将固体物分离并干燥,然后进行硅胶柱层析分离,以乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂或乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂进行洗脱,得到具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针;
所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或丙酮。
4.如权利要求3所述的具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针的制备方法,其特征在于,所述的二卤代烷为碳原子个数为2~6的直链卤代烃,两个卤原子分别连接于首位碳原子上,含羟基的荧光发色团与二卤代烷的摩尔比为1:1;
含羧基的荧光发色团与氯化亚砜发生酰氯化反应,两者的摩尔比为1:1;
含氨基的荧光发色团与氯乙酰氯发生酰胺化反应,两者的摩尔比为1:1。
5.如权利要求3所述的具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针的制备方法,其特征在于,所述的荧光发色团衍生物为7-(2-溴乙氧基)-4-甲基香豆素、2-氯-N-(4-甲基-2-氧杂-2-氢-苯并吡喃-7-基)-乙酰胺、2-氯-N-(5-氯-1-氢-吲哚-6-基)乙酰胺、罗丹明B酰氯或荧光素酰氯。
6.如权利要求3所述的具有肿瘤细胞增殖抑制活性的荧光探针的制备方法,其特征在于,硅胶柱层析分离的洗脱用溶剂,以体积比计,乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂为乙酸乙酯:甲醇=30:1~10:1,乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂为乙酸乙酯:石油醚=1:3。
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