CN113277985B - 一种荧光探针及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

一种荧光探针及其制备方法和用途，所述荧光探针对粘度响应敏感并且特异，可用于蛋白的特异性荧光标记，还可用于蛋白的定量、检测或动力学研究以及细胞、组织和活体影像。

Description

一种荧光探针及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种荧光探针及其制备方法和用途。
背景技术
荧光特异性标记，是研究蛋白功能并定量的一种重要手段。和其它研究方法相比，荧光标记具有灵敏、原位、即时、可视等不可替代的优势。当前，蛋白的特异性荧光标记最常用的方法就是通过基因融合技术将荧光蛋白原位表达于目标蛋白上，从而实现对目标蛋白的特异性点亮，并能够在荧光显微镜下对细胞或组织内靶蛋白进行跟踪研究。荧光蛋白技术经过较长时间发展，技术相对成熟，然而依然存在不少缺陷，例如，荧光蛋白成熟折叠较慢、容易聚集；并且一旦表达，很难进行后期修饰；另外，大多荧光蛋白还存在光稳定性差等不足；这些在一定程度上限制了荧光蛋白的应用。
事实上，荧光蛋白生色团的分子结构相对单一，构建不同种类或者功能化的荧光蛋白，往往没有多少规律可循，只能借助于无规突变的方式进行海选。相比，有机小分子荧光染料的分子结构丰富的多，但是小分子荧光探针在蛋白特异性标记方面仍存在很多缺陷。最近，化学标签(chemical tag)技术的出现，有效地解决了小分子荧光探针蛋白特异性标记的问题。该技术将具有特异性识别功能的多肽或蛋白标签(tag)与靶蛋白融合，并利用该标签与底物高度特异性结合的特点，实现小分子荧光探针特异性的蛋白标记，因此，化学标签技术不仅继承了基因融合技术的优势，而且与荧光蛋白相比，它充分继承了有机染料探针的各方面的优势。目前，SNAP-tag(K.Johnsson et.al.WO 2004031405.)、CLIP-tag(K.Johnsson et.al.WO 2008012296.)、Halo-tag(Wood，Keith V et.al.WO 2004072232)等蛋白标签技术已经商业化，特别是SNAP-tag和CLIP-tag应用最为广泛，并得到了市场的一致认可。
虽然SNAP-tag和CLIP-tag等化学标签技术对所属蛋白的标记具有特异性。但事实上，标记过程中，无论游离的探针还是已标记的探针都存在同样的荧光发射。也就是说，不管标记上的还是没标记上的探针都在该体系内发射荧光。这种非特征性的荧光发射，显然是当前化学标签技术的严重缺陷。因此，从严格意义上，这种方法依然无法达到与荧光蛋白同等的特异性。将没有标记上的探针通过洗涤的方法加以去除，是当前解决以上问题的唯一有效方法。显然，在一些需要快速，或者无法洗涤的场合，该技术的应用将受到严重限制。
假若设计一种适用于SNAP-tag和CLIP-tag的荧光激活型蛋白特异标记的方法，它在未标记之前是暗的或发射非常弱的荧光，一旦它标记在蛋白上后，染料的荧光急剧增强。毫无疑问，这类设计的探针将有可能实现与荧光蛋白具有等同的特异性，不仅可以免除游离探针洗涤，大幅降低游离探针的背景干扰，而且势必拓宽SNAP-tag和CLIP-tag技术的应用。设计适用于该技术的荧光激活型蛋白特异标记的方法，必须考虑一个合适的荧光失/激活机制。FRET机制首先应用于这方面的设计，在配体上额外加入荧光淬灭基团，正常情况下小分子荧光被与之相连的基团淬灭；一旦配体与化学标签结合后淬灭基团离去，实现荧光激活(T.Komatsu.et.al.J.Am.Chem.Soc.2011，133，6745-6751.)。但是，淬灭基团的引入，大大增加了探针的分子体积，使标记速度大大下降，严重限制了探针在细胞、组织中蛋白的实时跟踪与检测，并且，荧光探针与淬灭基团之间必须具有较好的能级匹配，这样使得长波长，例如，红光发射染料的FRET设计非常困难。另外，一些荧光对极性敏感的染料也被用来设计激活型探针(T.K.Liu.et.al.ACS Chem.Biol.2014，9，2359-2365.)，染料处于细胞液等大极性溶剂中，探针没有荧光或者具有较弱荧光，当配体与蛋白结合，探针处于蛋白非极性口袋中，探针发射较强荧光。然而，一方面由于蛋白表面本身就存在一个极性较大的水化层，使探针的荧光增强幅度有限；另一方面，细胞或组织本身是个非常复杂的体系，各个细胞器的极性变化很大，这些都会导致极性敏感的探针在细胞或组织造影中具有很高的背景。最近，文献(T.Y.Wang et.al.Chem Sci.2016，7，301-307.)报导了具有粘度响应性的分子转子荧光探针，在蛋白配体与蛋白共价结合后，蛋白位阻的作用降低分子转子自由度，从而使得探针荧光激活。然而，该文献中探针分子荧光激活后的荧光亮度并不高，荧光量子产率非常低。因此，该文献报导的方法不能作为合格的荧光蛋白标签，用于靶蛋白的标记、跟踪、定位和定量。
发明内容
本发明人发现，通过将配体部分与粘度响应性荧光染料的电子供体部分相连，能够极大地提高配体与标签蛋白结合激活荧光后的荧光亮度，从而获得了一种全新结构的荧光探针，其具有粘度响应性，可用于蛋白的特异性标记，标记速度快、荧光激活亮度高、适用范围广，能够有效用于靶蛋白的标记、跟踪、定位和定量。
鉴于此，本发明提供一种荧光探针，包括：配体部分A，任选的连接体部分C和荧光染料部分，所述荧光染料部分为粘度响应性荧光染料基团，包括电子供体部分D、共轭体系B和电子受体部分，所述配体部分A为能够与蛋白标签或融合蛋白标签的靶蛋白特异性识别并标记的基团，可选地，所述配体部分A为能够与蛋白标签或融合蛋白标签的靶蛋白特异性识别并共价标记的基团；其特征在于，所述配体部分A直接共价连接于荧光染料部分的电子供体部分D，或者，通过连接体部分C共价连接于荧光染料部分的电子供体部分D。
可选地，上述的荧光探针，其具有如式(I)所示的结构，
其中，连接体部分C为任选存在的基团，选自亚烷基、改性亚烷基；
式(I)中的式(I-R)所示结构部分为荧光染料部分，
其中：
电子供体部分-D-为-NX1-X2-，X1选自氢、烷基或改性烷基，X2选自亚烷基或改性亚烷基，X1，X2任选相互连接，与N原子一起形成脂杂环；
共轭体系B为选自双键、叁键、芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成，其为如下式(I-1)所示的结构，其中所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成脂环或脂杂环；
任选地，所述式(I-1)结构与X1、X2相互连接形成脂杂环；
电子受体部分具有如下式(I-2)所示的结构，
其中，
R1选自氢、卤原子、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基；
R2选自氰基、羧基、酮基、酯基、酰胺基、膦酸基、膦酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基或改性烷基；
R3为氰基；
电子受体部分任选形成下式(I-2-a)、(I-2-b)环状结构：
其中，Ra、Rb独立地选自氢、亲水性基团、烷基和改性烷基，Ra和Rb任选地相互连接形成脂环或脂杂环；
Y1选自-O-、-S-、-(S＝O)-和-(NRi)-，其中Ri选自氢、烷基或改性烷基；
Y2选自＝O、＝S、＝S＝O和＝NRi，其中Ri选自氢、烷基或改性烷基；
Y3选自＝O、＝S、＝S＝O和＝NRi，其中Ri选自氢、烷基或改性烷基；
或者，Y3为＝C(Re)(CN)；
Re选自氰基、羧基、酮基、酯基、酰胺基、膦酸基、膦酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基或改性烷基；
当R2或Re为芳基或杂芳基时，环上的氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基或改性烷基中的取代基取代；任选地，所述取代基相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环；
其中，
所述烷基为具有1～30个碳原子的饱和脂肪族直链或支链的烷基；
所述亚烷基为具有1～30个碳原子的饱和脂肪族直链或支链的亚烷基；
所述改性烷基为烷基的任意碳原子被选自卤原子、-O-、-OH、-CO-、-NO2、-CN、-S-、-SO2-、-(S＝O)-、苯基、亚苯基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、饱和或不饱和的单环或双环亚环烃基、桥联脂杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1～300个碳原子，其碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳叁键置换；
所述改性亚烷基为亚烷基的任意碳原子被选自卤原子、-O-、-OH、-CO-、-NO2、-CN、-S-、-SO2-、-(S＝O)-、苯基、亚苯基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、饱和或不饱和的单环或双环亚环烃基、桥联脂杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性亚烷基具有1～30个碳原子，其碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳叁键置换；
所述脂环为饱和或不饱和的4～10元单环或多环脂环；
所述脂杂环为环上含有选自N、O、S或Si中的至少一种杂原子的饱和或不饱和的4～10元单环或多环脂杂环，所述脂杂环上含有S原子时，其任选为-SO-或-SO2-；所述脂杂环任选被卤原子、硝基、烷基、芳基、亲水性基团和改性烷基取代；
所述芳基或芳香环为5～10元单环或稠合双环；
所述杂芳基或芳香杂环为环上含有选自N、O、S或Si中的至少一种杂原子的5～10元单环或稠合双环；
所述卤原子各自独立地选自F、Cl、Br、I；
所述亲水性基团为羟基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、伯氨基、仲氨基或叔氨基及其取代物；
所述单环亚环烃基为4～7元亚环烃基；
所述双环亚环烃基为5～7元双环亚环烃基；
所述桥联脂杂环为环上含有选自N、O、或S中的至少一种杂原子的5～20元桥联脂杂环。
可选地，上述的荧光探针，其特征在于：
所述蛋白标签为提纯品、未提纯品或存在于细胞或组织的原位状态；
可选地，所述蛋白标签为O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(SNAP-tag)或其突变体、烷基胞嘧啶转移酶(CLIP-tag)或其突变体；
可选地，所述O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的突变体选自SNAPF33G或SNAPV164E；
可选地，所述蛋白标签为O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(SNAP-tag)或其突变体；
所述配体部分A来自于O6-烷基鸟嘌呤衍生物、烷基4-氯嘧啶衍生物或烷基胞嘧啶衍生物；
可选地，适用于SNAP-tag的配体部分A来自于O6-烷基鸟嘌呤衍生物或烷基4-氯嘧啶衍生物；可选地，适用于CLIP-tag的配体部分A来自于烷基胞嘧啶衍生物；
可选地，所述配体部分A-选自下式结构：
可选地，所述改性烷基或改性亚烷基各自独立地为含有选自-OH、-O-、乙二醇单元(-(CH2CH2O)n-)、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基、C1～C8酰基氧基、C1～C8卤代烷基、单糖单元、二糖单元、多糖单元、-O-CO-、-NH-CO-、-(-NH-CHR-CO-)n-、-SO2-O-、-SO-、-SO2-NH-、-S-S-、-CH＝CH-、-C≡C-、卤原子、氰基、硝基、邻硝基苯基、苯甲酰甲基、磷酸酯基或膦酸酯基中至少一种基团的基团，其中，n为1～100，R为H或α-氨基酸的残基；
可选地，所述C1～C8烷基为甲基、乙基、丙基、异丙基，所述C1～C8烷氧基为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基，C1～C8酰基氧基为乙酰氧基、乙基、丙基、异丙基，C1～C8卤代烷基为三氟甲基、氯甲基、溴甲基；
可选地，所述脂杂环选自氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉、硫代吗啉；
可选地，所述杂芳环选自噻吩、呋喃、吡咯。
可选地，所述连接体部分选自-(C＝O)-、-(CH2CH2O)n-，其中，n为1～20
可选地，X1为任选被一个或多个选自羟基、氰基、卤原子、羧基、季铵基团的基团取代的C1-50直链或支链烷基，X2为任选被一个或多个选自羟基、氰基、卤原子、羧基、季铵基团的基团取代的C1-50直链或支链亚烷基；或者X1、X2各自独立地为任选被一个或多个选自磺酸基、羧基的基团取代的含1-10个氧原子的C2-50醚链基团；或者，-NX1-X2-形成选自下式(I-1-1)～(I-1-2)的任一基团：
可选地，X1为任选被1个或多个选自羟基、氰基、卤原子、羧基、季铵基团的基团取代的C1-10直链或支链烷基，X2为任选被1个或多个选自羟基、氰基、卤原子、羧基、季铵基团的基团取代的C1-10直链或支链亚烷基。
可选地，上述的荧光探针，其特征在于，所述共轭体系B中两个相邻取代基相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环；
可选地，所述共轭体系B中CH上的H被卤原子、硝基、亲水性基团、烷基或改性烷基取代；
可选地，所述共轭体系B中含有NH；可选地，所述NH上的H被烷基或改性烷基取代；
可选地，所述共轭体系B选自下式(I-1-1)～(I-1-28)中的结构：
可选地，所述共轭体系B与X1相互连接形成如下所示的脂杂环：
其中，X2如权利要求2或3中所述。
可选地，上述的荧光探针，其中，式(I-2-a)中Ra、Rb与所连接的碳原子一起形成：
可选地，所述R2和Re独立地为选自以下结构的基团，或者，由以下结构自身或相互之间稠合形成的双环或多环稠芳香环或稠芳香杂环：优选为双环或三环稠芳香环或稠芳香杂环；
可选的，R2或Re的上述结构中CH上的H被卤原子、硝基、亲水性基团、烷基或改性烷基取代；可选地，R2或Re为选自上述结构中的含NH的基团，可选地，所述NH上的H被烷基或改性烷基取代；
或者，所述R2和Re独立地为改性烷基：所述改性烷基含有酮基、酯基或酰胺基，并且通过酮基、酯基或酰胺基中的羰基连接到式(I-2)或式(I-2-a)的烯基碳上；
可选地，所述式(I-2)结构为选自下式(I-2-1)～(I-2-18)中的一种：
可选地，上述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针选自下式化合物：
/>
/>
本发明还提供制备上述的荧光探针的方法，其特征在于，包括式(II)所示荧光染料与配体以及任选的连接体发生反应的步骤：
其中，D’反应后能够形成D-基团与连接基团或配体键合。
本发明还提供一种荧光激活型蛋白特异性标记方法，其特征在于，包括以下步骤：将上述的荧光探针与蛋白标签或者融合蛋白标签的靶蛋白接触，所述荧光探针的配体部分与蛋白标签发生标记反应，将荧光探针标记到蛋白标签上；可选地，所述将荧光探针标记到蛋白标签上为共价标记；
可选地，所述标记反应的反应介质选自纯蛋白溶液、细胞裂解液或蛋白标签或融合蛋白标签的靶蛋白所处在的原位介质；可选地，所述原位介质为细胞内介质、细胞器内介质、活体组织介质、血液或体液。
本发明还提供上述的荧光探针在蛋白荧光标记，蛋白的定量、检测或动力学研究，以及细胞、组织、活体影像中的用途。
本发明还提供一种探针试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的荧光探针。
可选地，所述探针试剂盒还包含生物相容性介质；可选地，所述生物相容性介质选自二甲基亚砜、缓冲剂、生理盐水中的至少一种；可选地，所述缓冲剂包括磷酸盐缓冲液。
本发明所述蛋白标签(tag)或者是融合该标签的靶蛋白部分可通过现有基因工程技术制备而来。
本发明所述的具有粘度响应性荧光染料是指染料分子的荧光强度对溶液粘度响应，随溶液的粘度增大，荧光强度增强。可选地，所述的具有粘度响应性荧光染料为：在25℃下，同等浓度和激发波长的条件下，染料最大荧光发射强度在甘油中的荧光强度与在甲醇中的荧光强度之比大于2，优选大于5，更优选大于10的有机染料分子。所述粘度响应性染料的浓度的范围在1×10-7M～1×10-5M。
根据具体情况，本领域工作人员可根据需要选择对应的标签与配体。
本领域技术人员可以利用具有相应配制的仪器设备对蛋白标签或者是融合蛋白标签的靶蛋白进行跟踪监测，根据需要，所用的仪器设备包括能测试或显示荧光的设备与设施，如荧光光谱仪、荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、酶标仪、流式细胞仪和活体成像仪等设备。
根据需要，操作者可以选择不同种类或发射/激发波长的染料。
根据本发明一方面的实施方式，荧光探针荧光发射波长范围广。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针的荧光强度随环境粘度的增大而增强，对粘度响应灵敏，具有粘度响应性。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针可用于蛋白标签或融合蛋白标签的靶蛋白的特异性标记，荧光探针结合蛋白标签后荧光可以被激活，具有良好的荧光分子开关性质，而且荧光激活倍数高，荧光激活亮度高。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针的荧光强度和蛋白标签浓度具有很好的线性关系，可用于目标蛋白的定量检测。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针可以实现特异性标记细胞内蛋白标签，并且实现荧光特异性点亮，同时，探针荧光不受细胞内环境影响。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针可以作为细胞亚细胞器标记的有力工具，例如对细胞核、线粒体、高尔基体、内质网、全细胞、细胞骨架、细胞外膜、溶酶体、细胞内膜等的标记。
根据本发明另一方面的实施方式，不同的荧光探针荧光基团的光谱不会相互干扰，本发明不同色系的荧光探针，可以对样本进行多色标记，可以同时进行正交标记成像。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针的荧光不受动物内环境影响，可以应用于活体动物体内，例如特异性标记表达在肝脏部位的SNAP蛋白标签，并产生较强荧光信号。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针可以用于跟踪、监测目标蛋白的降解过程。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针实时监测哺乳动物细胞内生物大分子的组装与降解过程。
根据本发明的另一方面，荧光探针可以对组织、活体等不适宜清洗的样本进行快速造影成像。
根据本发明的另一方面，荧光探针未标记蛋白标签或融合蛋白标签的靶蛋白时几乎不产生检测信号，不干扰对样本的检测，可以实现复杂样本的快速定量检测，还可以跟踪标记反应过程的动力学过程。
附图说明
图1为不同探针与蛋白标签结合后不同波长的荧光被激活的荧光发射图；
图2～图11分别为探针1、探针14、探针21、探针30、探针43、探针48、探针56、探针63、探针70、探针88的荧光强度对不同SNAP蛋白标签浓度做的标准曲线；
图12为不同探针标记细胞荧光图谱，其中，(1)～(8)分别为探针1、探针15、探针21、探针30、探针56、探针60、探针63、探针88，A组是表达蛋白标签的Hela细胞，B组是Hela-WT细胞(Hela原始细胞，未表达蛋白标签)；
图13为不同探针标记不同的细胞器，其中，A组～F组分别为探针1、探针21、探针48、探针60、探针66、探针77，(1)～(9)分别为细胞核、线粒体、高尔基体、内质网、全细胞、细胞骨架、细胞外膜、溶酶体、细胞内膜；
图14为不同探针对相同细胞进行双色标记，其中，A为探针1标记的线粒体，B为探针43标记的细胞核，C为A和B的正交成像；
图15为探针88用于活体小鼠的标记，其中，A组为空白组，B组为对照组，C组为样品组，(1)为肝脏，(2)为肾脏；
图16为探针21在哺乳动物细胞中的荧光随蛋白降解的变化；
图17为不同探针示踪细胞间隙组装过程，其中，A表示探针21的荧光通道，B表示探针1的荧光通道，C表示探针21和探针21的叠加荧光通道。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于对本发明进行示例性说明，并不用于限制本发明。
实施例1
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的探针1：
化合物1：
N-甲基-N-(2-羟乙基)-4-氨基苯醛(0.358g，2mmol)和氰基乙酸叔丁酯(0.338g，2.4mmol)溶于50ml无水乙醇中，加入催化量无水氯化锌，Ar保护条件下油浴加热5h，反应结束，冷却至室温，旋转蒸发除掉部分溶剂，体系有大量固体析出，过滤，滤饼用冷乙醇洗两次，真空烘干，即得纯的黄色化合物1(0.49g，81％)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(s，1H)，7.97(d，2H，J＝9.2Hz)，6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，4.79(bt，1H)，3.55-3.59(m，4H)，3.08(s，3H)，1.50(s，9H)。
化合物2：
合成方法参照文献Antje Keppler et.al.Nat Biotechnology.2002，21，86-89.公开的方法进行合成。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.82(s，1H)，7.39(m，4H)，6.27(s，2H)，5.45(s，2H)，3.71(s，2H)。
探针1：
化合物1(0.302g，1.0mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.146g，1.2mmol)于20ml的无水二氯甲烷中溶解，氩气保护条件下缓慢滴加入对硝基氯甲酸苯酯(0.242g，1.2mmol)的10ml无水二氯甲烷溶液，滴加完毕，室温搅拌1h，反应完毕，旋转蒸干溶剂，残余物溶于10ml无水N，N-二甲基甲酰胺中，加入化合物2(0.324g，1.2mmol)，加入无水三乙胺(0.16ml，1.2mmol)，Ar保护条件下室温搅拌30min，反应完毕，旋转蒸干溶剂，残余物过柱分离，即得纯的探针10.42g，产率70％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.97(d，2H，J＝9.2Hz)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.79(bt，1H)，4.40(d，2H，J＝4.90Hz)，3.55-3.59(m，4H)，3.08(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例2
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的探针2：
化合物3：
合成方法参照文献J.Das et.al.Bioorg.Med.Chem.Lett.2005，15，337-343.公开的方法进行合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(m，2H)，4.12(s，2H)。
化合物4的合成：
参照化合物1的合成方法。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.11-8.07(m，2H)，8.01-7.97(m，3H)，7.70(d，1H，J＝8.8Hz)，7.46-7.43(m，1H)，6.27(dd，1H，J＝9.2，1.6Hz)，6.02(s，1H)，3.88(t，2H，J＝5.6Hz)，3.64(t，2H，J＝5.6Hz)，3.15(s，3H)。
探针2：
按照探针1的合成方法，产率75％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.41(s，1H)，10.01(s，1H)，8.11-8.07(m，2H)，8.01-7.97(m，3H)，7.81(s，1H)，7.70(d，1H，J＝8.8Hz)，7.46-7.43(m，1H)，7.41(m，4H)，6.29(s，2H)，6.27(dd，1H，J＝9.2，1.6Hz)，6.02(s，1H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.9Hz)，3.88(t，2H，J＝5.6Hz)，3.64(t，2H，J＝5.6Hz)，3.15(s，3H)。
实施例3
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针3：
化合物5：
参照化合物1的合成方法合成，产率95％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.09(s，1H)，8.02(d，1H，J＝8.0Hz)，7.98(d，2H，J＝9.2Hz)，7.86(d，1H，J＝8.4Hz)，7.48(t，1H，J＝7.8Hz)，7.36(t，1H，J＝7.36Hz)，6.73(d，2H，J＝9.2Hz)，3.88(t，2H，J＝5.6Hz)，3.64(t，2H，J＝5.6Hz)，3.15(s，3H)。
探针3：
参照探针1的合成方法合成，产率65％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.40(s，1H)，10.02(s，1H)，8.09(s，1H)，8.02(d，1H，J＝8.0Hz)，7.98(d，2H，J＝9.2Hz)，7.86(d，1H，J＝8.4Hz)，7.81(s，1H)，7.48(t，1H，J＝7.8Hz)，7.40(m，4H)，7.36(t，1H，J＝7.36Hz)，6.73(d，2H，J＝9.2Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，1H，J＝4.8Hz)，3.88(t，2H，J＝5.6Hz)，3.64(t，2H，J＝5.6Hz)，3.15(s，3H)。
实施例4
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针4：
化合物6：
按照文献(Srikun DK et.al.JACS 2010，132，4455-4465.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.31(d，2H，J＝8.0Hz)，7.10(brs，2H)，6.10(s，1H)，5.25(s，2H)，3.68(s，2H)。
探针4：
参照探针1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.99(brs，1H)，8.01(s，1H)，7.97(d，2H，J＝9.2Hz)，7.39(d，2H)，7.26(d，2H，J＝8.4Hz)，7.09(s，2H)，6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，6.10(s，1H)，5.26(s，2H)，4.79(bt，1H)，4.36(s，2H)，3.55-3.59(m，4H)，3.08(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例5
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针5
探针5：
参照探针1的合成方法，产率59％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.97(s，1H)，8.11-8.07(m，2H)，8.01-7.97(m，3H)，7.70(d，1H，J＝8.8Hz)，7.46-7.43(m，1H)，7.39(d，2H，J＝8.4Hz)，7.26(d，2H，J＝8.4Hz)，7.10(s，2H)，6.27(dd，1H，J＝9.2，1.6Hz)，6.10(s，1H)，6.02(s，1H)，5.26(s，2H)，4.36(s，2H)，3.88(t，2H，J＝5.6Hz)，3.64(t，2H，J＝5.6Hz)，3.15(s，3H)。
实施例6
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针6：
探针6：
参照化合物1的合成方法，产率55％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.98(brs，1H)，8.09(s，1H)，8.02(d，1H，J＝8.0Hz)，7.98(d，2H，J＝9.2Hz)，7.86(d，1H，J＝8.4Hz)，7.48(t，1H，J＝7.8Hz)，7.39(d，2H，J＝8.4Hz)，7.36(t，1H，J＝8.4Hz)，7.26(d，2H，J＝8.0Hz)，7.09(s，2H)，6.73(d，2H，J＝9.2Hz)，6.10(s，1H)，5.26(s，2H)，4.36(s，2H)，3.88(t，2H，J＝5.6Hz)，3.64(t，2H，J＝5.6Hz)，3.15(s，3H)。
实施例7
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针7：
化合物7：
按照文献公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ＝7.84(d，1H，J＝6.0Hz)，7.40(d，2H，J＝8.0Hz)，7.31(d，2H，J＝8.0Hz)，6.14(d，1H，J＝6.0)，5.29(s，2H)，3.78(s，2H)。
探针7：
参照探针1的合成方法，产率66％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(s，1H)，7.97(d，2H，J＝9.2Hz)，7.93(d，2H，J＝8.0Hz)，7.75(s，1H)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.55-3.59(m，4H)，3.08(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例8
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针8：
探针8：
参照探针1的合成，产率60％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.11-8.07(m，2H)，8.01-7.97(m，3H)，7.93(d，1H，J＝5.6Hz)，7.75(s，1H)，7.70(d，1H，J＝8.8Hz)，7.46-7.43(m，1H)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.27(dd，1H，J＝9.2，1.6Hz)，6.10(d，1H，J＝5.6Hz)，6.02(s，1H)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.88(t，2H，J＝5.6Hz)，3.64(t，2H，J＝5.6Hz)，3.15(s，3H)。
实施例9
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针9：
探针9：
参照探针1的合成方法，产率65％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.09(s，1H)，8.02(d，1H，J＝8.0Hz)，7.98(d，2H，J＝9.2Hz)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.86(d，1H，J＝8.4Hz)，7.75(s，1H)，7.48(t，1H，J＝7.8Hz)，7.36(t，1H，J＝7.36Hz)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.73(d，2H，J＝9.2Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.88(t，2H，J＝5.6Hz)，3.64(t，2H，J＝5.6Hz)，3.15(s，3H)。
实施例10
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针10：
化合物8：
参照化合物1的合成方法，产率95％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(s，1H)，7.97(d，2H，J＝9.2Hz)，6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，4.79(bt，1H)，3.85(t，4H，J＝5.6Hz)，3.60(t，4H，J＝5.6Hz)，1.50(s，9H)。
探针10：
参照探针1的合成方法，产率35％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.97(d，2H，J＝9.2Hz)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.79(bt，1H)，4.40(d，2H，J＝4.90Hz)，3.87(m，4H)，3.61(m，4H)，1.51(s，9H)。
实施例11
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针11：
探针11：
化合物1(0.629g，1.0mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.146g，1.2mmol)于20ml的无水二甲基甲酰胺中溶解，氩气保护条件下缓慢滴加入对硝基氯甲酸苯酯(0.242g，1.2mmol)的10ml无水二氯甲烷溶液，滴加完毕，室温搅拌1h，反应完毕，加入3-氨基-丙磺酸(0.168g，1.2mmol)，加入无水三乙胺(0.16ml，1.2mmol)，Ar保护条件下室温搅拌30min，反应完毕，旋转蒸干溶剂，残余物反相柱分离，即得纯的探针0.397g，产率50％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.97(d，2H，J＝9.2Hz)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.79(bt，1H)，4.40(d，2H，J＝4.90Hz)，3.81(t，4H，J＝6.0Hz)，3.60(t，4H，J＝6.0Hz)，3.21(t，2H，5.6Hz)，2.71(t，2H，5.6Hz)，2.31(m，2H)，1.51(s，9H)。
实施例12
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针12：
化合物9：
按照文献(Tetsuaki Fujhara et al.Chem Comm，2015，51，17382-17385.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.75(d，2H，J＝8.2Hz)，7.30(d，2H，J＝7.8Hz)，4.11(t，2H，J＝4.8Hz)，3.52-3.65(m，16H)，3.37(s，3H)，2.50(s，3H)。
化合物10：
化合物8(0.664g，2mmol)溶于10ml无水二甲基甲酰胺中，Ar保护条件下冷却至0℃，加入60％NaH(0.088g，2.2mmol)搅拌5min，加入化合物9(0.781g，2mmol)，缓慢恢复至室温搅拌3.5h，反应完毕，加水0.5ml淬灭反应，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得淡黄色油状物0.396g，产率36％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(s，1H)，7.97(d，2H，J＝9.2Hz)，6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，3.56-3.68(m，24H)，3.38(s，3H)，1.50(s，9H)。
探针12：
参照探针1的合成方法，产率71％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.97(d，2H，J＝9.2Hz)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.56-3.68(m，24H)，3.38(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例13
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针13：
化合物11：
按照文献(Yang W et al.J.Photochem.Photobiol.A.2011，222，228-235.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，D2O)：δ＝9.43(s，1H)，7.72(d，2H，J＝9.0Hz)，6.81(d，2H，J＝9.0Hz)，3.71(t，2H，J＝7.36Hz)，3.03(s，3H)，2.44(t，2H，J＝7.2Hz)。
化合物12：
参照化合物1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，D2O)：δ＝8.01(s，1H)，7.72(d，2H，J＝9.0Hz)，6.81(d，2H，J＝9.0Hz)，3.71(t，2H，J＝7.36Hz)，3.03(s，3H)，2.44(t，2H，J＝7.2Hz)，1.49(s，9H)。
探针13：
化合物12(0.33g，1mmol)六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.625g，1.2mmol)和化合物2(0.324g，1.2mmol)于50ml圆底烧瓶中，加入无水二甲基甲酰胺15ml，加入0.3ml三乙胺，Ar保护条件下室温搅拌0.5h，反应完毕，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得淡黄色固体0.524g，产率90％。1H-NMR(400MHz，D2O)：δ＝12.43(s，1H)，10.00(s，1H)，8.01(s，1H)，7.81(s，1H)，7.72(d，2H，J＝9.0Hz)，7.40(m，4H)，6.81(d，2H，J＝9.0Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.71(t，2H，J＝7.36Hz)，3.03(s，3H)，2.47(t，2H，J＝7.2Hz)，1.49(s，9H)。
实施例14
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针14：
化合物13：
参照文献(L.X.Wu，K.Burgess，J.Am.Chem.Soc.2008，130，4089-4096.)公开方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.63-7.48(m，5H)，4.27(s，2H)，3.13(s，3H)。
化合物14：
参照化合物1的合成方法，产率99％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.03(s，1H)，7.97(d，2H，J＝9.2Hz)，6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，4.27(s，2H)，3.55-3.59(m，4H)，3.08(s，3H)，3.13(s，3H)。
探针14：
参照探针1的合成方法，产率70％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.96(d，2H，J＝9.2Hz)，7.81(s，1H)，7.63-7.48(m，5H)，7.40(m，4H)，6.84(d，2H，J＝9.2Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，4.27(s，2H)，3.55-3.59(m，4H)，3.13(s，3H)，3.03(s，3H)。
实施例15
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针15：
化合物15：
参照文献(L.X.Wu，K.Burgess，J.Am.Chem.Soc.2008，130，4089-4096.)公开方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝3.98(q，2H，J＝2.4Hz)，3.01(s，3H)，2.15(t，3H，J＝2.4Hz)。
化合物16：
参照化合物1的方法合成，产率97％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.00(s，1H)，7.97(d，2H，J＝9.2Hz)，6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，3.98(q，2H，J＝2.4Hz)，3.55-3.59(m，4H)，3.08(s，3H)，3.01(s，3H)，2.15(t，3H，J＝2.4Hz)。
化合物17：
化合物17(0.546g，2mmol)、苯甲醛(0.530g，5mmol)和无水氯化锌(0.545g，4mmol)溶于100ml无水甲苯中，Ar保护条件下油浴加热回流48h，反应完毕，旋转蒸干溶剂，残余物溶于100ml二氯甲烷中，水洗三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离，得红褐色固体0.181g，产率25％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.21(d，2H，J＝8.8Hz)，8.00(d，1H，J＝16Hz)，7.85(d，2H，J＝8.0Hz)，7.45-7.38(m，3H)，7.24(s，1H)，7.01(s，1H)，6.92(d，2H，J＝8.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
探针15：
参照探针1的合成方法，产率66％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.21(d，2H，J＝8.8Hz)，8.00(d，1H，J＝16Hz)，7.85(d，2H，J＝8.0Hz)，7.81(s，1H)，7.45-7.38(m，7H)，7.24(s，1H)，7.01(s，1H)，6.92(d，2H，J＝8.8Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
实施例16
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针16：
探针16：
参照探针1的合成方法，产率78％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.99(brs，1H)，8.21(d，2H，J＝8.8Hz)，8.00(d，1H，J＝16Hz)，7.85(d，2H，J＝8.0Hz)，7.45-7.39(m，3H)，7.35(d，2H，J＝8.4Hz)，7.26(d，2H，J＝8.4Hz)，7.24(s，1H)，7.09(s，2H)，7.01(s，1H)，6.92(d，2H，J＝8.8Hz)，6.10(s，1H)，5.26(s，2H)，4.36(s，2H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
实施例17
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针17：
探针17：
参照探针1的合成方法，产率71％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.21(d，2H，J＝8.8Hz)，8.00(d，1H，J＝16Hz)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.85(d，2H，J＝8.0Hz)，7.75(s，1H)，7.45-7.38(m，3H)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.24(s，1H)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，7.01(s，1H)，6.92(d，2H，J＝8.8Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
实施例18
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针18：
化合物18：
按照文献(Wang H.et al.Tetra Let.2007，48，3471-3474.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.05(m，2H)，7.01(m，2H)，1.83(s，6H)。
化合物19：
化合物18(0.279g，1mmol)溶于20ml无水吡啶中，加入N-甲基-N-羟乙基1ml，Ar保护条件下40℃油浴加热过夜，反应完毕，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得红色产物0.187g，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.05(m，2H)，7.01(m，2H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.83(s，6H)。
探针18：
参照探针1的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.40(s，1H)，10.01(s，1H)，8.05(m，2H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.01(m，2H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.86(t，2H，J＝5.6Hz)，3.61(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.83(s，6H)。
实施例19
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针19：
探针19：
参照探针1的合成方法，产率75％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.90(brs，1H)，8.05(m，2H)，7.39(d，2H，J＝8.4Hz)，7.26(d，2H，J＝8.4Hz)，7.09(s，2H)，7.01(m，2H)，6.10(s，1H)，5.26(s，2H)，4.36(s，2H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.83(s，6H)。
实施例20
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针20：
探针20：
参照探针1的合成方法，产率71％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.05(m，2H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.75(s，1H)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，7.01(m，2H)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.83(s，6H)。
实施例21
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针21：
探针20：
按照公开方法(WO 2013142841(A1)，2013.09.26。)合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.92(s，1H)，7.63(d，1H，J＝5.2Hz)，7.31(d，1H，J＝5.2Hz)。
化合物21：
化合物20(0.438g，2mmol)溶于15mLN-甲基-N-羟乙基胺，加入铜粉(6.4mg，0.01mmol)，碘化亚铜(19mg，0.01mmol)，磷酸三钾(0.850g，4mmol)，Ar保护条件下80℃油浴加热过夜，反应完毕，冷却至室温，体系倒入50mL水中，二氯甲烷萃取3次×50mL，合并有机相，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离得黄色产物0.362g，产率85％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.92(s，1H)，7.63(d，1H，J＝5.2Hz)，7.31(d，1H，J＝5.2Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
化合物22：
化合物21(0.426g，2mmol)溶于50ml无水二氯甲烷中，加入1ml三乙胺，冰浴条件下缓慢滴加醋酸酐(0.3ml，3mmol)，滴加完毕，体系缓慢升至室温，搅拌3h，反应完毕，加水100ml，分出有机相，水相用二氯甲烷50ml二氯甲烷萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物无需进一步纯化，直接用于下一步。
上述残余物溶于50ml二氯甲烷中，加入二甲基甲酰胺5ml，冰浴条件下加入三氯氧磷2ml，Ar保护条件下搅拌0.5h，体系缓慢升至室温，继续搅拌5h，反应完毕，加入饱和碳酸钠溶液调pH＝10.0，室温条件下搅拌过夜，次日分出有机相，水相用二氯甲烷50ml萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤两次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得黄色固体0.285g，产率59％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.01(s，1H)，7.92(s，1H)，7.63(s，1H)3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
化合物23：
参照化合物1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，6.43(s，1H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.49(s，9H)。
探针21：
参照探针1的方法合成，产率65％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.22(s，1H)，10.01(s，1H)，8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，6.43(s，1H)，6.28(s，2H)，5.45(s，2H)，4.41(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，1.49(s，9H)。
实施例22
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针22：
化合物24：
参照化合物1的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(m，2H)，6.43(s，1H)，3.75(t，2H，J＝5.6Hz)，3.55(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
探针22：
参照探针1的合成方法，产率66％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.02(s，1H)，10.00(s，1H)，8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.81(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(m，6H)，6.43(s，1H)，6.28(s，2H)，5.45(s，2H)，4.41(d，2H，J＝4.8Hz)，3.75(t，2H，J＝5.6Hz)，3.55(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
实施例23
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针23：
化合物25：
参照化合物1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.22(s，1H)，8.09(d，1H，J＝8.0Hz)，8.02(s，1H)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，6.43(s，1H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
探针23：
参照探针1的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.32(s，1H)，10.03(s，1H)，8.22(s，1H)，8.09(d，1H，J＝8.0Hz)，8.02(s，1H)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.81(s，1H)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.40(m，4H)，6.43(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
实施例24
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针24：
探针24：
参照探针1的合成方法，产率58％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.98(brs，1H)，8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.39(d，2H，J＝8.4Hz)，7.26(d，2H，J＝8.4Hz)，7.09(s，2H)，6.43(s，1H)，6.10(s，1H)，5.26(s，2H)，4.36(s，2H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.49(s，9H)。
实施例25
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针25：
探针25：
参照探针1的合成方法，产率63％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.99(brs，1H)，8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.44(d，2H，J＝8.4Hz)，7.36-7.42(m，2H)，7.26(d，2H，J＝8.4Hz)，7.09(s，2H)，6.43(s，1H)，6.10(s，1H)，5.26(s，2H)，4.36(s，2H)，3.75(t，2H，J＝5.6Hz)，3.55(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
实施例26
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针26：
探针26：
参照化合物1的合成方法，产率58％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.98(brs，1H)，8.22(s，1H)，8.09(d，1H，J＝8.0Hz)，8.02(s，1H)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.39(d，2H，J＝8.4Hz)，7.26(d，2H，J＝8.4Hz)，7.09(s，2H)，6.43(s，1H)，6.10(s，1H)，5.26(s，2H)，4.36(s，2H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
实施例27
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针27：
探针27：
参照探针1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.75(s，1H)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.43(s，1H)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.49(s，9H)。
实施例28
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针28：
探针28：
参照探针1的合成方法，产率63％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.77(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(m，2H)，7.30(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.43(s，1H)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.75(t，2H，J＝5.6Hz)，3.55(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
实施例29
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针29：
探针29：
参照化合物1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.22(s，1H)，8.09(d，1H，J＝8.0Hz)，8.02(s，1H)，7.96(d，1H，J＝5.6)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.75(s，1H)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.43(s，1H)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
实施例30
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针30：
化合物26：
参照化合物21的合成方法，产率87％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.02(s，1H)，7.66(d，1H，J＝8.4Hz)，7.44-7.48(m，1H)，7.41(m，1H)，7.29(m，1H)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.10(s，3H)。
化合物27：
参照化合物22的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.92(s，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，J＝9.0Hz，1H)，6.92(d，J＝2.0Hz，1H)，6.82(d，J＝9.1，2.3Hz，1H)，3.61(t，J＝8.0Hz，3H)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.10(s，3H)。
化合物28：
参照化合物1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，6.43(s，1H)，3.61(t，J＝8.0Hz，3H)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.11(s，3H)，1.48(s，9H)。
探针30：
参照探针1的合成方法，产率66％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.20(s，1H)，7.81(s，2H)，7.68(d，J＝9.0Hz，1H)，7.40(m，4H)，6.92(d，J＝2.0Hz，1H)，6.82(d，J＝9.1，2.3Hz，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.61(t，J＝8.0Hz，3H)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.11(s，3H)，1.51(s，9H)。
实施例31
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针31：
化合物29：
参照化合物4的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.45(s，1H)，8.09(d，J＝8.00Hz，2H)，8.07(s，1H)，7.94(d，J＝8.00Hz，2H)，7.51(m，1H)，7.41(m，1H)，6.45(s，1H)，3.61(t，3H，J＝8.0Hz)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.21(s，3H)。
探针31：
参照探针1的合成方法，产率71％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.45(s，1H)，8.09(d，J＝8.00Hz，2H)，8.07(s，1H)，7.94(d，J＝8.00Hz，2H)，7.81(s，1H)，7.51(m，1H)，7.41(m，5H)，6.45(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.61(t，3H，J＝8.0Hz)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.21(s，3H)。
实施例32
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针32：
化合物30：
参照化合物1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.09(d，1H，J＝8.00Hz)，7.94(d，1H，J＝8.00Hz)，7.81(s，1H)，7.68(d，J＝9.0Hz，1H)，7.51(m，1H)，7.41(m，1H)，6.92(d，J＝2.0Hz，1H)，6.82(d，J＝9.1，2.3Hz，1H)，6.45(s，1H)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.21(s，3H)。
探针32：
参照探针1的合成方法，产率66％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.09(d，1H，J＝8.00Hz)，7.94(d，1H，J＝8.00Hz)，7.81(s，2H)，7.68(d，J＝9.0Hz，1H)，7.51(m，1H)，7.41(m，5H)，6.92(d，J＝2.0Hz，1H)，6.82(d，J＝9.1，2.3Hz，1H)，6.45(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.62(t，2H，J＝8.0Hz)，3.36(t，J＝8.0Hz，2H)，3.21(s，3H)。
实施例33
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针33：
探针33：
参照探针1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.99(brs，1H)，8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.39(d，2H，J＝8.4Hz)，7.26(d，2H，J＝8.4Hz)，7.09(s，2H)，6.43(s，1H)，6.10(s，1H)，5.26(s，2H)，4.36(s，2H)，3.61(t，J＝8.0Hz，3H)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.21(s，3H)，1.48(s，9H)。
实施例34
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针34：
探针34：
参照探针1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.75(s，1H)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.43(s，1H)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.62(t，J＝8.0Hz，3H)，3.35(t，J＝8.0Hz，3H)，3.21(s，3H)，1.48(s，9H)。
实施例35
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针35：
化合物29：
参照化合物26的合成方法，产率42％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.62(d，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.82(dd，1H，J1＝9.0Hz，J2＝2.4Hz)，3.62(t，J＝8.0Hz，3H)，3.35(t，J＝8.0Hz，3H)。
化合物30：
化合物29(0.965g，5mmol)于100ml圆底烧瓶中，乙腈50ml溶解，加入碳酸钾(1.38g，10mmol)，溴癸烷(1.33g，6mmol)，Ar保护条件下由于加热回流，反应完毕，过滤，旋转蒸去溶剂，残余物溶于100ml乙酸乙酯中，分别用水、饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得蜡状固体1.182g，产率71％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.64(d，1H，J＝8.8Hz)，7.81(s，1H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.82(m，1H)，3.62(t，J＝8.0Hz，3H)，3.35(t，J＝8.0Hz，3H)，3.12-3.09(t，2H，J＝7.6Hz)，1.59-1.65(m，24H)，0.89(t，3H，J＝2.0Hz)。
化合物31：
参照化合物27的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.92(s，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.82(m，1H)，3.62(t，J＝8.0Hz，3H)，3.35(t，J＝8.0Hz，3H)，3.12-3.09(t，2H，J＝7.6Hz)，1.59-1.65(m，24H)，0.89(t，3H，J＝2.0Hz)。
化合物32：
参照化合物1的合成方法，产率87％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(s，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.82(m，1H)，3.62(t，J＝8.0Hz，3H)，3.35(t，J＝8.0Hz，3H)，3.12-3.09(t，2H，J＝7.6Hz)，1.59-1.65(m，33H)，0.89(t，3H，J＝2.0Hz)。
探针35：
参照探针1的合成方法，产率60％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.83(s，1H)，7.78(s，1H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，7.40(m，4H)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.82(m，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.62(t，J＝8.0Hz，3H)，3.35(t，J＝8.0Hz，3H)，3.12-3.09(t，2H，J＝7.6Hz)，1.59-1.65(m，33H)，0.89(t，3H，J＝2.0Hz)。
实施例36
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针36：
化合物33：
化合物29(0.580g，3mmol)于100ml圆底烧瓶中中，加入60ml甲苯溶解，加1ml丙烯腈，1ml醋酸，Ar保护条件下油浴加热回流24h，反应完毕，体系倒入100ml水中，分出有机相，水相用50ml二氯甲烷萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得0.487g，产率66％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.62(d，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.82(dd，1H，J1＝9.0Hz，J2＝2.4Hz)，3.72(t，2H，J＝6.8Hz)，3.62(t，J＝8.0Hz，3H)，3.35(t，J＝8.0Hz，3H)，2.57(t，2H，J＝6.8Hz)。
化合物34：
参照化合物27的合成方法，产率43％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.97(s，1H)，7.60(d，1H)，7.80(s，1H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.82(dd，1H，J1＝9.0Hz，J2＝2.4Hz)，3.72(t，2H，J＝6.8Hz)，3.62(t，J＝8.0Hz，3H)，3.35(t，J＝8.0Hz，3H)，2.57(t，2H，J＝6.8Hz)。
化合物35：
参照化合物1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.00(s，1H)，7.60(d，1H)，7.80(s，1H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.82(dd，1H，J1＝9.0Hz，J2＝2.4Hz)，3.72(t，2H，J＝6.8Hz)，3.62(t，J＝8.0Hz，3H)，3.35(t，J＝8.0Hz，3H)，2.57(t，2H，J＝6.8Hz)，1.49(s，9H)。
探针36：
参照探针1的合成方法，产率55％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.00(s，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，7.60(d，1H)，7.40(m，4H)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.82(m，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.72(t，2H，J＝6.8Hz)，3.62(t，J＝8.0Hz，3H)，3.35(t，J＝8.0Hz，3H)，2.57(t，2H，J＝6.8Hz)，1.49(s，9H)。
实施例37
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针37：
化合物36：
参照化合物21的合成方法，产率67％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.62(d，1H，J＝8.8Hz)，7.15(d，1H，J＝5.6Hz)，7.08-7.01(m，2H)，6.81(d，1H，J＝2.4Hz)，3.62(t，4H，J＝8.0Hz)，3.35(t，4H，J＝8.0Hz)。
化合物37：
参照化合物27的合成方法，产率67％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.99(s，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.81(m，1H)，3.62(t，4H，J＝8.0Hz)，3.35(t，4H，J＝8.0Hz)。
化合物38：
参照化合物1的合成方法，产率96％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.00(s，1H)，7.83(s，1H)，7.69(d，1H，J＝9.0Hz)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.81(m，1H)，3.62(t，4H，J＝8.0Hz)，3.35(t，4H，J＝8.0Hz)，1.49(s，9H)。
探针37：
参照探针1的合成方法，产率44％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，9.99(s，1H)，8.00(s，1H)，7.83(s，1H)，7.81(s，1H)，7.69(d，1H，J＝9.0Hz)，7.40(m，4H)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.81(m，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.62(t，4H，J＝8.0Hz)，3.35(t，4H，J＝8.0Hz)，1.49(s，9H)。
实施例38
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针38：
化合物39：
参照化合物10的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.00(s，1H)，7.83(s，1H)，7.69(d，1H，J＝9.0Hz)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.81(m，1H)，3.56-3.68(m，24H)，3.38(s，3H)，1.49(s，9H)。
探针38：
参照探针1的合成方法，产率67％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.00(s，1H)，7.83(s，1H)，7.81(s，1H)，7.69(d，1H，J＝9.0Hz)，7.40(m，4H)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.81(m，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.56-3.68(m，24H)，3.38(s，3H)，1.49(s，9H)。
实施例39
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针39：
探针39：
参照探针11的合成方法，产率65％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，9.99(s，1H)，8.00(s，1H)，7.83(s，1H)，7.81(s，1H)，7.69(d，1H，J＝9.0Hz)，7.40(m，4H)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.81(m，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.62(t，4H，J＝8.0Hz)，3.35(t，4H，J＝8.0Hz)，3.21(t，2H，5.6Hz)，2.71(t，2H，5.6Hz)，2.31(m，2H)，1.49(s，9H)。
实施例40
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针40：
化合物41：
参照化合物27的合成方法，产率68％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.62(d，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.82(dd，1H，J1＝9.0Hz，J2＝2.4Hz)，3.55(t，2H，J＝7.6Hz)，3.35(t，2H，J＝6.8Hz)，3.13(s，3H)，1.24(m，2H)。
探针40：
参照探针13的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，7.81(s，1H)，7.82(s，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，7.40(m，4H)，6.92(d，1H，J＝2.0Hz)，6.82(m，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.55(t，2H，J＝7.6Hz)，3.35(t，2H，J＝6.8Hz)，3.13(s，3H)，1.24(m，2H)。
实施例41
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针41：
化合物44：
参照化合物14的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，6.43(s，1H)，3.61(t，J＝8.0Hz，3H)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.11(s，3H)，3.00(s，3H)，2.15(t，3H，J＝2.4Hz)，1.48(s，9H)。
探针41：
参照探针1的合成方法，产率55％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，6.43(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.61(t，J＝8.0Hz，3H)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.11(s，3H)，3.00(s，3H)，2.15(t，3H，J＝2.4Hz)，1.48(s，9H)。
实施例42：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针42：
化合物45：
参照化合物1的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.63-7.68(m，5H)，6.43(s，1H)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.15(s，3H)，3.11(s，3H)。
探针42：
参照探针1的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.81(s，1H)，7.63-7.68(m，5H)，6.43(s，1H)，7.40(m，4H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.61(t，J＝8.0Hz，3H)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.15(s，3H)，3.11(s，3H)。
实施例43：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针43：
化合物46：
参照化合物21的合成方法，产率78％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.07(s，1H)，7.77(d，1H，J＝1.6Hz)，7.66(d，1H，J＝8.4Hz)，7.50(dd，1H，J1＝8.4Hz，J2＝1.6Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)。
化合物47：
参照化合物22的合成方法，产率81％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.99(s，1H)，7.61(d，1H，J＝1.6Hz)，7.49(d，1H，J＝8.4Hz)，7.40(dd，1H，J1＝8.4Hz，J2＝1.6Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)。
化合物48：
参照化合物1的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(s，1H)，7.61(d，1H，J＝1.6Hz)，7.49(d，1H，J＝8.4Hz)，7.40(dd，1H，J1＝8.4Hz，J2＝1.6Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)，1.50(s，9H)。
探针43：
参照探针1的合成方法，产率66％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.81(s，1H)，7.61(d，1H，J＝1.6Hz)，7.49(d，1H，J＝8.4Hz)，7.40(m，5H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例44：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针44：
探针44：
参照探针1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.99(brs，1H)，8.01(s，1H)，7.61(d，1H，J＝1.6Hz)，7.49(d，1H，J＝8.4Hz)，7.40(m，1H)，7.33(d，2H，J＝8.4Hz)，7.26(d，2H，J＝8.4Hz)，7.09(s，2H)，6.10(s，1H)，5.26(s，2H)，4.36(s，2H)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例45：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针45：
探针45：
参照探针1的合成方法，产率67％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(s，1H)，7.89(d，1H，J＝5.6)，7.75(s，1H)，7.61(d，1H，J＝1.6Hz)，7.49(d，1H，J＝8.4Hz)，7.40(dd，1H，J1＝8.4Hz，J2＝1.6Hz)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例46：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针46：
化合物49：
参照化合物1的合成方法，产率97％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.99(s，1H)，7.61(d，1H，J＝1.6Hz)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.49(d，1H，J＝8.4Hz)，7.36-7.42(m，3H)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)。
探针46：
参照探针1的合成方法，产率65％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.32(s，1H)，10.01(s，1H)，7.99(s，1H)，7.81(s，1H)，7.61(d，1H，J＝1.6Hz)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.49(d，1H，J＝8.4Hz)，7.32-7.37(m，3H)，7.40(m，4H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)。
实施例47：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针47：
化合物50：
参照化合物1的合成方法，产率97％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.99(s，1H)，7.61(d，1H，J＝1.6Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.49(d，1H，J＝8.4Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.40(dd，1H，J1＝8.4Hz，J2＝1.6Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)。
探针47：
参照探针1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.99(s，1H)，7.81(s，1H)，7.61(d，1H，J＝1.6Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.49(d，1H，J＝8.4Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.40(m，5H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)。
实施例48：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针48：
探针48：
参照化合物1的合成方法，产率97％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.99(s，1H)，7.75(s，1H)，7.61(d，1H，J＝1.6Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.49(d，1H，J＝8.4Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.40(dd，1H，J1＝8.4Hz，J2＝1.6Hz)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)。
实施例49：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针49：
化合物51：
参照化合物1的合成方法，产率87％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.99(s，1H)，7.61(d，1H，J＝1.6Hz)，7.49(d，1H，J＝8.4Hz)，7.40(dd，1H，J1＝8.4Hz，J2＝1.6Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)。
探针49：
参照探针1的合成，产率31％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.32(s，1H)，10.05(s，1H)，8.01(s，1H)，7.81(s，1H)，7.61(d，1H，J＝1.6Hz)，7.49(d，1H，J＝8.4Hz)，7.40(m，5H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)。
实施例50：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针50：
化合物52：
参照化合物1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.98(s，1H)，7.64-7.48(m，7H)，7.40(dd，1H，J1＝8.4Hz，J2＝1.6Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.13(s，3H)，3.11(s，3H)。
探针50：
参照探针1的合成方法，产率67％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，7.98(s，1H)，7.81(s，1H)，7.64-7.48(m，7H)，7.40(m，5H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.13(s，3H)，3.11(s，3H)。
实施例51：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针51：
化合物53：
参照化合物21的合成方法，产率81％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.67(s，1H)，7.95(d，1H，J＝10.0Hz)，7.15(d，1H，J＝2.4Hz)，7.00(dd，1H，J1＝8.8Hz，J2＝2.4Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.10(s，3H)。
化合物54：
参照化合物22的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.06(s，1H)，8.03(d，1H，J＝10.0Hz)，7.07-7.04(m，2H)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.10(s，3H)。
化合物55：
参照化合物1的合成方法，产率96％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.03(d，1H，J＝10.0Hz)，7.95(s，1H)，7.07-7.04(m，2H)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.10(s，3H)，1.50(s，9H)。
探针51：
参照探针1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.03(d，1H，J＝10.0Hz)，7.95(s，1H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.07-7.04(m，2H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.10(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例52：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针52：
探针52：
参照探针1的合成方法，产率69％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.99(brs，1H)，8.03(d，1H，J＝10.0Hz)，7.95(s，1H)，7.39(d，2H，J＝8.4Hz)，7.26(d，2H，J＝8.4Hz)，7.19(s，2H)，7.07-7.04(m，2H)，6.10(s，1H)，5.26(s，2H)，4.36(s，2H)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.10(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例53：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针53：
探针53：
参照探针1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.03(d，1H，J＝10.0Hz)，7.95(s，1H)，7.90(d，1H，J＝5.6)，7.75(s，1H)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，7.07-7.04(m，2H)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.10(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例54：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针54：
化合物56：
参照化合物1的合成方法，产率81％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.03(d，1H，J＝10.0Hz)，7.95(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(m，2H)，7.07-7.04(m，2H)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.10(s，3H)。
探针54：
参照探针1的合成方法，产率65％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.03(d，1H，J＝10.0Hz)，7.95(s，1H)，7.81(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.40(m，4H)，7.36-7.42(m，2H)，7.07-7.04(m，2H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.10(s，3H)。
实施例55：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针55：
化合物57：
参照化合物1的合成方法，产率97％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，8.00(d，1H，J＝10.0Hz)，7.95(s，1H)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.07-7.04(m，2H)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.10(s，3H)。
探针55：
参照探针1的合成方法，产率66％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，8.00(d，1H，J＝10.0Hz)，7.95(s，1H)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.07-7.04(m，2H)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.10(s，3H)。
实施例56：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针56：
化合物58：
N-甲基-N-羟乙基苯胺(1.88g，12.5mmol)和NaHCO3(1.57g，18.7mmol)溶于48ml二氯甲烷和36ml水中，冷却至0℃，缓慢加入I2(3.0g，11.8mmol)，加毕，体系逐渐升至室温，搅拌30min，体系加300ml二氯甲烷40ml水稀释，分出有机相，有机相分别用水、硫代硫酸钠溶液、食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后旋转蒸干，残余物柱色谱分离，得纯化合物22(2.46g，92％)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.46(d，1H，J＝7.60Hz)，6.56(d，1H，J＝7.60Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，2.94(s，3H)。
化合物59：
化合物58(5.54g，20mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(213mg，0.3mmol)、碘化亚铜(38mg，0.2mmol)溶于20ml三乙胺中，Ar保护条件下室温搅拌30分钟，加入炔丙醇(1.53ml，26mmol)，体系室温搅拌24h，反应完毕，过滤，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离，得棕色固体3.20g，产率78％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.30(d，2H，J＝8.8Hz)，6.60(d，2H，J＝8.8Hz)，4.45(d，2H，J＝4.0Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
化合物60：
化合物59(2.05g，10mmol)溶于50ml四氢呋喃中，加入活性二氧化锰10g，Ar保护条件下室温搅拌24h，反应完毕，过滤，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得棕色固体1.42g，产率70％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.37(s，1H)，7.49(d，2H，J＝8.8Hz)，6.74(d，2H，J＝8.8Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
化合物61：
参照化合物1的合成，产率81％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(s，1H)，7.47(d，2H，J＝8.8Hz)，6.76(d，2H，J＝8.8Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)，1.50(s，9H)。
探针56：
参照探针1的合成方法，产率55％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.81(s，1H)，7.47(d，2H，J＝8.8Hz)，7.40(m，4H)，6.76(d，2H，J＝8.8Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例57：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针57：
探针57：
参照探针1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(s，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.75(s，1H)，7.47(d，2H，J＝8.8Hz)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.76(d，2H，J＝8.8Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例58：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针58：
化合物62：
参照化合物1的合成方法，产率90％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.47(d，2H，J＝8.8Hz)，7.36-7.42(m，2H)，6.76(d，2H，J＝8.8Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
探针58：
参照探针1的合成方法，产率50％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.81(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.47(d，2H，J＝8.8Hz)，7.40(m，4H)，7.36-7.42(m，2H)，6.76(d，2H，J＝8.8Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
实施例59：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针59：
化合物63：
参照化合物1的合成方法，产率90％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，8.01(s，1H)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.47(d，2H，J＝8.8Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，6.76(d，2H，J＝8.8Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
探针59：
参照探针1的合成方法，产率49％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，8.01(s，1H)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.81(s，1H)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.47(d，2H，J＝8.8Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.40(m，4H)，6.76(d，2H，J＝8.8Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
实施例60：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针60：
化合物64：
参照文献WO2009152165(A2)，2009.12.17.公开的方法进行合成。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.84(s，1H)，7.37(s，1H)，7.24(s，1H)。
化合物65：
参照化合物21的合成方法，产率85％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.84(s，1H)，7.37(s，1H)，7.24(s，1H)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
化合物66：
参照化合物22的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.04(s，1H)，7.84(s，1H)，7.24(s，1H)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
化合物67：
参照化合物1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(s，1H)，7.84(s，1H)，7.24(s，1H)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)，1.50(s，9H)。
探针60：
参照探针1的合成方法，产率55％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.84(s，1H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.24(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例61：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针61：
化合物68：
参照化合物1的合成方法，产率99％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(s，1H)，7.84(s，1H)，7.74(1H，d，J＝4.0Hz)，7.55(1H，d，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(2H，m)，7.24(s，1H)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
探针61：
参照探针1的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.84(s，1H)，7.81(s，1H)，7.74(1H，d，J＝4.0Hz)，7.55(1H，d，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(6H，m)，7.24(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
实施例62：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针62：
/>
化合物68：
参照化合物1的合成方法，产率99％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.07(1H，d，J＝8.0Hz)，8.01(s，1H)，7.90(1H，d，J＝8.0Hz)，7.84(s，1H)，7.53(1H，t，J＝8.0Hz)，7.45(1H，t，J＝8.0Hz)，7.24(s，1H)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
探针62：
参照探针1的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.07(1H，d，J＝8.0Hz)，8.01(s，1H)，7.90(1H，d，J＝8.0Hz)，7.84(s，1H)，7.81(s，1H)，7.53(1H，t，J＝8.0Hz)，7.45(1H，t，J＝8.0Hz)，7.40(m，4H)，7.24(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
实施例63：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针63：
化合物70：
6-溴-1-苯并噻吩(0.43g，2mmol)溶于50ml干燥的二卤甲烷中，加入醋酸钾(0.4g，4mmol)，冰浴条件下加入溴素(0.32g，2mmol)，缓慢升至室温，反应完毕，加入饱和硫代硫酸钠溶液100ml，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，旋转蒸干后过柱，得黄色产物0.64g，产率81％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.81(s，1H)，7.68(d，J＝9.0Hz，1H)，6.92(d，J＝2.0Hz，1H)。
化合物71的合成：
化合物70(1.27g，3.43mmol)溶于50ml干燥的三乙胺中，加入二氯二四三苯基膦钯(120.2mg，0.171mmol)，碘化亚铜(65.2mg，0.343mmol)和三甲基硅乙炔(344mg，3.43mmol)，Ar保护条件下油浴加热24h，反应完毕，加水5ml淬灭反应，旋转蒸干溶剂，残余物溶于乙醚，过滤，旋转蒸干得粗品，无需纯化，直接用于下一步。
粗品溶于30ml NMP中，加入九水合硫化钠(0.87g，3.63mmol)，Ar保护条件下190℃油浴加热12h，冷却至室温，加入20ml饱和氯化铵溶液，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水Na2SO4干燥有机相，过滤除去Na2SO4，旋转蒸干后过柱，得白色固体0.85g，产率49％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.87(m，1H)，7.71(m，1H)，7.51(d，J＝5.4Hz，1H)，7.41(m，1H)，7.32(d，J＝5.4Hz，1H)。
化合物72：
参照化合物21的合成方法，产率75％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.86(m，1H)，7.73(m，1H)，7.54(d，J＝5.4Hz，1H)，7.41(m，1H)，7.32(d，J＝5.4Hz，1H)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
化合物73：
参照化合物22的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.71(s，1H)，7.87(m，1H)，7.71(m，1H)，7.51(d，J＝5.4Hz，1H)，7.32(d，J＝5.4Hz，1H)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
化合物74：
参照化合物1的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(s，1H)，7.87(m，1H)，7.71(m，1H)，7.51(d，J＝5.4Hz，1H)，7.32(d，J＝5.4Hz，1H)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)，1.49(s，9H)。
探针63：
参照探针1的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，7.81(s，1H)，8.01(s，1H)，7.87(m，1H)，7.71(m，1H)，7.51(d，J＝5.4Hz，1H)，7.40(m，4H)，7.32(d，J＝5.4Hz，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)，1.49(s，9H)。
实施例64：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针64：
化合物75：
参照化合物75的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(s，1H)，7.87(m，1H)，7.71(m，1H)，7.51(d，J＝5.4Hz，1H)，7.32(d，J＝5.4Hz，1H)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
探针64：
参照探针1的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.87(m，1H)，7.81(s，1H)，7.71(m，1H)，7.51(d，J＝5.4Hz，1H)，7.40(m，4H)，7.32(d，J＝5.4Hz，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
实施例65：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针65：
化合物76：
参照化合物1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(s，1H)，7.87(m，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.71(m，1H)，)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.51(d，J＝5.4Hz，1H)，7.36-7.42(m，2H)，7.32(d，J＝5.4Hz，1H)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
探针65：
参照探针1的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(s，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.87(m，1H)，7.77(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.71(m，1H)，)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.51(d，J＝5.4Hz，1H)，7.36-7.42(m，4H)，7.32(d，J＝5.4Hz，1H)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，3.02(s，3H)。
实施例66：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针66：
化合物77：
化合物58(0.554g，2mmol)和5-醛基-2-噻吩硼酸(0.374g，2.4mmol)溶于10ml甲苯、10ml乙醇中，加入2ml2N K2CO3溶液，氩气保护条件下85℃油浴加热5h，反应完毕，冷却至室温，加水10ml淬灭，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干过柱，得纯化合物0.339g，产率65％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.81(s，1H)，7.68(s，1H)，7.55(d，1H，J＝8.00Hz)，7.25(d，2H，J＝8.00Hz)，6.78(d，2H，J＝8.00Hz)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)。
化合物78：
参照化合物1的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(s，1H)，7.68(s，1H)，7.55(d，1H，J＝8.00Hz)，7.25(d，2H，J＝8.00Hz)，6.78(d，2H，J＝8.00Hz)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)，1.50(s，9H)。
探针66：
参照探针1的合成方法，产率54％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.81(s，1H)，7.68(s，1H)，7.55(d，1H，J＝8.00Hz)，7.40(m，4H)，7.25(d，2H，J＝8.00Hz)，6.78(d，2H，J＝8.00Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例67：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针67：
化合物79：
氰乙酸(1.0g，10mmol)加入25ml圆底烧瓶中，加入2-甲氧基乙胺，Ar保护条件下室温搅拌，反应完毕，加入10ml无水乙醚，超声分散，过滤，真空干燥得白色固体。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝6.5(s，1H)，3.48-3.52(m，4H)，3.38(s，3H)。
化合物80：
参照化合物1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.31(s，1H)，8.22(bt，1H)，7.82(d，1H，J＝4.00Hz)，7.58(d，2H，J＝8.80Hz)，7.50(d，2H，J＝4.00Hz)，6.77(d，2H，J＝8.80Hz)，4.74(bt，1H)，3.57(t，2H，J＝5.20Hz)，3.41-3.48(m，4H)，3.38(t，2H，J＝5.20Hz)，3.27(s，3H)，3.01(s，3H)。
探针67：
参照化合物1的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.31(s，1H)，8.22(bt，1H)，7.82(m，2H)，7.58(d，2H，J＝8.80Hz)，7.50(d，2H，J＝4.00Hz)，7.40(m，4H)，6.77(d，2H，J＝8.80Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.74(bt，1H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.57(t，2H，J＝5.20Hz)，3.41-3.48(m，4H)，3.38(t，2H，J＝5.20Hz)，3.27(s，3H)，3.01(s，3H)。
实施例68：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针68：
探针68：
参照探针1的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.99(s，1H)，8.31(s，1H)，8.22(bt，1H)，7.82(d，1H，J＝4.00Hz)，7.58(d，2H，J＝8.80Hz)，7.50(d，2H，J＝4.00Hz)，7.39(d，2H，J＝8.4Hz)，7.26(d，2H，J＝8.4Hz)，7.09(s，2H)，6.77(d，2H，J＝8.80Hz)，6.10(s，1H)，5.26(s，2H)，4.74(bt，1H)，4.36(s，2H)，3.57(t，2H，J＝5.20Hz)，3.41-3.48(m，4H)，3.38(t，2H，J＝5.20Hz)，3.27(s，3H)，3.01(s，3H)。
实施例69：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针68：
探针69：
参照探针1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.31(s，1H)，8.22(bt，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.82(d，1H，J＝4.00Hz)，7.75(s，1H)，7.58(d，2H，J＝8.80Hz)，7.50(d，2H，J＝4.00Hz)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.77(d，2H，J＝8.80Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.74(bt，1H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.57(t，2H，J＝5.20Hz)，3.41-3.48(m，4H)，3.38(t，2H，J＝5.20Hz)，3.27(s，3H)，3.01(s，3H)。
实施例70：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针69：
化合物81：
参照文献(WO2013142841(A1)2013.09.26.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.87(s，2H)，7.54(s，1H)，7.42(d，J＝5.6Hz，1H)，7.39(d，J＝5.6Hz，1H)。
化合物82：
参照化合物21的合成，产率76％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.87(s，2H)，7.54(s，1H)，7.42(d，J＝5.6Hz，1H)，7.39(d，J＝5.6Hz，1H)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)。
化合物83：
参照化合物22的合成方法，产率62％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.99(s，1H)，7.89(s，2H)，7.59(s，1H)，7.27(s，1H)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)。
化合物84：
参照化合物1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.89(s，2H)，7.59(s，1H)，7.27(s，1H)，7.05(s，1H)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)。
探针70：
参照探针1的合成方法，产率54％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.22(s，1H)，10.11(s，1H)，7.89(s，2H)，7.81(s，1H)，7.59(s，1H)，7.40(m，4H)，7.27(s，1H)，7.05(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)。
实施例71：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针71：
化合物85：
参照化合物1的合成方法，产率95％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.98(s，1H)，7.89(s，2H)，7.59(s，1H)，7.27(s，1H)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.48-3.50(m，4H)，3.38(s，3H)，3.06(s，3H)。
探针71：
参照探针1的合成方法，产率66％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝11.92(s，1H)，10.21(s，1H)，7.98(s，1H)，7.89(s，2H)，7.81(s，1H)，7.59(s，1H)，7.40(m，4H)，7.27(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.48-3.50(m，4H)，3.38(s，3H)，3.06(s，3H)。
实施例72：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针72：
探针72：
参照探针1的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.98(s，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.89(s，2H)，7.75(s，1H)，7.59(s，1H)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.27(s，1H)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.48-3.50(m，4H)，3.38(s，3H)，3.06(s，3H)。
实施例73：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针73：
化合物87：
参照文献(Takuya M.et al.RSCAdv.2015.5.55406-55410.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.20(d，2H，J＝4.8Hz)，7.07(d，2H，J＝4.8Hz)，0.41(s，6H)。
化合物88：
化合物87(0.4g，1.8mmol)，溶于100ml无水四氢呋喃中，冷却至-30℃，加入N-溴代二丁酰亚胺，Ar保护条件下搅拌2h，加水5ml淬灭反应，恢复至室温，旋转蒸干除去溶剂，残余物溶于100ml二氯甲烷中，水洗三次，有机相用无水Na2SO4干燥，过滤除去Na2SO4，旋转蒸干后过柱，得白色固体0.31g，产率57％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.73(s，1H)，7.42(d，1H，J＝4.8Hz)，7.15(d，1H，J＝4.8Hz)，0.46(s，6H)。
化合物89：
参照化合物21的合成方法，产率76％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.73(s，1H)，7.42(d，1H，J＝4.8Hz)，7.15(d，1H，J＝4.8Hz)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)，0.46(s，6H)。
化合物90：
参照化合物22的合成方法，产率66％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.87(s，1H)，7.83(s，1H)，7.10(s，1H)，3.85(t，2H，J＝4.80Hz)，3.46(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)，0.46(s，6H)。
化合物91：
参照化合物1的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.83(s，1H)，7.11(s，1H)，3.85(t，2H，J＝4.80Hz)，3.46(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)，0.46(s，6H)。
探针73：
参照探针1的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.82(s，1H)，10.00(s，1H)，7.83(s，1H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.11(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝4.80Hz)，3.46(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)，0.46(s，6H)。
实施例74：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针74：
化合物92：
参照化合物1的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.83(s，1H)，7.11(s，1H)，3.85(t，2H，J＝4.80Hz)，3.46(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)，1.50(s，9H)，0.42(s，6H)。
探针74：
参照探针1的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.92(s，1H)，9.84(s，1H)，7.83(s，1H)，7.71(s，1H)，7.40(m，4H)，7.11(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝4.80Hz)，3.46(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)，1.50(s，9H)，0.46(s，6H)。
实施例75：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针75：
化合物93：
参照化合物1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.83(s，1H)，7.74(1H，d，J＝4.0Hz)，7.55(1H，d，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(2H，m)，7.11(s，1H)，4.12(2H，s)，3.85(t，2H，J＝4.80Hz)，3.46(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)，0.42(s，6H)。
探针75：
参照探针1的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝11.22(s，1H)，10.01(s，1H)，7.89(s，1H)，7.81(s，1H)，7.74(1H，d，J＝4.0Hz)，7.70(1H，d，J＝4.0Hz)，7.63-7.48(m，5H)，7.46(m，4H)，7.36-7.42(2H，m)，7.11(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，4.12(2H，s)，3.85(t，2H，J＝4.80Hz)，3.46(t，2H，J＝4.80Hz)，3.13(s，3H)，3.06(s，3H)，0.46(s，6H)。
实施例76：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针76：
化合物94：
参照化合物1的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.99(s，1H)，7.11(s，1H)，6.50(s，1H)，3.85(t，2H，J＝4.80Hz)，3.46(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)，0.46(s，6H)。
探针76：
参照探针1的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，7.99(s，1H)，7.81(s，1H)，7.4(m，4H)，7.11(s，1H)，6.50(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝4.80Hz)，3.46(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)，0.46(s，6H)。
实施例77：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针77：
化合物95：
参照文献(Martinez M.et al.Org.Biomol.Chem.2012.10.3892-3898.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.24(dd，J1＝5.2Hz，J2＝1.2Hz，1H)，7.13(dd，1H，J1＝3.6Hz，J2＝1.2Hz)，7.03(dd，1H，J1＝5.2Hz，J2＝1.2Hz)，6.99(d，1H，J＝3.8Hz)，6.93(d，1H，J＝3.6Hz)。
化合物96：
参照化合物21的合成方法，产率78％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.25(dd，J1＝5.2Hz，J2＝1.2Hz，1H)，7.13(dd，1H，J1＝3.6Hz，J2＝1.2Hz)，7.03(dd，1H，J1＝5.2Hz，J2＝1.2Hz)，6.99(d，1H，J＝3.8Hz)，6.93(d，1H，J＝3.6Hz)，3.85(t，2H，J＝4.80Hz)，3.46(t，2H，J＝4.80Hz)，3.10(s，3H)。
化合物97：
参照化合物22的合成方法，产率65％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.75(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.27(s，3H)，3.13(s，3H)。
化合物98：
参照化合物1的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.00(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.13(s，3H)，1.50(s，9H)。
探针77：
参照探针1的合成，产率45％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.52(s，1H)，10.01(s，1H)，8.00(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，6.29(s，2H)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.27(s，3H)，3.13(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例78：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针78：
化合物99：
参照化合物1的合成方法，产率96％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.00(s，1H)，7.81(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.40(m，4H)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，6.29(s，2H)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.48-3.52(m，4H)，3.38(s，3H)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.13(s，3H)。
探针78：
参照探针1的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.00(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.48-3.52(m，4H)，3.38(s，3H)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.13(s，3H)。
实施例79：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针79：
化合物100：
参照化合物1的合成方法，产率97％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.94(d，1H，J＝8.0Hz)，7.89(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.13(s，3H)。
探针79：
参照探针1的合成方法，产率48％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.82(s，1H)，10.21(s，1H)，8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.94(d，1H，J＝8.0Hz)，7.89(s，1H)，7.81(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.40(m，4H)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，6.29(s，2H)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.13(s，3H)。
实施例80：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针80：
探针80：
按照探针1的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.00(s，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.75(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.13(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例81：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针81：
化合物99：
参照化合物1的合成方法，产率96％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.00(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.51(d，1H，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(m，2H)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.13(s，3H)。
探针81：
参照探针1的合成方法，产率58％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.00(s，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.79(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.51(d，1H，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(m，4H)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.13(s，3H)。
实施例82：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针82：
探针82：
参照探针1的合成方法，产率57％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.94(d，2H，J＝8.0Hz)，7.89(s，1H)，7.75(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.13(s，3H)。
实施例83：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针83：
化合物101：
参照文献(WO2002020499(A1).2002.04.14.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝6.91(m，2H)，6.71(d，1H，J＝8.0Hz)，6.50(m，1H)4.71(t，1H，J＝5.6Hz)，3.62(m，2H)，3.56(m，2H)，3.35(m，2H)，3.00(m，2H)。
化合物102：
参照化合物22的合成，产率57％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.89(s，1H)，7.21(s，1H)，6.71(d，1H，J＝8.0Hz)，6.50(m，1H)4.71(t，1H，J＝5.6Hz)，3.62(m，2H)，3.56(m，2H)，3.35(m，2H)，3.00(m，2H)。
化合物103：
参照化合物1的合成，产率88％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.99(s，1H)，7.21(s，1H)，6.71(d，1H，J＝8.0Hz)，6.50(m，1H)4.71(t，1H，J＝5.6Hz)，3.62(m，2H)，3.56(m，2H)，3.35(m，2H)，3.00(m，2H)，1.49(s，9H)。
探针83：
参照探针1的合成方法，产率68％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.42(s，1H)，10.01(s，1H)，7.99(s，1H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.21(s，1H)，6.71(d，1H，J＝8.0Hz)，6.50(m，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.62(m，2H)，3.56(m，2H)，3.35(m，2H)，3.00(m，2H)，1.49(s，9H)。
实施例84：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针84：
探针84：
参照探针1的合成方法，产率48％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.99(s，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.75(s，1H)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.21(s，1H)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.71(d，1H，J＝8.0Hz)，6.50(m，1H)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.62(m，2H)，3.56(m，2H)，3.35(m，2H)，3.00(m，2H)，1.49(s，9H)。
实施例85：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针85：
化合物104：
参照化合物1的合成，产率88％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.99(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(m，2H)，7.21(s，1H)，6.71(d，1H，J＝8.0Hz)，6.50(m，1H)4.71(t，1H，J＝5.6Hz)，3.62(m，2H)，3.56(m，2H)，3.35(m，2H)，3.00(m，2H)。
探针85：
参照探针1的合成方法，产率49％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.82(s，1H)，10.51(s，1H)，7.99(s，1H)，7.81(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.47(m，4H)，7.36-7.42(m，2H)，7.21(s，1H)，6.71(d，1H，J＝8.0Hz)，6.50(m，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.62(m，2H)，3.56(m，2H)，3.35(m，2H)，3.00(m，2H)。
实施例86：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针86：
探针86：
参照化合物1的合成，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，8.02(s，1H)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.21(s，1H)，6.71(d，1H，J＝8.0Hz)，6.50(m，1H)4.71(t，1H，J＝5.6Hz)，3.62(m，2H)，3.56(m，2H)，3.35(m，2H)，3.00(m，2H)。
实施例87：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针87：
化合物106：
参照文献(Hao Y et al.Tetrahedron 2012.68.552-558.)公开的方法。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.06(d，1H，J＝7.6Hz)，6.94(t，1H，J＝7.6H)，6.58(t，1H，J＝7.2Hz)，6.4(d，1H，7.8Hz)，5.19(s，1H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
化合物107：
化合物106(1.73g，10mmol)加入250ml圆底烧瓶中，加入碳酸钾(2.76g，20mol)、溴乙醇(2.48g，20mmol)，加入120ml乙腈，Ar保护条件下油浴加热回流48h，反应完毕，过滤，旋转蒸干溶剂，残余物溶于100ml二氯甲烷中，50ml×3次水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得棕色产物1.76g，产率81％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.06(d，1H，J＝7.6Hz)，6.94(t，1H，J＝7.6H)，6.58(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，3.46(m，4H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
化合物108：
参照化合物22的合成方法，产率65％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.89(s，1H)，7.36(d，1H，J＝7.6Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，3.46(m，4H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
化合物109：
参照化合物1的合成方法，产率99％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.03(s，1H)，7.36(d，1H，J＝7.6Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，3.46(m，4H)，2.35(s，3H)，1.50(s，9H)，1.36(s，6H)。
探针87：
参照探针1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝11.82(s，1H)，9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.36(d，1H，J＝7.6Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.46(m，4H)，2.35(s，3H)，1.50(s，9H)，1.36(s，6H)。
实施例88：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针88：
/>
化合物110：
参照化合物1的合成方法，产率96％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.03(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(m，2H)，7.30(d，1H，J＝7.6Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，3.46(m，4H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
探针88：
参照探针1的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.72(s，1H)，9.56(s，1H)，8.03(s，1H)，7.81(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.49(m，4H)，7.36-7.42(m，2H)，7.30(d，1H，J＝7.6Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.46(m，4H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
实施例89：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针89：
化合物111：
参照化合物1的合成方法，产率99％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.99(s，1H)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.36(d，1H，J＝7.6Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，3.46(m，4H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
探针89：
参照探针1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.76(s，1H)，9.86(s，1H)，8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.99(s，1H)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.81(s，1H)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.40(m，4H)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.36(d，1H，J＝7.6Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.46(m，4H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
实施例90：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针90：
/>
探针90：
参照探针1的合成方法，产率52％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.03(s，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.75(s，1H)，7.38(d，1H，J＝7.6Hz)，7.31(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.46(m，4H)，2.35(s，3H)，1.50(s，9H)，1.36(s，6H)。
实施例91：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针91：
探针91：
参照探针1的合成方法，产率59％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.99(s，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.90(d，1H，J＝8.0Hz)，7.75(s，1H)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.36(d，1H，J＝7.6Hz)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.46(m，4H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
实施例92：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针92：
化合物112：
参照文献(Ping Yan.et al.J.Org.Chem.2008，73，6587-6594.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.18(s，1H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，1.50(s，6H)。
化合物113：
参照化合物21的合成方法，产率76％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.18(s，1H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.50(s，6H)。
化合物114：
参照化合物22的合成方法，产率66％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.89(s，1H)，7.18(s，1H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.50(s，6H)。
化合物115：
参照化合物1的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.89(s，1H)，7.18(s，1H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.50(m，15H)。
探针92：
参照探针1的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，7.89(s，1H)，7.18(s，1H)，7.81(s，1H)，7.4(m，4H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.50(m，15H)。
实施例93：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针93：
化合物116：
参照化合物1的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.89(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(m，2H)，7.18(s，1H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，4.12(s，2H)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.50(s，6H)。
探针93：
参照探针1的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，7.89(s，1H)，7.81(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(m，6H)，7.18(s，1H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，4.12(s，2H)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.50(s，6H)。
实施例94：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针94：
化合物117：
参照化合物1的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.93(d，1H，J＝8.0Hz)，7.89(s，1H)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.18(s，1H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，4.24(s，2H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.50(s，6H)。
探针94：
参照探针1的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.93(d，1H，J＝8.0Hz)，7.89(s，1H)，7.81(s，1H)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.40(m，4H)，7.18(s，1H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，4.24(s，2H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.50(s，6H)。
实施例95：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针95：
探针95：
参照探针1的合成方法，产率58％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.93(d，1H，J＝7.2Hz)，7.89(s，1H)，7.75(s，1H)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.23(d，2H，J＝8.0Hz)，7.18(s，1H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.15(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.50(m，15H)。
实施例96：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针96：
探针96：
参照探针1的合成方法，产率55％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.93(d，1H，J＝7.2Hz)，7.89(s，1H)，7.79(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz)，7.36-7.42(m，2H)，7.31(d，2H，J＝8.0Hz)，7.18(m，3H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.15(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，4.12(s，2H)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.50(s，6H)。
实施例97：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针97：
探针97：
参照探针1的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.93(m，2H)，7.89(s，1H)，7.75(s，1H)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.23(d，2H，J＝8.0Hz)，7.18(s，1H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.15(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，4.24(s，2H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.50(s，6H)。
实施例98：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针98：
化合物118：
参照化合物1的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.89(s，1H)，7.18(s，1H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
探针98：
参照探针1的合成方法，产量33％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.12(s，1H)，10.05(s，1H)，7.89(s，1H)，7.81(s，1H)，7.4(m，4H)，7.18(s，1H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
对比实施例99：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光参比探针99：
参比探针99：
化合物112(0.375g，1mmol)、化合物2(0.297g，1.1mmol)和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.625g，1.2mmol)溶于15ml无水二甲基甲酰胺中，加入三乙胺0.2ml，Ar保护条件下室温搅拌2h，反应完毕，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得黄色固体0.458g，，产量73％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.12(s，1H)，10.05(s，1H)，7.89(s，1H)，7.81(s，1H)，7.4(m，4H)，7.18(s，1H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
对比实施例100：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光参比探针100：
化合物119：
参照文献(Shirisha Gurrapu et al.ACS Med.Chem.Lett.2015.6.558-561.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.11(s，1H)，7.97(d，2H，J＝9.0Hz)，6.69(d，2H，J＝9.6Hz)，3.20(s，6H)。
参比探针100：
参照参比探针99的合成方法，产率81％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.52(s，1H)，10.01(s，1H)，8.11(s，1H)，7.97(d，2H，J＝9.0Hz)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，6.69(d，2H，J＝9.6Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.20(s，6H)。
实施例101：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针101：
化合物120：
参照化合物1的合成方法，产量95％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.07(s，1H)，7.93(d，2H，J＝9.2Hz)，6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，3.55-3.59(m，4H)，3.08(s，3H)。
探针101：
参照探针1的合成方法，产量35％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.22(s，1H)，10.01(s，1H)，8.07(s，1H)，7.93(d，2H，J＝9.2Hz)，7.81(s，1H)，7.4(m，4H)，6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.55-3.59(m，4H)，3.08(s，3H)。
对比实施例102：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光参比探针102：
参比探针102：
参照参比探针99的合成方法，产量65％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.22(s，1H)，10.01(s，1H)，8.07(s，1H)，7.93(d，2H，J＝9.2Hz)，7.81(s，1H)，7.4(m，4H)，6.85(d，2H，J＝9.2Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.55-3.59(m，4H)，3.08(s，3H)。
实施例103：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针103：
化合物122：
参照化合物1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.09(s，1H)，7.36(d，1H，J＝7.6Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，3.46(m，4H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
探针103：
参照探针1的合成，产率89％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝11.22(s，1H)，9.87(s，1H)，8.09(s，1H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.36(d，1H，J＝7.6Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.46(m，4H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
对比实施例104：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光参比探针104：
参比探针104：
参照参比探针99的合成，产率89％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝11.22(s，1H)，9.87(s，1H)，8.09(s，1H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.36(d，1H，J＝7.6Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.46(m，4H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
实施例105：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针105：
化合物123：
参照化合物1的合成方法，产率99％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.03(s，1H)，7.36(d，1H，J＝7.6Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，3.11(m，4H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
探针105：
参照探针99的合成方法，产率95％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.72(s，1H)，9.89(s，1H)，8.03(s，1H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.36(d，1H，J＝7.6Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.11(m，4H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
对比实施例106：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针106：
参比探针106：
参照参比探针99的合成方法，产率95％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.72(s，1H)，9.89(s，1H)，8.03(s，1H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.36(d，1H，J＝7.6Hz)，6.78(t，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，7.8Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.11(m，4H)，2.35(s，3H)，1.36(s，6H)。
实施例107：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针107：
化合物124：
参照化合物1的合成方法，产率96％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，6.43(s，1H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
探针107：
参照探针1的合成方法，产率39％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.72(s，1H)，9.79(s，1H)，8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，6.43(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
对比实施例108：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光参比探针108：
参比探针108：
参照探针92的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.72(s，1H)，9.79(s，1H)，8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，6.43(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
实施例109：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针109：
化合物125：
参照化合物1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.00(s，1H)，7.49(d，2H，J＝8.8Hz)，6.74(d，2H，J＝8.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
探针109：
参照探针99的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝11.51(s，1H)，9.72(s，1H)，8.00(s，1H)，7.81(s，1H)，7.49(d，2H，J＝8.8Hz)，7.40(m，4H)，6.74(d，2H，J＝8.8Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
对比实施例110：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光参比探针110：
参比探针110：
参照参比探针99的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝11.51(s，1H)，9.72(s，1H)，8.00(s，1H)，7.81(s，1H)，7.49(d，2H，J＝8.8Hz)，7.40(m，4H)，6.74(d，2H，J＝8.8Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
实施例111：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针111：
化合物127：
参照化合物1的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.95(s，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，6.92(d，1H，J＝2.0)，6.82(d，1H，J＝9.2Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
探针111：
参照探针99的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.12(s，1H)，10.09(s，1H)，7.95(s，1H)，7.81(m，2H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，7.40(m，4H)，6.92(d，1H，J＝2.0)，6.82(d，1H，J＝9.2Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
对比实施例112：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光参比探针112：
参比探针112：
参照参比探针99的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.12(s，1H)，10.09(s，1H)，7.95(s，1H)，7.81(m，2H)，7.68(d，1H，J＝9.0Hz)，7.40(m，4H)，6.92(d，1H，J＝2.0)，6.82(d，1H，J＝9.2Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
对比实施例113：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光参比探针113：
化合物128：
按照文献(Masahiro Ono et al.Bioorg.Med.Chem.2009，17，7002-7007。)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.06(s，1H)，8.03(d，1H，J＝10.0Hz)，7.07-7.04(m，2H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
化合物129：
参照化合物1的合成方法，产率96％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.06(s，1H)，8.03(d，1H，J＝10.0Hz)，7.07-7.04(m，2H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
参比探针113：
参照参比探针99的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.42(s，1H)，9.89(s，1H)，8.06(s，1H)，8.03(d，1H，J＝10.0Hz)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.07-7.04(m，2H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
实施例114：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针114：
化合物130：
参照化合物1的合成方法，产率96％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.06(s，1H)，8.03(d，1H，J＝10.0Hz)，7.07-7.04(m，2H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
探针114：
参照探针92的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.42(s，1H)，9.89(s，1H)，8.06(s，1H)，8.03(d，1H，J＝10.0Hz)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.07-7.04(m，2H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
对比实施例115：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光参比探针115：
参比探针115：
参照参比探针99的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.42(s，1H)，9.89(s，1H)，8.06(s，1H)，8.03(d，1H，J＝10.0Hz)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.07-7.04(m，2H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
对比实施例116：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光参比探针116：
化合物131：
按照文献(Marian.Z.J.et.al.Tetrahedron.，2008，64，10605-10618。)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.89(s，1H)，7.68(d，1H，J＝4.0Hz)，7.56(d，2H，J＝9.0Hz)，7.24(d，1H，J＝4.0Hz)，6.72(d，2H，J＝9.0Hz)，3.03(s，6H)。
化合物132：
参照化合物1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.00(s，1H)，7.68(d，1H，J＝4.0Hz)，7.56(d，2H，J＝9.0Hz)，7.24(d，1H，J＝4.0Hz)，6.72(d，2H，J＝9.0Hz)，3.03(s，6H)。
参比探针116：
参照探针92的合成方法，产率97％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.02(s，1H)，9.56(s，1H)，8.00(s，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，1H，J＝4.0Hz)，7.56(d，2H，J＝9.0Hz)，7.40(m，4H)，7.24(d，1H，J＝4.0Hz)，6.72(d，2H，J＝9.0Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.03(s，6H)。
实施例117：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针117：
化合物133：
参照化合物1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.00(s，1H)，7.68(d，1H，J＝4.0Hz)，7.56(d，2H，J＝9.0Hz)，7.24(d，1H，J＝4.0Hz)，6.72(d，2H，J＝9.0Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
探针117：
参照探针99的合成方法，产率97％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.02(s，1H)，9.56(s，1H)，8.00(s，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，1H，J＝4.0Hz)，7.56(d，2H，J＝9.0Hz)，7.40(m，4H)，7.24(d，1H，J＝4.0Hz)，6.72(d，2H，J＝9.0Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
对比实施例118：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光参比探针118：
参比探针118：
参照探针92的合成方法，产率97％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.02(s，1H)，9.56(s，1H)，8.00(s，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，1H，J＝4.0Hz)，7.56(d，2H，J＝9.0Hz)，7.40(m，4H)，7.24(d，1H，J＝4.0Hz)，6.72(d，2H，J＝9.0Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
对比实施例119：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光参比探针119：
化合物134：
按照文献(US 20090042227(A1).2009.12.12.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.75(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.0Hz)，7.13(d，1H，J＝4.0Hz)，6.95(d，1H，J＝4.0Hz)，5.81(d，1H，J＝4.0Hz)，3.00(s，6H)。
化合物135：
参照化合物1的合成方法，产率94％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.99(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.0Hz)，7.13(d，1H，J＝4.0Hz)，6.95(d，1H，J＝4.0Hz)，5.81(d，1H，J＝4.0Hz)，3.00(s，6H)。
参比探针119：
参照参比探针99的合成方法。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝11.32(s，1H)，9.75(s，1H)，7.99(s，1H)，7.81(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.0Hz)，7.40(m，4H)，7.13(d，1H，J＝4.0Hz)，6.95(d，1H，J＝4.0Hz)，6.29(s，2H)，5.81(d，1H，J＝4.0Hz)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.00(s，6H)。
实施例120：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针120：
化合物136：
参照化合物1的合成方法，产率94％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.99(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.0Hz)，7.13(d，1H，J＝4.0Hz)，6.95(d，1H，J＝4.0Hz)，5.81(d，1H，J＝4.0Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
探针120：
参照探针99的合成方法。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝11.32(s，1H)，9.75(s，1H)，7.99(s，1H)，7.81(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.0Hz)，7.40(m，4H)，7.13(d，1H，J＝4.0Hz)，6.95(d，1H，J＝4.0Hz)，6.29(s，2H)，5.81(d，1H，J＝4.0Hz)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
对比实施例121：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光参比探针121：
参比探针121：
参照参比探针99的合成方法。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝11.32(s，1H)，9.75(s，1H)，7.99(s，1H)，7.81(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.0Hz)，7.40(m，4H)，7.13(d，1H，J＝4.0Hz)，6.95(d，1H，J＝4.0Hz)，6.29(s，2H)，5.81(d，1H，J＝4.0Hz)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)。
实施例122
采用文献(T.Y.Wang et.al.Chem Sci.2016，7，301-307.)报道的方法制备得到参比探针BG-CCVJ和BG-Gly-CCVJ。
将探针1-98、101、103、105、107、109、111、114、117、和120以及参比探针99、100、102、104、106、108、110、112、113、115、116、118、119、121、BG-CCVJ和BG-Gly-CCVJ分别溶于二甲基亚砜中，制得浓度均为1×10-2M的母液，分别加入甘油和甲醇中，混合均匀，配制终浓度为1×10-5M的溶液，根据探针不同，依次用各探针的最大激发波长在相同条件下检测其荧光发射图谱，结果如表1所示。
由表1可知，实施例探针荧光发射波长范围广，并且在甘油和甲醇中的荧光强度区别很大，对粘度变化响应灵敏，具有粘度响应性。
实施例123
将探针与对应的蛋白标签混合得混合样品，混合样品中探针终浓度为5μM，蛋白标签终浓度为10μM，将混合样品置于37℃孵育1小时，使用荧光分光光度计检测样品荧光强度变化，结果如表1所示。
由表1中游离探针量子产率可知：实施例的探针以及参比探针未与蛋白标签反应时荧光极低，接近PBS缓冲液本底荧光水平，说明在未与蛋白标签反应时，粘度响应性荧光探针的荧光未被激活，而由结合蛋白标签量子产率可知，实施例的探针同蛋白标签反应后可以在相应的激发发射通道检测到明显的荧光信号增强，荧光激活倍数达到几百倍到一千倍以上，并且具有较高的亮度，说明实施例的探针结合蛋白标签后荧光可以被激活，具有良好的荧光分子开关性质；而参比探针虽然也有荧光激活的性质，但是，激活后荧光量子产率很低，亮度非常差，尤其是，从表1中探针98和参比探针99、探针101和参比探针102、探针103和参比探针104、探针105和参比探针106、探针107和参比探针108、探针109和参比探针110、探针111和参比探针112、探针114和参比探针115、探针117和参比探针118、探针120和参比探针121的对比结果可以看出，对于同一荧光染料，当配体连接在荧光染料的电子供体部分时，探针的荧光激活亮度远远高于配体连接在荧光染料的电子受体部分的参比探针。
综上可知：实施例的探针结合蛋白标签后荧光可以被激活，具有良好的荧光分子开关性质；与配体和荧光染料的电子受体结合后形成的参比探针相比，实施例的配体与荧光染料的电子供体结合后形成的探针具有明显提高的荧光激活亮度。
表1不同探针荧光发射图谱检测结果
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实施例124
将SNAP蛋白标签分别加入30uM的探针1、探针14、探针21、探针30、探针43、探针48、探针56、探针63、探针70、探针88的溶液中，制得SNAP蛋白标签终浓度为0.1uM、0.5uM、0.7uM、1.2uM、4.5uM、8.1uM、13.1uM、14.8uM的混合样品溶液，将混合样品溶液置于37℃反应1小时，使用荧光分光光度计检测样品激发发射光谱变化，根据发射光谱强度绘制SNAP蛋白标签浓度与荧光强度关系图，结果分别如图2～图11所示。
从图2中可以看出，SNAP蛋白标签浓度在0.1uM～14.8uM的范围内与探针的荧光强度都具有较好的线性关系，因此，可以根据标准曲线对蛋白标签进行定量检测。
实施例125
Hela细胞为例检测化合物在哺乳动物细胞中的标记效果。将稳定表达蛋白标签的Hela细胞、Hela-WT细胞(Hela原始细胞，未表达蛋白标签)种植于于14mm玻璃底96孔细胞培养板中，稳定10小时。将探针1、探针15、探针21、探针30、探针56、探针60、探针63、探针88分别加入至培养基中并稀释至5μM。细胞置于37℃二氧化碳培养箱孵育2小时，使用LeicaTPS-8共聚焦显微镜成像检测标记细胞荧光变化。图12B组结果显示加入上述探针后在Hela-WT细胞中未能检测到相应的荧光信号，说明探针荧光不受细胞内环境影响；而图12A组中表达蛋白标签的Hela细胞可以检测到强烈的荧光信号，荧光信号增强近300倍。
以上实验说明探针可以实现特异性标记细胞内蛋白标签，并且实现荧光特异性点亮，同时，探针荧光不受细胞内环境影响。
实施例126
为验证探针1、探针21、探针48、探针60、探针66、探针77可以应用于标记不同细胞器定位的目标蛋白，以Hela细胞为例检测了探针标记不同亚细胞蛋白标签的效果。Hela细胞5000细胞每孔种植于96孔玻璃底细胞培养板中，14小时后使用lipo2000试剂盒转染蛋白标签不同细胞器定位质粒；转染后24小时去除原有培养基，使用无酚红DMEM培养基清洗2次，使用含有0.2μM探针的无酚红培养基孵育细胞2小时，使用leica TCS-8共聚焦显微镜成像检测细胞标记效果。结果如图13显示，探针可以在免洗的情况下清晰展示多种亚细胞器结构，其中包括但不限于细胞核、线粒体、高尔基体、内质网、全细胞、细胞骨架、细胞外膜、溶酶体、细胞内膜。
以上结果说明的探针可以作为细胞亚细胞器标记的有力工具。
实施例127
Hela细胞5000细胞每孔种植于96孔玻璃底细胞培养板中，14小时后使用lipo2000试剂盒共转染pcdna3.1-CLIP-NLS(CLIP蛋白标签细胞核定位质粒)、pcdna3.1-mito-SNAP(SNAP蛋白标签线粒体定位质粒)，每孔0.1μg；转染后24小时去除原有培养基，使用无酚红DMEM培养基2次，分别使用含有0.2μM的探针1和探针43的无酚红培养基孵育细胞2小时，使用leica TCS-8共聚焦显微镜成像检测细胞标记效果。结果如图14显示，探针1与探针43可以在同时在免洗的情况下分别清晰展示线粒体和细胞核结构，且探针43标记的细胞核荧光与探针1标记的线粒体荧光通道共定位系数低于0.1，说明两个荧光通道之间不会相互干扰。
以上实验说明不同探针荧光基团的光谱不会相互干扰，可以同时进行正交标记成像。
实施例128
首先，将表达SNAP蛋白标签的质粒pcdna3.1-SNAP(样品组)和未表达SNAP蛋白标签的对照质粒pcdna3.1-CAT(对照组)导入小鼠体内。此方法是将质粒溶解在很大体积的溶液中通过尾静脉注射迅速注射入小鼠体内，小鼠肝脏和肾脏吸收DNA，进而表达目的蛋白。质粒注射后20小时，将溶于200ul PBS中的0.4μM探针88通过尾静脉注射方法注射到小鼠体内标记SNAP蛋白标签；6小时后解剖小鼠，通过柯达多光谱活体成像系统检测不同小鼠样品肝脏部位荧光差异。结果如图15显示，注射探针88的对照质粒pcdna3.1-CAT的小鼠肝脏荧光很低，接近为未注射探针的空白肝脏的本底荧光水平，而注射探针88的SNAP质粒pcdna3.1-SNAP的小鼠肝脏具有较强的荧光，信号强度是对照组荧光的20倍以上。
以上实验说明探针的荧光不受动物内环境影响，可以应用于活体动物体内，且可以特异性标记表达在肝脏部位的SNAP蛋白标签，并产生较强荧光信号。
实施例129：
通过噬菌体展示的定向进化方法，经过6轮对SNAP-tag进行筛选，克隆出两种SNAP-tag突变体分别为SNAP F33G和SNAP V164E，采用实施例123所述的方法，用探针1、21、40分别对所述两种SNAP-tag突变体进行标记，结果显示，在相同条件下，相比于文献公开(Bright Mollwitz et al.Biochem 2012，51，986-994.)序列，探针荧光激活后的量子产率为原来的2.1--1.6倍。
另附上SNAPF33G和SNAPV164E的DNA序列：
SNAPF33G的DNA序列：
ATGGACAAAGACTGCGAAATGAAGCGCACCACCCTGGATAGCCCTCTGGGCAAGCTGGAACTGTCTGGGTGCGAACAGGGCCTGCACCGTATCATCGGCCTGGGCAAAGGAACATCTGCCGCCGACGCCGTGGAAGTGCCTGCCCCAGCCGCCGTGCTGGGCGGACCAGAGCCACTGATGCAGGCCACCGCCTGGCTCAACGCCTACTTTCACCAGCCTGAGGCCATCGAGGAGTTCCCTGTGCCAGCCCTGCACCACCCAGTGTTCCAGCAGGAGAGCTTTACCCGCCAGGTGCTGTGGAAACTGCTGAAAGTGGTGAAGTTCGGAGAGGTCATCAGCTACAGCCACCTGGCCGCCCTGGCCGGCAATCCCGCCGCCACCGCCGCCGTGAAAACCGCCCTGAGCGGAAATCCCGTGCCCATTCTGATCCCCTGCCACCGGGTGGTGCAGGGCGACCTGGACGTGGGGGGCTACGAGGGCGGGCTCGCCGTGAAAGAGTGGCTGCTGGCCCACGAGGGCCACAGACTGGGCAAGCCTGGGCTGGGTTAA
SNAPV164E的DNA序列：
ATGGACAAAGACTGCGAAATGAAGCGCACCACCCTGGATAGCCCTCTGGGCAAGCTGGAACTGTCTGGGTGCGAACAGGGCCTGCACCGTATCATCTTCCTGGGCAAAGGAACATCTGCCGCCGACGCCGTGGAAGTGCCTGCCCCAGCCGCCGTGCTGGGCGGACCAGAGCCACTGATGCAGGCCACCGCCTGGCTCAACGCCTACTTTCACCAGCCTGAGGCCATCGAGGAGTTCCCTGTGCCAGCCCTGCACCACCCAGTGTTCCAGCAGGAGAGCTTTACCCGCCAGGTGCTGTGGAAACTGCTGAAAGTGGTGAAGTTCGGAGAGGTCATCAGCTACAGCCACCTGGCCGCCCTGGCCGGCAATCCCGCCGCCACCGCCGCCGTGAAAACCGCCCTGAGCGGAAATCCCGTGCCCATTCTGATCCCCTGCCACCGGGTGGTGCAGGGCGACCTGGACGTGGGGGGCTACGAGGGCGGGCTCGCCGAGAAAGAGTGGCTGCTGGCCCACGAGGGCCACAGACTGGGCAAGCCTGGGCTGGGTTAA
实施例130：
为验证本发明探针的荧光激活与蛋白的存在具有相关性，以哺乳动物细胞SNAP蛋白为例，在Hela细胞中以AID降解系统为例检测了结合SNAP蛋白的探针在蛋白降解后的荧光变化。首先，Hela细胞20000/cm2种植于20mm玻璃底细胞培养皿中，14小时后通过invirtogen公司的lipofectmain2000转染试剂转染pcdna3.1-TIR1与pcdna3.1-SNAP-IAA17-H2B质粒。细胞转染后24小时，使用含有1μM探针21的无酚红DMEM培养基替换原有细胞培养基标记细胞，细胞样品置于37℃二氧化碳培养箱孵育1小时。标记完成后，使用LeicaSP8激光共聚焦显微镜成像检测细胞标记荧光信号，并加入吲哚乙酸(IAA)，诱导SNAP-IAA17-H2B蛋白降解，检测蛋白降解过程中细胞荧光变化情况。结果如图16所示，SNAP-IAA17-H2B蛋白定位于细胞核中(0min)，加入吲哚乙酸诱导蛋白降解，随着时间的增加，SNAP-IAA17-H2B蛋白荧光信号逐渐降低，加入吲哚乙酸120min时，荧光信号基本不可见，蛋白降解速度与文献报道结果一致。以上实验说明探针的荧光性质在哺乳动物细胞中的同样依赖于蛋白的存在，当蛋白存在时荧光被激活，当蛋白降解以后，荧光消失，可用于跟踪、监测目标蛋白的降解过程。
实施例131：
为验证本发明的探针可以用于实时监测哺乳动物细胞内生物大分子的组装与降解过程，以Hela细胞为例检测了探针在哺乳动物细胞内示踪细胞间隙蛋白CX43组装形成细胞间隙通道的过程。CX43基因C端同SNAP基因融合，并通过慢病毒感染技术构建并获得了稳定表达融合蛋白CX43-SNAP的Hela细胞株。探针标记前10小时，将Hela-CX43-SNAP细胞株种植于20mm玻璃底细胞培养培养皿中。标记时首先使用无酚红DMEM培养基稀释探针21至2μM并替换原有细胞培养基。细胞置于37℃二氧化碳培养箱孵育1小时。之后使用新鲜无酚红DMEM培养基清洗细胞两次，去除未结合探针21，每次间隔2分钟。然后，加入含有1μM探针1的DMEM无酚红培养基标记细胞，使用Leica SP8共聚焦显微镜长时间监测标记细胞样品在探针21、探针1两个探针相应荧光通道的荧光强度及位置变化过程分别如图17A和17B所示。在探针21荧光通道可见在2个细胞之间长柱形特异性荧光信号，如图17A所示，与文献(GuidoGaietta et al.Science 2002，296，503-507.)报道的结果一致。刚刚加入探针1时在其相应荧光通道并不能检测到荧光信号，如图17B所示，说明探针21标记了细胞内全部存在的CX43蛋白。随着培养时间延长，不断有新的CX43-SNAP蛋白合成，并被探针1标记。标记2小时后，在被探针21标记的原有细胞间隙通道边缘出现探针1荧光信号出现并逐渐增强，而旧的细胞间隙通道探针21荧光信号逐渐降低，说明细胞间隙通道中新合成的CX43-SNAP蛋白是从周围逐渐向中心替换原有CX43-SNAP蛋白，叠加通道如图17C所示，与文献报道的结果一致。以上的实验结果证明SNAP一系列化合物可以适用于实时监测细胞内生物大分子的组装与降解过程。
序列表
<110> 上海高驰资产管理有限公司
<120> 一种荧光探针及其制备方法和用途
<130> 072-2104025ID
<141> 2016-07-20
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 549
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggacaaag actgcgaaat gaagcgcacc accctggata gccctctggg caagctggaa 60
ctgtctgggt gcgaacaggg cctgcaccgt atcatcggcc tgggcaaagg aacatctgcc 120
gccgacgccg tggaagtgcc tgccccagcc gccgtgctgg gcggaccaga gccactgatg 180
caggccaccg cctggctcaa cgcctacttt caccagcctg aggccatcga ggagttccct 240
gtgccagccc tgcaccaccc agtgttccag caggagagct ttacccgcca ggtgctgtgg 300
aaactgctga aagtggtgaa gttcggagag gtcatcagct acagccacct ggccgccctg 360
gccggcaatc ccgccgccac cgccgccgtg aaaaccgccc tgagcggaaa tcccgtgccc 420
attctgatcc cctgccaccg ggtggtgcag ggcgacctgg acgtgggggg ctacgagggc 480
gggctcgccg tgaaagagtg gctgctggcc cacgagggcc acagactggg caagcctggg 540
ctgggttaa 549
<210> 2
<211> 549
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atggacaaag actgcgaaat gaagcgcacc accctggata gccctctggg caagctggaa 60
ctgtctgggt gcgaacaggg cctgcaccgt atcatcttcc tgggcaaagg aacatctgcc 120
gccgacgccg tggaagtgcc tgccccagcc gccgtgctgg gcggaccaga gccactgatg 180
caggccaccg cctggctcaa cgcctacttt caccagcctg aggccatcga ggagttccct 240
gtgccagccc tgcaccaccc agtgttccag caggagagct ttacccgcca ggtgctgtgg 300
aaactgctga aagtggtgaa gttcggagag gtcatcagct acagccacct ggccgccctg 360
gccggcaatc ccgccgccac cgccgccgtg aaaaccgccc tgagcggaaa tcccgtgccc 420
attctgatcc cctgccaccg ggtggtgcag ggcgacctgg acgtgggggg ctacgagggc 480
gggctcgccg agaaagagtg gctgctggcc cacgagggcc acagactggg caagcctggg 540
ctgggttaa 549

Claims (11)

1.一种荧光探针，包括：配体部分A，任选的连接体部分C和荧光染料部分，所述荧光染料部分为粘度响应性荧光染料基团，包括电子供体部分D、共轭体系B和电子受体部分，所述配体部分A为能够与蛋白标签或融合蛋白标签的靶蛋白特异性识别并共价标记的基团；其特征在于，所述配体部分A通过连接体部分C共价连接于荧光染料部分的电子供体部分D；
其具有如式(I)所示的结构，
其中，
所述配体部分A-选自下式结构：
连接体部分C为-(C＝O)-；
式(I)中的式(I-R)所示结构部分为荧光染料部分，
其中：
电子供体部分-D-为-X2-NX1-，X1选自氢、烷基，X2为改性亚烷基，所述改性亚烷基为亚烷基的任意碳原子被选自-O-基团置换所得的基团，所述改性亚烷基具有1～30个碳原子；
所述共轭体系B选自式(I-1-5)、(I-1-11)、(I-1-19)、(I-1-22)～(I-1-24)中的结构：
电子受体部分具有如下式(I-2)所示的结构，
其中，
R1选自氢；
R2选自氰基、羧基、酯基、酰胺基、杂芳基、或改性烷基；
R3为氰基；
其中，
所述烷基为具有1～30个碳原子的饱和脂肪族直链或支链的烷基；
所述亚烷基为具有1～30个碳原子的饱和脂肪族直链或支链的亚烷基；
所述改性烷基为烷基的任意碳原子被选自-O-、-OH、-CO-、伯氨基、仲氨基、叔氨基、-NH-CO-中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1～30个碳原子；
所述碳原子被置换，是指碳原子或碳原子与其上的氢原子一起被相应的基团置换；
所述杂芳基或芳香杂环为环上含有选自N、O、S中的至少一种杂原子的5～10元单环或稠合双环。
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：
所述改性烷基为含有选自-OH、-O-、C1～C8烷氧基、C1～C8酰基氧基、-O-CO-中至少一种基团的基团；
所述改性亚烷基各自独立地为含有选自-(CH2CH2O)n-的基团，其中，n为1；
所述C1～C8烷氧基为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基，C1～C8酰基氧基为乙酰氧基、丙酰氧基、异丙酰氧基。
3.根据权利要求1或2所述的荧光探针，其中，
所述式(I-2)结构为选自下式(I-2-1)～(I-2-4)、(I-2-6)、(I-2-7)、(I-2-9)、(I-2-17)、(I-2-18)中的一种：
4.根据权利要求1-3任一项所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针选自下式化合物：
5.制备权利要求1-4任一项所述的荧光探针的方法，其特征在于，包括式(II)所示荧光染料与配体以及连接体发生反应的步骤：
其中，D’反应后能够形成D-基团与连接基团或配体键合。
6.一种荧光激活型蛋白特异性标记方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-4任一项所述的荧光探针与蛋白标签或者融合蛋白标签的靶蛋白接触，所述荧光探针的配体部分与蛋白标签发生标记反应，将荧光探针标记到蛋白标签上，所述将荧光探针标记到蛋白标签上为共价标记，所述方法为非用于疾病的治疗或诊断方法。
7.根据权利要求6所述的荧光激活型蛋白特异性标记方法，其特征在于，所述标记反应的反应介质选自纯蛋白溶液、细胞裂解液或蛋白标签或融合蛋白标签的靶蛋白所处在的原位介质。
8.根据权利要求7所述的荧光激活型蛋白特异性标记方法，其特征在于，所述原位介质为细胞内介质、细胞器内介质、活体组织介质、血液或体液。
9.权利要求1-4任一项所述的荧光探针在蛋白荧光标记，蛋白的定量、检测或动力学研究，以及细胞、组织、活体影像中的用途；所述用途为非用于疾病的治疗或诊断方法的用途。
10.一种探针试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的荧光探针；
所述探针试剂盒还包含生物相容性介质；所述生物相容性介质选自二甲基亚砜、缓冲剂、生理盐水中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的探针试剂盒，其特征在于，所述缓冲剂包括磷酸盐缓冲液。
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