CN104910276B - 基因编码的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供基因编码的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸荧光探针及其制备方法和应用，所述基因编码的NADPH荧光探针，包括：对NADPH敏感的多肽B和对NADPH进行表现的荧光蛋白A；所述对NADPH敏感的多肽B和NADPH相互作用导致荧光蛋白A荧光强度的变化。该NADPH荧光探针可以在体内、体外、亚细胞或原位水平检测NADPH；探针特异性非常好，对于ATP等类似物没有响应，对于NADH等类似物也没有干扰。探针蛋白相对较小且易于成熟，其荧光动态变化大，是一种适合于生理水平和亚细胞特异性的实时检测NADPH的技术。

Description

基因编码的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸荧光探针及其制备方 法和应用

技术领域

本发明涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用。一方面本发明涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的检测探针，具体涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的重组荧光融合蛋白检测探针。在又一方面，本发明也涉及上述检测探针的制备方法及其在检测NADPH中的应用。

背景技术

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）是体内重要的辅酶之一，它不仅参与了细胞内的脂类、脂肪酸和核苷酸等物质的合成代谢反应并为该反应过程提供还原力；还通过重生还原型谷胱甘肽，硫氧还蛋白等抗氧化物质维持着细胞内的氧化还原势；另外它也可以通过细胞色素P450蛋白等参与细胞的去毒反应，降解细胞内的毒性物质；除此之外，它还可以通过NADPH氧化酶产生活性氧类（ROS），调节基因表达、细胞内信号转导和免疫反应等（Agledal,L.等，Redox Rep.2010，V.15（1），pp.2-10）。因此，NADPH和细胞代谢、氧化还原代谢和细胞内信号转导等生命过程有紧密的关系，而与NADPH代谢相关的众多酶类也成为了药物设计的靶标（Rohle,D.等，Science.2013，V.340(6132):，pp.626-630）。

但是，大多数细胞内游离的NADPH含量非常低，1g湿重的小鼠肝脏大约含有0.1μmol的NADP(H)，其中绝大部分都是以结合形式存在的（Reiss,P.D.等，Anal Biochem.1984，V.140(1)，pp.162-171）。在不同细胞类型和亚细胞器中，游离的NADPH和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP⁺）的比例略有变化，例如线粒体中的游离NADPH和NADP的比例通常高于10:1，而在细胞胞浆中还原状态的NADPH甚至占到了游离NADP(H)部分的99%左右（Veech,R.L.等，Biochem J.1969，V.115(4)，pp.609-619）。早期的紫外分光光度法是利用NADPH的光吸收性质，但是该方法的灵敏度很差且不能有效地区分还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）与NADPH。随后发展的酶学方法是依据NADP⁺和NADPH可以在酶作用下互相转化的性质，但是这种检测方法受到外界环境，酶的活性以及分析仪器的灵敏度限制。另外还有一些物理化学检测方法，如HPLC分析、电化学法、毛细管电泳等，虽然它们的精度较高，但是在活细胞研究中存在很大的缺陷。它们需要经过耗时的样品处理时间（细胞破碎、分离提取纯化等），而NADPH 在环境中非常容易氧化，因此这些方法不能应用于细胞或活体动物的实时准确地检测。这些检测方法测量的是细胞群体，掩盖了细胞之间的差异，限制了它们在临床疾病诊断及药物前体研究等邻域的应用。目前虽然存在检测NADH和NADH:NAD⁺比例的基因编码荧光探针(Zhao,Y.等，Cell Metabolism.2011,V.14(4),pp.555-566)，但是它们依然存在荧光强度低，动态变化范围小以及不合适于线粒体检测等劣势，最为重要的是它们不能用于细胞内NADPH的检测。

虽然目前可以利用自发荧光的方法在细胞或活体上进行NADPH的实时检测，但是这种方法存在严重的局限性：首先，不能有效的区分NADH与NADPH，由于它们的荧光光谱完全相同，因而检测的信号是NADH与NADPH总量之和；另外游离的NAD(P)H含量很低，所以测量的NAD(P)H的自发荧光信号，反映的其实是蛋白质结合的NAD(P)H的荧光(Zhang.Q.H.等，Science.2002，V.295(5561)，pp.1895-1897)；其次，NADPH的激发波长位于近紫外区（340nm），它的穿透力很弱且长时间照射会造成严重的细胞损伤，用于自发荧光检测的仪器价格也非常昂贵，这些局限性都制约了该方法在活细胞中的应用。因此，本研究领域亟需发展一种特异性检测NADPH的技术，特别是适合于生理水平的时空特异性检测NADPH的技术。

相对于传统的小分子化学染料以及迅速发展的量子点检测技术，基因编码的荧光蛋白探针在活细胞成像方面具有很大优势。基因编码的荧光蛋白探针存在光毒性小、可以基因编码，并能够通过基因操作的方法在细胞、组织乃至整个器官中进行表达，因此荧光探针是优异的单细胞代谢小分子的实时指示器。基因编码的荧光蛋白探针是由荧光蛋白和对配体特异性结合的支架蛋白组成的。

最早发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白GFP（SEQ ID NO13），它是从维多利亚发光水母(Aequorea victoria)中提取出来的，由238个氨基酸构成，分子量约为26kDa。GFP是由11条β-折叠链形成了独特的桶状结构，其内包裹着生色三肽（Ser65-Tyr66-Gly67）。当在氧气存在下，它会自发形成对-羟基苯亚甲基咪唑啉酮的生色团结构而产生荧光。GFP产生荧光不需要辅因子，而且荧光非常稳定，是一种良好的成像工具。GFP有两个激发峰，395nm的主峰可产生508nm的发射光，而肩峰475nm的激发光照射则会产生的503nm的发射光(Heim，R.等，Proc Natl Acad Sci U S A.1994，V.91(26)，pp.12501-12504)。随着对GFP蛋白突变的研究不断深入，目前产生了很多不同颜色的突变体例如荧光增强型绿色荧光蛋白（eGFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、青色荧光蛋白（CFP）、蓝色荧光蛋白（BFPSeq ID NO14），绿色荧光蛋白（TFP）等。除此之外，科学家还在海洋珊瑚中发现了第一种红色荧光蛋白（RFP），经过不断的改造产生了多种商业化的红色荧光蛋白突变体，其中最常用的红色荧光蛋白，一种是樱桃红荧光蛋白mcherry（Seq ID NO15），它的激发峰在587nm，发射峰在621nm（Tsien,R.Y.等，Nat Methods.2008，V.5(6)，pp.545-551）；另一种是mKate（Seq ID NO16）,它的光谱和mcherry类似(Shcherbo,D.等,Nature Methods.2007,V.4(9),pp.741-746)等。

基因编码的荧光探针的主要构建方式是荧光共振能量转移（FRET）和基于单生色团的荧光蛋白，其中后者的主要形式是天然荧光蛋白质的环状重排。例如将GFP的原始N端和C端通过一段柔性的短肽链连接，而在野生型GFP近生色团位置（如Y144和N145位氨基酸）制造一个新的N端和C端，就可以形成一个对空间构象变化非常敏感的环状排列荧光蛋白(circularly permuted fluorescent protein)。目前已经创造了多种环状重排的荧光蛋白（cpFP）用于荧光探针的构建，如环状重排蓝色荧光蛋白（cpBFPSeq ID NO8），环状重排绿色荧光蛋白(cpEGFPSeq ID NO7)，环状重排黄色荧光蛋白(cpYFPSeq ID NO6)，环状重排绿色荧光蛋白(cpTFPSeq ID NO9)，环状重排橙色荧光蛋白（cpmOrange Seq ID NO10），环状重排苹果红荧光蛋白(cpmAppleSeq ID NO11)，环状重排红色荧光蛋白(cpmKateSeq IDNO12)等(Zhao,Y.等,Science,2011,V333(6051),pp.1888-1891)，其中cpYFP在荧光探针的构建和应用中非常普遍(Nagai，T.等，Proc Natl Acad Sci U S A.2001，V.98(6)，pp.3197-3202)。

本技术中用于对NADPH进行表现的多肽来源于嗜热水生菌（Thermus Aquaticus）的Rex蛋白（T-Rex），它是由ydih基因编码（Seq ID NO1）。Rex蛋白是一种广泛存在于革兰氏阳性菌中并对细菌氧化还原势敏感的转录调控因子，分子量约为23kDa，它能调控发酵和厌氧呼吸(Sickmier,E.A.等,Structure,2005,V13(1),pp.43-54)。不同种属的Rex蛋白结构非常类似，它们都是由NAD(P)H结合域和DNA结合域组成的同源二聚体，其中NAD(P)H结合域是典型的Rossmann结构域，它可以结合辅因子NAD(H)，NADP（H）及其类似物ATP等，但是它对NAD（H）的亲和力强于NADP（H），因此天然的Rex蛋白在细胞内主要感应胞质NADH和NAD⁺比率的变化，在NADH和NAD⁺比率动态变化的过程中Rex蛋白的空间构象也会发生很大改变(Brekasis，D.等，EMBO J.2003，V.22(18)，pp.4856-4865)，因此，Rex蛋白是一个很好的细胞内NADH及其类似物检测探针的候选者，而我们可以通过对Rex蛋白进行理性突变改造，产生一个对于NADPH响应的多肽用于探针构建。

将理性突变获得的对NADPH特异性结合而对NADH不敏感的Rex蛋白突变体和环状重排的荧光蛋白（cpFP）进行融合并改造，可能会筛选获得新型的基因编码的NADPH荧光探针。理论上，对NADPH特异性结合的Rex蛋白突变体可以感受环境内NADPH的浓度变化，并将这一构象变化传递至临近的环状重排的荧光蛋白，通过对荧光变化的测量，就可以对环境中NADPH的浓度改变进行实时且直观地描述。

综上所述，我们认为利用包含理性突变的Rex蛋白的重组荧光融合蛋白能够满足在生理水平和亚细胞水平上检测NADPH的迫切需要。

不应认为对本文所述参考文献的引用或讨论意味着承认这些参考文献是本发明的现有技术。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的第一个目的是提供基因编码的NADPH荧光探针。

本发明的第二个目的是提供编码基因编码的NADPH荧光探针的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供基因编码的NADPH荧光探针的制备方法。

本发明的第四个目的是提供包含基因编码的NADPH荧光探针的融合蛋白。

本发明的第五个目的是提供编码含有NADPH荧光探针的融合蛋白的核苷酸序列。

本发明的第六个目的是提供包含编码NADPH荧光探针核苷酸序列的表达载体。

本发明的第七个目的是提供包含本发明所述表达载体的宿主细胞。

本发明的第八个目的是提供基因编码的NADPH荧光探针在检测NADPH或筛选药物中的应用。

本发明的第九个目的是提供一种试剂盒，其包含本发明所述的基因编码的NADPH荧光探针和说明书。

本发明的技术方案如下：

本发明提供基因编码的NADPH荧光探针，包括：对NADPH敏感的多肽B和对NADPH进行表现的荧光蛋白A；所述对NADPH敏感的多肽B和NADPH相互作用导致荧光蛋白A荧光强度的变化。

根据本发明所述的基因编码的NADPH荧光探针，优选的是，来源于对NADH敏感的嗜热水生菌的转录调控因子T-Rex蛋白的突变体，所述T-Rex蛋白如SEQ ID NO：2所示，所述突变体是通过对T-Rex蛋白的NADH结合口袋的关键氨基酸90-91位,112-116位,130位,148位进行突变而改造为对NADPH敏感的多肽B，优选如SEQ ID NO：30-44所示；或

与来源于对NADH敏感的嗜热水生菌的转录调控因子T-Rex蛋白同源性高达90%以上的氨基酸序列，所述T-Rex蛋白如SEQ ID NO2所示，如来源于Thermus oshimai JL-2的Rex蛋白如SEQ ID NO：3所示，来源于Marinithermushydrothermalis DSM14884的Rex蛋白如SEQ ID NO：4所示，来源于Deinococcusproteolyticus MRP的Rex蛋白如SEQ ID NO：5所示等，所述突变是在NADH结合口袋的关键氨基酸90-91位,112-116位,130位,148位进行突变。

本发明所述对NADH敏感的嗜热水生菌的转录调控因子T-Rex蛋白的突变体，突变体是通过对T-Rex蛋白的NADH结合口袋的关键氨基酸90-91位,112-116位,130位,148位进行突变而改造为对NADPH敏感的多肽B，其中112-116位氨基酸组成了NAD)H结合口袋，其112-114位的突变可以为T/S112，R113，T/S/K114，而115-116位的突变可以为P/A115&Q116或G/A/P115&E116；而90-91位，130位，148位为结合口袋三维结构上 临近的氨基酸，可以调节多肽B结合NAD(P)H的亲和力，其突变可以为D90，K/R91，V/T/Y130或V/A/T148。

本发明对NADPH敏感的多肽B可以来源于和嗜热水生菌T-Rex蛋白同源性在90%以上的其他嗜热菌Rex蛋白突变体，它们的关键氨基酸90-91位,112-116位,130位,148位氨基酸于T-Rex蛋白相同或者性质相似，如来源于Thermus oshimai JL-2的Rex蛋白如SEQ IDNO：3所示，来源于Marinithermushydrothermalis DSM14884的Rex蛋白如SEQ ID NO：4所示，来源于Deinococcusproteolyticus MRP的Rex蛋白如SEQ ID NO：5所示等。

根据本发明所述的基因编码的NADPH荧光探针，进一步优选的是，所述的对NADPH敏感的多肽B来源于对NADH敏感的嗜热水生菌的转录调控因子T-Rex蛋白突变体，所述T-Rex蛋白如SEQ ID NO：2所示，所述突变体是通过对T-Rex蛋白的NADH结合口袋的关键氨基酸90-91位,112-116位,130位,148位进行突变而改造为对NADPH敏感的多肽B的DNA结构域的截短体（如SEQ ID NO：45-54所示）。

根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，所述荧光探针的组合形式是对NADPH进行表现的荧光蛋白A插入到对NADPH敏感的多肽B中，将B分为两个部分，B的第一部分B1和B的第二部分B2，形成的探针结构式B1-A-B2；所述荧光蛋白A的插入位点是对NADPH敏感多肽B的79/80，99/100，112/113，112/114，166-167，187/188，188/189，189/190，187/189，187/190，188/190位，或者其家族蛋白的对应氨基酸位点。

根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，优选的是，所述荧光探针的组合形式是对NADPH进行表现的荧光蛋白A插入到对NADPH敏感的T-Rex蛋白的突变体多肽B中，将B分为两个部分，B的第一部分B1和B的第二部分B2，形成的探针结构式B1-A-B2；所述荧光蛋白A的插入位点是对NADPH敏感的T-Rex蛋白的突变体多肽B的79/80，99/100，112/113，112/114，166-167，187/188，188/189，189/190，187/189，187/190，188/190位，或者其家族蛋白的对应氨基酸位点。

本发明所述荧光蛋白A的插入位点，进一步优选的是对NADPH敏感的T-Rex蛋白的突变体多肽B的112/113，112/114，188/189，189/190（如SEQ ID NO：55-58所示）。

本发明所述基因编码的NADPH荧光探针，优选的是，所述对NADPH敏感的多肽B含有关键氨基酸突变体的DNA结合域截短体78-212，如SEQ ID NO：45-54所示。

根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，所述的NADPH进行表现的荧光蛋白A选自：维多利亚水母的环状变换的绿色荧光蛋白的突变体cpGFP如SEQID NO：7所示及其同源突变体蓝色荧光蛋白cpBFP如SEQ ID NO：8所示、黄色荧光蛋白cpYFP如SEQ ID NO：6所示、绿色荧光蛋白cpTFP如SEQID NO：9所示，和/或来自于海洋珊瑚的红色荧光蛋白及其衍生物，包括但不局限于这些突变体：环状重排橘黄色荧光蛋白如SEQ ID NO：10所示、环状重排苹果红荧光蛋白cpmApple如SEQ ID NO：11所示、环状重排红色荧光蛋白cpmKate如SEQID NO：12所示；等。

根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，所述的NADPH进行表现的荧光蛋白A，优选的是，来自于维多利亚水母的环状变换的绿色荧光蛋白的突变体如SEQ ID NO：6-9所示。

根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，所述的NADPH进行表现的荧光蛋白A，进一步优选的是，来自于维多利亚水母的环状变换的黄色荧光蛋白cpYFP如SEQID NO：6所示。

根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，对NADPH敏感的多肽B和对NADPH进行表现的荧光蛋白A之间可直接或通过柔性氨基酸操作性连接；所述柔性氨基酸是甘氨酸，丙氨酸，苏氨酸，丝氨酸；所述柔性氨基酸的数目，优选的是不超过5个（SEQ IDNO59）；所述柔性氨基酸的数目，进一步优选的是不超过4个(SEQ IDNO60)；所述柔性氨基酸的数目，更优选的是不超过3个（SEQ IDNO61-62）；所述柔性氨基酸的数目，最好是氨基端的数目为3个，羧基端的数目1个（SEQIDNO63）。

根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，所述荧光探针的氨基酸序列为：SEQ ID NO：67-69。

根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，优选的是，所述荧光探针的氨基酸序列SEQ ID NO：90-109。

根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，所述荧光探针由SEQ ID NO：64-66所示的基因编码。

根据本发明提供的优选基因编码的NADPH荧光探针，所述荧光探针由SEQ ID NO：70-89所示的基因编码：。

根据本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，本发明还提供和编码所述荧光探针的核苷酸序列互补的核酸序列。

本发明还提供一种融合蛋白，将所述的NADPH荧光探针作为基本单位，在其N端和/或C端融合其他多肽；该融合蛋白不影响所述的NADPH荧光探针的性质，用于扩大所述的NADPH荧光探针的应用，所述在NADPH荧光探针的N端和/或C端融合的多肽包括定位到 不同亚细胞器的信号肽、用于纯化或者免疫印迹的标签、荧光蛋白或以NADP（H）为辅酶的酶。

所述在NADPH荧光探针的N端和/或C端融合的多肽包括定位到不同亚细胞器的信号肽，所述亚细胞器为核排阻、细胞核、线粒体基质、细胞内膜、细胞外膜、内质网、高尔基体、线粒体膜间质等，其氨基酸序列如SEQ ID NO：23-30所示。

所述在NADPH荧光探针的N端和/或C端融合的多肽包括用于纯化或者免疫印迹的标签，所述标签为6个组氨酸（6*His）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）、sumo、myc、Flag等。

所述在NADPH荧光探针的N端和/或C端融合的多肽包括荧光蛋白，所述荧光蛋白来自维多利亚水母的GFP（Seq ID NO13）及其突变体BFP（Seq ID NO14）等、或者来源于珊瑚的红色荧光蛋白mcherry（SEQ ID NO：15），mKate（SEQ ID NO：16）及其突变体。

所述在NADPH荧光探针的N端和/或C端融合的多肽包括以NADP（H）为辅酶的酶，所述酶为葡萄糖-6磷酸脱氢酶（SEQ ID NO：17），异柠檬酸脱氢酶1型或2型（SEQ ID NO：18-19），苹果酸脱氢酶1型（SEQ ID NO：20），烟酰胺核苷酸转氢酶（SEQ ID NO：21），谷氧还蛋白（SEQ ID NO：22）等。

本发明还提供编码所述融合蛋白的核苷酸序列。

本发明还提供一种表达载体，所述的表达载体由载体质粒与所述的核酸序列操作性连接得到的。

本发明所述表达载体选自原核表达载体、真核表达载体和病毒载体。

本发明所述原核表达载体，优选的是，由载体质粒pRSETb与所述的核酸序列操作性连接得到的。

本发明还提供一种包含所述的表达载体的宿主细胞。

本发明还提供所述的荧光探针在检测NADPH或药物筛选中的应用。

本发明还提供一种用于检测NADPH、筛选药物的试剂盒，所述的试剂盒包含说明书和所述的荧光探针。

本发明所述融合蛋白，其包含所述基因编码的NADPH荧光探针；优选的是，所述融合蛋白是由所述荧光探针与特异性亚细胞定位信号融合形成的，所述定位信号可将目标蛋白定位于指定的亚细胞器内。

本发明所用的用于对NADPH进行表现的荧光蛋白序列可以来自于维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的荧光蛋白及其衍生物，包括但不局限于这些突变体：环状重排蓝色 荧光蛋白（cpBFP），环状重排绿色荧光蛋白(cpGFP)，环状重排黄色荧光蛋白(cpYFP)，环状重排绿色荧光蛋白(cpTFP)等的序列，其中环状排列的黄色荧光蛋白cpYFP的序列；和/或来自于海洋珊瑚的红色荧光蛋白（RFP）及其衍生物，包括但不局限于这些突变体：环状重排橘黄色荧光蛋白(cpmOrange)：环状重排苹果红荧光蛋白(cpmApple)，环状重排红色荧光蛋白(cpmKate)等。

本发明技术中用于对NADPH敏感的多肽来源于嗜热水生菌的T-Rex蛋白，它由ydih基因编码。Rex蛋白是一种广泛存在于革兰氏阳性菌中并对细菌氧化还原势敏感的转录调控因子，分子量约为23kDa，它能调控发酵和厌氧呼吸。不同种属的Rex蛋白结构非常类似，它们都是由NAD(P)H结合域和DNA结合域组成的同源二聚体，其中NADH结合域是典型的Rossmann结构域，它可以结合辅因子NAD(H)，NADP(H)及其类似物ATP等，但是对NAD(H)的亲和力强于NADP(H)，因此天然的Rex蛋白在细胞内主要感应胞质NADH/NAD⁺比率的变化，在NADH/NAD⁺比率动态变化的过程中Rex蛋白的空间构象也会发生很大改变。因此，Rex蛋白是一个很好的细胞内NADH及其类似物检测探针的候选者，而我们可以对Rex蛋白进行改造，产生一个对于NADPH响应的多肽用于探针构建。

目前蛋白质活性位点结构比对（Comparison of Protein Active SiteStructures）在蛋白质改造中应用非常普遍。我们通过对蛋白质结构库（Proteindatabase）中NAD(H)结合蛋白和NADP(H)结合蛋白的晶体结构进行比对，由CPASS打分就可以获知Rex蛋白对于NADH和NADPH结合口袋的关键氨基酸残基。对这些氨基酸进行理性设计，就可能会获得一种对于NADPH特异性结合而对于NADH不结合的人工多肽，这个多肽可以用于NADPH的探针构建。

本发明中构建的是基于单生色团荧光蛋白的基因编码荧光探针，它是由环状重排的荧光蛋白（cpFP）和对配体敏感的蛋白融合产生。这种构建方式是将荧光蛋白插入到后者的柔性松散区域，这个柔性松散区域可以根据蛋白的晶体结构推测，通常是两个结构域之间的一段环状结构，这个结构特别适合构象变化后力的传递。荧光蛋白有两百多个氨基酸，它的插入可能会导致蛋白质的折叠能力变差、荧光探针失去荧光等，因此荧光蛋白的插入位点的选择很重要。另外，合理的荧光蛋白插入位点一般和支架蛋白的配体结合关键位点之间不存在直接联系，因此对支架蛋白的配体结合关键氨基酸的改造，产生的新的配体结合性质就可以衍生出相似性质的荧光探针。除此之外，荧光蛋白和对配体特异性结合的支架蛋白融合的连接区氨基酸数目和性质也非常关键，它们直接决定支架蛋白结合配体后构象变化产生的力传递到荧光蛋白的效率，因此探针构建必须对连接区氨基酸进行筛选。

本发明中将理性突变获得的对NADPH特异性结合而对NADH不敏感的Rex蛋白突变体和环状重排的荧光蛋白（cpFP）进行融合并改造，希望可以筛选获得新型的基因编 码的NADPH荧光探针。理论上，对NADPH特异性结合的T-Rex蛋白突变体可以感受环境内NADPH的浓度变化，并将这一构象变化传递至临近的环状重排的荧光蛋白，通过对荧光变化的测量，就可以对环境中NADPH的浓度改变进行实时且直观地描述。

本发明中，可以将NADPH荧光探针和其他蛋白多肽在氨基酸或羧基端融合，这种融合一般不会改变荧光探针的性质，同时可以扩大探针的应用。例如将NADPH荧光探针和信号肽相连，可以将荧光探针定位到特定的亚细胞器中进行表达，检测该亚细胞器内的NADPH浓度；将NADPH荧光探针和多种融合标签相连，可以使该探针在多种宿主细胞内表达纯化或者免疫印迹进行相关的生化研究；将NADPH荧光探针和没有光谱交叉的荧光蛋白融合，可以将该探针改造为对pH不敏感的荧光探针；将NADPH荧光探针和以NADP(H)为辅酶的酶融合表达，可以通过检测NADPH的浓度变化，实时检测酶底物和产生之间的比例差异。

本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针，其内含有对环境内NADPH敏感的多肽，和通过光谱性质的改变对环境内NADPH进行表现的部分。在一个实施方式中，所述通过光谱性质的改变对环境内NADPH进行表现的部分是荧光蛋白或其衍生物。

在一个实施方式中，本发明还提供一种荧光探针，其包含荧光团以及嗜热水生菌T-Rex蛋白的突变体或和T-Rex蛋白序列同源性90%以上的其他嗜热菌Rex蛋白的类似物。在另一实施方式中，本发明还提供一种荧光探针，其包含荧光团以及嗜热水生菌T-Rex蛋白的突变体。本发明还提供一种荧光探针，其包含荧光团以及嗜热水生菌T-Rex蛋白突变体的可溶性片段。

在一个实施方式中，本发明提供一种荧光探针，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:67-69。在优选实施方式中，本发明提供一种荧光探针，在至少85个氨基酸残基内任何与氨基酸序列SEQ ID NO:90-109具有99%、95%、90%、80%、70%或50%相同性的同源或非同源序列。在另一实施方式中，本发明提供一种荧光探针，包含在至少85个氨基酸残基内任何与氨基酸序列SEQ ID NO:67-69实质上相似或相同的同源或非同源序列。在优选实施方式中，本发明提供一种荧光探针，包含氨基酸序列SEQ ID NO:90-109的变异体或衍生物。

本发明提供一种核酸序列，包含核苷酸序列SEQ ID NO:64-66。在优选实施方式中，本发明提供一种核酸序列，包含在至少85个碱基长度内任何与核苷酸序列SEQ ID NO:70-89具有99%、95%、90%、80%、70%或50%相同性的同源或非同源序列。在另一实施方式中，本发明提供一种核酸序列，包含在至少85个碱基与核苷酸序列SEQ ID NO:64-66实质上相似或相同的核苷酸序列；在优选实施方式中，本发明提供一种核酸序列，包含核苷酸序列SEQID NO:70-89的变异体或衍生物。

本发明还涉及上述核酸序列的互补序列和变异体，其可包含编码本发明荧光探针或融合蛋白的片段、类似物、衍生物、可溶性片段和变异体的核酸序列或其互补序列。

本发明提供的表达载体，其包含与表达控制序列操作性连接的本发明核酸序列。所述表达控制序列可以是复制起点、启动子、增强子、操纵子、终止子、核糖体结合位点等。

本发明提供的制备本发明荧光探针或融合蛋白的方法，包括以下步骤：

a.将本发明表达载体转移到宿主细胞中，

b.在适合所述宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，和

c.由所述宿主细胞分离所述荧光探针或融合蛋白。

本发明还提供所述荧光探针或融合蛋白在检测NADPH中的应用。在一个实施方式中，本发明提供所述荧光探针或融合蛋白在体外或体内检测NADPH中的应用。在一个实施方式中，本发明提供所述荧光探针或融合蛋白在亚细胞水平检测NADPH中的应用。在一个实施方式中，本发明提供所述荧光探针或融合蛋白在原位检测NADPH中的应用。在另一个实施方式中，本发明提供所述荧光探针或融合蛋白在筛选药物中的应用，所述药物可用于调节对象的NADPH水平。在另一个实施方式中，本发明提供所述荧光探针或融合蛋白在诊断疾病中的应用，所述疾病与NADPH水平有关。

本发明还提供了一种检测NADPH的试剂盒，其中包含本发明荧光探针或融合蛋白。所述检测可以在体内、体外、亚细胞或原位水平进行。本发明还提供一种筛选药物的试剂盒，所述药物可用于调节对象的NADPH水平，所述试剂盒包含有效量的本发明荧光探针或融合蛋白。本发明还提供了一种用于检测与NADPH水平有关的疾病的试剂盒，所述试剂盒包含有效量的本发明融合蛋白。在使用时，本领域技术人员能够根据所述融合蛋白的活性方便地确定所述的有效量。

本发明中的蛋白质和核酸序列优选以分离形式提供，更优选地被纯化至均质。

发明详述

I.定义：

在给出数值或范围时，本文所用术语“约”指该数值或范围在给定数值或范围的20%以内、10%以内和5%以内。

本文所用术语“包含”、“包括”和其等同形式包括“含有”以及“由……组成”的含义，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。

在本发明中，术语“Rex蛋白”指的是一种广泛存在于革兰氏阳性菌中并对细菌氧化还原势敏感的调控蛋白（由ydih基因编码），分子量为23kDa，它能调控发酵和厌氧呼吸。本技术中的“T-Rex蛋白”来源于嗜热水生菌(Thermus aquaticus)，它们含有典型的Rossmann结构域，可以结合辅因子NAD(H)及其类似物。Rex蛋白可以感应胞质NADH/NAD⁺比率的变化，在NADH/NAD+比率动态变化的过程中Rex蛋白的空间构象也会发生很大改变。本发明中所涉及的“T-Rex蛋白”可以包含核苷酸序列SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列。本发明中所涉及的“柔性区域”是指蛋白质高级结构中存在的一些特定的如环状结构域等结构，这些结构域相比于蛋白质的其他高级结构具有更高的移动性和柔性，并且该区域可以在该蛋白质和配体结合后，空间结构构象发生动态变化。本发明所涉及的柔性区域主要指T-Rex蛋白中的插入位点所在区域，如D112-G119区域，以及D188-G192等区域。

本文所用术语“CPASS”或“Comparison of Protein Active Site Structures”或“蛋白质活性位点结构比对”，它是一种基于蛋白质与配体结合的关键氨基酸残基位点的晶体结构比对方法，在蛋白质改造中应用非常普遍。本文使用的技术通过对蛋白质结构库（Protein database）中NAD(H)结合蛋白和NADP(H)结合蛋白的晶体结构进行比对，由程序自动打分就可以获知T-Rex蛋白对于NADH和NADPH结合口袋的关键氨基酸残基。对这些氨基酸进行理性设计，就可能会获得一种对于NADPH特异性结合而对于NADH不结合的人工多肽，这个多肽可以用于NADPH的探针构建。因此，“CPASS“是一种对氨基酸配体亲和力进行改造的优良的方法。

本文所用术语“T-Rex蛋白突变体”或“T-Rex突变体”或“理性设计的T-Rex突变体”是指应用蛋白质活性位点结构比对（CPASS）程序之后，将获得的预测结果在天然的嗜热水生菌T-Rex蛋白上NADH结合口袋上的关键氨基酸90-91位,112-116位，130位，148位发生了突变，这些突变可以改变T-Rex蛋白结合NADH和NADPH的性质，提高突变体对NADPH的结合能力，降低或消除对于NADH的结合能力。本发明中所涉及的“T-Rex蛋白突变体”可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：30-54以及与SEQ ID NO30有90%以上同源的多肽如SEQ ID NO3-5。

本文所用术语“NAD(P)H”是对NADH和NADPH的统称，“NAD(H)”分别是对NAD⁺和NADH的统称，“NADP(H)”是对NADP⁺和NADPH的统称。NAD(P)H的两种分子在光学上不可分辨，因此在很多文献上将其合称为NAD(P)H。而NAD(H)和NADP(H)是一种分子的氧化形式和还原形式，而且它们的功能相关，因此很多研究者也将它们并称。

本文所用术语“融合蛋白”与“荧光融合蛋白”和“重组荧光融合蛋白”同义，指包含第一种多肽或蛋白质或者其片段、类似物或衍生物的氨基酸序列，以及异源多肽或蛋白质(即，不同于第一种多肽或蛋白质或者其片段、类似物或衍生物的第二种多肽或蛋白质或者其片段、类似物或衍生物)的氨基酸序列的多肽或蛋白质。在一个实施方式中，融合蛋白包含与异源蛋白质、多肽或肽融合的荧光蛋白。按照这个实施方式，异源蛋白质、多肽或肽可能是或不是不同类型荧光蛋白。在一个实施方式中，与融合于异源蛋白质、多肽或肽之前的原始多肽或蛋白质的活性相比，融合蛋白保持或提高了活性。在一个具体实施方式中，融合蛋白包含与异源蛋白质、多肽或肽融合的荧光探针，所述异源蛋白质、多肽或肽可以是特异性亚细胞定位信号。而本文所用术语中的“NADPH荧光探针”或“NADPH荧光探针蛋白”特指与荧光蛋白融合的对环境中NADPH敏感的多肽，所述对环境内NADPH敏感的多肽具体可以是T-Rex蛋白突变体或来源于其他嗜热菌和T-Rex蛋白有90%以上同源性的Rex蛋白突变体，其利用T-Rex蛋白突变体中专一性的NADPH结合结构Rossman结构域与NADPH结合后产生的构象变化引起的荧光蛋白的构象变化，进而导致荧光蛋白的荧光发生改变，并借助不同NADPH浓度下测定的荧光蛋白的荧光绘制标准曲线，进而检测并分析NADPH的存在和/或水平。

本文中所用术语“支架蛋白”是指具有配体亲和能力的蛋白，该蛋白可以和荧光蛋白融合形成该配体特异性的荧光探针。支架蛋白和配体结合后，通常有较大的构象变化，通过将荧光蛋白插入到构象变化较大的区域后，这种动态变化就可能传递到与之临近的荧光蛋白上，并导致荧光性质的变化。例如本发明中的“T-Rex蛋白突变体”就是一种支架蛋白，它可以和NADPH结合，并产生较大的构象变化。

在本发明中，与荧光团融合的Rex蛋白突变体可以是嗜热水生菌属T-Rex蛋白突变体的全长或其片段（SEQ ID NO30-54），优选是嗜热水生菌T-Rex蛋白突变体的DNA结构域截短体，即T-Rex蛋白突变体的氨基酸85-211（SEQ ID NO45-54）。

本文所用术语“生色团”，“荧光团”与“荧光蛋白”同义，指在激发光照射下发出荧光的蛋白质。荧光蛋白作为生物科学领域的基础检测手段，例如生物技术领域常用的绿色荧光蛋白GFP及由该蛋白突变衍生出的环状重排的蓝色荧光蛋白（cpBFP）、环状重排的绿色荧光蛋白（cpGFP）、环状重排的绿色荧光蛋白（cpTFP）、环状重排的黄色荧光蛋白（cpYFP）等；还有本技术领域常用的红色荧光蛋白RFP，及由该蛋白衍生出来的环状重排的蛋白，如cpmApple，cpmOrange，cpmKate等。

本文所用术语“GFP”指绿色荧光蛋白，最初是从维多利亚发光水母(Aequoreavictoria)中提取出来的，由238个氨基酸构成，分子量约为26kDa。GFP是由12条β-折叠链形成了独特的桶状结构，其内包裹着生色三肽（Ser65-Tyr66-Gly67）。当在氧气存在下，它会自发形成对-羟基苯亚甲基咪唑啉酮的生色团结构而产生荧光。GFP产生荧光不需要辅因子，而且荧光非常稳定，是一种良好的成像工具。GFP有两个激发峰，395nm的主峰可产生508nm的发射光，而肩峰475nm的激发光照射则会产生的503nm的发射光。

本文所用术语“RFP”指红色荧光蛋白，最初是从海洋中的珊瑚中提取的，野生的RFP是寡聚体蛋白不利于生物体的融合表达，随后在RFP的基础上进一步衍生出了不同颜色波段的红色荧光蛋白，其中最常用的是mcherry和mKate等。

本文所用术语“cpFP”指环状重排的荧光蛋白，该蛋白最早衍生自绿色荧光蛋白GFP，其氨基酸序列与GFP同源性高达90%以上。它是将GFP的原始N端和C端通过一段柔性的短肽链连接，而在野生型GFP近生色团位置（如Y144和N145位氨基酸）制造一个新的N端和C端，将原第145-238位氨基酸部分作为新蛋白的N端，原第1-144位氨基酸作为新蛋白的C端，两片段间通过5～9个具有柔性的短肽链，如VDGGSGGTG或GGSGG等连接，形成一个对空间变化敏感的环状排列黄色荧光蛋白cpGFP（SEQ ID NO7）。目前已经创造了多种环状重排的荧光蛋白（cpFP）用于荧光探针的构建，其中应用最广泛一种是cpYFP，其氨基酸序列为SEQ IDNO:6。

“接头”或“连接区”指在本发明多肽、蛋白质或核酸中连接两个部分的氨基酸或核苷酸序列。在本发明NADPH荧光探针内部的多肽或蛋白质中进行连接时，接头的长度不大于5个氨基酸，优选不大于4个氨基酸，更优选是1-3个氨基酸。而当重组荧光蛋白探针作为基本单元和功能蛋白连接时，可以融合在重组荧光蛋白探针的氨基酸或羧基端，优选为重组荧光蛋白探针的氨基端；接头序列为柔性氨基酸组成的短肽链的重复单元，如GGGGS，其数目不超过30个，优选为10-20个。

本文所用术语“截短”或“截短突变”指的是采用分子克隆的方法将编码荧光探针蛋白的部分氨基酸序列的核苷酸序列进行缩短或者删除的操作。截短可以直接将蛋白的一个结构域（例如Rex蛋白的DNA结构域）缩短或者删除，也可以是对蛋白内部的一些连接区域（例如Rex蛋白突变体和cpYFP连接部分的氨基酸寡肽）的氨基酸进行缩短或者删除。截短主要通过反向PCR的分子操作方法来实现，即通过一对特异性的引物与截短区域外的蛋白序列两端匹配，这样通过反向PCR扩增就可以产生删除某段核苷酸的线性化质粒，之后形成的重组 质粒编码产生的蛋白就不再含有特定的氨基酸。这种截短方法在荧光蛋白探针的构建中很常用，适用于探针的性质优化和改造。例如本技术中，将T-Rex蛋白突变体的DNA结合域截短形成的多肽（SEQ NO45-54）。

本文所用术语“游离的NADPH”或“细胞内游离的NADPH”指的是细胞内以游离形式存在的NADPH分子，它们的自由度比较高，可以很方便的参与到细胞内的多种生命反应，例如物质合成，硫氧还蛋白的还原等。游离的NADPH自发荧光比较弱，浓度相对细胞内NADPH总量很低，细胞内游离的NADPH作用很重要，但是浓度很低，使用常规的方法难以检测。

本文所用术语“蛋白结合的NADPH”或“细胞内蛋白结合的NADPH”是指细胞内与蛋白质结合的NADPH，它占了细胞内NADPH总量的绝大部分。它们相对于游离的NADPH自由度低且相对稳定，一般不参与到细胞代谢反应中。NADPH在结合蛋白后的自发荧光增强，因此通过自发荧光检测方法检测的一般都是蛋白结合的信号。

本文所用术语“荧光动态变化”或“荧光变化”或“荧光变化倍数”指的的是荧光蛋白探针在结合配体后的荧光强度的变化，这种荧光变化可以根据荧光蛋白探针的光谱性质分为单通道变化或者双通道变化。单通道荧光变化的探针如基于cpBFP，cpGFP，cpTFP，cpRFP的探针，当这些探针和配体结合，它们的发射光荧光强度会增加或者降低，而这种增加或者降低的倍数就可以称为“荧光变化”。如果荧光探针蛋白是基于cpYFP的就可能拥有两个激发峰，当这种探针和配体结合，它们的不同激发光下的发射光荧光强度都有可能会增加或者降低，而将双通道的荧光变化相除得到的比值变化，也称为“荧光变化”。荧光变化越大，说明这个探针的性质越优良，更有可能用于细胞内检测。

本文所用术语“实时检测”或“时空特异性的检测”指的是荧光蛋白探针可以对细胞内特定空间进行实时追踪。当含有特定定位信号的荧光蛋白探针的质粒导入到细胞中后，就可以在细胞的特定区域中表达并驻留。在荧光显微镜等观察手段下对细胞进行连续成像，将获得的图片转化为细胞内的配体信号，就可以对细胞内的检测物进行时空特异性的检测。

提到某多肽或蛋白时，本发明所用术语“变异体”，“突变体”或“衍生突变体”包括具有所述多肽或蛋白相同功能、但序列不同的变异体。这些变异体包括(但并不限于)：在所述多肽或蛋白的序列中缺失、插入和/或取代一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸，以及在其羧基末端和/或氨基末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸获得的序列。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变多肽或蛋白的功能。在本领域中，性能相似的氨基酸往往指具有相似侧链的氨基酸家族，在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。又比如，在氨基末端和/或羧基末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽或蛋白的功能。本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的多肽或蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的多肽或蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。多肽或蛋白的变异体可包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与所述多肽或蛋白的DNA杂交的DNA所编码的多肽或蛋白、以及利用抗所述多肽或蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。这些变异体还可包含与所述多肽或蛋白的序列相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的多肽或蛋白。

在两种或多种多肽或核酸分子序列中，术语“相同性”或“相同性百分数”指在比较窗口或指定区域上，采用本领域已知方法如序列比较算法，通过手工比对和目测检查来比较和比对最大对应性时，两个或多个序列或子序列相同或其中在指定区域有一定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同)。例如，适合测定序列相同性百分数和序列相似性百分数的优选算法是BLAST和BLAST2.0算法，分别可参见Altschul等(1977)Nucleic Acids Res.25:3389和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403。

本文所用术语“功能片段”、“衍生物”、“突变体”和“类似物”是指基本上保持与本发明理性突变产生的“T-Rex突变体”相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的理性突 变产生的“T-Rex突变体”的功能片段、衍生物、突变体或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些功能片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

所述类似物与理性突变产生的“T-Rex突变体”的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术得到。

所述类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的T-Rex蛋白并不限于上述列举的代表性蛋白、片段、衍生物和类似物。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

本发明所用术语“核酸”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白的编码区序列可以与SEQ ID NO:64-66,70-89所示的编码区序列相同或者是其简并变体。如本文所用，“简并变体”在本发明中是指编码本发明荧光融合蛋白，但与SEQ ID NO:64-66,70-89所示的编码区序列有差别的核酸序列。

提到核酸时，本文所用术语“变异体”可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括简并变异体、取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个核酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。本发明核酸可包含与所述核酸序列的序列相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、 至少约98%、至少约99%或100%的核苷酸序列。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)。

本发明荧光探针或融合蛋白的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离和纯化得到有关多肽或蛋白。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段、衍生物、类似物或变异体)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。可通过突变PCR或化学合成等方法将突变引入本发明蛋白序列中。

本文所用的术语“质粒”，“重组质粒”，“载体”和“重组载体”等可互换使用，指本领域熟知的原核或真核载体，例如细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体，这些载体能够在宿主体内复制和稳定，这些重组载体的一个重要特征是通常含有表达控制序列。本文所用术语“表达控制序列”指调控目的基因的转录、翻译和表达的可以与目的基因操作性连接的元件，可以是复制起点、启动子、标记基因或翻译控制元件，包括增强子、操纵子、终止子、核糖体结合位点等，表达控制序列的选择取决于所用的宿主细胞。在本发明中适用的重组载体包括但不限于细菌质粒。在重组表达载体中，“操作性连接”是指目的的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接。本领域的技术人员熟知能用于构建含本发明融合蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体的方法。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动 子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTR和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本领域普通技术人员将理解重组表达载体的设计可取决于如欲转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等因素。此外，重组表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

在一种实施方式中，将本发明荧光探针或融合蛋白的编码序列经BamHI和HindIII双酶切后与BamHI和HindIII双酶切的pRSETb载体连接，得到大肠杆菌重组表达载体。可以将本发明的表达载体转移到宿主细胞中，以产生包括融合蛋白的蛋白或肽。此种转移过程可用转化或转染等本领域技术人员熟知的常规技术进行。

本文在所用术语“宿主细胞”又称为受体细胞，是指能够接收和容纳重组DNA分子的细胞，是重组基因扩增的场所，理想的受体细胞应该满足易于获取和增殖两个条件。本发明的“宿主细胞”可包括原核细胞和真核细胞，具体包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

本发明的表达载体可用于在原核或真核细胞中表达本发明荧光探针或融合蛋白。从而，本发明涉及已导入本发明表达载体的宿主细胞、优选大肠杆菌。宿主细胞可为任何原核或真核细胞，代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母，植物细胞，果蝇S2或Sf9的昆虫细胞，CHO、COS、HEK293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等，其中包括但不限于上述的那些宿主细胞。所述宿主细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的一个实施方式中，选用大肠杆菌Mach1构建表达本发明融合蛋白的宿主细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本文所用术语“转化”和“转染”、“接合”和“转导”意指本领域内公知的各种将外源核酸(例如，线性DNA或RNA(例如，线性化载体或无载体的单独的基因构建体))或载体形式的核酸(例如，质粒、粘粒、噬菌体、噬粒、噬菌粒、转座子或其它DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-甘露聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移或电穿孔。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主细胞是真核细胞时，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

可以用适合所述宿主细胞表达的常规方法培养获得的转化细胞，表达本发明融合蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可以是各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离或纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在一个实施方式中，通过包含本发明融合蛋白编码序列的大肠杆菌发酵生产本发明荧光探针或融合蛋白，并通过超声破碎，亲和层析和凝胶层析纯化得到了纯形式的本发明荧光探针或融合蛋白。

本发明荧光探针或融合蛋白的用途包括但不限于：检测NADPH、在生理状态下检测NADPH、在亚细胞水平检测NADPH、原位检测NADPH、筛选药物、诊断与与NADPH水平有关的疾病等。

在本文中，浓度、含量、百分数和其它数值均可用范围的形式表示。也应理解，使用这种范围形式只是为了方便和简洁，应该被弹性地借读为包括范围上下限所明确提及的数值，还应包括该范围内包括的所有单个数值或子范围，就好像明确提及各个数值和子范围那样。

本发明的荧光探针是由环状变换的黄色荧光蛋白（cpYFP）插入到“Rex突变体”蛋白单体中构建而成的，而克服现有技术中关于NADPH探针是在peredox（Hung,Y.等，CellMetabolism.2011，V.14（4），pp.545-554）的基础上构建的，即在两个串联的完整Rex蛋白中间插入一种pH相对不敏感的环状变换的T-Sapphire荧光蛋白（cpTFP）。因此本发明的荧光蛋白探针分子量更小，而且探针在哺乳动物中成熟性很好，有利于细胞质膜，线粒体等亚细胞器的表达。结构模拟图见图1所示。

本发明克服了现有技术NADPH探针对于低浓度NADH有着较大的敏感性，且同时在NADH，ATP，ADP等其他类似物存在下，探针对于NADPH的Kd将会发生改变的劣势。细胞线粒体内的NADH浓度高达30μM左右，胞浆内的ATP高达4mM左右，因此本技术 克服了现有技术NADPH荧光探针在细胞内应用存在的问题。

有益技术效果：

本发明提供的基因编码的NADPH荧光探针及其制备方法和应用，该NADPH荧光探针可以在体内、体外、亚细胞或原位水平检测NADPH；探针特异性非常好，对于ATP等类似物没有响应，对于NADH等类似物也没有干扰。探针蛋白相对较小且易于成熟，其荧光动态变化大，是一种适合于生理水平和亚细胞特异性的实时检测NADPH的技术。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1本发明所述基因编码的NADPH荧光探针的基本构造。

图2SDS-PAGE鉴定从大肠杆菌(E.coli)中分离纯化的56-2（Grex），SS-AD，5-3-T。

图3为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸荧光探针56-2（Grex）的吸收光谱和荧光光谱特性。

图4为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸荧光探针5-3-T、SS-AD的荧光光谱特性。

图5为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸荧光探针56-2（Grex）在体外模拟的生理条件下对吡啶核苷酸类似物的响应。

图6为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸荧光探针56-2（Grex）通过pH对照探针SS-AD校正的pH滴定曲线

图7为在HEK293细胞中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸探针（Grex）的亚细胞器定位表达。

图8为还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸探针（Grex）实时测定外源NADPH加入对细胞内NADPH水平变化的影响。

图9为还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸探针（Grex）在高通量药物筛选的应用。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

I.实验材料和试剂

以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法和细胞培养以及成像方法等，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：简·罗斯凯姆斯等的《分子生 物学实验参考手册》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著,黄培堂等译：《分子克隆实验指南》（第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京）；费雷谢尼等的《动物细胞培养:基本技术指南》(第五版)，章静波，徐存拴等译；J.S.博尼费斯农，M.达索等的《精编细胞生物学实验指南》，章静波等译。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。

实施例中所用的基于pcDNA3.1的不同定位信号的质粒，pRSETb-cpYFP，pRSETb-T-Rex质粒由华东理工大学蛋白质实验室构建，pRSETb，pBad-myc-HisB，pDisplay，pcDNA3.1-flag，质粒载体购自Invitrogen公司，pE-sumo质粒购自lifesensor公司，pGEX-4T-1质粒来源于Amersham Bioscience公司。所有用于PCR的引物均由上海捷瑞生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由华大基因公司和杰李测序公司完成。各实施例所用的Taq DNA聚合酶购自东盛生物，pfu DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司，primeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司，三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和dNTP。BamHI、BglII、HindIII、NdeI、XhoI、EcoRI、SpeI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶（T4PNK）购自Fermentas公司，购买时附带有相对应的缓冲液等。NADH,NAD,NADP,NADPH,ATP,ADP等均购自Merck公司。除非特别声明，无机盐类等化学试剂均购自sigma-aldrich公司。HEPES盐，氨苄青霉素（Amp）和嘌呤霉素购自Ameresco公司；96孔检测黑板、384孔荧光检测黑板购自Grenier公司。

实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司（加拿大），普通质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，转染级别质粒小抽试剂盒购自OMEGA公司。克隆菌株Mach1购自Invitrogen公司。镍柱亲和层析柱和脱盐柱填料均来自GE healthcare公司。

实施例中所用的HEK293等细胞购自ATCC细胞保藏库，磷酸盐缓冲液（PBS），胰酶，澳洲特级胎牛血清，lipofectamine2000，DMEM培养基都是购自美国invitrogen公司，小干扰RNA（siRNA）由上海吉玛公司合成。

实施例中用到的主要仪器：Biotek Synergy2多功能酶标仪（美国Bio-Tek公司），X-15R高速冷冻离心机（美国Beckman公司），Microfuge22R台式高速冷冻离心机（美国Beckman公司），PCR扩增仪（德国Biometra公司），超声破碎仪（宁波新芝公司），核酸电泳仪（申能博彩公司），荧光分光光度计(美国Varian公司)，CO2恒温细胞培养箱（SANYO），倒置荧光显微镜（日本尼康公司），活体成像系统（美国Kodak公司），Aria II流式细胞仪（美国BD公司）。

II.实施例中用到的常规分子生物学方法和细胞实验方法

（一）聚合酶链式反应（PCR）：

1.目的片段扩增PCR：

该方法主要用于基因片段扩增和菌落PCR鉴定阳性克隆。

扩增步骤（bp表示扩增片段的核苷酸数量）：

2.长片段（>2500bp）扩增PCR：

本发明中使用的长片段扩增，主要是反向PCR扩增载体，在下述实施例中用于获得定点突变的一种技术。在变异部位设计反向PCR引物，其中一条引物的5’端包含变异的核苷酸序列。扩增后的产物就含有相应的突变位点。

扩增步骤（bp表示扩增片段的核苷酸数量）：

或者

（二）核酸内切酶酶切反应：

对质粒载体进行双酶切的体系（n代表使体系达到总体积所需要加入的灭菌超纯水μL量）：

（三）DNA片段5’端磷酸化反应

从微生物中抽提出的质粒或者基因组末端都含有磷酸基团，而PCR产物没有，故需对PCR产物的5’端碱基进行磷酸基团加成反应，只有末端含有磷酸基团DNA分子才能发生连接反应。

T4PNK为T4多聚核苷酸激酶的简写，用于对DNA分子的5’端磷酸基团的加成反应。

(四)目的片段和载体的连接反应

不同的片段和载体之间的连接方法有所差异，本发明中使用了三种连接方法

1.平末端短片段和线性化载体的平末端连接

该方法的原理是PCR获得的平末端产物在T4PNK作用下对DNA片段的5’末端进行磷酸化反应后，与线性化的载体在PEG4000和T4DNA连接酶的作用下连接获得重组质粒。

2.含有粘性末端的DNA片段和含有粘性末端载体片段的连接

通过限制性内切酶切割的DNA片段通常会产生突出的粘性末端，因此可以和含有序列互补的粘性末端载体片段连接，形成重组质粒。

注：PCR产物片段与载体双酶切产物的质量比大致在2:1—6:1之间。

3.反向PCR引入定点突变后5’端磷酸化的DNA片段产物自身环化的连接反应

将5’端磷酸化的DNA片段通过自身环化连接反应将线性化载体的3’端和5’端连接反应得到重组质粒。

（五）感受态细胞的制备与转化

感受态细胞的制备：

1.挑取单菌落(如Mach1)接种于5mL LB培养基中，37℃摇床过夜。

2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50mL LB培养基中，37℃，220rpm培养3至5h，直到OD600达到0.5。

3.冰浴预冷细胞2h。

4.4℃4000rpm离心10min。

5.弃上清，用5ml预冷的重悬缓冲液悬浮细胞，待均匀后再加入重悬缓冲液至终体积为50mL。

6.冰浴45min。

7.4℃4000rpm离心10min，用5mL冰预冷的储存缓冲液重悬细菌。

8.每个EP管中放100μL菌液，-80℃或液氮冻存。

重悬缓冲液:CaCl2(100mM)、MgCl2(70mM)、NaAc(40mM)

储存缓冲液:0.5mL DMSO、1.9mL80%甘油、1mL10×CaCl2(1M)、1mL10×MgCl2(700mM)、1mL10×NaAc(400mM)、4.6mL ddH2O

转化：

1.取100μl感受态细胞于冰浴上融化。

2.加入适当体积的连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30min。通常加入的连接产物的体 积少于感受态细胞体积的1/10。

3.将菌液放入42℃水浴中热激90秒，迅速转移至冰浴中放置5min。

4.加入500μl LB，于37℃恒温摇床上200转培养1h。

5.将菌液4000rpm离心3min，留200μl上清将菌体吹匀，均匀涂布于含适当抗生素的 琼脂平板表面，平板于37℃恒温培养箱内倒置过夜。

（六）蛋白质的表达，纯化和荧光检测

1.将pRSETb为基础的NADPH探针质粒到JM109(DE3)中，倒置培养过夜，从平板上挑取克隆到250ml锥形瓶中，置于37℃摇床，220rpm培养至OD=0.4～0.8，加入1/1000（v/v） 的IPTG（1M），18℃诱导表达24～36h。

2.诱导表达完成后，4000rpm，30min离心收菌，加入50mM的Tris-HCl缓冲液重悬菌体沉淀，超声破碎至菌体澄清。9600rpm，4℃离心20min。

3.离心上清通过自装的镍柱亲和层析柱纯化获得蛋白，镍柱亲和层析后的蛋白再通过自 装的脱盐柱获得溶解在100mM HEPES缓冲液(100mM HEPES，100mM NaCl，pH7.3)或者 磷酸盐缓冲液PBS中的蛋白。

4.纯化的rex突变蛋白经过SDS-PAGE鉴定后，使用测定缓冲液（100mM HEPES，100mM NaCl，pH7.3)或者磷酸盐缓冲液PBS稀释探针成终浓度为5～10μM的蛋白溶液。用测定缓 冲液(100mM HEPES，100mM NaCl，pH7.3)或者磷酸盐缓冲液PBS将吡啶核苷酸类似物NADH、NADPH分别配制成终浓度为100mM的储液。

取100μl5μM的蛋白溶液，37℃温育5min，分别加入NADH或NADPH混匀后至终 浓度为200μM，利用多功能荧光酶标仪测定蛋白在340nm下的光吸收。

5.纯化的探针蛋白鉴定后，使用测定缓冲液（100mM HEPES，100mM NaCl，pH7.3)或者磷酸盐缓冲液PBS稀释探针成终浓度为0.2μM或者5～10μM的蛋白溶液。用测定缓冲 液(100mM HEPES，100mM NaCl，pH7.3)或者磷酸盐缓冲液PBS将吡啶核苷酸类似物NAD⁺、NADH、ATP、ADP、NADP⁺及NADPH分别配制成终浓度为100mM的储液，在测定前配 置成为不同浓度梯度储液待用。

取100μl 0.2μM的荧光探针溶液，37℃温育5min，加入吡啶核苷酸类似物逐次滴定， 测定蛋白的485nm荧光激发后528nm发射的荧光强度。对样品的荧光激发、发射测定利用多 功能荧光酶标仪完成。

取100μl5～10μM的荧光探针溶液，37℃温育5min，加入吡啶核苷酸类似物，测定探针蛋白的吸收光谱和荧光光谱。对样品的吸收光谱和荧光光谱的测定是通过分光光度计和荧光分光光度计完成。

（七）哺乳动物细胞的转染和荧光检测

1.取对数生长期的细胞，吸出细胞培养板中的旧培养液，用磷酸盐缓冲液PBS洗涤细胞一次

2.加入0.5ml胰酶，37℃或者常温作用数分钟，于光学显微镜下进行观察，当细胞呈现圆粒状将要离壁时，就可以终止消化。

3.加入无抗生素的含有胎牛血清的培养基，轻拍培养板使细胞脱落，用吸管轻轻吹匀打散细胞团，将单细胞悬液铺板到24孔培养板或者35毫米玻璃底培养板。

4.约12小时候转染，使用lipofectamine2000将合适量的质粒或者siRNA转染到细胞中，4-6小时候更换培养基。

5.显微镜荧光成像：将转染后的细胞培养基移除，加入含有10mM葡萄糖的磷酸盐缓冲液PBS，将样品置于倒置荧光显微镜载物台上，选择好合适的条件进行拍照。

6.酶标仪荧光检测：消化细胞后铺板到96孔黑底的荧光检测板，加入检测药物或试剂，放入酶标仪进行荧光检测。

（八）哺乳动物细胞的稳定转染和药物筛选

1.通过100-200μg/ml的Hygromycin B筛选，瞬时转染了NADPH探针的细胞，大约2周左右筛选出阳性的克隆后，通过流式细胞仪分选即可获得含有NADPH荧光探针的稳定细胞株；

2.将HELA或者H1299癌细胞以密度30-50%铺板到384孔透明底板中，待细胞贴壁后，使用高通量加样站加入2～4个浓度梯度的药物

3.24～48小时后，细胞计数得出细胞死亡率，并将这些阳性药物挑选出来，进行NADPH稳定细胞株的检测

4.按照（八）的方法，检测获得的阳性药物，并分析它们对细胞内NADPH的影响。

实施例1.利用CPASS程序对Rex蛋白进行理性设计

我们使用CPASS程序对343个NAD(H)结合蛋白和211个NADP(H)结合蛋白（如表1）的配体结合域进行序列非依赖型的比对，特别是对NAD(P)(H)的腺苷部分和2’-氧原子的结合口袋部分进行单独分析，结果得出了Rex蛋白的90-91位,112-116位，130位， 148位是控制NAD(P)H结合的关键位点。通过计算机模拟，经过分析得出的结果认为112-114位突变（T/S112，R113，T/S/K114)和115-116位突变(P/A115&Q116，G/A/P115&E116)可能对提高Rex蛋白对于NADPH的亲和力，降低对于NADH的亲和力；而V/T/Y130和V/A/T148可能会进一步提高探针的选择性。另外T-Rex蛋白的晶体结构显示，R90D的突变将会降低蛋白质对于NADH的亲和，而L91K/R会消除T-Rex蛋白对NADH及其类似物的亲和能力，因此这两个位点也将是改造T-Rex蛋白亲和力的关键位点。

表1利用CPASS程序进行比对的NADH结合蛋白

表2利用CPASS程序进行比对的NADP(H)结合蛋白

实施例2：pRSETb-T-Rex理性突变质粒的构建和检测

我们在华东理工大学蛋白质技术实验室之前构建好的pRSETb-Trex的基础上(Zhao,Y.等，Cell Metabolism.2011,V.14(4),pp.555-566)，通过反向PCR扩增线性化载体，T4PNK加磷后载体自连，引入上述位点的突变。使用通用引物T7正向测序，其中部分T-Rex蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO30-44所示。

所用引物为：

P1：SRK(112-114)-rv：CTTGCGGCTGAAGAAGCCCCGCAGCTCGAAG

P2：SRT(112-114)-rv：GGTGCGGCTGAAGAAGCCCCGCAGCTCGAAG

P3：SRS(112-114)-rv：GCTGCGGCTGAAGAAGCCCCGCAGCTCGAAG

P4：TRK(112-114)-rv：CTTGCGGGTGAAGAAGCCCCGCAGCTCGAAG

P5：TRT(112-114)-rv：GGTGCGGGTGAAGAAGCCCCGCAGCTCGAAG

P6：TRS(112-114)-rv：GCTGCGGGTGAAGAAGCCCCGCAGCTCGAAG

P7：PE(115-116)-fw：CCCGAGAAGGTGGGCCGGCCCGTGC

P8：GE(115-116)-fw：GGCGAGAAGGTGGGCCGGCCCGTGC

P9：AE(115-116)-fw：GCCGAGAAGGTGGGCCGGCCCGTGC

P10：PQ(115-116)-fw：CCCCAGAAGGTGGGCCGGCCCGTGC

P11：AQ(115-116)-fw：GCCCAGAAGGTGGGCCGGCCCGTGC

经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达，并纯化蛋白质。利用酶标仪检测蛋白质在340nm下的光吸收，确定T-Rex突变蛋白是否有NADPH结合能力。结果如表3所示，结果显示：

检测结果显示S112的突变比T112更能降低Rex蛋白对NADH的亲和力，而K114，T114，S114则不太影响Rex蛋白对NADH和NADPH的亲和力。随后挑取了两种S112和T112突变体“SRKPE”和“TRSAE”进行90位，91位，130和148位突变的检测，查看这两个位点突变对Rex的配体亲和力的影响。

用于产生112位和114位氨基酸定点突变的引物如下：

P12：D112S,V113,D114S-rv：CTTCTTCAGCGTCAGCCCCGAG

P7：PE(115-116)-fw：CCCGAGAAGGTGGGCCGGCCCGTGC

用于产生90位和91位氨基酸定点突变的引物如下：

P13：L91-fw：CTGGGCAGCGCCCTGGCCGAC

P14：L91R-fw：CGGGGCAGCGCCCTGGCCGAC

P15：R90-rv：CCGGCCCATGCCCACGATGC

P16：R90D-rv：GTCGCCCATGCCCACGATGC

用于产生130位氨基酸定点突变的引物如下：

P17：V130-rv：GATCACGCCGCCCCGCACGGGCCGG

P18：V130T-fw：GAGCACACCGATCTGCTGCCCCAGC

P19：V130Y-fw：GAGCACTACGATCTGCTGCCCCAGC

用于产生148位氨基酸定点突变的引物如下：

P20：V148-rv：GATCTCGATCCGGCCGGGCACCCGC

P21：V148A-fw：GCCCTGCTGACCGCCCCCCGGGAGG

P22：V148T-fw：GCCCTGCTGACCACCCCCCGGGAGG

P23：测序引物T7promoter-fw：TAATACGACTCACTATAGGG

经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达，并纯化蛋白质。利用酶标仪检测蛋白质在340nm下的光吸收，确定T-Rex突变蛋白是否有NADPH结合能力。结果如表3所示，结果显示：

130位和148位都会对NADPH和NADH的结合的产生影响，其中选择的两种突变体（“SRKPE”和“TRSAE”）在T130和Y130存在下对NAD(P)H的Kd都会略微增大，因此130位会对NAD(P)H的结合起到微调作用。选择的两种突变体（“SRKPE”和“TRSAE”） 在A148和T148下对NADPH的Kd增大将近1个数量级，而NADH的Kd也提高了2～5倍，这说明148位对NAD(P)H的结合起到重要作用。

从表XX中可以明显的看到，R90D可以显著降低Rex蛋白突变体对于NADPH及其类似物的亲和力，大约一个数量级。而L91R/K突变则基本上消除了突变体对于较低浓度的NADPH及其类似物的响应，亲和力下降大约1～2个数量级。而在Rex蛋白上进行突变（D112S和D114S）则可以降低NADH的亲和力，同时提高了NADPH的亲和力，如果再加上R90D和V148A的突变可以消除其对于NADPH及其类似物的亲和力。如果在M49的基础上，引入R90D和L91K/R也同样可以消除其对于NADPH及其类似物的亲和力。因此M51，M54，M55可以作为对照探针的基础用于构建探针。

另外，由于Rex蛋白是一种广泛存在于革兰氏阳性菌的调控氧化还原势的转录调控因子，其中来源于嗜热水生菌的转录调控因子T-Rex蛋白（SEQ ID NO2）与很多其他嗜热菌的Rex蛋白的突变体同源性很高（高达90%以上）。例如来源于Thermus oshimai JL-2的Rex蛋白与T-Rex蛋白同源性高达99%（SEQ ID NO3），来源于Marinithermushydrothermalis DSM14884的Rex蛋白与T-Rex蛋白同源性高达同源性99%（SEQ ID NO4），来源于Deinococcus proteolyticus MRP的Rex蛋白与T-Rex蛋白同源性高达98%（SEQ IDNO5）等。而且它们相应于T-Rex蛋白的90-91位,112-116位,130位,148位和T-Rex蛋白氨基酸完全相同或者性质相似，因此我们认为这种和T-Rex高度同源的Rex蛋白家族都可以用于NADPH多肽的理性改造。

实施例3：pRSETb-M10-cpYFP荧光探针不同插入位点的质粒构建和检测

T-Rex突变体具有Rex蛋白家族的结构特点，即由NADH结合域以及DNA结合域组成。而T-Rex突变体所选择的位置均在蛋白表面或者二级结构连接的松散区域等，这些位置对蛋 白的晶体结构几乎没有影响，因此选择一个T-Rex突变体进行插入位点的测试，结果也同样可以应用到其他T-Rex突变体上。

本实施例中，我们以T-Rex突变体M10（SRKPQ）(Seq ID NO32)为基础质粒根据Rex晶体结构选择了79/80，99/100，112/113，112/114，166-167，187/188，188/189，189/190，187/189，187/190，188/190位的位点插入cpYFP，其中插入位点112/113，112/114，188/189，189/190的氨基酸序列如SEQ ID NO：55-58所示。

利用PCR产生cpYFP的DNA片段，对该DNA片段使用5’末端的加磷操作后灭活，同时通过反向PCR扩增产生含有不同断裂位点的pRSETb-Trex线性化载体，将线性化的pRSETb-Trex和5’末端磷酸化的cpYFP片段在PEG4000和T4DNA ligase的作用下连接产生重组质粒，将这些平板在Kodak多功能活体成像系统，挑取在FITC通道激发下有黄色荧光的克隆，由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司完成测序。

反向扩增产生线性化载体所用引物如下：

P24:79-rv:CCGGTTCAGGCCCAGGATGTGCCG

P25:80-fw:AAGTGGGGCCTGTGCATCGTGGGC

P26:99-rvGGGGTAGTCGGCCAGGGCGCTGCC

P27:100-fw:GGCTTCGGCGAGAGCTTCGAGCTG

P28:166-rv：CTTGATGCCGGCGGCCACCAGCAG

P29:167-fw：GGCATCCTGAACTTCGCACCGGTG

产生112-114断裂位点

P30:112-rv：GTCGAAGAAGCCCCGCAGCTCG

P31：113-rv：GACGTCGAAGAAGCCCCGCAGC

P32：113-fw：GTCGACCCCGAGAAGGTGGGCC

P33：114-fw：GACCCCGAGAAGGTGGGCCGG

产生187-190断裂位点

P34：187-rv:CACGTTCTCCACGGCCACCTCC

P35：188-rv:GTCCACGTTCTCCACGGCCACCTCC

P36：189-rv:GAAGTCCACGTTCTCCACGGCCACCTC

P37：188-fw:GACTTCCTGGCCGGCCTGACC

P38：189-fw:TTCCTGGCCGGCCTGACCCGG

P39：190-fw:CTGGCCGGCCTGACCCGGCTG

扩增产生cpYFP的DNA片段引物为：

P40：cpYFP-fw：TACAACAGCGACAACGTCTATATC

P41：cpYFP-rv：GTTGTACTCCAGCTTGTGCCC

经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达，并纯化蛋白质，检测它们对于NADPH的响应。结果如下：

说明：+表征荧光强度，+越多荧光越强。

检测结果显示189/190的插入位点对NADPH探针的荧光动态变化最大，这个被我们用于后续的进一步优化实验；而112/113的荧光比较强，也有一定的生物学用途，例如在难表达的细胞中应用。

实施例4：pRSETb-M10（189/190）-cpYFP荧光探针质粒的连接区优化和检测

因为Rex突变蛋白和cpYFP之间的连接区氨基酸数目和柔性直接关系到荧光探针对NADPH响应导致的荧光变化，因此需要进一步对两者之间的连接区进行优化。我们以pRSETb-M10（189/190）-cpYFP为基础质粒，进行cpYFP和Trex蛋白突变体M10连接区的氨基酸数目和氨基酸种类进行优化。

首先通过简并密码子的设计方法，设计PCR引物，一般认为柔性氨基酸包括A,G,T,S，它们的密码子合并之后是1位TAG,2位G/C，3位ATGC均可，考虑到密码子偏爱性以及避免终止密码子的出现，第3位选择C，最终简并密码子为“DSC”。扩增产生含有不同数目和性质的连接区的cpYFP片段，然后插入到M10的189/190位点，采用实施例3的方法，平末端加磷连接转化的方法构建出链接区优化的荧光探针。部分不同连接区氨基酸长度的荧光探针氨基酸序列如SEQ ID NO59-63所示。

使用的引物如下所示：

P42：Linker-5个AA-fw：DSCDSCDSCDSCDSCTACAACAGCGACAACGTCTATATCA

P43：Linker-5个AA-rv：GSHGSHGSHGSHGSHGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGG

P44：Linker-4个AA-fw：DSCDSCDSCDSCTACAACAGCGACAACGTCTATATCA

P45：Linker-4个AA-rv：GSHGSHGSHGSHGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGG

P46：Linker-3个AA-fw：DSCDSCDSCTACAACAGCGACAACGTCTATATCA

P47：Linker-3个AA-rv：GSHGSHGSHGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGG

P48：Linker-2个AA-fw：DSCDSCTACAACAGCGACAACGTCTATATCA

P49：Linker-2个AA-rv：GSHGSHGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGG

P50：Linker-1个AA-fw：DSCTACAACAGCGACAACGTCTATATCA

P51：Linker-1个AA-fw：GSHGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGG

经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达，并纯化蛋白质，检测它们对于NADPH的响应。结果如下：

检测结果显示氨基端（N端）和羧基端（C端）连接区氨基酸个数在0-5个范围内都可以使用，其中N端氨基酸为3个，C端为1个的时候，探针对NADPH的荧光响应最大。进一步对linker区的氨基酸性质进行研究，结果发现所有荧光探针都对NADPH有响应，其中变化倍数在6倍以上的探针linker区序列如下所示：

检测结果显示，连接区的氨基酸位AGTS对探针的性质影响不大,例如N端氨基酸为SAG，C端氨基酸位A（SEQ ID NO63）)，但是当N端氨基酸为SAG，C端为G的时候，探针对NADPH的荧光动态变化最大，因此它是最优选的连接区氨基酸（SEQ ID NO63）。

实施例5pRSETb-M10-cpYFP以及其他荧光探针质粒的截短

在确定最优选的插入位点和连接区长度以及氨基酸序列后，我们又随机挑选了两个突变体（M11，M14）构建了2个质粒M11-cpYFP-189/190，M14-cpYFP-189/190。考虑到Rex突变蛋白含有两个结构域DNA结合域和NADPH结合功能域，而DNA结合域的存在可能会影响探针在细胞内的表达，因此我们挑选了采用实施例3的方法对连接区优化的探针进行DNA结合域的截短（探针使用的Rex突变体分别为M10，M11，M14，其氨基酸序列SEQ ID NO：67-69），所用引物如下：

P52：Trex-去除DNA domain-fw：ATGAACCGGAAGTGGGGCCTG

P53：Trex-去除DNA domain-rv：CGGATCCTTATCGTCATCGTCGTAC

经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达，并纯化蛋白质，检测探针对于NADPH的响应。结果如下：

结果显示，截短了DNA结合域的探针相对于原始探针显示出略大的荧光动态变化和更强的荧光强度，而对NADPH的亲和力略有改变，这说明DNA结合域的存在可能会对蛋白的折叠产生一定的影响，而对蛋白和配体的结合，荧光蛋白的构象变化则几乎没有影响。截短后的荧光探针性能更加优良，而且氨基酸数目减少了约80个，蛋白大小因此少了近8kDa，更加适合于哺乳动物细胞表达和亚细胞器定位。

实施例6：其他对NADPH敏感的Rex突变体的荧光探针质粒的构建和检测

由于在Rex突变体（112-116为SRKPQ）中插入cpYFP后构建产生的荧光探针对NADPH有响应，因此我们进一步对其他突变体进行类似的构建。根据实施例3-5的结果，插入位点为189/190，N端氨基酸为SAG，C端氨基酸为G，且DNA结合域去除后具有最好的NADPH响应效果。

PCR产生N端氨基酸为SAG，C端氨基酸位G的cpYFP所用引物：

P54：cpYFP-N-SAG-fw：TCTGCAGGCTACAACAGCGACAACGTC

P55：cpYFP-C-G-rv：ACCGTTGTACTCCAGCTTGTGCCC

按照以上结果，进行质粒构建，经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达，并纯化蛋白质，检测探针对于NADPH的响应。部分处于最佳条件下荧光探针的氨基酸序列如SEQ ID NO：90-109所示，类似的优选的NADPH荧光探针对应的部分截短了DNA结构域的T-Rex突变体氨基酸序列如SEQ ID NO:45-54。

基于M1-M30构建的荧光探针及其性质

结果显示，基于M1-M30的突变体构建的荧光探针都可以用于NADPH的测量，但是基于M1-M3以及M16-M30的突变体构建的荧光探针对NADH的亲和力较强，在细胞内检测可能存在干扰，因此M4-M15更具有优化潜力，随后在M4-M15的突变体上进行130位进行突变，由于148位，90位以及91位的突变产生的亲和力增大的效果非常明显，因此我们就从中挑选了性能最为优良的候选探针56-2用于验证（并称之为Green rex,Grex），另外M51，M54，M55也可以作为对照质粒用于NADPH荧光探针的pH校正。按照以上结果，进行质粒构建，经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达，并纯化蛋白质，检测探针对于NADPH的响应。结果如下：

在Rex突变体上引入130突变后，探针对于NADPH的影响和原始蛋白存在一些差异，这可能是cpYFP的插入导致的。但是我们发现几乎所有的这些突变体对NADPH都有很好的响应，可以用于NADPH的检测。而148位，90位,91位的突变，产生的效果和野生型一致，V148A/T可以导致探针对NADPH的亲和力上升3～5倍，而R90D的突变则直接可以上升了一个数量级，91位的突变近乎消除了探针对NADPH的响应，因此通过以上结果，这些突变在M1-M30的其他衍生探针上都可用。最后我们还发现5-1-Y，5-3-T探针的荧光变化很大，而且Kd可能比较适合不同线粒体的检测，而SS-AD和56-2-DR是非常良好的对照质粒，可以用于pH的校正。

实施例7：NADPH探针的体外荧光性质检测

将纯化制备的荧光探针56-2（Grex），5-3-T和SS-AD进行蛋白定量后SDS-PAGE鉴定纯度（如图2），蛋白只在约50kDa（千道尔顿）处有一条蛋白条带，为目的蛋白蛋白，图2中M为蛋白标准标记物。

将荧光探针56-2，5-3-T和SS-AD溶解于测定缓冲液(100mM HEPES，100mM NaCl，pH7.3)中配制成终浓度为5μM的荧光探针溶液。用测定缓冲液将吡啶核苷酸类似物NAD⁺、NADH、ATP、ADP、NADP⁺及NADPH分别配制成终浓度为100mM的储液，在测定前配置成为不同浓度梯度储液待用。利用多功能荧光酶标仪测定吸收光谱(图3A)，荧光分光光度计测定激发和发射光谱(图3B)。

荧光光谱特性测定的实验结果表明，56-2蛋白具有两个激发峰，分别为420nm和490nm，其中后者的振幅强度约为前者的五倍。而56-2蛋白仅有一个发射峰为521nm。5-3-T蛋白具有两个激发峰分别为420nm和490nm，其中后者的振幅强度约是前者的四倍，而5-3-T蛋白仅有一个发射峰为521nm(图4A)。SS-AD蛋白具有两个激发峰分别为420nm和490nm，其中后者的振幅强度约是前者的两倍，而SS-AD蛋白仅有一个发射峰为521nm(图4B)。

取100μl0.2μM的荧光探针溶液，37℃温育5min，按照表格的浓度进行逐次滴定，测定蛋白的485nm荧光激发后528nm发射的荧光强度。对样品的荧光激发、发射测定利用多功能荧光酶标仪完成。

测定结果显示，NADPH荧光探针在各种NADPH类似物的生理浓度下，仅对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)有明显响应，而对于其他吡啶类核苷酸并无明显响应(如图5)。另外，NADPH荧光探针存在对pH的敏感性，而NADPH荧光探针突变体SS-AD对于NADPH等都非常不敏感，因此可以使用SS-AD探针校正NADPH荧光探针56-2的pH敏感性（如图6）。

实施例8：不同颜色的荧光探针的构建和检测

以实施例6产生的突变质粒56-2(Grex)为模板，将cpYFP依次替换成为cpGFP，cpBFP，cpTFP，cpOrange，cpmApple和cpmKate，获得了不同颜色的NADPH探针，采用和实施例3类似的方法，进行质粒构建，获得了不同颜色的荧光探针。部分探针的氨基酸如SEQ IDNO110-115所示。

用于扩增产生cpGFP和cpBFP的引物

P56：cpGFP-fw：TCTGCAGGCTACAACAGCGACAACGTC

P57：cpGFP-rv：ACCGTTGTACTCCAGCTTGTGCCC

用于扩增产生cpTFP的引物

cpTFP-fw：P58：TCTGCAGGCTACAACAGCGACAACG

cpTFP-rv：P59：ACCGTTGTACTCCAGCTTGTGCCC

用于扩增产生cpOrange和cpmApple的引物

cpmApple-fw：P60：TCTGCAGGCGTTTCCGAGCGGATGTAC

cpmApple-rv：P61：ACCAGCCTCCCAGCCCATGGTCTTC

用于扩增产生cpmKate的引物

P62：cpmKate-fw：TCTGCAGGCATGGGCGGCCGCTCCAAG

P63：cpmKate-rv：ACCTTTCTTGGATCTGTATGTGG

经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达，并纯化蛋白质，检测探针对于NADPH的响应。

基于56-2的荧光探针的性质

基于5-1-Y的荧光探针性质

结果显示，将56-2和5-1-Y荧光探针的荧光蛋白cpYFP替换为其他颜色荧光蛋白之后，探针仍然对NADPH存在响应，虽然探针的最大响应倍数有所下降，但是它们对NADPH的亲和力并没有太大的改变，因此它们可进一步优化用于NADPH多色成像，这些不同颜色的检测工具将会深化对NADPH的研究。

实施例9：荧光探针和其他蛋白的融合和应用

以实施例6产生的突变质粒56-2(Grex)为所选的荧光探针，将其直接酶切亚克隆到含有不同蛋白纯化标签和蛋白免疫印迹标签的质粒上，经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达，使用菌体破碎上清，检测探针对于NADPH的响应。其中pcDNA3.1-flag在细胞中表达，检测方法和重组菌相似。

结果显示，所有的测试蛋白标签和NADPH荧光探针融合都不影响其性质，而GST和sumo 标签因为本身存在分子伴侣的功能，融合蛋白的荧光甚至比原始探针的荧光还强，这使得探针可以在不同的表达系统和蛋白检测系统中使用。

以实施例6产生的突变质粒56-2(Grex)为所选的荧光探针，使用不同长度的柔性连接区重复单元GGGGS，将其和其他颜色的荧光蛋白融合，经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达并纯化蛋白质，检测探针对于NADPH的响应。PCR产生不同片段所用的引物为：

PCR产生氨基端mcherry和BFP片段：

P64：mcherry-BamHI-fw：GACGGATCCGATGGTGAGCAAGGGCGA

P65：mcherry-SpeI-rv：GACACTAGTCTTGTACAGCTCGTCCA

PCR产生氨基端mKate片段：

P66：mKate-BamHI-fw：GACGGATCCGATGAGCGAGCTGATCAC

P67：mKate-SpeI-rv：GACACTAGTATTAAGCTTGTGCCCCAG

PCR产生氨基端Grex片段

P68：Grex-BamHI-fw：GACGGATCCGATGAACCGGAAGTGGGGC

P69：Grex-SpeI-rv：GACACTAGTGCCCATCATCTCCTCCCG

PCR产生羧基端mcherry和BFP片段：

P70：mcherry-KpnI-fw：GACGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGA

P71：mcherry-HindIII-rv：GACAAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCA

PCR产生羧基端mKate片段：

P72：mKate-KpnI-fw：GACGGATCCATGAGCGAGCTGATCAC

P73：mKate-HindIII-rv：GACAAGCTTATTAAGCTTGTGCCCCAG

PCR产生羧基端Grex片段

P74：Grex-KpnI-fw：GACGGATCCATGAACCGGAAGTGGGGC

P75：Grex-HindIII-rv：GACAAGCTTGCCCATCATCTCCTCCCG

双引物退火产生不同长度linker所用的引物：

P76：Linker-10个氨基酸-SpeI-fw：GTACCTCTGGCGGTGGAGGCAGTGA

P77：Linker-10个氨基酸-KpnI-rv：CTAGTCACTGCCTCCACCGCCAGAG

P78：Linker-20个氨基酸-SpeI-fw：

GTACCTCTGGCGGTGGAGGCAGTGGTGGCGGAGGCTCTGGAGGTGGCGGTAGTA

P79：Linker-20个氨基酸-KpnI-rv：

CTAGTACTACCGCCACCTCCAGAGCCTCCGCCACCACTGCCTCCACCGCCAGAG

P80：Linker-30个氨基酸-SpeI-fw：

GTACCTCTGGTGGAGGTGGCAGTGGTGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTAGTGGCGGAGGCGGTAGTGGCGGTGGCGGATCTA

P81：Linker-30个氨基酸-KpnI-rv：

CTAGTAGATCCGCCACCGCCACTACCGCCTCCGCCACTACCTCCGCCTCCAGATCCACCGCCACCACTGCCACCTCCACCAGAG

结果显示，在蛋白探针的氨基端或者羧基端融合红色荧光蛋白mcherry都不会明显影响探针的荧光性质以及对配体的亲和能力。柔性的连接区的氨基酸数目在20个时，探针的荧光性质和原始探针改变最小，这个结论在BFP和mKate上也成立。其中部分荧光探针融合蛋白的氨基酸序列如SEQ NO ID116-118所示。

以实施例6产生的突变质粒56-2(Grex)为所选的荧光探针，将它和NADPH产生酶按照和荧光蛋白类似的方法融合表达，经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达并纯化蛋白质，检测探针对于NADPH的响应。其中部分荧光探针融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO119-120所示。

PCR扩增产生不同酶所用的引物为：

P82：G6PD-BamHI-fw：GACGGATCCGATGGGCCGGCGGGGCTCAG

P83：G6PD-SpeI-rv：GACACTAGTGAGCTTGTGGGGGTTCAC

P84：IDH1-BamHI-fw：GACGGATCCGATGTCCAAAAAAATCAG

P85：IDH1-SpeI-rv：GACACTAGTAAGTTTGGCCTGAGCT

P86：IDH2-BamHI-fw：GACGGATCCGATGGCCGGCTACCTGCG

P87：IDH2-SpeI-rv：GACACTAGTCTGCCTGCCCAGGGCTC

P88：ME1-BamHI-fw：GACGGATCCGATGGAGCCCGAAGCCCC

P89：ME1-SpeI-rv：GACACTAGTCTGGTCAACTTTGGTC

P90：NNT-BamHI-fw：GACGGATCCGATGGCAAACCTATTGAA

P91：NNT-SpeI-rv：GACACTAGTCTTCTGATAGGATTCTC

P92：GRX1-BamHI-fw：GACGGATCCGATGGCTCAAGAGTTTGTG

P93：GRX1-SpeI-rv：GACACTAGTCTGCAGAGCTCCAATCTG

结果显示，在NADPH探针的N端融合NADPH的产生酶不会明显影响探针的荧光性质以及对配体的亲和能力，柔性的连接区的氨基酸数目在20个时，探针的荧光性质变化最小，构建完成的探针可用于检测酶底物的浓度。

实施例10：NADPH荧光探针在不同亚细胞器内定位表达

以实施例6产生的突变质粒56-2(Grex)为所选的荧光探针，以pRSETb-56-2为模板，通过双酶切或者PCR的方法获得还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸荧光探针基因(56-2)，酶切产物片段回收后分别连接到pcDNA3.1-Hygro-Cyto&Nuc、pcDNA3.1-Hygro-tdNES-Cyto、pcDNA3.1-Hygro-Mito、pcDNA3.1-Hygro-Nuc、pcDNA3.1-Hygro-Mem、pcDNA3.1-Hygro-pero、pcDNA3.1-Hygro-ER、pcDNA3.1-Hygro-golgi、pcDNA3.1-Hygro-IMS，pDisplay载体上。各种不同定位的信号肽氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:23-30所示。利用所得的重组质粒转染HEK293细胞，用倒置荧光显微镜观察转染后的细胞，两组激发光波长分别为405nm和488nm，发射光波长为500-550nm。

实验结果表明，Grex-Cyto&Nuc在HEK293细胞中高效、准确定位于细胞浆和细胞核中(图7A)；Grex-Cyto（tdNES）在HEK293细胞中高效、准确定位于细胞浆中(图7B)；Grex-Mito在HEK293细胞中高效、准确定位于线粒体中(图7C)；Grex-Nuc在HEK293细胞中高效、准确定位于细胞核中(图7D)；Grex-Mem在HEK293细胞中高效、准确定位于细胞内膜上(图7E)；pDisplay-Grex在HEK293细胞中高效、准确定位于细胞外膜上(图7F)；Grex-IMS在HEK293细胞中高效、准确定位于细胞线粒体膜周质中(图7G)Grex-pero在HEK293细胞中高效、准确定位于细胞过氧化物酶体中(图7H)；Grex-ER在HEK293细胞中高效、准确定位于细胞内质网中(图7H)；Grex-golgi在HEK293细胞中高效、准确定位于细胞高尔基体中(图7I)；

实施例11：用Grex荧光探针实时测定NADPH跨膜进入细胞

按照实施例8的方法在HEK293细胞胞浆内表达还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸荧光探针，在培养基中外加NADPH的实验结果显示该系列探针能够实时地检测外源NADPH对细胞内NADPH水平的影响(图8-1A)，当在细胞培养基中外加NADPH时，用多功能荧光酶标仪观察转染后的细胞，结果显示，探针的420nm和485nm光激发下的发射荧光比例相对于对照组增强了约50%，证明NADPH可以跨膜进入细胞导致细胞内NADPH水平立即增加；同时该图显示还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸荧光探针不受NADPH类似物NAD⁺、NADH和NADP+等影响。对照实验组(图8-1B)，SS-AD亦不受外加NADPH及其类似物的影响，由此可排除pH对探针产生的影响。我们进一步利用该系列探针检测外加NADPH对其他细胞器内NADPH水平的影响，结果显示外加NADPH没有检测到线粒体中的NADPH水平的变化，图8-1C显示线粒体内结果，pH对照和NADPH探针均没有响应。综上结果表明烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸荧光探针可以很好指示出NADPH跨膜进入哺乳动物细胞内并导致胞浆内NADPH水平增加。

实施例12：基于Grex荧光探针的高通量药物筛选

NADPH是维持细胞内的氧化还原势的关键分子，又是细胞内还原性物质合成的推动力，而且还是细胞内的去毒反应的辅因子。众所周知，癌细胞比正常细胞有更强的抗药性，更快的生物质合成速率以及拮抗凋亡的能力等，而这些都和NADPH息息相关，因此可以使用稳定转染Grex探针的细胞筛选和NADPH相关的抗癌药物。

以小分子抑制剂化合物库为例，我们发现了200种化合物在一定剂量范围内，能有效杀死肿瘤细胞，却对正常细胞没有毒害，因此具有被开发成抗肿瘤药物的潜力。

我们随后将表达Grex的稳定细胞株添加到黑底的384孔板中，并与筛选出来的200种具有一定抗癌效果的药物混合，利用多功能酶标仪测定2小时内的荧光变化。最终发现了3种能够提高细胞内NADPH水平的药物(图9A)，10多种能够降低细胞内NADPH水平的药物（图9B）。

本领域技术人员通过阅读本说明书获知不背离本发明的构思和范围的各种改进。因此，这些其他实施方式也应包括在所附权利要求书的范围内。

Claims (8)

1.基因编码的NADPH荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为：如SEQ ID NO：67-69,90-109，115-120所示氨基酸序列。

2.一种SEQ ID NO：64-66,70-89所示编码SEQ ID NO：67-69,90-109荧光探针的核苷酸序列。

3.一种制备权利要求1所述荧光探针的方法，包括以下步骤：

1)将含有权利要求2所述核苷酸序列的表达载体转移到宿主细胞中，

2)在所述宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，和

3)由所述宿主细胞分离所述荧光探针。

4.一种如SEQ ID NO：55-58所示的融合蛋白。

5.一种表达载体，所述的表达载体由载体质粒与权利要求2中所述的核酸序列操作性连接得到的，表达载体可选自原核表达载体、真核表达载体和病毒载体。

6.一种包含权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。

7.权利要求1所述的荧光探针在药物筛选中的应用。

8.一种用于检测NADPH、筛选药物的试剂盒，所述的试剂盒包含说明书和权利要求1所述的荧光探针。