CN117946221A - 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针。具体地,本发明提供一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针,其包含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽和光学活性多肽,其中,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的序列内。本发明的荧光探针荧光动态变化大,特异性好,可在细胞内外高通量、定量检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
Description
技术领域
本发明涉及光学探针技术领域,尤其涉及一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针及其制备方法和应用。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)是氧化还原反应中所需的辅酶,参与糖酵解、脂肪酸β-氧化和三羧酸循环等多种代谢途径。其还原形式NADH是糖代谢途径中重要的氢化物供体,并可通过乳酸发酵、乙醇发酵和线粒体的呼吸作用等再次生成NAD+。NAD+的磷酸化衍生物NADP+广泛参与脂肪酸氧化及胆固醇合成等过程。作为细胞内聚(ADP-核糖)聚合酶PARPs、去乙酰化酶SIRTs和环ADP-核糖合成酶cADPRSs的底物,NAD+在DNA连接、蛋白质的ADP核糖基化、蛋白质的去乙酰化、钙信号转导等方面发挥重要作用。
传统的检测NAD+的方法有酶循环检测法(Lowry O H等.J Biol Chem,1961,236:2746-2755;Karp M T等.Anal Biochem,1983,128(1):175-180)、毛细管电泳法(Xie W等.Anal Chem,2009,81(3):1280-1284)、高效液相色谱与质谱联用法(Fischer E等.AnalBiochem,2004,325(2):308-316;Jones D P等.J Chromatogr,1981,225(2):446-449;Trammell S a J等.Nat Commun,2016,7)和同位素标记法(Liu L等.Cell Metab,2018,27(5):1067-1080)。这些方法都需要将样品进行彻底的裂解,无法对活细胞内的NAD+水平进行实时的监测。此外,NAD+不具有内源荧光性质,无法通过直接的荧光成像方法检测(Blacker T S等.Nat Commun,2014,5)。因此亟需开发出能够原位监测活细胞内NAD+动态变化的遗传编码荧光探针。
发明内容
本发明的目的在于提供在细胞内、外实时定位、高通量、定量检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的探针和方法。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明第一方面提供一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体S,其:
(a)具有SEQ ID NO:1所示的序列并且在选自以下的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个位点具有突变:K39、I40、K41、A45、Q46、K47、L48、K72、H77、H80、E144、Y150、E179、R201、I206、K244、Y294、F297、A298,所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失,
(b)是与(a)的序列具有至少70%序列相同性并具有(1)所述突变并保留对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合能力的序列。
在一个或多个实施方案中,(a)中所述突变的位点包括:(1)选自以下的1个、2个、3个、4个或5个:A45、Q46、K47、L48、Y150,(2)选自以下的1个、2个或3个:K39、I40、K41,(3)选自以下的1个、2个、3个或更多个:K72、H77、H80、E144、E179、R201、I206、K244、Y294、F297、A298。优选地,(a)中所述突变的位点包括:(1)和(2)、(1)和(3)、(2)和(3)。更优选地,(a)中所述突变的位点包括:(1)和(2)和(3)。
在一个或多个实施方案中,(1)所示的位点包括Q46、K47、L48,优选还包括A45,更优选还包括Y150。
在一个或多个实施方案中,(2)所示的位点包括I40、K41,优选还包括A45,更优选还包括K39。
在一个或多个实施方案中,(3)所示的位点包括H77,优选还包括K72,更优选还包括F297、Y294、A298、E179、K244、E144、R201、E144中的任1个、2个或更多个。
在一个或多个实施方案中,(a)中所述突变包括选自以下任一组或多组的位点处的突变:(1)A45、Q46、K47、L48、Y150,(2)Q46、K47、L48,(3)A45、Q46、K47、L48,(4)H77,(5)K72、H77,(6)K72、H77、F297,(7)K72、H77、Y294,(8)K72、H77、A298,(9)K72、H77、E179,(10)K72、H77、K244,(11)K72、H77、E144,(12)K72、H77、R201,(13)K72、H77、E144,(14)K72、H77、E179、Y294,(15)K72、I206,(16)H80、I206,(17)K72、H80,(18)I40、K41,(19)K39、I40、K41。
优选地,(a)中所述突变包括以下项目中所示位点的突变:
(i)(1)-(3)中的任一组和(4)-(17)中的任一组,
(ii)(1)-(3)中的任一组和(18)-(19)中的任一组,
(iii)(4)-(17)中的任一组和(18)-(19)中的任一组,
(iv)(1)-(3)中的任一组、(4)-(17)中的任一组和(18)-(19)中的任一组。
在一个或多个实施方案中,K39位置处的突变是缺失突变。
在一个或多个实施方案中,I40位置处的突变是缺失突变。
在一个或多个实施方案中,K41处的突变是缺失突变。
在一个或多个实施方案中,A45突变为G或W。
在一个或多个实施方案中,Q46突变为L、R、G、P或W。
在一个或多个实施方案中,K47突变为Y。
在一个或多个实施方案中,L48突变为P。
在一个或多个实施方案中,K72突变为A或E。
在一个或多个实施方案中,H80突变为D或E。
在一个或多个实施方案中,E144突变为Q。
在一个或多个实施方案中,Y150突变为H或D。
在一个或多个实施方案中,E179突变为A或V。
在一个或多个实施方案中,R201突变为E或V。
在一个或多个实施方案中,I206突变为F。
在一个或多个实施方案中,K244突变为T。
在一个或多个实施方案中,Y294突变为W、F、P、Q、N、C、H、G、A或K。
在一个或多个实施方案中,F297突变为Y、V、R、W、M、I、K、T、Q、S、L、N、E、A、G、C、D或H。
在一个或多个实施方案中,A298突变为S。
在一个或多个实施方案中,所述突变包含选自以下的一个或多个:A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A和Y150H。
在一个或多个实施方案中,所述突变包含选自以下任一组的突变:(1)A45G、Q46L、K47Y、L48P、Y150H,(2)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P,(3)ΔI40、ΔK41、A45G、Q46G、K47Y、L48P,(4)A45W、Q46P、K47Y、L48P,(5)A45G、Q46L、K47Y、L48P、H77A、Y150H,(6)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H,(7)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150D,(8)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297Y,(9)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297V,(10)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297R,(11)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297W,(12)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297I,(13)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297M,(14)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297K,(15)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297T,(16)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297Q,(17)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297S,(18)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297L,(19)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297N,(20)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297E,(21)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297A,(22)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297C,(23)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297G,(24)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297D,(25)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297H,(26)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294W,(27)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294P,(28)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294F,(29)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294Q,(30)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294N,(31)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294C,(32)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294H,(33)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294G,(34)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294A,(35)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294K,(36)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、A298S,(37)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、E179V,(38)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、E179A,(39)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、K244T,(40)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、E144Q、Y150H,(41)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、R201V,(42)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、R201E,(43)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72E、Y150H、I206F,(44)A45G、Q46L、K47Y、L48P、H80D、Y150H、I206F,(45)A45G、Q46L、K47Y、L48P、H80E、Y150H、I206F,(46)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72E、H80D、Y150H,(47)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72E、H80E、Y150H,(48)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、H77A,(49)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A,(50)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A,(51)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A、Y294W,(52)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A、Y294F,(53)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A、Y294P。
本发明第一方面还提供一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针,包含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽和光学活性多肽,其中光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的序列内。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽被光学活性多肽分为第一部分和第二部分。
在一个或多个实施方案中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S,其具有:
(1)SEQ ID NO:1所示的序列,或与它们有至少70%序列相同性并保留对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合活性的序列,
(2)SEQ ID NO:1所示序列的功能变体,该功能变体在与光学活性多肽连接处的5个(优选3个,更优选2个)氨基酸内具有突变,
(3)本文第一方面任一实施方案所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体S的序列,或
(4)与(2)或(3)所述序列具有至少70%序列相同性并具有(2)所述突变并保留对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感性的序列。
在一个或多个实施方案中,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S的残基37-63、90-93,111-120,131-137,168-174,196-208,255-265,270-281,301-305和/或346-364中或置换其中的残基,编号对应于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的全长。
在一个或多个实施方案中,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S的残基37-63,196-208和/或346-364中或置换其中的残基,编号对应于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S的全长。优选地,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S的选自下述位点中的任一个或多个:37/38,38/39,39/40,40/41,41/42,42/43,43/44,44/45,44/46,44/47,44/48,45/46,45/47,45/48,46/47,46/48,47/48,48/49,49/50,50/51,51/52,52/53,53/54,54/55,55/56,56/57,57/58,58/59,59/60,61/62,62/63,90/91,91/92,92/93,111/112,112/113,113/114,114/115,115/116,116/117,117/118,118/119,119/120,131/132,132/133,133/134,135/136,169/170,170/171,171/172,172/173,196/197,197/198,197/199,197/200,197/201,197/202,197/203,198/199,198/200,198/201,198/202,198/203,199/200,199/201,199/202,199/203,200/201,200/202,201/202,201/203,202/203,203/204,204/205,205/206,206/207,255/256,256/257,257/258,258/259,259/260,260/261,261/262,262/263,263/264,264/265,270/271,272/273,273/274,274/275,275/276,276/277,277/278,278/279,279/280,280/281,301/302,303/304,304/305,346/347,347/348,349/350,350/351,351/352,351/353,351/355,351/356,351/357,351/358,352/353,352/354,352/355,352/356,352/357,352/358,353/354,354/355,355/356,356/357,357/358,358/359,359/360,360/361,361/362,362/363和/或363/364。更优选地,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S的选自下述位点中的任一个或多个:45/46,46/47,199/200,199/203,201/202,351/352,351/358,352/354和352/356。更优选地,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S的45/46或46/47位点。
在一个或多个实施方案中,所述光学活性多肽是荧光蛋白或其功能变体,其中,荧光蛋白的功能变体在与光学活性多肽连接处的3个(优选2个)氨基酸内具有突变。所述突变优选是缺失突变,例如荧光蛋白N端的第1个、第1-2个或第1-3个氨基酸缺失。
在一个实施方式中,荧光蛋白选自黄色荧光蛋白、橘黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、苹果红荧光蛋白。在一个实施方式中,荧光蛋白具有SEQID NO:3-10中任一所示的序列,优选SEQ ID NO:3、7、8或10。
在一个或多个实施方案中,荧光蛋白的功能变体具有SEQ ID NO:3所示的序列或者在SEQ ID NO:3所示序列的N端缺失第1个、第1-2个或第1-3个氨基酸。
在一个实施方式中,光学探针还包含侧接所述光学活性多肽的一个或多个接头。本发明所述接头可以是任何长度的任何氨基酸序列。在一个实施方式中,光学活性多肽侧翼包含不超过5个氨基酸的接头,例如0、1、2、3、4个氨基酸的接头。在一个实施方式中,光学活性多肽侧翼的接头包含氨基酸Y。在一个实施方式中,接头Y位于光学活性多肽的N端和/或C端。在一个实施方式中,光学探针如下所示:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的第一部分B1、Y、光学活性多肽A、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的第二部分B2。在一个实施方式中,本发明光学探针不包含接头。
在一个实施方式中,本发明光学探针还包含定位序列,用于将探针定位到例如细胞的特定细胞器。
在一个或多个实施方案中,所述光学探针中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S如SEQ ID NO:1所示,光学活性多肽如SEQ ID NO:3-10(优选SEQ ID NO:3、7、8、10)所示,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的选自下述位点中的任一个或多个:37/38,38/39,39/40,40/41,41/42,42/43,43/44,44/45,44/46,44/47,44/48,45/46,45/47,45/48,46/47,46/48,47/48,48/49,49/50,50/51,51/52,52/53,53/54,54/55,55/56,56/57,57/58,58/59,59/60,61/62,62/63,90/91,91/92,92/93,111/112,112/113,113/114,114/115,115/116,116/117,117/118,118/119,119/120,131/132,132/133,133/134,135/136,169/170,170/171,171/172,172/173,196/197,197/198,197/199,197/200,197/201,197/202,197/203,198/199,198/200,198/201,198/202,198/203,199/200,199/201,199/202,199/203,200/201,200/202,201/202,201/203,202/203,203/204,204/205,205/206,206/207,255/256,256/257,257/258,258/259,259/260,260/261,261/262,262/263,263/264,264/265,270/271,272/273,273/274,274/275,275/276,276/277,277/278,278/279,279/280,280/281,301/302,303/304,304/305,346/347,347/348,349/350,350/351,351/352,351/353,351/355,351/356,351/357,351/358,352/353,352/354,352/355,352/356,352/357,352/358,353/354,354/355,355/356,356/357,357/358,358/359,359/360,360/361,361/362,362/363和/或363/364。优选地,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S的选自下述位点中的任一个或多个:45/46,46/47,199/200,199/203,201/202,351/352,351/358,352/354和352/356。
在一个或多个实施方案中,所述光学探针中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S如SEQ ID NO:1所示,并且具有以下的一个或多个突变:A45G,A45W,Q46L,Q46R,Q46G,Q46P,Q46W,K47Y,L48P,K72A,K72E,H77A,H80D,H80E,E144Q,Y150H,Y150D,E179A,E179V,R201E,R201V,I206F,K244T,Y294W,Y294F,Y294P,Y294Q,Y294N,Y294C,Y294H,Y294G,Y294A,Y294K,F297Y,F297V,F297R,F297W,F297M,F297I,F297K,F297T,F297Q,F297S,F297L,F297N,F297E,F297A,F297G,F297C,F297D,F297H和/或A298S,光学活性多肽如SEQ ID NO:3-10所示(优选SEQ ID NO:3、7、8、10)或是其N端缺失1或2个氨基酸的变体,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S的46/47位点。优选地,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S的突变包含选自以下任一组的突变:(1)A45G、Q46L、K47Y、L48P、Y150H,(2)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P,(3)ΔI40、ΔK41、A45G、Q46G、K47Y、L48P,(4)A45W、Q46P、K47Y、L48P,(5)A45G、Q46L、K47Y、L48P、H77A、Y150H,(6)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H,(7)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150D,(8)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297Y,(9)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297V,(10)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297R,(11)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297W,(12)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297I,(13)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297M,(14)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297K,(15)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297T,(16)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297Q,(17)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297S,(18)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297L,(19)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297N,(20)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297E,(21)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297A,(22)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297C,(23)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297G,(24)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297D,(25)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297H,(26)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294W,(27)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294P,(28)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294F,(29)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294Q,(30)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294N,(31)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294C,(32)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294H,(33)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294G,(34)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294A,(35)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294K,(36)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、A298S,(37)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、E179V,(38)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、E179A,(39)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、K244T,(40)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、E144Q、Y150H,(41)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、R201V,(42)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、R201E,(43)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72E、Y150H、I206F,(44)A45G、Q46L、K47Y、L48P、H80D、Y150H、I206F,(45)A45G、Q46L、K47Y、L48P、H80E、Y150H、I206F,(46)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72E、H80D、Y150H,(47)A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72E、H80E、Y150H,(48)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、H77A,(49)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A,(50)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A,(51)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A、Y294W,(52)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A、Y294F,(53)ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A、Y294P。优选地,光学活性多肽如SEQ IDNO:3所示或是其N端缺失1或2个氨基酸的变体。
在一个或多个实施方案中,所述光学探针中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S如SEQ ID NO:1所示,光学活性多肽如SEQ ID NO:3-10所示(优选SEQ ID NO:3、7、8、10),光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的46/47位点,并且,所述光学探针具有如下所示的突变:(1)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、Y150H,(2)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、Y150H,光学活性多肽的N端缺失第1个氨基酸,(3)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P,(4)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P,光学活性多肽的N端缺失前2位氨基酸,(5)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的ΔI40、ΔK41、A45G、Q46G、K47Y、L48P,(6)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45W、Q46P、K47Y、L48P,(7)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45W、Q46V、K47Y、L48P,(8)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、H77A、Y150H,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(9)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(10)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150D,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(11)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297Y,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(12)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297V,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(13)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297R,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(14)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297W,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(15)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297I,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(16)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297M,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(17)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297K,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(18)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297T,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(19)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297Q,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(20)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297S,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(21)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297L,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(22)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297N,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(23)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297E,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(24)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297A,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(25)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297C,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(26)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297G,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(27)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297D,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(28)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、F297H,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(29)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294W,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(30)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294P,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(31)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294F,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(32)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294Q,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(33)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294N,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(34)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294C,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(35)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294H,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(36)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294G,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(37)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294A,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(38)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、Y294K,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(39)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、A298S,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(40)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、E179V,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(41)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、E179A,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(42)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、K244T,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(43)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、E144Q、Y150H,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(44)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、R201V,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(45)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72A、H77A、Y150H、R201E,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(46)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72E、Y150H、I206F,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(47)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、H80D、Y150H、I206F,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(48)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、H80E、Y150H、I206F,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(49)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72E、H80D、Y150H,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(50)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的A45G、Q46L、K47Y、L48P、K72E、H80E、Y150H,光学活性多肽的N端缺失第1位氨基酸,(51)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、H77A,(52)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A,(53)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A,(54)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A、Y294W,(55)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A、Y294F,(56)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A、Y294P,(57)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、H77A,光学活性多肽的N端缺失前2位氨基酸,(58)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A,光学活性多肽的N端缺失前2位氨基酸,(59)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A,光学活性多肽的N端缺失前2位氨基酸,(60)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的ΔK39、ΔI40、ΔK41、Q46R、K47Y、L48P、K72A、H77A、E179A、Y294W,光学活性多肽的N端缺失前2位氨基酸。
本发明第二方面提供一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体E,其:
(a)具有SEQ ID NO:2所示的序列并且在选自以下的1个、2个或3个位点具有突变:R212,Q280,Y281,所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失,
(b)是(a)的具有第63-409位氨基酸的截短变体,或
(c)是与(a)或(b)的序列具有至少70%序列相同性并具有(1)所述突变并保留对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合能力的序列。
在一个或多个实施方案中,(a)中所述突变包括选自以下任一组的位点处的突变:(1)R212,Q280,Y281,(2)R212,Q280,(3)R212,Y281。
在一个或多个实施方案中,R212突变为C。
在一个或多个实施方案中,Q280突变为E、P、I、R、N或A,优选突变为。
在一个或多个实施方案中,Y281突变为F、H、L或I。
在一个或多个实施方案中,所述突变包含选自以下任一组的突变:(1)Q280R、Y281F、R212C,(2)Q280N、Y281F、R212C,(3)Q280A、Y281I、R212C,(4)Q280N、Y281L、R212C,(5)Q280P、Y281F、R212C,(6)Q280I、Y281F、R212C,(7)Q280D、Y281F、R212C,(8)Q280R、Y281F、R212C,(9)Q280E、R212C,(10)Y281H、R212C。
在一个或多个实施方案中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体E具有SEQ IDNO:2所示的序列,并且包含选自以下任一组的突变:(1)Q280R、Y281F、R212C,(2)Q280N、Y281F、R212C,(3)Q280A、Y281I、R212C,(4)Q280N、Y281L、R212C,(5)Y281H、R212C,(6)Q280P、Y281F、R212C,(7)Q280I、Y281F、R212C,(8)Q280E、R212C,(9)Q280D、Y281F、R212C。
在一个或多个实施方案中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体E是SEQ ID NO:2的具有第63-409位氨基酸的截短变体,并且包含选自以下任一组的突变:(1)Q280R、Y281F、R212C,(2)Q280N、Y281F、R212C,(3)Q280A、Y281I、R212C,(4)Y281H、R212C,(5)Q280P、Y281F、R212C,(6)Q280I、Y281F、R212C,(7)Q280E、R212C。
本发明第二方面还提供一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针,包含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽和光学活性多肽,其中光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的序列内。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽被光学活性多肽分为第一部分和第二部分。
在一个或多个实施方案中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E,其具有:
(1)SEQ ID NO:2所示的序列或其具有第63-409位氨基酸的截短变体,或与它们有至少70%序列相同性并保留对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合活性的序列,
(2)SEQ ID NO:2所示序列的功能变体,该功能变体在与光学活性多肽连接处的5个(优选3个,更优选2个)氨基酸内具有突变,
(3)本文第二方面任一实施方案所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体E的序列,或
(4)与(2)或(3)所述序列具有至少70%序列相同性并具有(2)所述突变并保留对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感性的序列。
在一个或多个实施方案中,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E的残基37-63、90-93,111-120,131-137,168-174,196-208,255-265,270-281,301-305和/或346-364中或置换其中的残基,编号对应于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的全长。
在一个或多个实施方案中,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E或其具有第63-409位氨基酸的截短变体的残基37-63,196-208和/或270-281中或置换其中的残基,编号对应于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E的全长。优选地,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E的选自下述位点中的任一个或多个:37/38,38/39,39/40,40/41,41/42,42/43,43/44,44/45,45/46,46/47,46/48,47/48,47/49,48/49,49/50,50/51,51/52,52/53,54/55,55/56,56/57,57/58,58/59,59/60,60/61,61/62,62/63,90/91,91/92,92/93,111/112,112/113,113/114,114/115,115/116,116/117,117/118,118/119,119/120,131/132,132/133,133/134,134/135,135/136,136/137,168/169,169/170,170/171,171/172,172/173,173/174,196/197,197/198,197/199,197/200,197/201,197/202,197/203,197/204,197/205,198/199,198/200,198/201,198/202,198/203,198/204,198/205,199/200,199/201,199/202,199/203,199/204,199/205,200/201,200/202,200/203,200/204,200/205,201/202,201/203,201/204,201/205,202/203,202/204,202/205,203/204,203/205,204/205,205/206,206/207,207/208,255/256,256/257,257/258,258/259,259/260,260/261,261/262,262/263,263/264,264/265,270/271,271/272,272/273,272/274,272/275,272/276,272/277,272/278,272/279,272/280,273/274,273/275,273/276,273/277,273/278,273/279,273/280,274/275,274/276,274/277,274/278,274/279,274/280,275/276,275/277,275/278,275/279,275/280,276/277,276/278,276/279,276/280,277/278,277/279,277/280,278/279,278/280,279/280,302/303,303/304,304/305,346/347,347/348,348/349,349/350,350/351,351/352,352/353,353/354,354/355,355/356,356/357,357/358,358/359,359/360,360/361,361/362,362/363和/或363/364。更优选地,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E的选自下述位点中的任一个或多个:46/47,198/199,199/200,199/202,199/203,199/204,200/201,201/202,203/204,261/262,272/280,273/278,273/280和276/277。更优选地,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E的46/47或272/280位点
在一个或多个实施方案中,所述光学活性多肽是荧光蛋白或其功能变体,其中,荧光蛋白的功能变体在对应于SEQ ID NO:3的第246位氨基酸处具有突变。所述突变优选突变为Y、F、E、V、P、I或L。
在一个实施方式中,荧光蛋白选自黄色荧光蛋白、橘黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、苹果红荧光蛋白。在一个实施方式中,荧光蛋白具有SEQID NO:3-10中任一所示的序列。荧光蛋白的功能变体在对应于SEQ ID NO:3的第246位氨基酸处具有突变,所述突变优选突变为Y、F、E、V、P、I或L。
在一个或多个实施方案中,荧光蛋白的功能变体具有SEQ ID NO:3所示的序列并且在N246处具有突变。所述突变优选为N246Y,N246F,N246E,N246V,N246P,N246I或N246L。
在一个实施方式中,光学探针还包含侧接所述光学活性多肽的一个或多个接头。本发明所述接头可以是任何长度的任何氨基酸序列。在一个实施方式中,光学活性多肽侧翼包含不超过5个氨基酸的接头,例如0、1、2、3、4个氨基酸的接头。在一个实施方式中,光学活性多肽侧翼的接头包含氨基酸Y。在一个实施方式中,接头Y位于光学活性多肽的N端和/或C端。在一个实施方式中,光学探针如下所示:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的第一部分B1、Y、光学活性多肽A、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的第二部分B2。在一个实施方式中,本发明光学探针不包含接头。
在一个实施方式中,本发明光学探针还包含定位序列,用于将探针定位到例如细胞的特定细胞器。
在一个或多个实施方案中,所述光学探针中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽如SEQ ID NO:2所示或是其具有第63-409位氨基酸的截短变体,光学活性多肽如SEQ ID NO:3-10所示(优选SEQ ID NO:3、7、8、10),光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的选自下述位点中的任一个或多个:37/38,38/39,39/40,40/41,41/42,42/43,43/44,44/45,45/46,46/47,46/48,47/48,47/49,48/49,49/50,50/51,51/52,52/53,54/55,55/56,56/57,57/58,58/59,59/60,60/61,61/62,62/63,90/91,91/92,92/93,111/112,112/113,113/114,114/115,115/116,116/117,117/118,118/119,119/120,131/132,132/133,133/134,134/135,135/136,136/137,168/169,169/170,170/171,171/172,172/173,173/174,196/197,197/198,197/199,197/200,197/201,197/202,197/203,197/204,197/205,198/199,198/200,198/201,198/202,198/203,198/204,198/205,199/200,199/201,199/202,199/203,199/204,199/205,200/201,200/202,200/203,200/204,200/205,201/202,201/203,201/204,201/205,202/203,202/204,202/205,203/204,203/205,204/205,205/206,206/207,207/208,255/256,256/257,257/258,258/259,259/260,260/261,261/262,262/263,263/264,264/265,270/271,271/272,272/273,272/274,272/275,272/276,272/277,272/278,272/279,272/280,273/274,273/275,273/276,273/277,273/278,273/279,273/280,274/275,274/276,274/277,274/278,274/279,274/280,275/276,275/277,275/278,275/279,275/280,276/277,276/278,276/279,276/280,277/278,277/279,277/280,278/279,278/280,279/280,302/303,303/304,304/305,346/347,347/348,348/349,349/350,350/351,351/352,352/353,353/354,354/355,355/356,356/357,357/358,358/359,359/360,360/361,361/362,362/363和/或363/364。更优选地,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的选自下述位点中的任一个或多个:46/47,198/199,199/200,199/202,199/203,199/204,200/201,201/202,203/204,261/262,272/280,273/278,273/280和276/277。
在一个或多个实施方案中,所述光学探针中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽如SEQ ID NO:2所示,并且具有以下的一个或多个突变:R212C,Q280E,Q280P,Q280I,Q280R,Q280N,Q280A,Y281F,Y281H,Y281L和/或Y281I,光学活性多肽如SEQ ID NO:3-10所示或其功能变体(优选SEQ ID NO:3、7、8、10),该功能变体在对应于SEQ ID NO:3的第246位氨基酸处具有选自以下的任一种突变Y、F、E、V、P、I或L,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的272/280位点。优选地,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的突变优选是选自以下任一组的突变:(1)Q280R、Y281F、R212C,(2)Q280N、Y281F、R212C,(3)Q280A、Y281I、R212C,(4)Q280N、Y281L、R212C,(5)Q280P、Y281F、R212C,(6)Q280I、Y281F、R212C,(7)Q280D、Y281F、R212C,(8)Q280R、Y281F、R212C,(9)Q280E、R212C,(10)Y281H、R212C。优选地,光学活性多肽如SEQ ID NO:3所示,并且具有突变:N246Y,N246F,N246E,N246V,N246P,N246I或N246L。
在一些优选实施方案中,所述光学探针中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E如SEQ ID NO:2所示,光学活性多肽如SEQ ID NO:3所示,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的272/280位点,所述光学探针具有如下任一组所示的突变:(1)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280R、Y281F、R212C,光学活性多肽的N246V,(2)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280N、Y281F、R212C,光学活性多肽的N246P,(3)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280A、Y281I、R212C,光学活性多肽的N246L,(4)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280N、Y281L、R212C,光学活性多肽的N246I,(5)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Y281H、R212C,光学活性多肽的N246V,(6)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280P、Y281F、R212C,光学活性多肽的N246F,(7)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280I、Y281F、R212C,光学活性多肽的N246E,(8)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280E、R212C,光学活性多肽的N246Y,(9)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280D、Y281F、R212C,光学活性多肽的N246V。
在另一些优选实施方案中,所述光学探针中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E是SEQ ID NO:2的具有第63-409位氨基酸的截短变体,光学活性多肽如SEQ ID NO:3所示,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的272/280位点,所述光学探针具有如下任一组所示的突变:(1)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280R、Y281F、R212C,光学活性多肽的N246V,(2)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280N、Y281F、R212C,光学活性多肽的N246P,(3)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280A、Y281I、R212C,光学活性多肽的N246L,(4)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Y281H、R212C,光学活性多肽的N246V,(5)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280P、Y281F、R212C,光学活性多肽的N246F,(6)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280I、Y281F、R212C,光学活性多肽的N246E,(7)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的Q280E、R212C,光学活性多肽的N246Y。
本发明还提供融合多肽,包含本文任一实施方案所述的光学探针和其它多肽。在一些实施方式中,其他多肽位于所述光学探针的N端和/或C端。在一些实施方式中,其他多肽包括将光学探针定位到不同细胞器或亚细胞器的多肽、用于纯化的标签或者用于免疫印迹的标签。
本发明还提供核酸分子,其包含:(a)本文任一实施方案所述的蛋白变体、光学探针或融合多肽的编码序列,或(b)(a)的互补序列,或(c)(a)或(b)的片段。所述片段是引物。
本发明还涉及上述核酸分子的变体,包括编码本发明蛋白变体、光学探针或融合多肽的片段、类似物、衍生物、可溶性片段和变体的核酸序列或其互补序列。
本发明还提供包含本文所述核酸分子的核酸构建物。该核酸序列编码本发明任一实施方案所述的蛋白变体、光学探针或融合多肽。
在一个或多个实施方案中,所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或重组载体。
在一个或多个实施方案中,所述核酸分子与表达控制序列操作性连接。
在一些实施方案中,表达载体选自原核表达载体、真核表达载体和病毒载体。
本发明另一方面还提供一种宿主细胞,所述宿主细胞:(1)表达本发明任一实施方案所述的光学探针或融合多肽;(2)包含本发明任一实施方案所述的核酸分子;或(3)包含本发明任一实施方案所述的核酸构建物。所述宿主细胞优选大肠杆菌。
本发明另一方面还提供烟酰胺腺嘌呤二核苷酸检测试剂盒,包括本文所述光学探针或融合多肽或多核苷酸或如本文所述方法制备的光学探针。
在一个或多个实施方案中,所述试剂盒还包含选自以下的一种或多种试剂:缓冲液、培养基、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸标准品。
本发明另一方面提供制备本文所述光学探针的方法,包括:提供表达本文所述光学探针或融合多肽的宿主细胞,在所述细胞表达的条件下培养所述宿主细胞,和分离光学探针或融合多肽。
在一个或多个实施方案中,所述方法包括包括以下步骤:1)将编码本文所述光学探针或融合多肽的核酸分子纳入表达载体;2)将表达载体转移到宿主细胞中;2)在适合所述表达载体表达的条件下培养所述宿主细胞,3)分离所述光学探针或融合多肽。
本发明另一方面还提供检测样品中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法,包括:使本文所述光学探针或融合多肽或宿主细胞与样品接触,和检测光学活性多肽的变化。所述检测可以在体内、体外、亚细胞或原位进行。所述样品例如血液。
本文另一方面还提供定量样品中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法,包括:使本文所述光学探针或融合多肽或宿主细胞与样品接触,检测光学活性多肽的光学变化,和根据光学活性多肽的光学变化定量样品中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
本发明另一方面还提供筛选化合物(例如药物)的方法,包括:在含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的体系中使本文所述光学探针或融合多肽或宿主细胞与候选化合物接触,检测光学活性多肽的光学变化,和根据光学活性多肽的光学变化筛选化合物。所述方法可以高通量地筛选化合物。
在一个或多个实施方案中,在含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的体系中使本文所述宿主细胞与候选化合物接触,并且光学活性多肽的光学变化指示所述候选化合物是否能调节细胞对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的摄取。
本发明另一方面还提供对所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进行细胞内和/或外定位的方法,包括:将含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的体系与所述光学探针或所述宿主细胞接触,和检测光学活性多肽的光学变化。
在一个或多个实施方案中,所述体系是溶液体系、细胞体系、亚细胞体系。
本发明另一方面还提供本文所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针或融合多肽或宿主细胞在检测样品中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、筛选化合物或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸细胞内/外定位中的应用。在一个或多个实施方案中,所述定位是实时定位。
本发明的有益效果:本发明提供的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针易于成熟,荧光动态变化大,特异性好,并且能够通过基因操作的方法在细胞中表达,可在细胞内外实时定位、高通量、定量检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,省去了耗时的处理样品步骤。实验效果表明本申请所提供的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的最高响应达到对照的5倍以上,并且可以在细胞浆、线粒体、细胞核、内质网、溶酶体和高尔基体等亚细胞结构中对细胞进行定位、定性、定量检测,并且可以进行高通量的化合物筛选以及血液中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸定量检测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为示例性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针的SDS-PAGE图;
图2为示例性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针的荧光光谱性质图;
图3为示例性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针对不同浓度烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的滴定曲线;
图4A和图4B为示例性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针对其余相似底物的特异性检测响应汇总;
图5为示例性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针在哺乳动物细胞中的亚细胞器定位照片;
图6为对示例性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针在哺乳动物细胞中对胞浆中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度进行动态监测的示意图;
图7为示例性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针在活细胞水平进行高通量化合物筛选的点图;
图8为示例性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针对小鼠和人血液中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进行定量的柱状图。
具体实施方式
在给出数值或范围时,本文所用术语“约”指该数值或范围在给定数值或范围的20%以内、10%以内和5%以内。
本文所用术语“包含”、“包括”和其等同形式包括“含有”以及“由……组成”的含义,例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质,例如X+Y。
本文所用术语“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽”指对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸产生响应的多肽,所述响应包括与敏感多肽的相互作用相关的多肽的化学,生物学,电学或生理学参数的任何响应。响应包括小的变化,例如,多肽的氨基酸或肽片段的方向的变化以及例如多肽的一级,二级或三级结构的变化,包括例如质子化,电化学势和/或构象的变化。“构象”是分子中包含侧基的分子的一级,二级和三级结构的三维排列;当分子的三维结构发生变化时,构象发生变化。构象变化的实例包括从α-螺旋转变为β-折叠或从β-折叠转变为α-螺旋。可以理解的是,只要荧光蛋白部分的荧光被改变,可检测到的改变不需要是构象改变。本文所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽还可包括其功能变体。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的功能变体包括但不限于可以与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸相互作用从而发生与亲本烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽相同或相似变化的变体。
本发明所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽包括但不限于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白NadR或与其有90%以上同源性的变体。NadR是NAD+合成与调节过程中的关键酶,是一个多功能蛋白,N端具有转录因子功能,中间功能域催化NMN生成NAD+,C端功能域则磷酸化NR生成NMN。本发明所述示例性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白StNadR(本文简称结合蛋白S,SEQ ID NO:1)来源于鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium,EcNadR(本文简称结合蛋白E,SEQ ID NO:2)来源于大肠杆菌Escherichia coli。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白可以感应烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度的变化,在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度动态变化的过程中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白的空间构象也会发生改变。NadR的截短变体亦可用于本发明,示例性EcNadR截短变体如SEQ ID NO:2第63-409位氨基酸所示。
本文所用术语“光学探针”是指与光学活性多肽融合的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽。发明人发现,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白专一性地对生理浓度的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合后所产生的构象变化会引起光学活性多肽(例如荧光蛋白)的构象变化,进而导致光学活性多肽的光学性质发生改变。借助不同烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度下测定的荧光蛋白的荧光绘制标准曲线,可以检测并分析烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在和/或水平。当描述本发明光学探针时(例如描述插入位点或突变位点时),提及氨基酸残基编号均参考SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
在本发明的光学探针中,光学活性多肽(例如荧光蛋白)可操作地插入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽中。基于蛋白质的“光学活性多肽”是具有发射荧光能力的多肽。荧光是光学活性多肽的一种光学性质,其可用作检测本发明的光学探针的响应性的手段。如本文所用,术语“荧光性质”是指适当激发波长下的摩尔消光系数,荧光量子效率,激发光谱或发射光谱的形状,激发波长最大值和发射波长最大值,两个不同波长激发的振幅,两个不同波长的发射振幅比,激发态寿命或荧光各向异性。活性和无活性状态之间的这些性质中的任何一个的可测量的差异足以用于本发明的荧光蛋白底物在活性测定中的效用。可测量的差异可通过确定任何定量荧光性质的量来确定,例如,特定波长处的荧光量或荧光在发射光谱上的积分。优选地,选择蛋白质底物以具有在未激活和活化的构象状态下容易区分的荧光特性。本文所述光学活性多肽还可包括其功能变体。光学活性多肽的功能变体包括但不限于可以发生与亲本光学活性多肽相同或相似荧光性质变化的变体。
本文所用术语“荧光蛋白”指在激发光照射下发出荧光的蛋白质。荧光蛋白作为生物科学领域的基础检测手段,例如生物技术领域常用的绿色荧光蛋白GFP及由该蛋白突变衍生出的环状重排的蓝色荧光蛋白(cpBFP)、环状重排的绿色荧光蛋白(cpGFP)、环状重排的黄色荧光蛋白(cpYFP)等;还有本技术领域常用的红色荧光蛋白RFP,及由该蛋白衍生出来的环状重排的蛋白,如cpmApple,cpmOrange,cpmKate等。示例性地,cpYFP如SEQ ID NO:3所示,cpmOrange如SEQ ID NO:4所示,cpmKate如SEQ ID NO:5或9所示,mCherry如SEQ IDNO:6所示,cpGFP如SEQ ID NO:7所示,cpBFP如SEQ ID NO:8所示,cpmApple如SEQ ID NO:10所示。
光学探针中的荧光蛋白也包括具有突变的功能变体,包括但不限于在第1-3位或对应于SEQ ID NO:3的第246位氨基酸具有突变的荧光蛋白。第1-3位的突变优选为缺失突变,例如缺失第1、前2位氨基酸。对应于SEQ ID NO:3的第246位的突变优选突变为Y、F、E、V、P、I或L。
在本发明的光学探针中,光学活性多肽以N-C方向位于N-C方向的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的残基37-63、90-93,111-120,131-137,168-174,196-208,255-265,270-281,301-305和/或346-364中或置换其中的残基,编号对应于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的全长。本文中,如果以“X/Y”形式表示的位点中的两个数字是连续的整数,则表示光学活性多肽位于该数字所述的氨基酸之间。例如插入位点174/175表示光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的氨基酸174与175之间。如果以“X/Y”形式表示的位点中的两个数字不是连续的整数,则表示光学活性多肽置换该数字所示氨基酸之间的氨基酸。例如插入位点174/185表示光学活性多肽置换烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的氨基酸175-184。在示例性实施方式中,SEQ ID NO:3、7、8或10所示的光学活性多肽位于SEQ IDNO:1所示的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的选自下述位点中的任一个或多个:45/46,46/47,199/200,199/203,201/202,351/352,351/358,352/354和352/356。在另一些示例性实施方式中,SEQ ID NO:3、7、8或10所示的光学活性多肽位于SEQ ID NO:2或其截短变体所示的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的选自下述位点中的任一个或多个:46/47,198/199,199/200,199/202,199/203,199/204,200/201,201/202,203/204,261/262,272/280,273/278,273/280和276/277。
提到某多肽或蛋白时,本发明所用术语“变体”或“突变体”包括具有所述多肽或蛋白相同功能、但序列不同的变体。多肽或蛋白的变体可包括:同源序列、保守性变体、等位变体、天然突变体、诱导突变体。这些变体包括但并不限于:在所述多肽或蛋白的序列中缺失、插入和/或取代一个或多个(通常为1-30个,较佳地1-20个,更佳地1-10个,最佳地1-5个)氨基酸,以及在其羧基末端和/或氨基末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸获得的序列。这些变体还可包含与所述多肽或蛋白的序列相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的多肽或蛋白。不希望受理论限制,氨基酸残基发生改变而不改变多肽或蛋白质的总体构型和功能,即功能保守突变。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变多肽或蛋白的功能。在本领域中,性能相似的氨基酸往往指具有相似侧链的氨基酸家族,在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。又比如,在氨基末端和/或羧基末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽或蛋白的功能。对于许多常见已知非遗传性编码氨基酸的保守氨基酸取代本领域已知。其他非编码氨基酸的保守取代可基于其物理性质与遗传上编码的氨基酸的性质的比较来确定。
“接头”或“连接区”指在本发明多肽、蛋白质或核酸中连接两个部分的氨基酸或核苷酸序列。示例性地,本发明中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽与光学活性多肽的连接区氨基端的氨基酸数目选择的是0-3个,羧基端的氨基酸数目选择的是0-2个;当重组光学探针作为基本单元与功能蛋白连接时,可以融合在重组光学探针的氨基酸或羧基端。接头序列可为一个或多个柔性氨基酸组成的短肽链,如Y。
发明人发现,在选自以下的位点具有突变的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体表现出与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸不同的结合活性:SEQ ID NO:1的K39、I40、K41、A45、Q46、K47、L48、K72、H77、H80、E144、Y150、E179、R201、I206、K244、Y294、F297、A298,SEQ ID NO:2的R212、Q280、Y281。所述氨基酸突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失。
本发明提供具有这些突变的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体以及包含此类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的光学探针。因此,在一个或多个实施方案中,光学探针中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽是本文任一实施方案所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体,光学探针中的荧光蛋白如SEQ IDNO:3-10或其功能变体所示。
在一些具体实施方案中,光学探针中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽如SEQ IDNO:1所示,光学活性多肽如SEQ ID NO:3所示,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的46/47位点,光学探针的突变如表5和表7中任一行所示。
在一些具体实施方案中,光学探针中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽如SEQ IDNO:1所示,光学活性多肽如SEQ ID NO:3所示,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的46/47位点,光学探针的突变如表5和表7中任一行所示。
在一些具体实施方案中,光学探针中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽如SEQ IDNO:2所示,光学活性多肽如SEQ ID NO:3所示,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的272/280位点,光学探针的突变如表6中任一行所示。
在两种或多种多肽或核酸分子序列中,术语“相同性”或“相同性百分数”指在比较窗口或指定区域上,采用本领域已知方法如序列比较算法,通过手工比对和目测检查来比较和比对最大对应性时,两个或多个序列或子序列相同或其中在指定区域有一定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(例如,60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同)。例如,适合测定序列相同性百分数和序列相似性百分数的优选算法是BLAST和BLAST 2.0算法,分别可参见Altschul等(1977)Nucleic Acids Res.25:3389和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403。
本领域技术人员公知,在基因克隆操作中,常常需要设计合适的酶切位点,这势必在所表达的多肽或蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基,而这并不影响目的多肽或蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化,常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内,例如,包括但不限于,适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签,或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。
本文所用术语“功能片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与原始多肽或蛋白(例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白或荧光蛋白)相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的多肽或蛋白(例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白或荧光蛋白)的功能变体、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白,或(iii)成熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列,或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些功能变体、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。所述类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽并不限于上述列举的代表性蛋白、变体、衍生物和类似物。修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化,如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。
本发明融合多肽包含本文所述光学探针和其它多肽。在一些实施方案中,本文所述光学探针还包含与之融合的其它多肽。本文所述其他多肽不影响光学探针的性质。其他多肽可位于所述光学探针的N端和/或C端。在一些实施方案中,其他多肽包括将光学探针定位到不同细胞器或亚细胞器的多肽、用于纯化的标签或者用于免疫印迹的标签。本文所述融合多肽中的光学探针和其它多肽之间可具有接头。
本文所述亚细胞器包括细胞浆、线粒体、细胞核、内质网、细胞膜、高尔基体、溶酶体和过氧化物酶体等。在一些实施方案中,用于纯化的标签或者用于免疫印迹的标签包括6组氨酸(6*His)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、Flag。
本发明包含编码本发明所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽或光学探针的核酸分子。本发明所用术语“核酸”或“核苷酸”或“多核苷酸”或“核酸序列”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。提到核酸时,本文所用术语“变体”可以是天然发生的等位变体或非天然发生的变体。这些核苷酸变体包括简并变体、取代变体、缺失变体和插入变体。如本领域所知的,等位变体是一个核酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。本发明核酸可包含与所述核酸序列的序列相同性为至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的核苷酸序列。本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用,“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)。
本发明光学探针或融合蛋白的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、人工合成法或重组法获得。本领域知晓常规PCR、合成法、重组法的步骤和所用试剂。此外,可通过突变PCR或化学合成等方法将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及核酸构建物,该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸,以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的多核苷酸可以多种方式被操作以保证所述多肽或蛋白的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。
在某些实施方案中,所述核酸构建物是载体。载体可以是克隆载体、表达载体、或同源重组载体。本发明的多核苷酸可被克隆入许多类型的载体,例如,质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。
典型的表达载体包含可用于调节期望核酸序列表达的表达控制序列,与本发明所述的核酸序列或其互补序列操作性连接。本文所用术语“表达控制序列”指调控目的基因的转录、翻译和表达的可以与目的基因操作性连接的元件,可以是复制起点、启动子、标记基因或翻译控制元件,包括增强子、操纵子、终止子、核糖体结合位点等,表达控制序列的选择取决于所用的宿主细胞。在重组表达载体中,“操作性连接”是指目的的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接。本领域的技术人员熟知能用于构建含本发明融合蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体的方法。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有:大肠杆菌的lac或trp启动子;λ噬菌体PL启动子;真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTR和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。在一个实施方案中,表达载体可采用市售的pCDF载体,无其他特殊要求。示例性地,采用BamHI和EcoRI分别对编码所述光学探针的核苷酸序列和表达载体进行双酶切,然后将二者的酶切产物连接得到重组表达载体。本发明对酶切和连接的具体步骤和参数没有特殊限定,采用本领域常规的步骤和参数即可。
在获得重组表达载体后,将该载体转化到宿主细胞中,以产生包括融合蛋白的蛋白或肽。此种转移过程可用转化或转染等本领域技术人员熟知的常规技术进行。本发明所述的宿主细胞是指能够接收和容纳重组DNA分子的细胞,是重组基因扩增的场所,理想的受体细胞应该满足易于获取和增殖两个条件。本发明的“宿主细胞”可包括原核细胞和真核细胞,具体包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。所述宿主细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞,此类细胞已为本领域熟知并常用。具体的可为大肠杆菌,链霉菌属,鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞,真菌细胞如酵母,植物细胞,果蝇S2或Sf9的昆虫细胞,CHO、COS、HEK293、HeLa细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。在本发明实施例中所用的示例性宿主细胞为大肠杆菌BL21-DE3菌株。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
本发明所述的转移到宿主细胞的方法为本领域常规的方法,包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-甘露聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移或电穿孔。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,所述方法优选的为CaCl2法或MgCl2法处理,所用的步骤为本领域公知。当宿主细胞是真核细胞时,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
本发明在将表达载体转入宿主细胞后,对转入表达载体的宿主细胞进行扩增表达培养,分离得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针。所述宿主细胞扩增表达培养采用常规的方法即可。根据所用的宿主细胞种类,培养中所用的培养基可以是各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。
在本发明中,光学探针在细胞内、细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离或纯化重组的蛋白。本发明对分离所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光蛋白的方法没有特殊限定,采用本领域常规的融合蛋白的分离方法即可。这些方法是本领域技术人员所熟知的,包括但并不限于:常规的复性处理、盐析方法、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。在一个实施方案中,利用His标签的亲和层析法进行光学探针的分离。
本发明还提供了所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸实时定位、定量检测以及高通量化合物筛选中的应用。在一个方面,所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针优选与细胞不同部位的信号肽连接,转入到细胞中,通过检测细胞中荧光信号的强弱,进行烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的实时定位;通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸标准滴加曲线结合荧光信号的变化进行相应烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的定量检测。荧光信号的变化通过例如标准化后的荧光信号比值展示,在涉及cpYFP的实施方案中,所述比值是样品的485纳米荧光信号与420纳米荧光信号之比与对照的相应之比的比值。本发明所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸标准滴加曲线是根据烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针在不同浓度烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的情况下的荧光信号绘制而成。本发明所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针直接转入细胞中,在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸实时定位和定量检测过程中,不需要耗时的样品处理过程,更加准确。本发明烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针在进行高通量化合物筛选时,将不同的化合物添加到细胞培养液中,测定烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量的变化,从而筛选出对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量变化有影响的化合物。在本发明中所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸实时定位、定量检测以及高通量化合物筛选中的应用,均是非诊断和治疗目的,不涉及疾病的诊断和治疗。
本发明还提供包括本文所述光学探针、核酸分子、核酸构建物和/或细胞的检测试剂盒。所述试剂盒还包含检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸所需的其他试剂。所述其他试剂本领域周知,例如缓冲液、细胞培养基、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸标品。示例性缓冲液例如100mMHEPES和100mM NaCl,pH 7.4。
在本文中,浓度、含量、百分数和其它数值均可用范围的形式表示。也应理解,使用这种范围形式只是为了方便和简洁,应该被弹性地解读为包括范围上下限所明确提及的数值,还应包括该范围内包括的所有单个数值或子范围。
实施例
下面结合实施例对本发明提供的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
I.实验材料和试剂
实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法和细胞培养以及成像方法等,这些方法是本领域普通技术人员所熟知的,例如:简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》,J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔著,黄培堂等译:《分子克隆实验指南》(第三版,2002年8月,科学出版社出版,北京);费雷谢尼等的《动物细胞培养:基本技术指南》(第五版),章静波,徐存拴等译;J.S.博尼费斯农,M.达索等的《精编细胞生物学实验指南》,章静波等译。
实施例中所用的基于pCDF-cpYFP,pCDF-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白质粒由华东理工大学蛋白质实验室构建,pCDF质粒载体购自Invitrogen公司。所有用于PCR的引物均由上海捷瑞生物工程技术有限公司和华大基因合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定,序列测定由华大基因公司和杰李测序公司完成。各实施例所用的Taq DNA聚合酶购自东盛生物,pfu DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司,primeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司,三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和dNTPs。BamHI、BglII、HindIII、NdeI、XhoI、EcoRI、SpeI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶(T4PNK)购自Fermentas公司,购买时附带有相对应的缓冲液等。转染试剂Lip2000Kit购于Invitrogen公司。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等化合物均购自Sigma公司。除非特别声明,无机盐类等化学试剂均购自Sigma-Aldrich公司。HEPES盐,氨苄青霉素(Amp)和嘌呤霉素购自Ameresco公司。96孔检测黑板、384孔荧光检测黑板购自Grenier公司。
实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司(加拿大),普通质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。克隆菌株Mach1购自Invitrogen公司。镍柱亲和层析柱和脱盐柱填料均来自GE healthcare公司。
实施例中用到的主要仪器包括:Biotek Synergy 2多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司),X-15R高速冷冻离心机(美国Beckman公司),Microfuge22R台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司),PCR扩增仪(德国Biometra公司),超声破碎仪(宁波新芝公司),核酸电泳仪(申能博彩公司),荧光分光光度计(美国Varian公司),CO2恒温细胞培养箱(SANYO),倒置荧光显微镜(日本尼康公司)。
II.分子生物学方法和细胞实验方法
II.1聚合酶链式反应(PCR):
1.目的片段扩增PCR:
该方法主要用于基因片段扩增和菌落PCR鉴定阳性克隆。所述PCR扩增的反应体系如下:模板序列0.5-1μL,正向引物(25μM)0.5μL,反向引物(25μM)0.5μL,10×pfu缓冲液5μL,pfu DNA聚合酶0.5μL,dNTP(10mM)1μL,灭菌超纯水(ddH2O)41.5-42μL,总体积50μL。PCR扩增程序如下:95℃变性2-10分钟,30轮循环(94-96℃持续30-45秒,50-65℃持续30-45秒,72℃持续一定时间(600bp/min)),72℃延伸10分钟。
2.长片段(>2500bp)扩增PCR:
本发明中使用的长片段扩增,主要是反向PCR扩增载体,在下述实施例中用于获得定点突变的一种技术。在变异部位设计反向PCR引物,其中一条引物的5’端包含变异的核苷酸序列。扩增后的产物就含有相应的突变位点。长片段扩增PCR反应体系如下:模板序列(10pg-1ng)1μL,正向引物(25μM)0.5μL,反向引物(25μM)0.5μL,5×PrimerSTAR缓冲液10μL,PrimerSTAR DNA聚合酶0.5μL,dNTP(2.5mM)4μL,灭菌超纯水(ddH2O)33.5μL,总体积50μL。PCR扩增程序如下:95℃变性5分钟,30轮循环(98℃持续10秒,50-68℃持续5-15秒,72℃持续一定时间(1000bp/min)),72℃延伸10分钟;或者95℃变性5分钟,30轮循环(98℃持续10秒,68℃持续一定时间(1000bp/min)),72℃延伸10分钟。
II.2核酸内切酶酶切反应:
对质粒载体进行双酶切的体系如下:质粒载体20μL(约1.5μg),10×缓冲液5μL,限制性内切酶11-2μL,限制性内切酶21-2μL,用灭菌超纯水补至总体积50μL。反应条件37℃,1-7小时。
II.3 DNA片段5’端磷酸化反应
从微生物中抽提出的质粒或者基因组末端都含有磷酸基团,而PCR产物没有,故需对PCR产物的5’端碱基进行磷酸基团加成反应,只有末端含有磷酸基团DNA分子才能发生连接反应。磷酸化反应体系如下:PCR产物片段DNA序列5-8μL,10×T4连接酶缓冲液1μL,T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)1μL,灭菌超纯水0-3μL,总体积10μL。反应条件37℃,30分钟-2小时后72℃灭活20分钟。
II.4目的片段和载体的连接反应
不同的片段和载体之间的连接方法有所差异,本发明中使用了三种连接方法
1.平末端短片段和线性化载体的平末端连接
该方法的原理是PCR获得的平末端产物在T4 PNK作用下对DNA片段的5’末端进行磷酸化反应后,与线性化的载体在PEG4000和T4 DNA连接酶的作用下连接获得重组质粒。同源重组连接体系如下:T4 PNK处理的DNA片段4μL,线性化载体片段4μL,PEG4000 1μL,10×T4连接酶缓冲液1μL,T4 DNA连接酶1μL,总计10μL。反应条件22℃,30分钟。
2.含有粘性末端的DNA片段和含有粘性末端载体片段的连接
通过限制性内切酶切割的DNA片段通常会产生突出的粘性末端,因此可以和含有序列互补的粘性末端载体片段连接,形成重组质粒。连接反应体系如下:酶切后的PCR产物片段DNA 1-7μL,酶切后的质粒0.5-7μL,10×T4连接酶缓冲液1μL,T4 DNA连接酶1μL,灭菌超纯水补至总体积10μL。反应条件16℃,4-8小时。
3.反向PCR引入定点突变后5’端磷酸化的DNA片段产物自身环化的连接反应
将5’端磷酸化的DNA片段通过自身环化连接反应将线性化载体的3’端和5’端连接反应得到重组质粒。自身环化连接反应体系如下:磷酸化反应体系10μL,T4连接酶(5U/μL)0.5μL,总体积10.5μL。反应条件16℃,4-16小时。
II.5感受态细胞的制备与转化
感受态细胞的制备:
1.挑取单菌落(如Mach1)接种于5mL LB培养基中,37℃摇床过夜。
2.取0.5-1mL过夜培养的菌液转种到50mL LB培养基中,37℃,220rpm培养3至5小时,直到OD600达到0.5。
3.冰浴预冷细胞2小时。
4. 4℃,4000rpm离心10分钟。
5.弃上清,用5mL预冷的缓冲液重悬细胞,待均匀后再加入重悬缓冲液至终体积为50mL。
6.冰浴45分钟。
7. 4℃ 4000rpm离心10分钟,用5mL冰预冷的储存缓冲液重悬细菌。
8.每个EP管中放100μL菌液,-80℃或液氮冻存。
重悬缓冲液:CaCl2(100mM)、MgCl2(70mM)、NaAc(40mM)
储存缓冲液:0.5mL DMSO、1.9mL 80%甘油、1mL 10×CaCl2(1M)、1mL10×MgCl2(700mM)、1mL 10×NaAc(400mM)、4.6mL ddH2O
感受态细胞的转化:
1.取100μL感受态细胞于冰浴上融化。
2.加入适当体积的连接产物,轻轻吹打混匀,冰浴30分钟。通常加入的连接产物的体积少于感受态细胞体积的1/10。
3.将菌液放入42℃水浴中热激90秒,迅速转移至冰浴中放置5分钟。
4.加入500μL LB,于37℃恒温摇床上200rpm培养1小时。
5.将菌液4000rpm离心3分钟,留200μL上清将菌体吹匀,均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面,平板于37℃恒温培养箱内倒置过夜。
II.6蛋白质的表达,纯化和荧光检测
1.将表达载体(例如以pCDF为基础的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针表达载体)转化到BL21(DE3)细胞中,倒置培养过夜,从平板上挑取克隆到250ml锥形瓶中,置于37℃摇床,220rpm培养至OD=0.4-0.8,加入1/1000(v/v)的IPTG(1M),18℃诱导表达24-36小时。
2.诱导表达完成后,4000rpm,30分钟离心收菌,加入50mM的磷酸盐缓冲液重悬菌体沉淀,超声破碎至菌体澄清。9600rpm,4℃离心20分钟。
3.离心上清通过自装的镍柱亲和层析柱纯化获得蛋白,镍柱亲和层析后的蛋白再通过自装的脱盐柱获得溶解在100mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中的蛋白。
4.纯化的蛋白经过SDS-PAGE鉴定后,使用测定缓冲液(100mM HEPES,100mM NaCl,pH 7.4)稀释探针成终浓度为0.2-5μM的蛋白溶液。用测定缓冲液(100mM HEPES,100mMNaCl,pH 7.4)将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸配制成终浓度为50mM的储液。
5.取100μl 1μM的蛋白溶液,37℃温育10分钟,加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸滴定,测定蛋白的420nm光激发后528nm发射和485nm光激发后528nm发射的荧光强度。对样品的荧光激发、发射测定利用多功能荧光酶标仪完成。
6.取100μl 1μM的蛋白溶液,37℃温育10分钟,加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,测定蛋白的吸收光谱和荧光光谱。对样品的吸收光谱和荧光光谱的测定通过分光光度计和荧光分光光度计完成。
II.7哺乳动物细胞的转染和荧光检测
1.将pCDNA3.1+为基础的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针质粒通过转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen)转染到HEK293中,置于37℃,5% CO2的细胞培养箱中培养。待外源基因充分表达24~36h后进行荧光检测。
2.诱导表达完成后,将贴壁的HEK293细胞,用PBS冲洗三次,置于HBSS溶液中分别进行荧光显微镜和酶标仪检测。
实施例1:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白质粒
通过PCR扩增鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌基因中的StNadR和EcNadR基因,PCR产物凝胶电泳后回收后用BamHI和XhoI酶切,同时对pCDF载体进行相应的双酶切。用T4 DNA连接酶连接后,用产物转化DH5α,转化的DH5α涂布于LB平板(链霉素100ug/mL),置于37℃培养过夜。将生长DH5α转化子进行质粒抽提后,进行PCR鉴定。阳性质粒经过测序正确后进行后续的质粒构建。
实施例2:不同插入位点的cpYFP光学探针的表达和检测
本实施例中,以pCDF-StNadR为基础根据烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白晶体结构选择了下述位点插入cpYFP,得到相应pCDF-StNadR-cpYFP质粒:37/38,38/39,39/40,40/41,41/42,42/43,43/44,44/45,44/46,44/47,44/48,45/46,45/47,45/48,46/47,46/48,47/48,48/49,49/50,50/51,51/52,52/53,53/54,54/55,55/56,56/57,57/58,58/59,59/60,61/62,62/63,90/91,91/92,92/93,111/112,112/113,113/114,114/115,115/116,116/117,117/118,118/119,119/120,131/132,132/133,133/134,135/136,169/170,170/171,171/172,172/173,196/197,197/198,197/199,197/200,197/201,197/202,197/203,198/199,198/200,198/201,198/202,198/203,199/200,199/201,199/202,199/203,200/201,200/202,201/202,201/203,202/203,203/204,204/205,205/206,206/207,255/256,256/257,257/258,258/259,259/260,260/261,261/262,262/263,263/264,264/265,270/271,272/273,273/274,274/275,275/276,276/277,277/278,278/279,279/280,280/281,301/302,303/304,304/305,346/347,347/348,349/350,350/351,351/352,351/353,351/355,351/356,351/357,351/358,352/353,352/354,352/355,352/356,352/357,352/358,353/354,354/355,355/356,356/357,357/358,358/359,359/360,360/361,361/362,362/363和363/364。以pCDF-EcNadR为基础根据烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白晶体结构选择了下述位点插入cpYFP,得到相应pCDF-EcNadR-cpYFP质粒:37/38,38/39,39/40,40/41,41/42,42/43,43/44,44/45,45/46,46/47,46/48,47/48,47/49,48/49,49/50,50/51,51/52,52/53,54/55,55/56,56/57,57/58,58/59,59/60,60/61,61/62,62/63,90/91,91/92,92/93,111/112,112/113,113/114,114/115,115/116,116/117,117/118,118/119,119/120,131/132,132/133,133/134,134/135,135/136,136/137,168/169,169/170,170/171,171/172,172/173,173/174,196/197,197/198,197/199,197/200,197/201,197/202,197/203,197/204,197/205,198/199,198/200,198/201,198/202,198/203,198/204,198/205,199/200,199/201,199/202,199/203,199/204,199/205,200/201,200/202,200/203,200/204,200/205,201/202,201/203,201/204,201/205,202/203,202/204,202/205,203/204,203/205,204/205,205/206,206/207,207/208,255/256,256/257,257/258,258/259,259/260,260/261,261/262,262/263,263/264,264/265,270/271,271/272,272/273,272/274,272/275,272/276,272/277,272/278,272/279,272/280,273/274,273/275,273/276,273/277,273/278,273/279,273/280,274/275,274/276,274/277,274/278,274/279,274/280,275/276,275/277,275/278,275/279,275/280,276/277,276/278,276/279,276/280,277/278,277/279,277/280,278/279,278/280,279/280,302/303,303/304,304/305,346/347,347/348,348/349,349/350,350/351,351/352,352/353,353/354,354/355,355/356,356/357,357/358,358/359,359/360,360/361,361/362,362/363和/或363/364。
利用PCR产生cpYFP的DNA片段,同时通过引物5’端引入cpYFP末端同源序列,PCR扩增产生pCDF-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白线性化载体,其5’和3’最末端分别带有和cpYFP两末端对应的完全一致的序列(15bp~20bp)。将线性化的pCDF-StNadR、pCDF-EcNadR和cpYFP片段在Hieff Clone Enzyme的作用下发生同源重组。产物转化DH5α,转化的DH5α涂布于LB平板(链霉素100ug/mL),置于37℃培养过夜。PCR鉴定的阳性克隆抽质粒后测序。由杰李测序公司完成测序。
经过测序正确后,将重组质粒转化到BL21(DE3)中诱导表达,并纯化蛋白质,通过SDS-PAGE电泳大小在75.89KDa附近。该大小符合pCDF-StNadR-cpYFP和pCDF-EcNadR-cpYFP表达出的含His-tag纯化标签的StNadR-cpYFP和EcNadR-cpYFP融合蛋白质的大小。结果如图1所示。
用表达StNadR-cpYFP、EcNadR-cpYFP融合蛋白质的大肠杆菌的破碎上清进行烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应筛选,将含有2mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的融合荧光蛋白质的检测信号除以无烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的融合荧光蛋白质的检测信号。如表1所示,检测结果显示表达有StNadR-cpYFP融合蛋白质的破碎上清对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应超过1.4倍的光学探针有45/46,46/47,199/200,199/203,201/202,351/352,S351/358,352/354和S352/356位点或者其家族蛋白的对应氨基酸位点实施插入的光学探针,其中对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸具有特异性荧光响应的有45/46和46/47位点。表达有EcNadR-cpYFP融合蛋白质的破碎上清对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应超过1.4倍的光学探针有46/47,198/199,199/200,199/202,199/203,199/204,200/201,201/202,203/204,261/262,272/280,273/278,273/280和276/277位点或者其家族蛋白的对应氨基酸位点实施插入的光学探针,其中对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸具有特异性荧光响应的有46/47和272/280位点。
表1
实施例3:不同插入位点的cpGFP光学探针的表达和检测
按照实施例2中的方法将cpYFP替换为cpGFP,构建烟酰胺腺嘌呤二核苷酸绿色荧光蛋白荧光探针。如表2所示,检测结果显示表达有StNadR-cpGFP融合蛋白质的破碎上清对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应超过1.4倍的光学探针有45/46,46/47,199/200,199/203和201/202位点或者其家族蛋白的对应氨基酸位点实施插入的光学探针,其中对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸具有特异性荧光响应的有45/46和46/47位点。表达有EcNadR-cpGFP融合蛋白质的破碎上清对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应超过1.4倍的光学探针有199/200,199/202,199/203,203/204,272/280和273/278位点或者其家族蛋白的对应氨基酸位点实施插入的光学探针,其中对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸具有特异性荧光响应的有272/280位点。
表2
实施例4:不同插入位点的cpBFP光学探针的表达和检测
按照实施例2中的方法将cpYFP替换为cpBFP,构建烟酰胺腺嘌呤二核苷酸蓝色荧光蛋白荧光探针。如表3所示,检测结果显示表达有StNadR-cpBFP融合蛋白质的破碎上清对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应超过1.4倍的光学探针有45/46,46/47,199/200,199/203和201/202位点或者其家族蛋白的对应氨基酸位点实施插入的光学探针,其中对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸具有特异性荧光响应的有45/46和46/47位点。表达有EcNadR-cpBFP融合蛋白质的破碎上清对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应超过1.4倍的光学探针有199/200,199/202,199/203,199/204,200/201,203/204和272/280位点或者其家族蛋白的对应氨基酸位点实施插入的光学探针,其中对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸具有特异性荧光响应的有272/280位点。
表3
实施例5:不同插入位点的cpmApple光学探针的表达和检测
按照实施例2中的方法将cpYFP替换为cpmApple,构建烟酰胺腺嘌呤二核苷酸红色荧光蛋白荧光探针。如表4所示,检测结果显示表达有StNadR-cpmApple融合蛋白质的破碎上清对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应超过1.3倍的光学探针有45/46,46/47,199/200,199/203和201/202位点或者其家族蛋白的对应氨基酸位点实施插入的光学探针,其中对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸具有特异性荧光响应的有45/46和46/47位点。表达有EcNadR-cpmApple融合蛋白质的破碎上清对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应超过1.3倍的光学探针有199/200,199/201,199/202,199/203,199/204,199/205,200/201,201/202,203/204,272/280和273/280位点或者其家族蛋白的对应氨基酸位点实施插入的光学探针,其中对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸具有特异性荧光响应的有272/280位点。
表4
实施例6:linker突变的cpYFP光学探针的表达和检测
对于实施例2中所得的对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应超过1.5倍且对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸具有特异性荧光响应的光学探针,即在StNadR的46/47位点与在EcNadR的272/280位点实施插入的2种光学探针基础上通过反向PCR线性化探针,引物中引入linker突变位点的序列,对得到的PCR产物在Hieff Clone Enzyme的作用下进行同源重组,建立突变库。将突变库重组质粒转化到BL21(DE3)中诱导表达,纯化探针蛋白进行烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应筛选,将含有2mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的融合荧光蛋白质的检测信号除以无烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的融合荧光蛋白质的检测信号。检测结果显示对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应超过或等于1.5倍的光学探针如表5和表6所示。
表5
表6
示例性地,272/280-EcNadR-Q280N/Y281F/R212C-cpYFP-N246的氨基酸序列如SEQID NO:13所示,其示例性核酸序列如SEQ ID NO:14所示。
实施例7:结合口袋突变的cpYFP光学探针的表达和检测
对于实施例6中所得的46/47-StNadR-A45G/Q46L/K47Y/L48P/Y150H-cpYFP-N1、46/47-StNadR-Q46R/K47Y/L48P/ΔK39/ΔI40/ΔK41-cpYFP、和46/47-StNadR-Q46R/K47Y/L48P/ΔK39/ΔI40/ΔK41-cpYFP-N2的光学探针,进行烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合口袋处的K72,H77,H80,G79,T177,S178,E179,R201,I206,R212,E144,P149,Y150,W154,W157,Y294,F297,A298,W261和Y294位氨基酸的突变,潜在底物结合口袋的K244位氨基酸的突变来消除AXP对于探针解离常数的影响并调整烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的亲和力。通过反向PCR线性化探针,引物中引入突变位点的序列,对得到的PCR产物进行同源重组,得到含有以上位点突变的质粒。将突变质粒转化到BL21(DE3)中诱导表达,纯化突变体探针蛋白进行烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应测试,将含有2mM次烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的融合荧光蛋白质的检测信号除以无烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的融合荧光蛋白质的检测信号。检测结果显示对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应超过或等于1.5倍的光学探针如表7所示,其中N1表示cpYFP的N端截短1位氨基酸,N2表示cpYFP的N端截短2位氨基酸。示例性地,46/47-StNadR-A45G/Q46L/K47Y/L48P/H80D/Y150H/I206F-cpYFP-N1所示的序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,其核酸序列如SEQ ID NO:12所示。
表7
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实施例8.光学探针突变体的性能
示例性地,将纯化的实施例6和实施例7所述的1个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针分别进行0mM和5mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸处理10分钟后,使用荧光分光光度计进行荧光谱的检测。
对激发光谱的测定:以370nm至510nm的激发范围和530nm的发射波长记录激发光谱,每5nm读取一次。结果显示,探针在约410和490nm处有两个激发峰,如图2所示。
对发射光谱的测定:固定激发波长分别为420nm和460nm,记录470-600nm和490-600nm的发射光谱,每5nm读取一次。结果如图2所示。
将纯化的实施例6和实施例7所述的69个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸探针进行浓度梯度(0~10mM)的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸检测。对纯化的探针处理10分钟后,检测420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值的变化。结果如图3所示,69个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针的Kd(结合常数)分别为53.43、106.7、148.9、206.5、206.9、213.2、224.1、223.3、228.4、242.7、277.3、291.4、296.3、318.6、329.6、331.6、343.1、339.3、386.3、676、65.52、70.86、224.8、257.6、309.7、444、553.7、641.8、973、2139、168.1、173.7、181.7、307.8、394.1、691.6、767.1、77.05、83.36、189.2、240、1565、1748、23.63、42.48、36.08、16.88、39.98、17.28、32.18、55.83、44.23、22.67、102.9、132.4、32.93、283.2、81.68、37.33、104.3、37.83、1544、142.6、189.5、23.88、267.9、37.95、57.06和23.33μM。
将69个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针与StNadR和EcNadR结合底物ATP及相似物ADP进行反应性检测,将3个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸前体物质β-烟酰胺单核苷酸(NMN),烟酰胺核糖(NR),烟酰胺(NAM)和烟酸(NA)进行反应性检测,结果表明其具有很好的特异性,如图4A和4B所示。
实施例9:光学探针的亚细胞器定位和光学探针在亚细胞器内的性能
本实施例中,使用不同的定位信号肽与光学探针272/280-EcNadR-Q280N/Y281F/R212C-cpYFP-N246P融合,将光学探针定位到不同的细胞器中。
用融合不同定位信号肽的光学探针质粒转染293T细胞36小时后,使用PBS冲洗,置于HBSS溶液中使用倒置荧光显微镜进行FITC通道下进行荧光检测。结果如图5所示。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针通过与不同的特异定位信号肽融合能够定位到包括细胞浆、细胞核、线粒体和核排阻等亚细胞器中。不同的亚细胞结构中都显示有荧光,并且荧光的分布和强度各不相同。
用胞浆表达的光学探针质粒转染293T细胞24小时分别加入2mM NMN,2mM NR和2mMNAM处理24h后,使用PBS冲洗,置于HBSS溶液中,检测420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值的变化。结果如图6所示。检测结果表明,添加NMN,NR和NAM的样品的485/420增加,最高可以达到初始值的1.45倍,而不添加NR,NMN和NAM的对照组的485/420为0.74保持不变。
实施例10:在活细胞中基于光学探针进行高通量化合物筛选
本实施例中,我们使用胞浆表达的272/280-EcNadR-Q280N/Y281F/R212C-cpYFP-N246P的293T细胞进行高通量化合物筛选。
经转染的293T细胞使用PBS冲洗,置于HBSS溶液中(无烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)处理1小时,然后使用10μM的化合物处理1小时。各样品中分别滴加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。使用酶标仪记录420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值变化。以未用任何化合物处理的样品作为对照进行标准化。结果如图7所示。在使用的2000种化合物中,绝大部分的化合物对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进入细胞影响极小。有19种化合物能够提高细胞对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的摄取能力,另外有9种化合物能够明显降低细胞对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的摄取。
实施例11:光学探针定量检测血液中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
在本实施中,使用纯化的Kd为23.33μM的272/280-EcNadR-N62-Q280E/Y281Y/R212C-cpYFP-N246Y对小鼠和人的血液上清中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进行分析。
将272/280-EcNadR-N62-Q280E/Y281Y/R212C-cpYFP-N246Y与稀释的血液上清混合处理10分钟后,使用酶标仪检测420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值。结果如图8所示,小鼠血液中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量在10.5μM左右,人血液中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量在1μM左右。
由以上实施例可知,本发明提供的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针,蛋白分子量相对较小且易于成熟,荧光动态变化大,特异性好,并且能够通过基因操作的方法在细胞中表达,可在细胞内外实时定位、定量检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸;并且能够进行高通量的化合物筛选。
其它实施方式
本说明书描述了许多实施方式。然而应理解,本领域技术人员通过阅读本说明书获知的不背离本发明的构思和范围的各种改进,也应包括在所附权利要求书的范围内。
本文序列
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Claims (10)
1.一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体,其中,
所述变体是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体S,其:
(a)具有SEQ ID NO:1所示的序列并且在选自以下的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个位点具有突变:K39、I40、K41、A45、Q46、K47、L48、K72、H77、H80、E144、Y150、E179、R201、I206、K244、Y294、F297、A298,所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失,
(b)是与(a)的序列具有至少70%序列相同性并具有(1)所述突变并保留对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合能力的序列,
优选地,(a)中所述突变包括选自以下任一组或多组的位点处的突变:(1)A45、Q46、K47、L48、Y150,(2)Q46、K47、L48,(3)A45、Q46、K47、L48,(4)H77,(5)K72、H77,(6)K72、H77、F297,(7)K72、H77、Y294,(8)K72、H77、A298,(9)K72、H77、E179,(10)K72、H77、K244,(11)K72、H77、E144,(12)K72、H77、R201,(13)K72、H77、E144,(14)K72、H77、E179、Y294,(15)K72、I206,(16)H80、I206,(17)K72、H80,(18)I40、K41,(19)K39、I40、K41,
或者,所述变体是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体E,其:
(a)具有SEQ ID NO:2所示的序列并且在选自以下的1个、2个或3个位点具有突变:R212,Q280,Y281,所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失,
(b)是(a)的具有第63-409位氨基酸的截短变体,或
(c)是与(a)或(b)的序列具有至少70%序列相同性并具有(1)所述突变并保留对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合能力的序列,
优选地,(a)中所述突变包括选自以下任一组的位点处的突变:(1)R212,Q280,Y281,(2)R212,Q280,(3)R212,Y281。
2.一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸光学探针,包含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽和光学活性多肽,其中,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的序列内,并且
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S,其具有:
(1)SEQ ID NO:1所示的序列,或与它们有至少70%序列相同性并保留对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合活性的序列,
(2)SEQ ID NO:1所示序列的功能变体,该功能变体在与光学活性多肽连接处的5个氨基酸内具有突变,
(3)权利要求1中所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体S的序列,或
(4)与(2)或(3)所述序列具有至少70%序列相同性并具有(2)所述突变并保留对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感性的序列,
或者,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E,其具有:
(1)SEQ ID NO:2所示的序列或其具有第63-409位氨基酸的截短变体,或与它们有至少70%序列相同性并保留对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合活性的序列,
(2)SEQ ID NO:2所示序列的功能变体,该功能变体在与光学活性多肽连接处的5个氨基酸内具有突变,
(3)权利要求1中所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋白变体E的序列,或
(4)与(2)或(3)所述序列具有至少70%序列相同性并具有(2)所述突变并保留对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感性的序列。
3.如权利要求2所述的光学探针,其中,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的残基37-63、90-93,111-120,131-137,168-174,196-208,255-265,270-281,301-305和/或346-364中或置换其中的残基,
优选地,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S的残基37-63,196-208和/或346-364中或置换其中的残基,或者光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E或其具有第63-409位氨基酸的截短变体的残基37-63,196-208和/或270-281中或置换其中的残基。
4.如权利要求2所述的光学探针,其中,
光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S的选自下述位点中的任一个或多个:37/38,38/39,39/40,40/41,41/42,42/43,43/44,44/45,44/46,44/47,44/48,45/46,45/47,45/48,46/47,46/48,47/48,48/49,49/50,50/51,51/52,52/53,53/54,54/55,55/56,56/57,57/58,58/59,59/60,61/62,62/63,90/91,91/92,92/93,111/112,112/113,113/114,114/115,115/116,116/117,117/118,118/119,119/120,131/132,132/133,133/134,135/136,169/170,170/171,171/172,172/173,196/197,197/198,197/199,197/200,197/201,197/202,197/203,198/199,198/200,198/201,198/202,198/203,199/200,199/201,199/202,199/203,200/201,200/202,201/202,201/203,202/203,203/204,204/205,205/206,206/207,255/256,256/257,257/258,258/259,259/260,260/261,261/262,262/263,263/264,264/265,270/271,272/273,273/274,274/275,275/276,276/277,277/278,278/279,279/280,280/281,301/302,303/304,304/305,346/347,347/348,349/350,350/351,351/352,351/353,351/355,351/356,351/357,351/358,352/353,352/354,352/355,352/356,352/357,352/358,353/354,354/355,355/356,356/357,357/358,358/359,359/360,360/361,361/362,362/363和/或363/364,或者,
光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E的选自下述位点中的任一个或多个:37/38,38/39,39/40,40/41,41/42,42/43,43/44,44/45,45/46,46/47,46/48,47/48,47/49,48/49,49/50,50/51,51/52,52/53,54/55,55/56,56/57,57/58,58/59,59/60,60/61,61/62,62/63,90/91,91/92,92/93,111/112,112/113,113/114,114/115,115/116,116/117,117/118,118/119,119/120,131/132,132/133,133/134,134/135,135/136,136/137,168/169,169/170,170/171,171/172,172/173,173/174,196/197,197/198,197/199,197/200,197/201,197/202,197/203,197/204,197/205,198/199,198/200,198/201,198/202,198/203,198/204,198/205,199/200,199/201,199/202,199/203,199/204,199/205,200/201,200/202,200/203,200/204,200/205,201/202,201/203,201/204,201/205,202/203,202/204,202/205,203/204,203/205,204/205,205/206,206/207,207/208,255/256,256/257,257/258,258/259,259/260,260/261,261/262,262/263,263/264,264/265,270/271,271/272,272/273,272/274,272/275,272/276,272/277,272/278,272/279,272/280,273/274,273/275,273/276,273/277,273/278,273/279,273/280,274/275,274/276,274/277,274/278,274/279,274/280,275/276,275/277,275/278,275/279,275/280,276/277,276/278,276/279,276/280,277/278,277/279,277/280,278/279,278/280,279/280,302/303,303/304,304/305,346/347,347/348,348/349,349/350,350/351,351/352,352/353,353/354,354/355,355/356,356/357,357/358,358/359,359/360,360/361,361/362,362/363和/或363/364。
进一步优选地,
光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S的选自下述位点中的任一个或多个:45/46,46/47,199/200,199/203,201/202,351/352,351/358,352/354和352/356,或者,
光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E的选自下述位点中的任一个或多个:46/47,198/199,199/200,199/202,199/203,199/204,200/201,201/202,203/204,261/262,272/280,273/278,273/280和276/277。
进一步优选地其特征在于,光学活性多肽是荧光蛋白或其功能变体,
优选地,
荧光蛋白具有SEQ ID NO:3-10中任一所示的序列,
荧光蛋白的功能变体在对应于SEQ ID NO:3的第246位氨基酸处具有突变,所述突变优选突变为Y、F、E、V、P、I或L,
荧光蛋白的功能变体在与光学活性多肽连接处的3个氨基酸内具有突变,所述突变优选为缺失突变。
进一步优选地其特征在于,所述光学探针中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽S如SEQID NO:1所示,并且具有以下的一个或多个突变:A45G,A45W,Q46L,Q46R,Q46G,Q46P,Q46W,K47Y,L48P,K72A,K72E,H77A,H80D,H80E,E144Q,Y150H,Y150D,E179A,E179V,R201E,R201V,I206F,K244T,Y294W,Y294F,Y294P,Y294Q,Y294N,Y294C,Y294H,Y294G,Y294A,Y294K,F297Y,F297V,F297R,F297W,F297M,F297I,F297K,F297T,F297Q,F297S,F297L,F297N,F297E,F297A,F297G,F297C,F297D,F297H和/或A298S,光学活性多肽如SEQ ID NO:3-10所示或是其N端缺失1或2个氨基酸的变体,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的46/47位点。
进一步优选地,其特征在于,所述光学探针中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽E如SEQID NO:2所示,并且具有以下的一个或多个突变:R212C,Q280E,Q280P,Q280I,Q280R,Q280N,Q280A,Y281F,Y281H,Y281L和/或Y281I,光学活性多肽如SEQ ID NO:3-10所示或其功能变体,该功能变体在对应于SEQ ID NO:3的第246位氨基酸处具有选自以下的任一种突变Y、F、E、V、P、I或L,光学活性多肽位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感多肽的272/280位点。
5.一种核酸分子,其包含:
(a)权利要求2-4中任一项所述的光学探针的编码序列,
(b)(a)的互补序列。
6.包含权利要求5所述的核酸分子的核酸构建物,
优选地,所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或重组载体。
7.一种宿主细胞,所述宿主细胞:
(1)表达权利要求2-4中任一项所述的光学探针;
(2)包含权利要求5所述的核酸分子;或
(3)包含权利要求6所述的核酸构建物。
8.一种检测试剂盒,其包含:
(1)权利要求2-4中任一项所述的光学探针,
(2)权利要求5所述的核酸序列,
(3)权利要求6所述的核酸构建物,或
(4)权利要求7所述的宿主细胞,
所述检测试剂盒任选还包含利用光学探针检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸所需的其他试剂,
优选地,所述检测试剂盒还包含选自以下的一种或多种试剂:缓冲液、培养基、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸标准品。
9.制备权利要求2-4中任一项所述的光学探针的方法,包括:提供权利要求7所述的宿主细胞,在所述光学探针表达的条件下培养所述宿主细胞,和分离光学探针。
10.权利要求2-4中任一项所述的光学探针、权利要求5所述的核酸序列、权利要求6所述的核酸构建物或权利要求7所述的宿主细胞在检测样品中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、筛选化合物、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸细胞内/外定位中的应用,
优选地,
检测样品中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸包括步骤:使所述光学探针或宿主细胞与样品接触,检测光学活性多肽的光学变化,和根据光学活性多肽的光学变化检测样品中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,
所述筛选化合物包括步骤:在含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的体系中使所述光学探针或宿主细胞与候选化合物接触,检测光学活性多肽的光学变化,和根据光学活性多肽的光学变化筛选化合物;优选地,所述筛选化合物包括步骤:在含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的体系中使所述宿主细胞与候选化合物接触,并且光学活性多肽的光学变化指示所述候选化合物是否调节细胞对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的摄取,
所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸细胞内/外定位包括步骤:将含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的体系与所述光学探针或所述宿主细胞接触,和检测光学活性多肽的光学变化,
更优选地,所述体系是溶液体系、细胞体系或亚细胞体系。
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