CN111333642A - 一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针 - Google Patents
一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111333642A CN111333642A CN201811550073.2A CN201811550073A CN111333642A CN 111333642 A CN111333642 A CN 111333642A CN 201811550073 A CN201811550073 A CN 201811550073A CN 111333642 A CN111333642 A CN 111333642A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- naphthalimide
- aminoalkyl
- substituted
- cell membrane
- nitro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 title claims abstract description 94
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 59
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 95
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 39
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 31
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 29
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 29
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 29
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 28
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 24
- NRKYWOKHZRQRJR-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetamide Chemical compound NC(=O)C(F)(F)F NRKYWOKHZRQRJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 20
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 19
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 18
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 10
- -1 amino alkane Chemical class 0.000 claims description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- PPKSYRUVTABEIE-UHFFFAOYSA-N 3,7-dimethyloctan-1-amine Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCN PPKSYRUVTABEIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000004821 distillation Methods 0.000 claims description 4
- 125000001273 sulfonato group Chemical class [O-]S(*)(=O)=O 0.000 claims description 4
- FSSPGSAQUIYDCN-UHFFFAOYSA-N 1,3-Propane sultone Chemical compound O=S1(=O)CCCO1 FSSPGSAQUIYDCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 claims description 2
- 125000000467 secondary amino group Chemical class [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 abstract description 30
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 abstract description 6
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- XJHABGPPCLHLLV-UHFFFAOYSA-N benzo[de]isoquinoline-1,3-dione Chemical compound C1=CC(C(=O)NC2=O)=C3C2=CC=CC3=C1 XJHABGPPCLHLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-N azetidine Chemical compound C1CNC1 HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 3
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 abstract description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 abstract description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 abstract 1
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 33
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 16
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 16
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 12
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 12
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 10
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 4
- SSJXIUAHEKJCMH-UHFFFAOYSA-N cyclohexane-1,2-diamine Chemical compound NC1CCCCC1N SSJXIUAHEKJCMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 4
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical group 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 3
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 3
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- JRBPAEWTRLWTQC-UHFFFAOYSA-N dodecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCN JRBPAEWTRLWTQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FJLUATLTXUNBOT-UHFFFAOYSA-N 1-Hexadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCN FJLUATLTXUNBOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 150000001338 aliphatic hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000002393 azetidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
- C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D471/06—Peri-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
- C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J43/00—Normal steroids having a nitrogen-containing hetero ring spiro-condensed or not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
- C07J43/003—Normal steroids having a nitrogen-containing hetero ring spiro-condensed or not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton not condensed
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
- C09K2211/1011—Condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1044—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针，一类可用于细胞膜荧光成像的萘酰亚胺类探针，该荧光探针具有合成原料低廉、方法简单且易于衍生等优点。研究发现，该类染料在萘酰亚胺母体的4‑,5‑位引入氮杂环丁烷、氮杂环戊烷等高刚性的结构，同时增加了染料的刚性和亲脂性。此类染料在乙醇中的摩尔消光系数均在35000M‑1cm‑1以上，量子产率最高可达0.72，有很高的亮度和光稳定性；该类染料还具有环境不敏感性，在不同环境中的光谱性质差异极小，有很好的成像准确性；该类染料结构中含有长脂肪烃链或胆固醇衍生物或季铵盐等结构，可以与细胞膜发生相互作用，因而可以实现对细胞膜快速、精准的定位能够快速标记细胞膜并利用于细胞膜荧光成像等领域。
Description
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针。
背景技术
细胞膜能调控物质进出细胞以保证细胞内各项生命活动的需求，维持着细胞内环境的稳定性，又能依靠糖蛋白等识别和传递信息，在细胞生命活动中有着复杂的功能。随着对细胞膜的研究的不断深入，研究者们对细胞膜荧光染料的性质与功能要求也不断提高，尤其超分辨荧光成像技术的迅速崛起促使新型的高稳定性、高亮度细胞膜荧光染料的开发与应用。
目前常用的细胞膜荧光染料如DiD、DiI等，其染料的母体结构为花菁染料，含有长链烷烃结构，具有较高的亲脂性，可以插入磷脂双分子层中实现细胞膜的标记。然而花菁类染料的光稳定性普遍极差，无法满足长时间成像观察的需求；且由于双键的扭转这类染料为环境敏感染料，在大极性环境中荧光很弱，在低极性环境如细胞膜中有较高的亮度，然而细胞膜并非匀质结构，这使这类环境敏感染料的成像准确性大为降低。此外，这类染料的染色时间较长(通常30分钟以上)，在活细胞染色实验中受到严格限制。现有的细胞膜荧光染料难以满足超分辨技术对荧光稳定性、荧光亮度、长时间染色等性能的需求，因而开发高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光染料迫在眉睫。
发明内容
本发明提供了一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针，，该类染料在萘酰亚胺母体的4-,5-位引入氮杂环丁烷、氮杂环戊烷等高刚性的结构，同时增加了染料的刚性和亲脂性。研究发现这类染料有很高的亮度、优异的光稳定性，能够快速高选择性地标记细胞膜，可进一步用于荧光成像。该类染料还具有环境不敏感性，在不同环境中的光谱性质差异极小，有很好的成像准确性。
一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针，其结构式如下所示：
其中
一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针的合成方法，合成步骤如下：
一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针，优选一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的胆固醇衍生物类细胞膜荧光探针，其结构式如下所示：
其中，
n＝0,1,2,3。
所述一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的胆固醇衍生物类细胞膜荧光探针的合成方法，其具体方法如下：
步骤一：中间体N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的合成将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于乙醇中，并向其中加入三氟取代氨基烷烃，升温至50-70℃下反应10-24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到中间体N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺。
步骤二：中间体N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的合成
将中间体N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环伯胺或仲胺，将反应液缓慢加热至100-140℃，并反应10-24h，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物得到中间体N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺。
步骤三：中间体的N-胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺合成
将中间体N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺溶于甲醇中，并加入碳酸钾，将反应液缓慢加热至50-70℃，并反应6-8h，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到中间体N-胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺。
步骤四：细胞膜探针N-(2-胆固醇衍生物)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的合成
将中间体N-胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺溶于乙腈中，并向其中加入碘化钾、碳酸钾及胆固醇衍生物，并将反应液缓慢加热至60-80℃，并反应5-10h，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到细胞膜探针N-(2-胆固醇衍生物)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺。
步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与三氟取代氨基烷烃的质量比为1:0.25-8，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-80g/mL。
步骤二中，N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与氮杂环伯胺或仲胺的质量比为1:0.5-2，N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:5-40g/mL。
步骤三中，N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺与碳酸钾的质量比为1:1-20，N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的质量与甲醇的体积比为1:20-400g/mL。
步骤四中，N-胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺、碘化钾、碳酸钾、胆固醇衍生物的质量比为1:0.25-1:1-3:1-3，N-胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的质量与乙腈的体积比为1:2.5-100g/mL。
一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针，优选一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的磺酸盐衍生物类细胞膜荧光探针，其结构式如下所示：
其中，
n＝0,1,2,3。
所述一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的磺酸盐衍生物类细胞膜荧光探针的合成方法，其具体方法如下：
步骤一：中间体N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的合成
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于乙醇中，并向其中加入1-(N-(3-氨基)烷基-N-甲基)氨基-3,7-二甲基辛烷，升温至50-70℃下反应10-24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到中间体N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺。
步骤二：中间体N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的合成
将中间体N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环伯胺或仲胺，将反应液缓慢加热至100-140℃，并反应10-24h，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物得到中间体N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺。
步骤三：细胞膜探针N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基-N-丙磺酸基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的合成
将中间体N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺溶于乙腈中，1,3-丙烷磺内酯，将反应液缓慢加热至40-80℃，并反应10-24h，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到细胞膜探针N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基-N-丙磺酸基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺。
步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与1-(N-(3-氨基)烷基-N-甲基)氨基-3,7-二甲基辛烷的质量比为1:0.25-8，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-80g/mL。
步骤二中，N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与氮杂环伯胺或仲胺的质量比为1:0.5-2，N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:5-40g/mL。
步骤三中，N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺与1,3-丙烷磺内酯的质量比为1:0.25-5，N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的质量与乙腈的体积比为1:5-100g/mL。
一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针，优选一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的长链烷烃衍生物类细胞膜荧光探针，其结构式如下所示：
其中，
n＝0,1,2,3。
所述一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的长链烷烃衍生物类细胞膜荧光探针的合成方法，其具体方法如下：
步骤一：中间体N-取代胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的合成
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于乙醇中，并向其中加入氨基烷烃，升温至50-70℃下反应10-24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到中间体N-取代胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺。
步骤二：细胞膜探针N-取代胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的合成
将中间体N-取代胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环伯胺或仲胺，将反应液缓慢加热至100-140℃，并反应10-24h，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物得到细胞膜探针N-取代胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺。
步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与氨基烷烃的质量比为1:0.25-8，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-80g/mL。
步骤二中，N-取代胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与氮杂环伯胺或仲胺的质量比为1:0.5-2，N-取代胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:5-40g/mL。上述细胞膜荧光探针在活细胞及活体内能够对细胞膜进行特异性标记并实现荧光成像。
一种高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针在荧光成像、分子探针及荧光传感等领域的应用。
本发明具有以下特征：
该类染料拥有合成原料低价、方法简单且易于衍生等优点。
该类染料在萘酰亚胺母体的4-,5-位引入氮杂环丁基、氮杂环戊基等结构使分子有很强的刚性，可以有效地抑制非辐射跃迁过程，此类染料在乙醇中的摩尔消光系数均在35000M-1cm-1以上，量子产率最高可达0.72，有很高的亮度和光稳定性。
该类染料结构有很强的刚性，有明显的共振型染料环境不敏感的特性。
该类染料有长脂肪烃链或胆固醇衍生物或季铵盐等结构，可以与细胞膜发生相互作用，因而可以实现对细胞膜快速、精准的定位，可应用于细胞膜上蛋白功能等领域的研究中。
附图说明
图1为实施例1制备的细胞膜探针DDAN-DAC的核磁氢谱；
图2为实施例2制备的细胞膜探针HexAN-DAC的高分辨质谱；
图3为实施例3制备的中间体MBAN-DAC的核磁氢谱；
图4为实施例3制备的细胞膜探针MBSO3-DAC的高分辨质谱；
图5为实施例4制备的细胞膜探针CMN-DAC的高分辨质谱；
图6为实施例2制备的细胞膜探针HexAN-DAC在乙醇中归一化荧光激发与发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化的荧光强度与吸收强度，荧光探针的浓度为10μM；
图7为实施例5制备的细胞膜探针DDAN-DAze在乙醇中归一化荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化的荧光强度，荧光探针的浓度为10μM；
图8为实施例5制备的细胞膜探针DDAN-DAze与荧光素在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4)中，经过不同时间激光照射后后其最大荧光发射强度的变化，横坐标为激光照射时间，纵坐标为相对荧光强度，即最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值；
图9为实施例5制备的细胞膜探针DDAN-DAze在不同溶剂中归一化荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化的荧光强度，荧光探针的浓度为10μM；
图10为实施例3制备的细胞膜探针MBSO3-DAC在不同溶剂中的归一化紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化紫外吸收强度，荧光探针的浓度为10μM
图11为实施例3中制备的细胞膜探针MBSO3-DAC在不同溶剂中的归一化荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光发射强度，荧光探针的浓度为10μM；
图12为实施例3中制备的细胞膜探针MBSO3-DAC在曲拉通100的胶束中的共聚焦荧光成像图。
具体实施方式
实施例1
细胞膜探针DDAN-DAC的合成。
中间体DDAN-NBr的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于30mL乙醇中，并向其中滴加十二胺(0.87g，4.68mmol)，加热至90℃下反应24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/二氯甲烷＝2/1，V/V)分离得黄白色固体DDAN-NBr0.54g，产率为71％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.9Hz,1H),8.51(d,J＝7.8Hz,1H),8.23(d,J＝7.8Hz,1H),7.94(d,J＝7.8Hz,1H),3.66(t,J＝6.4Hz,2H),1.1-1.8(m,20H),0.94(t,J＝7.9Hz,3H).
经检测，其结构如上式DDAN-NBr所示。
细胞膜探针DDAN-DAC的合成：
将DDAN-NBr(0.25g，0.51mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(0.35g,3.1mmol)，将反应液缓慢加热至130℃，并反应18h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝150/1，V/V)，得黄色固体0.06g，产率25％。
其核磁谱图氢谱谱图如下图1所示，其具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.46(s,2H),6.82(d,J＝8.6Hz,2H),3.94(t,J＝7.2Hz,2H),3.15(s,2H),2.19(d,J＝11.6Hz,2H),1.73(d,J＝6.3Hz,2H),1.54(s,2H),1.43–1.12(m,22H),0.84(t,J＝6.5Hz,3H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.42,154.48,134.69,133.28,110.54,107.93,106.56,59.54,32.09,31.76,29.48,29.46,29.43,29.39,29.27,29.17,28.16,27.06,23.65,22.55,14.41.
经检测，其结构如上式DDAN-DAC所示，其在乙醇中的紫外吸收波长为475nm，荧光发射波长为485nm，有很高的亮度和光稳定性，对环境不敏感且能够准确定位活细胞细胞膜。
实施例2
细胞膜探针HexAN-DAC的合成。
中间体HexAN-NBr的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于60mL乙醇中，并向其中加入十六胺(0.11g，4.68mmol)，加热至90℃下反应24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/二氯甲烷＝2/1，V/V)分离得黄白色固体HexAN-NBr 0.52g，产率62％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.7Hz,1H),8.51(d,J＝7.9Hz,1H),8.23(d,J＝7.8Hz,1H),7.94(d,J＝7.9Hz,1H),3.63(t,J＝6.5Hz,2H),1.1-1.8(m,28H),0.92(t,J＝7.8Hz,3H).
经检测，其结构如上式HexAN-NBr所示。
细胞膜探针HexAN-DAC的合成：
将N-十六烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.3g，0.55mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(0.45g,3.99mmol)，将反应液缓慢加热至130℃，并反应18h，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝150/1，V/V)，得黄色固体HexAN-DAC 0.1g，产率35％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06(d,J＝8.7Hz,2H),7.51(s,2H),6.85(d,J＝8.5Hz,2H),3.96(t,J＝7.2Hz,2H),3.25(s,2H),2.19(d,J＝11.3Hz,2H),1.73(d,J＝6.3Hz,2H),1.54(s,2H),1.47–1.02(m,30H),0.85(t,J＝6.5Hz,3H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.55,154.62,134.77,133.20,110.54,108.05,106.70,59.55,32.12,31.76,29.48,29.46,29.33,29.32,29.19,28.20,27.07,23.68,22.57,14.43.
其高分辨质谱谱图如下图2所示，具体数据如下：
高分辨质谱理论值C34H50N3O2[M+H]+532.3903,实际值532.3930.
经检测，其结构如上式HexAN-DAC所示，其在乙醇中的紫外吸收波长为475nm，荧光发射波长为485nm，有很高的亮度和光稳定性，对环境不敏感且能够准确定位活细胞细胞膜。
将待测染料分别溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其荧光光谱变化及细胞内细胞膜荧光成像。
HexAN-DAC在乙醇中的光谱测试。取20μL HexAN-DAC母液，加入4mL乙醇中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。
HexAN-DAC在乙醇中的吸收光谱和荧光光谱如下图6所示，其中荧光探针浓度为10μM，HexAN-DAC在乙醇中摩尔消光系数达46136M-1cm-1，量子产率达到0.72，该探针具有很高的亮度。
实施例3
细胞膜探针MBSO3-DAC的合成。
中间体MBAN-NBr的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于60mL乙醇中，并向其中加入1-(N-(3-氨基)丙基-N-甲基)氨基-3,7-二甲基辛烷(1.07g，4.68mmol)，加热至70℃下反应12h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝80:1，V/V)分离得黄色固体MBAN-NBr 0.43g，产率52％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.68(d,J＝7.6Hz,1H),8.48(d,J＝7.7Hz,1H),8.20(d,J＝7.8Hz,1H),7.92(d,J＝7.6Hz,1H),4.24(t,J＝6.5Hz,2H),2.80(s,2H),2.65(s,2H),2.46(s,3H),2.10(s,2H),1.41(s,2H),1.30–1.03(m,8H),0.86(t,J＝6.3Hz,9H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.87,162.12,151.31,135.98,132.38,131.32,130.52,125.56,124.30,123.55,122.28,121.18,77.24,55.19,54.51,39.18,38.82,37.13,31.22,29.71,27.93,24.63,22.71,22.60,19.56.
经检测，其结构如上式MBAN-NBr所示。
中间体MBAN-DAC的合成：
将MBAN-NBr(50mg，0.09mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(200mg,1.77mmol)，将反应液缓慢加热至130℃，并反应18h，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)，得黄色固体MBAN-DAC 25mg，产率52％。
其核磁谱图氢谱谱图如下图3所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.04(d,J＝8.2Hz,2H),6.63(d,J＝8.4Hz,2H),5.70(s,2H),4.17(s,2H),3.16(s,4H),3.07–2.92(m,2H),2.78(s,3H),2.26(d,J＝11.0Hz,4H),1.83(d,J＝6.6Hz,3H),1.53–1.44(m,6H),1.10(d,J＝5.4Hz,4H),1.01–0.76(m,12H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.06,153.29,134.31,133.59,111.06,108.74,106.81,59.35,54.89,54.09,40.04,39.06,36.85,32.57,31.12,29.71,27.89,24.57,23.62,22.71,22.58,19.30,14.14.
经检测，其结构如上式MBAN-DAC所示。
细胞膜探针MBSO3-DAC的合成：
将MBAN-DAC(20mg，0.04mmol)，1,3-丙烷磺内酯(5mg,0.04mmol)溶于5mL乙腈中，并将反应液缓慢加热至60℃反应18h。减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝20/1，V/V)，得深黄色固体MBSO3-DAC 12mg，产率48％。
其高分辨质谱谱图如下图4所示，具体数据如下：
高分辨质谱理论值C35H53N4O5S[M+H]+641.3737,实际值641.3762.
经检测，其结构如上式MBSO3-DAC所示，其在乙醇中的紫外吸收波长为475nm，荧光发射波长为485nm，有很高的亮度和光稳定性，对环境不敏感且能够准确定位活细胞细胞膜。
将待测染料分别溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其荧光光谱变化及细胞内细胞膜荧光成像。
MBSO3-DAC在不同溶剂中的紫外吸收、荧光光谱测试。每次取20μLMBSO3-DAC母液，分别加入4mL待测溶剂中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行紫外吸收和荧光光谱的测试。
MBSO3-DAC在不同溶剂中的紫外吸收光谱如下图10所示，其中荧光探针浓度为10μM，在极性差异很大的溶剂中，MBSO3-DAC的紫外吸收波长和强度均无明显变化，证明MBSO3-DAC为环境不敏感染料。
MBSO3-DAC在不同溶剂中的荧光发射光谱如下图11所示，其中荧光探针浓度为10μM，在极性差异很大的溶剂中，MBSO3-DAC的发射波长和强度均无明显变化，证明MBSO3-DAC为环境不敏感染料。
实施例4
细胞膜探针CMN-DAC的合成。
中间体CFAN-DAC的合成：
将CFAN-NBr(150mg，0.33mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(400mg,3.54mmol)，将反应液缓慢加热至130℃，反应18h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得深黄色固体CFAN-DAC 73mg，产率50％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.46(s,1H),8.05(d,J＝8.4Hz,2H),7.52(s,2H),6.83(d,J＝8.6Hz,2H),4.16(s,2H),3.46(d,J＝4.8Hz,2H),3.16(s,2H),2.20(d,J＝10.7Hz,2H),1.73(s,2H),1.30(dd,J＝28.5,18.2Hz,4H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.68,156.68,154.59,134.95,133.35,110.56,107.83,106.50,59.52,38.24,38.19,32.08,23.64.
经检测，其结构如上式CFAN-DAC所示。
中间体EDA-DAC的合成：
将CFAN-DAC(50mg，0.11mmol)溶于20mL甲醇中，并向其中加入碳酸钾(200mg,1.4mmol),将反应液缓慢加热至70℃，并反应6h。减压除去甲醇，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝40/1，V/V)，得深黄色固体EDA-DAC 33mg，产率85％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.05(d,J＝8.6Hz,2H),7.57(s,2H),6.84(d,J＝8.7Hz,2H),4.12(t,J＝6.4Hz,2H),3.15(d,J＝8.8Hz,2H),2.91(t,J＝6.4Hz,2H),2.20(d,J＝11.5Hz,2H),1.73(d,J＝6.7Hz,2H),1.49–1.16(m,4H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.74,154.68,134.97,133.40,110.64,107.69,106.35,59.48,55.39,32.06,23.62.
经检测，其结构如上式EDA-DAC所示。
细胞膜探针CMN-DAC的合成：
将EDA-DAC(20mg，0.06mmol)，碘化钾(10mg，0.06)，碳酸钾(30mg，0.22mmol)，Chol-ANBr(29mg,0.06mmol)溶于10mL乙腈中，并将反应液缓慢加热至85℃，并反应6h，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝80/1，V/V)，得深黄色固体CMN-DAC 29mg，产率65％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38(d,J＝8.6Hz,2H),7.62(s,2H)，6.51-6.20(m,2H),5.35(s,2H),4.71(d,J＝8.1Hz,2H),4.57(d,J＝4.7Hz,2H),4.23-3.46(m,10H),2.39(dd,J＝28.2,12.6Hz,8H),2.16-1.28(m,16H),1.21-0.75(m,22H).
其高分辨质谱谱图如下图5所示，具体数据如下：
高分辨质谱理论值C49H69N4O4[M+H]+777.5319,实际值777.5365.
经检测，其结构如上式CMN-DAC所示，其在乙醇中的紫外吸收波长为475nm，荧光发射波长为485nm，有很高的亮度和光稳定性，对环境不敏感且能够准确定位活细胞细胞膜。
实施例5
细胞膜探针DDAN-DAze的合成。
中间体DDAN-NBr的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于30mL乙醇中，并向其中滴加十二胺(0.87g，4.68mmol)，加热至90℃下反应24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/二氯甲烷＝2/1，V/V)分离得黄白色固体DDAN-NBr0.54g，产率为71％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.9Hz,1H),8.51(d,J＝7.8Hz,1H),8.23(d,J＝7.8Hz,1H),7.94(d,J＝7.8Hz,1H),3.66(t,J＝6.4Hz,2H),1.1-1.8(m,20H),0.94(t,J＝7.9Hz,3H).
经检测，其结构如上式DDAN-NBr所示。
细胞膜探针DDAN-DAze的合成。
将DDAN-NBr(150mg，0.26mmol)溶于30mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷(400mg,7mmol)，将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝100/1，V/V)，得深黄色固体51mg，产率35％。
其高分辨质谱数据如下：
高分辨质谱理论值C22H26N3O3[M+H]+364.2025,实际值364.2082.
经检测，其结构如上式DDAN-DAze所示，其在乙醇中的荧光发射波长为490nm，有很高的亮度和光稳定性，对环境不敏感且能够准确定位活细胞细胞膜。
将待测染料分别溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其荧光光谱变化及细胞内细胞膜荧光成像。
DDAN-DAze在乙醇中的荧光发射光谱测试。取20μL DDAN-DAze母液，加入4mL乙醇中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行荧光发射光谱的测试。
DDAN-DAze在乙醇中的荧光发射光谱如下图7所示，其中荧光探针浓度为10μM，DDAN-DAze在乙醇中摩尔消光系数达35742M-1cm-1，量子产率达到0.60，该探针具有很高的亮度。
DDAN-DAze与荧光素在水中的PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4)稳定性测试。取20μLDDAN-DAze、荧光素母液，分别加入4mL PBS缓冲液中，配制成10μM的荧光探针测试液，并在500W钨灯下连续照射。光源距离样品50cm，每次将测试液温度稳定在25℃后进行荧光光谱测试。采取0,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,10h为时间点分别测试。
DDAN-DAze与荧光素在不同时间激光照射后，最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值如下图8所示，其中荧光探针浓度均为10μM，在连续照射10h后，DDAN-DAze的荧光发射强度相比初始最大荧光发射强度仅仅降低了10％，然而荧光素则降低了54％，证明DDAN-DAze有很好的光稳定性。
DDAN-DAze在不同溶剂中的荧光发射光谱测试。每次取20μL DDAN-DAze母液，分别加入4mL待测溶剂中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行荧光光谱的测试。
DDAN-DAze在乙醇、乙腈等溶剂中的荧光光谱如下图9所示，其中荧光探针浓度为10μM，在极性差异很大的溶剂中，DDAN-DAze的发射波长和强度均无明显变化，证明DDAN-DAze为环境不敏感染料。
实施例6
取0.5μL MBSO3-DAC母液溶于1mL 0.15％曲拉通水溶液中，震荡1min后取20μL混合液置于0.17mm玻璃载玻片而后进行荧光成像。
MBSO3-DAC在0.15％曲拉通水溶液中的成像结果如下图12所示，MBSO3-DAC由于强的脂溶性能够嵌插在胶束中进行荧光成像，形成圆形环状，证明其可以对亲脂性的胶束进行成像。
Claims (17)
1.一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针，其特征在于：其结构式如下所示：
其中
2.根据权利要求1所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针，其特征在于：其结构式如下所示：
其中，
n＝0,1,2,3。
3.根据权利要求1所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针，其特征在于：其结构式如下所示：
其中，
n＝0,1,2,3。
4.根据权利要求1所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针，其特征在于：其结构式如下所示：
其中，
n＝0,1,2,3。
5.根据权利要求2所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针的合成方法，其具体方法如下：
步骤一：中间体N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的合成
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于乙醇中，并向其中加入三氟取代氨基烷烃，升温至50-70℃下反应10-24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到中间体N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺。
步骤二：中间体N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的合成
将中间体N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环伯胺或仲胺，将反应液缓慢加热至100-140℃，并反应10-24h，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物得到中间体N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺。
步骤三：中间体的N-胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺合成
将中间体N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺溶于甲醇中，并加入碳酸钾，将反应液缓慢加热至50-70℃，并反应6-8h，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到中间体N-胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺。
步骤四：细胞膜探针N-(2-胆固醇衍生物)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的合成
将中间体N-胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺溶于乙腈中，并向其中加入碘化钾、碳酸钾及胆固醇衍生物，并将反应液缓慢加热至60-80℃，并反应5-10h，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到细胞膜探针N-(2-胆固醇衍生物)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺。
6.根据权利要求5所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与三氟取代氨基烷烃的质量比为1:0.25-8，
4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-80g/mL。
7.根据权利要求5所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤二中，N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与氮杂环伯胺或仲胺的质量比为1:0.5-2，
N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:5-40g/mL。
8.如权利要求5所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的4细胞膜荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤三中，N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺与碳酸钾的质量比为1:1-20，
N-(2,2,2-三氟乙酰胺)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的质量与甲醇的体积比为1:20-400g/mL。
9.如权利要求5所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤四中，N-胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺、碘化钾、碳酸钾、胆固醇衍生物的质量比为1:0.25-1:1-3:1-3，
N-胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的质量与乙腈的体积比为1:2.5-100g/mL。
10.根据权利要求3所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针的合成方法，其具体方法如下：
步骤一：中间体N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的合成
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于乙醇中，并向其中加入1-(N-(3-氨基)烷基-N-甲基)氨基-3,7-二甲基辛烷，升温至50-70℃下反应10-24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到中间体N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺。
步骤二：中间体N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的合成
将中间体N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环伯胺或仲胺，将反应液缓慢加热至100-140℃，并反应10-24h，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物得到中间体N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺。
步骤三：细胞膜探针N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基-N-丙磺酸基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的合成
将中间体N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺溶于乙腈中，1,3-丙烷磺内酯，将反应液缓慢加热至40-80℃，并反应10-24h，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到细胞膜探针N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基-N-丙磺酸基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺。
11.根据权利要求10所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与1-(N-(3-氨基)烷基-N-甲基)氨基-3,7-二甲基辛烷的质量比为1:0.25-8，
4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-80g/mL。
12.根据权利要求10所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的磺酸盐衍生物类细胞膜荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤二中，N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与氮杂环伯胺或仲胺的质量比为1:0.5-2，
N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:5-40g/mL。
13.根据权利要求10所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的磺酸盐衍生物类细胞膜荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤三中，N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺与1,3-丙烷磺内酯的质量比为1:0.25-5，
N-(N-甲基-N-(2,9-二甲基)壬烷基)胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的质量与乙腈的体积比为1:5-100g/mL。
14.根据权利要求4所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针的合成方法，其具体方法如下：
步骤一：中间体N-取代胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的合成
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于乙醇中，并向其中加入氨基烷烃，升温至50-70℃下反应10-24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到中间体N-取代胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺。
步骤二：细胞膜探针N-取代胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺的合成
将中间体N-取代胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环伯胺或仲胺，将反应液缓慢加热至100-140℃，并反应10-24h，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物得到细胞膜探针N-取代胺烷基-4,5-双氮杂环取代-1,8萘酰亚胺。
15.根据权利要求14所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感细胞膜荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与氨基烷烃的质量比为1:0.25-8，
4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-80g/mL。
16.根据权利要求14所述的一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤二中，N-取代胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与氮杂环伯胺或仲胺的质量比为1:0.5-2，
N-取代胺烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:5-40g/mL。
17.根据权利要求1所述的一种高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811550073.2A CN111333642A (zh) | 2018-12-18 | 2018-12-18 | 一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811550073.2A CN111333642A (zh) | 2018-12-18 | 2018-12-18 | 一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111333642A true CN111333642A (zh) | 2020-06-26 |
Family
ID=71177465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811550073.2A Pending CN111333642A (zh) | 2018-12-18 | 2018-12-18 | 一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111333642A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112782138A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-05-11 | 生物岛实验室 | 用于检测细胞外囊泡的试剂盒及其应用 |
| CN113666869A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-11-19 | 大连工业大学 | 一类含有氨基的萘酰亚胺类染料在超临界co2中的合成与染色方法 |
| CN115504934A (zh) * | 2021-06-22 | 2022-12-23 | 中国医学科学院药物研究所 | 萘二甲酰亚胺-硝酮类化合物及其制备方法和用途 |
| CN115724798A (zh) * | 2022-11-26 | 2023-03-03 | 南昌大学 | 一种水溶性硫代萘酰亚胺光敏剂、其制备方法及其应用 |
| CN116283878A (zh) * | 2021-12-01 | 2023-06-23 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种用于标记细胞膜的荧光探针及其合成和应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3625947A (en) * | 1957-01-30 | 1971-12-07 | Nippon Kayaku Kk | N heterocyclic ethyl naphthalimides |
| CN106867515A (zh) * | 2015-12-11 | 2017-06-20 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种用于蛋白标记及检测的荧光探针及其合成方法与应用 |
| CN107603269A (zh) * | 2016-07-11 | 2018-01-19 | 华东理工大学 | 一类基于萘酰亚胺的荧光染料、其制备方法及应用 |
| CN107641121A (zh) * | 2016-07-20 | 2018-01-30 | 华东理工大学 | 一种荧光探针及其制备方法和用途 |
| CN108069902A (zh) * | 2016-11-14 | 2018-05-25 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一类标记和/或检测细胞中脂滴的荧光探针及其制备和应用 |
-
2018
- 2018-12-18 CN CN201811550073.2A patent/CN111333642A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3625947A (en) * | 1957-01-30 | 1971-12-07 | Nippon Kayaku Kk | N heterocyclic ethyl naphthalimides |
| CN106867515A (zh) * | 2015-12-11 | 2017-06-20 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种用于蛋白标记及检测的荧光探针及其合成方法与应用 |
| CN107603269A (zh) * | 2016-07-11 | 2018-01-19 | 华东理工大学 | 一类基于萘酰亚胺的荧光染料、其制备方法及应用 |
| CN107641121A (zh) * | 2016-07-20 | 2018-01-30 | 华东理工大学 | 一种荧光探针及其制备方法和用途 |
| CN108069902A (zh) * | 2016-11-14 | 2018-05-25 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一类标记和/或检测细胞中脂滴的荧光探针及其制备和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FED"KO, N. F. ET AL: "Synthesis and properties of N-alkylnaphthalimides with electron donating substituents at positions 4 and 5", 《ZHURNAL ORGANICHNOI TA FARMATSEVTICHNOI KHIMII》 * |
| XIAOGANG LIU ET AL: "Aziridinyl Fluorophores Demonstrate Bright Fluorescence and Superior Photostability by Effectively Inhibiting Twisted Intramolecular Charge Transfer", 《J. AM. CHEM. SOC.》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112782138A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-05-11 | 生物岛实验室 | 用于检测细胞外囊泡的试剂盒及其应用 |
| CN112782138B (zh) * | 2020-12-24 | 2021-10-29 | 生物岛实验室 | 用于检测细胞外囊泡的试剂盒及其应用 |
| CN115504934A (zh) * | 2021-06-22 | 2022-12-23 | 中国医学科学院药物研究所 | 萘二甲酰亚胺-硝酮类化合物及其制备方法和用途 |
| CN113666869A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-11-19 | 大连工业大学 | 一类含有氨基的萘酰亚胺类染料在超临界co2中的合成与染色方法 |
| CN113666869B (zh) * | 2021-09-10 | 2023-11-14 | 大连工业大学 | 一类含有氨基的萘酰亚胺类染料在超临界co2中的合成与染色方法 |
| CN116283878A (zh) * | 2021-12-01 | 2023-06-23 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种用于标记细胞膜的荧光探针及其合成和应用 |
| CN116283878B (zh) * | 2021-12-01 | 2024-09-20 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种用于标记细胞膜的荧光探针及其合成和应用 |
| CN115724798A (zh) * | 2022-11-26 | 2023-03-03 | 南昌大学 | 一种水溶性硫代萘酰亚胺光敏剂、其制备方法及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111333642A (zh) | 一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针 | |
| Mitronova et al. | New fluorinated rhodamines for optical microscopy and nanoscopy | |
| Grimm et al. | Synthesis of a far‐red photoactivatable silicon‐containing rhodamine for super‐resolution microscopy | |
| CA3004831C (en) | Fluorochromes for organelle tracing and multi-color imaging | |
| Shaya et al. | Turn-on fluorene push–pull probes with high brightness and photostability for visualizing lipid order in biomembranes | |
| US8715944B2 (en) | Fluorochromes for organelle tracing and multi-color imaging | |
| CN111334083B (zh) | 一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料及其合成和应用 | |
| Aparin et al. | Fluorogenic dimers as bright switchable probes for enhanced super-resolution imaging of cell membranes | |
| Zhang et al. | Synthesis, spectral properties of cell-permeant dimethine cyanine dyes and their application as fluorescent probes in living cell imaging and flow cytometry | |
| CN111333619B (zh) | 一类488nm激发的高稳定性超分辨荧光染料及其合成和应用 | |
| Ripoll et al. | Synthesis and Spectroscopy of Benzylamine‐Substituted BODIPYs for Bioimaging | |
| US20160169850A1 (en) | Sensor molecule | |
| CN111333618B (zh) | 一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针及其制备方法 | |
| CN111333574B (zh) | 一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针 | |
| CN111333643B (zh) | 一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针 | |
| CN111334074A (zh) | 一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料 | |
| CN111334080A (zh) | 一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针 | |
| CN111334075B (zh) | 一种450nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成方法 | |
| CN111333621B (zh) | 一种488nm激发的免洗Halo-tag探针及其合成和生物应用 | |
| CN111334077A (zh) | 一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成方法 | |
| CN111333622B (zh) | 含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成和应用 | |
| CN111334084B (zh) | 一种高亮度、高稳定性、高渗透性线粒体荧光染料 | |
| CN112940520B (zh) | 一类具有细胞器定位性质的荧光染料在细胞器成像中的应用 | |
| CN111333576B (zh) | 一类高稳定性的免洗Halo-tag探针及其合成方法和生物应用 | |
| CN111333679A (zh) | 一类用于超分辨成像的线粒体荧光探针及其制备和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200626 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |