CN111334080A - 一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针，该探针的结构式如(1)所示，其为可用于碳酸酐酶检测和荧光成像的4‑取代萘酰亚胺类染料，该染料具有合成原料低廉、方法简单且易于衍生等优点。研究表明，其上含有的苯磺胺结构可以高选择性地结合细胞内的碳酸酐酶；在萘酰亚胺染料4‑位引入氮杂环丁烷可以抑制TICT过程，增加染料的亮度和光稳定性。该染料在乙醇中的摩尔消光系数达15382M‑1cm‑1，量子产率达到0.52。染料在水环境中表现为短荧光寿命，在结合碳酸酐酶后处于弱极性环境中表现为长荧光寿命，荧光寿命由4.27ns增加至10.6ns。该碳酸酐酶染料有很高的亮度和光稳定性，能够快速标记碳酸酐酶并利用于碳酸酐酶检测、荧光成像及荧光寿命成像等领域。

Description

一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针。
背景技术
荧光成像技术是一种灵敏度高、选择性好的光学显微成像技术，被广泛应用在生物技术、细胞成像、药物代谢等领域进行相关研究。近年来，新兴的超分辨荧光显微技术进一步将光学显微镜的分辨率提升至数十纳米甚至几个纳米。碳酸酐酶是一种含Zn2+的金属酶，研究表明其在生物体内承担着多种生理学功能，并与多种癌症的发生息息相关，利用荧光染料标记碳酸酐酶进而进行荧光成像，可以了解碳酸酐酶的数量、在细胞中的分布等信息，对疾病诊断、治疗有着重要的意义。
染料需要有足够的亮度才能使发出的荧光信号被检测到，此外还需要光稳定性才能在长时间的观测中不被漂白，现有的荧光染料大多难以满足这样苛刻的要求。例如萘酰亚胺类染料是典型的推-拉电子体系染料，染料在激发态时容易通过TICT(分子内扭转电荷转移)的方式损耗大量能量，大大降低了染料的亮度及光稳定性，极大地限制了它们的应用。此外，现有的对于碳酸酐酶的荧光分析与成像技术大多依赖于荧光强度的测量，然而荧光强度的测定容易受激发光强度、染料分布浓度、光漂白等因素的影响，其结果的准确性受到了很大的影响。荧光寿命成像技术的出现较好的解决了这个问题，荧光寿命是是荧光分子固有的特征参数，与绝对发光强度无关，因而测定时不受激发光强度、荧光团浓度等因素的影响。然而有机小分子荧光染料的寿命通常较短(约为10-9秒)，结合目标分子前后的寿命变化较小。因此，如何通过简单的结构修饰，使染料既有高亮度、高光稳定性以满足高分辨荧光成像，又能在结合碳酸酐酶前后产生明显的寿命变化以实现高分辨的荧光寿命成像成为了一个巨大的挑战。
发明内容
本发明提供了一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针，该探针为4-取代萘酰亚胺类荧光探针，其上含有的苯磺胺结构可以高选择性地结合碳酸酐酶。通过在染料4-位引入氮杂环丁基，有效地抑制了TICT过程，增加了染料的亮度和光稳定性。染料从细胞培养基到与碳酸酐酶结合前后微环境产生变化，荧光寿命有明显增加。该探针可以实现碳酸酐酶的标记检测，可以应用于碳酸酐酶的荧光显微成像及荧光寿命显微成像。
本发明一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针，以4-取代萘酰亚胺染料为结构单元，其结构式如下所示：
Figure BDA0001911476460000021
一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针的合成方法，合成步骤如下：
Figure BDA0001911476460000022
具体合成步骤如下：
步骤一：中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺(SML-Br)的合成：
将4-溴-1,8-萘酐与4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐及三乙胺溶解于无水乙醇中，升温至60-80℃，搅拌8-15h后减压除蒸溶剂，通过硅胶柱色谱分离提纯，得到中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺。
步骤二：探针N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺(SML-Aze)的合成：
将中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺与氮杂环丁烷溶于乙二醇单甲醚中，升温至120-140℃反应8-15h，减压除蒸溶剂后经硅胶柱色谱分离提纯后得到探针N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺。
步骤一中：4-溴-1,8-萘酐、4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐与三乙胺的质量比为1:1-3:1-6，4-溴-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-25g/mL。
步骤二中：N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺与氮杂环丁烷的质量比为1:0.06-6，N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:5-100g/mL。
一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用
本发明具有以下特点：
该探针拥有合成原料低价、方法简单且易于衍生等优点。
该探针在4-位引入的氮杂环丁烷结构可以有效地抑制TICT过程，SML-Aze在乙醇中的摩尔消光系数达15382M-1cm-1，量子产率达到0.52；该碳酸酐酶荧光探针有很高的亮度和光稳定性，可以用于碳酸酐酶的荧光检测与荧光成像。
在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4)中，SML-Aze在加入碳酸酐酶前后染料的荧光寿命由4.27ns增加至10.6ns，结合碳酸酐酶后探针的荧光寿命明显增加，可以用于碳酸酐酶的荧光寿命成像。
该探针在活细胞中能够实时对碳酸酐酶进行精准标记；同时能够监测细胞中的碳酸酐酶的变化，可应用于碳酸酐酶分布及其分子机制等研究中。
附图说明
图1为实施例1中制备的中间体SML-Br的核磁氢谱；
图2为实施例1中制备的中间体SML-Br的核磁碳谱；
图3为实施例1中制备的碳酸酐酶探针SML-Aze的核磁氢谱；
图4为实施例1中制备的碳酸酐酶探针SML-Aze的核磁碳谱；
图5为实施例1制备的碳酸酐酶探针SML-Aze在乙醇中归一化荧光激发与发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化的荧光强度与吸收强度，荧光探针的浓度为10μM；
图6为实施例1制备的碳酸酐酶探针SML-Aze与荧光素在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4)中，经过不同时间激光照射后后其最大荧光发射强度的变化，横坐标为光照时间，纵坐标为相对荧光强度，即最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值；
图7为实施例1中制备的碳酸酐酶探针SML-Aze在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4)中加入碳酸酐酶前后及碳酸酐酶抑制剂依索唑胺前后荧光寿命谱图，横坐标为通道，纵坐标为光子数，荧光探针的浓度为1μM，碳酸酐酶浓度为1μM，依索唑胺浓度为10μM
具体实施方式
实施例1
碳酸酐酶探针SML-Aze的合成。
中间体SML-Br的合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001911476460000041
向50mL乙醇中分别加入4-溴-1,8-萘酐(2.0g,7.2mmol)、4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐(3.2g,14.4mmol)与三乙胺(6.8g,36mmol)，并将反应液加热至80℃。8h后，将反应液冷却至室温并将浑浊液抽滤得灰白色固体SML-Br2.94g，产率92％。
其核磁谱图氢谱如下图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.50(tdd,J＝13.0,7.9,5.1Hz,2H),8.32–8.24(m,1H),8.20–8.10(m,1H),7.96(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.77(d,J＝8.1Hz,2H),7.56(d,J＝8.3Hz,2H),7.33(s,2H),5.29(s,2H).
其核磁谱图碳谱如下图2所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.45,163.41,143.35,141.54,133.33,132.31,131.85,131.67,130.27,129.92,129.28,128.87,128.31,126.26,123.04,122.26,43.32.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：444.9858，实验值：444.9806。
经检测，其结构如上式SML-Br所示。
碳酸酐酶探针SML-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001911476460000051
将SML-Br(0.2g,0.45mmol)、氮杂环丁烷(0.13g,2.25mmol)溶于5mL乙二醇单甲醚中，升温至120℃反应10h，冷却至室温后减压蒸除溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50/1,V/V)分离提纯得到产物SML-Aze，为黄色粉末0.15g，产率为80％。
其核磁谱图氢谱如下图3所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.43(t,J＝8.5Hz,2H),8.24(d,J＝8.5Hz,1H),7.75(d,J＝8.4Hz,2H),7.67–7.54(m,1H),7.48(d,J＝8.4Hz,2H),7.27(s,2H),6.49(d,J＝8.6Hz,1H),5.27(s,2H),4.51(t,J＝7.5Hz,4H),2.4-2.6(2H).
其核磁谱图氢谱如下图4所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.01,168.04,157.79,147.93,147.13,138.42,136.44,136.31,135.40,132.94,131.00,129.21,126.68,125.43,113.03,111.42,60.45,47.57,21.70,19.49.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：422.1175，实验值：422.1151。
经检测，其结构如上式SML-Aze所示，SML-Aze在乙醇中的摩尔消光系数达15382M- 1cm-1，量子产率达到0.52，有很高的亮度和光稳定性，能够准确标记活细胞碳酸酐酶。
将待测染料分别溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其荧光光谱变化及细胞中碳酸酐酶荧光成像。
SML-Aze在乙醇中的光谱测试。取20μL SML-Aze母液，加入4mL乙醇中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。
SML-Aze在乙醇中的吸收光谱和荧光光谱如下图5所示，其中荧光探针浓度为10μM，SML-Aze在乙醇中的摩尔消光系数达15382M-1cm-1，量子产率达到0.52，该探针具有很高的亮度。
SML-Aze与荧光素在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4)中的光稳定性测试。取20μL SML-Aze、荧光素母液，分别加入4mL PBS缓冲液中，配制成10μM的荧光探针测试液，并在500W钨灯下连续照射。光源距离样品50cm，每次将测试液温度稳定在25℃后进行荧光光谱测试。采取0,0.5,1,1.5,2,3,4,5,6,8,10h为时间点分别测试。
SML-Aze与荧光素在不同时间激光照射后，最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值如下图6所示，其中荧光探针浓度均为10μM，在连续照射10h后，SML-Aze的荧光发射强度相比初始最大荧光发射强度仅下降了10％，而荧光素染料的发射强度下降了近90％，证明SML-Aze有很好的光稳定性。
实施例2
碳酸酐酶探针SML-Aze的合成。
中间体SML-Br的合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001911476460000071
向30mL乙醇中分别加入4-溴-1,8-萘酐(1.0g,3.6mmol)、4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐(0.9g,3.6mmol)与三乙胺(1.0g,10.2mmol)，并将反应液加热至60℃。10h后，将反应液冷却至室温并将浑浊液抽滤得灰白色固体SML-Br0.8g，产率85％。
其核磁谱图氢谱如下图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.50(tdd,J＝13.0,7.9,5.1Hz,2H),8.32–8.24(m,1H),8.20–8.10(m,1H),7.96(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.77(d,J＝8.1Hz,2H),7.56(d,J＝8.3Hz,2H),7.33(s,2H),5.29(s,2H).
其核磁谱图碳谱如下图2所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.45,163.41,143.35,141.54,133.33,132.31,131.85,131.67,130.27,129.92,129.28,128.87,128.31,126.26,123.04,122.26,43.32.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：444.9858，实验值：444.9806。
经检测，其结构如上式SML-Br所示。
碳酸酐酶探针SML-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001911476460000072
将SML-Br(0.4g,0.90mmol)、氮杂环丁烷(0.26g,2mmol)溶于5mL乙二醇单甲醚中，升温至140℃反应12h，冷却至室温后减压蒸除溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50/1,V/V)分离提纯得到产物SML-Aze，为黄色粉末0.33g，产率为88％。
其核磁谱图氢谱如下图3所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.43(t,J＝8.5Hz,2H),8.24(d,J＝8.5Hz,1H),7.75(d,J＝8.4Hz,2H),7.67–7.54(m,1H),7.48(d,J＝8.4Hz,2H),7.27(s,2H),6.49(d,J＝8.6Hz,1H),5.27(s,2H),4.51(t,J＝7.5Hz,4H),2.4-2.6(2H).
其核磁谱图氢谱如下图4所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.01,168.04,157.79,147.93,147.13,138.42,136.44,136.31,135.40,132.94,131.00,129.21,126.68,125.43,113.03,111.42,60.45,47.57,21.70,19.49.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：422.1175，实验值：422.1151。
经检测，其结构如上式SML-Aze所示，SML-Aze在乙醇中的摩尔消光系数达15382M- 1cm-1，量子产率达到0.52，有很高的亮度和光稳定性，能够准确标记活细胞碳酸酐酶。
实施例3
碳酸酐酶探针SML-Aze的合成。
中间体SML-Br的合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001911476460000081
向50mL乙醇中分别加入4-溴-1,8-萘酐(3.0g,10.8mmol)、4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐(7.2g,32.4mmol)与三乙胺(13.6g,72mmol)，并将反应液加热至80℃。6h后，将反应液冷却至室温并将浑浊液抽滤得灰白色固体SML-Br3.97g，产率81％。
其核磁谱图氢谱如下图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.50(tdd,J＝13.0,7.9,5.1Hz,2H),8.32–8.24(m,1H),8.20–8.10(m,1H),7.96(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.77(d,J＝8.1Hz,2H),7.56(d,J＝8.3Hz,2H),7.33(s,2H),5.29(s,2H).
其核磁谱图碳谱如下图2所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.45,163.41,143.35,141.54,133.33,132.31,131.85,131.67,130.27,129.92,129.28,128.87,128.31,126.26,123.04,122.26,43.32.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：444.9858，实验值：444.9806。
经检测，其结构如上式SML-Br所示。
碳酸酐酶探针SML-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001911476460000091
将SML-Br(1g,2.25mmol)、氮杂环丁烷(6.0g,48mmol)溶于10mL乙二醇单甲醚中，升温至130℃反应12h，冷却至室温后减压蒸除溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50/1,V/V)分离提纯得到产物SML-Aze，为黄色粉末0.64g，产率为85％。
其核磁谱图氢谱如下图3所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.43(t,J＝8.5Hz,2H),8.24(d,J＝8.5Hz,1H),7.75(d,J＝8.4Hz,2H),7.67–7.54(m,1H),7.48(d,J＝8.4Hz,2H),7.27(s,2H),6.49(d,J＝8.6Hz,1H),5.27(s,2H),4.51(t,J＝7.5Hz,4H),2.4-2.6(2H).
其核磁谱图氢谱如下图4所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.01,168.04,157.79,147.93,147.13,138.42,136.44,136.31,135.40,132.94,131.00,129.21,126.68,125.43,113.03,111.42,60.45,47.57,21.70,19.49.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：422.1175，实验值：422.1151。
经检测，其结构如上式SML-Aze所示，SML-Aze在乙醇中的摩尔消光系数达15382M- 1cm-1，量子产率达到0.52，有很高的亮度和光稳定性，能够准确标记活细胞碳酸酐酶。
实施例4
SML-Aze在加入人碳酸酐酶I及人碳酸酐酶I抑制剂依索唑胺前后荧光发射谱图及荧光寿命谱图。取2μL SML-Aze母液，加入4mL PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4)中，配制成1μM的荧光探针测试液进行荧光光谱及荧光寿命测试；后加人碳酸酐酶I，使酶的终浓度为1μM，混匀5分钟后进行荧光光谱及荧光寿命测试；最后加入抑制剂依索唑胺，使依索唑胺的终浓度为10μM，混匀3分钟后进行荧光光谱及荧光寿命测试。
SML-Aze在加入人碳酸酐酶I前后及抑制剂依索唑胺前后荧光寿命谱图如下图7所示，其中荧光探针浓度为1μM，人碳酸酐酶I的浓度为1μM，依索唑胺的浓度为10μM。在加入碳酸酐酶前后，SML-Aze的荧光寿命由4.27ns增加至10.6ns，在加入抑制剂依索唑胺后荧光寿命又下降为4.94ns。证明SML-Aze能够结合碳酸酐酶，且结合前后有明显的荧光寿命的变化，可以运用于碳酸酐酶的荧光检测、荧光成像、荧光寿命成像等领域中。

Claims (5)

1.一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针，其特征在于：其结构式如下所示：
Figure FDA0001911476450000011
2.如权利要求1所述高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针的合成方法，其特征在于：该合成的具体方法如下：
步骤一：中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-1,8-萘酐与4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐及三乙胺溶解于无水乙醇中，升温至60-80℃，搅拌8-15h后减压除蒸溶剂，通过硅胶柱色谱分离提纯，得到中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺；
步骤二：探针N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺与氮杂环丁烷溶于乙二醇单甲醚中，升温至120-140℃反应8-15h，减压除蒸溶剂后经硅胶柱色谱分离提纯后得到探针N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺。
3.如权利要求2中所述的高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针的合成方法，其特征在于步骤一中：4-溴-1,8-萘酐、4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐与三乙胺的质量比为1:1-3:1-6，4-溴-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-25g/mL。
4.如权利要求2中所述的高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针的合成方法，其特征在于步骤二中：N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺与氮杂环丁烷的质量比为1:0.06-6，N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:5-100g/mL。
5.如权利要求1所述的高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
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