CN102617554A - 一类以萘为母体的双光子荧光探针、其制备方法及应用 - Google Patents
一类以萘为母体的双光子荧光探针、其制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
一类以萘为母体的双光子荧光探针，所述荧光探针具有通式I的结构(附图1)，式I中：X选自X1、X2、X3和X4；
Description
技术领域
本发明涉及一类以萘为母体的双光子荧光探针、其制备方法，以及利用该类荧光探针化合物在肿瘤细胞或组织标记中的应用。
背景技术
当前，癌症发病率正处于“井喷”前期。世界卫生组织国际癌症研究中心公布的《世界癌症报告》中说明，根据目前癌症的发病趋势，到2020年全世界癌症发病率将比现在增加50％，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。所以建立一种简便的、快速的、有效的、灵敏的癌症标记技术是一项重要的工作。现有的标记成像的方法主要有：X线检测技术、超声波检测技术、CT检测技术、磁磁共振(MRI)检测技术、红外热像图检测技术、近红外线扫描检测技术、PET-CT检测技术等。但上述方法在实际成像应用中存在以下缺陷：缺乏成像专一性，具有大的放射性损伤，无法独立标记诊断肿瘤，无法对肿瘤进行深度成像等等。荧光标记的光学分子成像的出现为现存的问题提供了一种很好的解决方法。目前，菲啶类(EB、PI)、吖啶类(AO)、咪唑类(Hoechst、DAPI)和花菁家族类(Cy、TOTO、SYTO)等商品化荧光染料在基因组学技术、核酸定量检测、血细胞分析等领域中都起到了重要的作用。然而，用于肿瘤细胞及组织标记的荧光染料与探针还相对较少，且标记性能较差。
随着双光子技术的发展，双光子荧光显微镜在生命科学的研究中已经成为最重要的成像工具。与传统的单光子荧光共聚焦显微镜相比，双光子荧光显微镜具有显著优势，包括近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等(Helmchen F，Svoboda K，Denk W et al.Nature，1999，2：989-996.Maiti S，Shear J B，Williams R M et al.Science，1997，275：530.Ventelon L，Charier S，Moreaux L et al.Angewandte Chemie International Edition，2001，40：2098.)，因此双光子显微成像技术为生物成像提供了一个崭新的平台。而对肿瘤标记成像、其活体内分布成像以及肿瘤深度成像的专一性双光子荧光探针还相对较少，开发专一性好的标记肿瘤的双光子荧光探针是实现双光子肿瘤成像的关键。
发明内容
本发明提供一类以萘为母体的双光子荧光探针，所述荧光探针具有通式I的结构(附图1)：
其中：
X选自X1、X2、X3和X4；X通过虚线键与通式I相连；
R1和R2各自独立地选自-OCH3、-OCOCH3和卤素；
R3选自-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-和-(CH2)8-；
R4选自C1-6烷基、HOCH2-、HO(CH2)2-、HO(CH2)3-、HO(CH2)4-、HO(CH2)5-和HO(CH2)6-；
R5选自-H、-CN、-COOH、-NH2、-NO2、-OH和-SH。
本发明另一方面提供所述以萘为母体的双光子荧光探针的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)4-溴-1，8-萘酐与R4-NH3按摩尔比1∶1-1∶5反应，制备化合物V：
反应温度为70-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
2)4-溴-1，8-萘酐与式i的化合物按照摩尔比1∶1-1∶5反应，制备化合物VI：
反应温度为70-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
3)4-溴苊醌与式i的化合物按照摩尔比1∶1-1∶5反应，制备化合物VII：
反应温度为70-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
4)使苊醌、丙二腈、二甲基亚砜按照摩尔比1∶1∶5反应，制备化合物VIII：
反应先在室温下进行0.5小时后，逐渐升高反应温度并控制在70-180℃，在该反应温度下反应进行为4-12小时，反应溶剂为二甲基亚砜、四氢呋喃或它们与水组成的混合物
5)将步骤1)-4)中制备得到的化合物V，VI，VII，VIII分别与NH2R3NH2按照摩尔比1∶1-1∶2.5反应，制备化合物IX，X，XI，XII：
反应温度为100-175℃，反应时间为1-7小时，反应溶剂为乙醇、乙二醇单甲醚或其混合物；
6)使化合物IX，X，XI，XII与式ii按照摩尔比1∶1-1∶3反应，制备化合物I：
反应温度为0-100℃，反应时间为12-48小时，反应溶剂为二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯或其混合物，反应在有机碱存在条件下进行，以4-二甲氨基吡啶为催化剂。
上述对本发明的以萘为母体的双光子荧光探针制备方法的描述中，各个取代基的定义，即对R1、R2、R3、R4和R5的定义，均与上述对化合物的描述中的定义相同。
再一方面，本发明提供上述以萘为母体的双光子荧光探针在生物样品标记、尤其是肿瘤细胞和组织标记中的应用。
本发明改进现有的肿瘤标记荧光探针性能上的不足，设计并合成出双光子激发、适用于有效的、专一的标记癌症活细胞和癌变组织的双光子荧光探针。该类双光子荧光染料在非肿瘤细胞和组织内具有较低的荧光背景，在肿瘤细胞和组织内具有较强的荧光信号，且对肿瘤细胞和组织具有很强的专一性标记。这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性。并且还具有较大的有效的双光子吸收截面。本发明的这类化合物同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异。
附图说明
本发明附图13幅：
图1是本发明的以萘为母体的双光子荧光探针的结构通式I。
图2是实施例2中表征本发明的荧光探针化合物A1的在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的双光子共聚焦成像图片。将4μL浓度为4μM的A1-DMSO溶液分别加入到的Hela细胞和HEK293细胞，在37℃，5％CO2下孵育60分钟，选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。图片收集波段500-550nm。图2(a)为hela肿瘤细胞，图2(b)为HEK293肿瘤细胞。
图3是实施例3中本发明的荧光探针化合物A1的不同溶剂中双光子吸收截面的测定结果。测定溶剂为：二甲基亚砜。测定方法为：采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，所用A1溶液浓度都为1×10-4M，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm，在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。
图4是实施例5中表征本发明的荧光探针化合物A2的在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的双光子共聚焦成像图片。将4μL浓度为4μM的A2-DMSO溶液分别加入到的Hela细胞和HEK293细胞，在37℃，5％CO2下孵育60分钟，选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。图片收集波段500-550nm。图4(a)为hela肿瘤细胞，图4(b)为HEK293肿瘤细胞。
图5是实施例6中本发明的荧光探针化合物A2的水溶解性表征结果。使用化合物A2不同浓度的水溶液，测定其在最大吸收波长下吸光度。重复三次。
图6是实施例8中本发明的荧光探针化合物A3的溶剂化效应表征结果。将化合物A3分别加入到的二甲基亚砜、四氢呋喃。测定不同溶剂中的紫外吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b)。
图7是实施例9中本发明的荧光探针化合物A3在不同溶剂中双光子吸收截面表征结果。检测溶剂为：二甲基亚砜、四氢呋喃。测定方法为：采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，所用A3溶液浓度都为1×10-4M，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm，在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。
图8是实施例11中表征本发明的荧光探针化合物A4的在小鼠肺部肿瘤组织与小鼠肺部非肿瘤组织的双光子共聚焦成像图片。将4μL浓度为10μM的A4-DMSO溶液分别加入到的小鼠肺部肿瘤组织切片和小鼠肺部非肿瘤组织切片，选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。图8(a1)和(a2)为加入探针A4后小鼠肺部肿瘤组织切片的聚焦图片，图8(b1)和(b2)为加入探针A4后小鼠肺部非肿瘤组织切片的聚焦图片。其中图8(a1)与图8(b1)的采集波段为500-550nm，图8(a2)与图8(b2)的采集波段为570-650nm。
图9是实施例12中本发明的荧光探针化合物A4的水溶解性表征结果。使用化合物A4不同浓度的水溶液，测定其在最大吸收波长下吸光度。重复三次。
图10是实施例14中表征本发明的荧光探针化合物A5的在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的双光子共聚焦成像图片。将4μL浓度为4μM的A5-DMSO溶液分别加入到的Hela细胞和HEK293细胞，在37℃，5％CO2下孵育60分钟，选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。图10(a1)与图10(a2)是hela细胞，图10(b1)与图10(b2)是HEK293细胞，其中图10(a1)与图10(b1)的采集波段为500-550nm，图10(a2)与图10(b2)的采集波段为570-650nm。
图11是实施例15中表征本发明的荧光探针化合物A5的在小鼠肺部肿瘤组织与小鼠肺部非肿瘤组织的双光子共聚焦成像图片。将4μL浓度为10μM的A5-DMSO溶液分别加入到的小鼠肺部肿瘤组织切片和小鼠肺部非肿瘤组织切片，选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。图11(a1)与图11(a2)是小鼠肺部肿瘤组织，图11(b1)与图11(b2)是小鼠肺部非肿瘤组织，其中图11(a1)与图11(b1)的采集波段为500-550nm，图11(a2)与图11(b2)的采集波段为570-650nm。
图12是实施例17中本发明的荧光探针化合物A6的溶剂化效应表征结果。检测溶剂为二甲基亚砜。测定不同溶剂中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。
图13是实施例18中本发明的荧光探针化合物A6的不同溶剂中双光子吸收截面的测定结果。测定溶剂为：二甲基亚砜、四氢呋喃。测定方法为：采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，所用A1溶液浓度都为1×10-4M，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm，在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。
具体实施方式
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
在本发明的通式化合物中，所述及的R1和R2各自独立地选自-OCH3、-OCOCH3和卤素；优选的技术方案中，R1和R2各自独立地选自-OCH3或卤素；更优选R1和R2各自独立选自-OCH3或-Cl；最优选地，R1为-OCH3，R2均为-Cl。
所述及的R3优选-(CH2)3～7-；最优选-(CH2)5-和-(CH2)6-。
所述及的R4选自C1-6烷基、HOCH2-、HO(CH2)2-、HO(CH2)3-、HO(CH2)4-、HO(CH2)5-和HO(CH2)6-；优选的技术方案中，R4为C1-6烷基；最为优选地，R4为C1-4烷基。
所述及的R5选自-H、-CN、-COOH、-NH2、-NO2、-OH和-SH；优选-H、-CN、-COOH、-NH2和-NO2；更优选-H、-CN、-COOH和-NO2；最优选-H和-NO2。
另一方面，本发明提供了上述本发明以萘为母体的双光子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
1)4-溴-1，8-萘酐与R4-NH3按摩尔比1∶1-1∶5反应，制备化合物V：
反应温度为70-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
优选的实施方式中，反应温度为80-140℃，反应时间为2-10小时，反应溶剂选自乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，4-溴-1，8-萘酐与R4-NH3摩尔为1∶1-1∶4；
进一步优选的实施方式中，反应温度为90-120℃，反应时间为3-10小时，反应溶剂选自乙酸乙酯、醋酸或其混合物，4-溴-1，8-萘酐与R4-NH3摩尔为1∶1-1∶3；
最优选的实施方式中，反应温度为95-110℃，反应时间为4-8小时，反应溶剂选自醋酸，4-溴-1，8-萘酐与R4-NH3摩尔为1∶1-1∶2；
2)4-溴-1，8-萘酐与式i的化合物按照摩尔比1∶1-1∶5反应，制备化合物VI：
反应温度为70-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
优选的实施方式中，反应温度为80-140℃，反应时间为2-10小时，反应溶剂选自乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，4-溴-1，8-萘酐与R4-NH3摩尔为1∶1-1∶4；
进一步优选的实施方式中，反应温度为90-120℃，反应时间为3-10小时，反应溶剂选自乙酸乙酯、醋酸或其混合物，4-溴-1，8-萘酐与R4-NH3摩尔为1∶1-1∶3；
最优选的实施方式中，反应温度为95-110℃，反应时间为4-8小时，反应溶剂选自醋酸，4-溴-1，8-萘酐与R4-NH3摩尔为1∶1-1∶2；
3)4-溴苊醌与式i的化合物按照摩尔比1∶1-1∶5反应，制备化合物VII：
反应温度为70-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
优选的实施方式中，反应温度为80-140℃，反应时间为2-10小时，反应溶剂选自乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，4-溴-1，8-萘酐与R4-NH3摩尔比为1∶1-1∶4；
进一步优选的实施方式中，反应温度为90-120℃，反应时间为3-10小时，反应溶剂选自乙酸乙酯、醋酸或其混合物，4-溴-1，8-萘酐与R4-NH3摩尔为1∶1-1∶3；
最优选的实施方式中，反应温度为95-110℃，反应时间为4-8小时，反应溶剂选自醋酸，4-溴-1，8-萘酐与R4-NH3摩尔为1∶1-1∶2；
4)使苊醌、丙二腈、二甲基亚砜按照摩尔比1∶1∶5反应，制备化合物VIII：
反应先在室温下进行0.5小时后，逐渐升高反应温度并控制在70-180℃，在该反应温度下反应进行为4-12小时，反应溶剂为二甲基亚砜、四氢呋喃或它们与水组成的混合物；
优选的实施方式中，反应先在室温下进行0.5小时后，逐渐升高反应温度并控制在80-160℃，在该反应温度下反应进行为4-10小时，反应溶剂为二甲基亚砜、四氢呋喃或它们与水组成的混合物；
进一步优选的实施方式中，反应先在室温下进行0.5小时后，逐渐升高反应温度并控制在90-140℃，在该反应温度下反应进行为4-8小时，反应溶剂为二甲基亚砜或它与水组成的混合物；
最优选的实施方式中，反应先在室温下进行0.5小时后，逐渐升高反应温度并控制在100-120℃，在该反应温度下反应进行为4-6小时，反应溶剂为二甲基亚砜；
5)将步骤1)-4)中制备得到的化合物V，VI，VII，VIII分别与NH2R3NH2按照摩尔比1∶1-1∶2.5反应，制备化合物IX，X，XI，XII：
反应温度为100-175℃，反应时间为1-7小时，反应溶剂为乙醇、乙二醇单甲醚或其混合物；
优选的实施方式中，反应温度为100-165℃，反应时间为1-6小时，反应溶剂为乙醇、乙二醇单甲醚或其混合物，化合物V，VI，VII，VIII分别与NH2R3NH2摩尔为1∶1-1∶2.5；
进一步优选的实施方式中，反应温度为100-150℃，反应时间为1-5小时，反应溶剂为乙醇、乙二醇单甲醚或其混合物，化合物V，VI，VII，VIII分别与NH2R3NH2摩尔为1∶1-1∶2；
最优选的实施方式中，反应温度为100-130℃，反应时间为1-4小时，反应溶剂为乙二醇单甲醚，化合物V，VI，VII，VIII分别与NH2R3NH2摩尔为1∶1-1∶1.5；
6)使化合物IX，X，XI，XII与式ii按照摩尔比1∶1-1∶3反应，制备化合物I：
反应温度为0-100℃，反应时间为12-48小时，反应溶剂为二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯或其混合物，反应在有机碱存在条件下进行，以4-二甲氨基吡啶催化剂。
优选的实施方式中，反应温度为10-80℃，反应时间为12-32小时，反应溶剂为二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯或其混合物，反应在有机碱存在条件下进行，以4-二甲氨基吡啶催化剂，化合物IX，X，XI，XII与式ii摩尔为1∶1-1∶3；
进一步优选的实施方式中，反应温度为20-70℃，反应时间为12-24小时，反应溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯或其混合物，反应在有机碱存在条件下进行，以4-二甲氨基吡啶催化剂，化合物IX，X，XI，XII与式ii摩尔为1∶1-1∶2.5；
最优选的实施方式中，反应温度为25-40℃，反应时间为12-24小时，反应溶剂为二氯甲烷，反应在有机碱存在条件下进行，以4-二甲氨基吡啶催化剂，化合物IX，X，XI，XII与式ii摩尔为1∶1-1∶1.5；
上述对本发明的以萘为母体的双光子荧光探针制备方法的描述中，各个取代基(R1、R2、R3、R4和R5)的定义及优选，均与本发明中对化合物的描述中的定义及优选相同。
对本发明采用上述方法合成的双光子荧光探针化合物，采用核磁共振谱图或质谱来确认其结构，并且辅以碳谱、熔点测试来辅助确认其结构。
本发明所述的以萘为母体的双光子荧光探针具备以下优点：
所述化合物引入了专一性靶向点，提高了对肿瘤细胞和组织标记的专一性、特异性；
所述化合物具有优异的双光子性能，应用于生物样品成像时具有低的生物光漂白、光损伤和生物毒性，并且产生的荧光信号可以穿透较深的生物组织；
所述化合物部分分子的荧光发射波长大于600nm，可用于动物活体成像；
所述化合物中带有硝基的分子可作为比例型探针用于肿瘤细胞和组织的标记，可以实现很好的定量标记，并能避免外在的环境因素对荧光强度的干扰；
所述化合物毒副性小，原料易得，结构简单，易于之辈，易产业化；
鉴于此，本发明所述的双光子荧光探针化合物可用于肿瘤细胞和组织标记。除了以本文中所述的形式直接用于肿瘤细胞和组织的染色外，含有本发明的双光子荧光探针化合物的组合物也可以用于肿瘤细胞和组织的染色。所述组合物中应当包含有效量的本发明所提供的双光子荧光探针化合物之一。另外，还可以包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、pH调节剂等。这些组分都是本行业内已知的。上述组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。
本发明还提供使用上述本发明的双光子荧光探针化合物标记肿瘤细胞和组织生物样品的方法，该方法包括使所述化合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
制备探针化合物A1
(1)中间体1的合成
将20mmol 4-溴-1，8-萘酐和25mmol甲胺加入到含有10ml醋酸溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热100℃回流持续反应2h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得白色固体粉末粗产品，中间产物1，收率96％。
(2)中间体2的合成
将上步20mmol粗产品1和30mmol己二胺加入到含有20ml乙二醇单甲醚溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125℃回流持续反应5h后停止。混合物倒入冰水中，黄色沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，柱色谱分离得黄色固体粉末中间体2，收率55％。
(3)探针化合物A1的合成
将20mmol黄色固体粉末中间体2，25mmol吲哚美辛，25mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)以及少许4-甲基吡啶加入到无水的二氯甲烷溶液中，室温下搅拌反应24小时，停止反应，减压蒸出大部分溶剂，柱色谱分离得亮黄色产品，收率84％。
图1为化合物A1核磁图，1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.69(d，J＝8.3Hz，1H)，8.43(d，J＝7.2Hz，1H)，8.25(d，J＝8.5Hz，1H)，8.03(s，1H)，7.72(d，J＝3.5Hz，2H)，7.64(dt，J＝20.8，6.4Hz，5H)，7.12(d，J＝2.4Hz，1H)，6.91(d，J＝9.0Hz，1H)，6.72(d，J＝8.6Hz，1H)，6.68(dd，J＝9.0，2.5Hz，1H)，4.22(s，1H)，3.74(s，3H)，3.48(s，2H)，3.37-3.12(m，16H)，3.08(d，J＝6.1Hz，2H)，2.51(d，J＝1.6Hz，6H)，2.22(s，3H)，1.71-1.57(m，3H)，1.37(ddd，J＝24.7，14.6，6.8Hz，8H)，1.23(s，1H)。
实施例2
探针化合物A1对肿瘤细胞与非肿瘤细胞的标记试验
使用实施例1合成的化合物A1，以浓度为4μM的A1-DMSO溶液4μL分别加入到的Hela细胞和HEK293细胞，在37℃，5％CO2下将加入探针A1的Hela细胞和HEK293细胞于培养基中孵育60分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。成像显示Hela细胞中的有强荧光信号，HEK293细胞中无荧光信号。图2(a)为加入探针A1后Hela细胞的聚焦图片，图2(b)为加入探针A1后Hela细胞的聚焦图片。图片收集波段500-550nm。
实施例3
探针A1的双光子有效吸收截面检测试验：
采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，将实施例1合成的化合物A1分别加入到的甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氧六环、二甲基亚砜、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、水等溶剂中双光子吸收截面的测试，所用溶液浓度都为1×10-4M，用计算公式如下所示：
公式中的C为溶液的浓度，n是溶剂的折射率，可查表得到。F是上转换荧光强度，由实验测得。δ是双光子吸收截面。参比溶液的物理量均用下标r表示。
测定不同溶剂中、不同波长下双光子有效吸收截面(Φδ)图3。双光子激发荧光光谱的激发源是一台锁模飞秒钛蓝宝石激光器，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm，在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。
实施例4
制备探针化合物A2：
(1)中间体1的合成
将20mmol 4-溴-1，8-萘酐和25mmol邻苯二胺加入到含有10ml醋酸溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热95℃回流持续反应4h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，中间产物1，收率90％。
(2)中间体2的合成
将上步20mmol粗产品1和25mmol己二胺加入到含有20ml乙二醇单甲醚溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125℃回流持续反应5h后停止。混合物倒入冰水中，黄色沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，柱色谱分离得黄色固体粉末中间体2，收率63％。
(3)探针A2的合成
将20mmol黄色固体粉末中间体2，25mmol吲哚美辛，25mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)以及少许4-甲基吡啶加入到无水的二氯甲烷溶液中，室温下搅拌反应24小时，停止反应，减压蒸出大部分溶剂，柱色谱分离得深黄色产品A2，收率84％。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.99(d，J＝7.2Hz，2H)，8.69(d，J＝8.3Hz，1H)，8.43(d，J＝7.2Hz，1H)，8.25(d，J＝8.5Hz，1H)，8.19(d，J＝6.3Hz，2H)，8.03(s，1H)，7.85(d，J＝4.6Hz，1H)，7.72(d，J＝3.5Hz，2H)，7.64(dt，J＝20.8，6.4Hz，5H)，7.12(d，J＝2.4Hz，1H)，6.91(d，J＝9.0Hz，1H)，6.72(d，J＝8.6Hz，1H)，6.68(dd，J＝9.0，2.5Hz，1H)，4.22(s，1H)，3.48(s，2H)，3.37-3.12(m，16H)，3.08(d，J＝6.1Hz，2H)，2.51(d，J＝1.6Hz，6H)，2.22(s，3H)，1.71-1.57(m，3H)，1.37(ddd，J＝24.7，14.6，6.8Hz，8H)，1.23(s，1H)。
实施例5
探针化合物A2对肿瘤组织与非肿瘤组织的标记试验
分别将小鼠肺部肿瘤组织切片和小鼠肺部非肿瘤组织切片浸泡于上述实施例4合成的化合物A2的10μM PBS溶液中，30分钟后取出，装片，封存，双光子激光共聚焦拍摄荧光图片。双光子激光共聚焦成像显示在小鼠肺部肿瘤组织切片中有强荧光信号，在小鼠肺部非肿瘤组织切片中未收集到荧光信号。图4(a)为加入探针A2后小鼠肺部肿瘤组织切片的聚焦图片，图4(b)为加入探针A2后小鼠肺部非肿瘤组织切片的聚焦图片。图片收集波段500-550nm。
实施例6
探针化合物A2的水溶解性检测试验
使用上述实施例4合成的化合物A2加入到水中，测定在不同浓度A2水溶液的最大吸收波长下吸光度。测试结果显示当化合物A2浓度为5μM时，吸光度值未发生偏移，即化合物A2在水中的溶解度为5μM。图5为不同探针A2浓度的最大吸收波长下吸光度。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计。
实施例7
制备探针化合物A3
(1)中间体1的合成
将20mmol 4-溴-1，8-萘酐和25mmol4-硝基邻苯二胺加入到含有10ml醋酸溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热105℃回流持续反应3h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，中间产物1，收率87％。
(2)中间体2的合成
将上步20mmol粗产品1和25mmol己二胺加入到含有20ml乙二醇单甲醚溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125℃回流持续反应4h后停止。混合物倒入冰水中，橙红色沉淀析出，抽滤得橙红色固体粉末粗产品，柱色谱分离得红色固体粉末中间体2，收率54％。
(3)探针A3的合成
将20mmol橙红色固体粉末中间体2，25mmol吲哚美辛，25mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)以及少许4-甲基吡啶加入到无水的二氯甲烷溶液中，室温下搅拌反应28小时，停止反应，减压蒸出大部分溶剂，柱色谱分离得橘红色产品A3，收率84％。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.99(d，J＝7.2Hz，1H)，8.69(d，J＝8.3Hz，1H)，8.43(d，J＝7.2Hz，1H)，8.25(d，J＝8.5Hz，1H)，8.19(d，J＝6.3Hz，1H)，8.03(s，1H)，7.85(d，J＝4.6Hz，1H)，7.72(d，J＝3.5Hz，2H)，7.64(dt，J＝20.8，6.4Hz，5H)，7.12(d，J＝2.4Hz，1H)，6.91(d，J＝9.0Hz，1H)，6.72(d，J＝8.6Hz，1H)，6.68(dd，J＝9.0，2.5Hz，1H)，4.22(s，1H)，3.48(s，2H)，3.37-3.12(m，16H)，3.08(d，J＝6.1Hz，2H)，2.51(d，J＝1.6Hz，6H)，2.22(s，3H)，1.71-1.57(m，3H)，1.37(ddd，J＝24.7，14.6，6.8Hz，8H)，1.23(s，1H)。
实施例8
探针化合物A3的溶剂化效应检测试验
使用上述实施例7合成的化合物A3分别加入到的甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氧六环、二甲基亚砜、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、水等溶剂中，测定不同溶剂中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。测试结果显示，随着溶剂极性的改变，紫外吸收光谱中的最大吸收波长有相应的移动，荧光发射光谱也同样存在着最大发射波长的移动。图6(a)为探针A3在不同溶剂中的紫外吸收光谱，图6(b)为探针A3在不同溶剂中的荧光发射光谱。所用仪器分别是Agilent8453紫外分光光度计和Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计。
实施例9
探针化合物A3的双光子有效吸收截面检测试验
采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，将上述实施例7合成的探针化合物A3分别加入到的甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氧六环、二甲基亚砜、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、水等溶剂中双光子吸收截面的测试，所用溶液浓度都为1×10-4M，用计算公式2.2所示，就能得到双光子吸收截面值。使用，测定不同溶剂中、不同波长下双光子有效吸收截面(Φδ)图7。双光子激发荧光光谱的激发源是一台锁模飞秒钛蓝宝石激光器，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm，在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。
实施例10
制备探针化合物A4
(1)中间体1的合成
在单口烧瓶中加入33mmol的苊醌，180mmol液溴，搅拌下，缓慢升温至65℃，并恒温搅拌3h。反应停止倒入300ml含有少量H2SO4的蒸馏水中析出黄色固体，水溶液呈深黄色，加热沸腾去除溴及溴化氢，直到液体呈无色。过滤并多次溶解使滤液呈中性，干燥后得到粗产品，中间体1，粗收率90％。M.p.236-238℃。
(2)中间体2的合成
将20mmol中间体1和25mmol邻苯二胺加入到含有10ml醋酸溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热100℃回流持续反应6h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，中间产物2，收率79％。
(3)中间体3的合成
将上步20mmol中间产物2和25mmol己二胺加入到含有20ml乙二醇单甲醚溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125℃回流持续反应6h后停止。混合物倒入冰水中，黄色沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，柱色谱分离得黄色固体粉末中间体3，收率66％。
(4)探针A4的合成
将20mmol黄色固体粉末中间体3，30mmol吲哚美辛，25mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)以及少许4-甲基吡啶加入到无水的二氯甲烷溶液中，室温下搅拌反应25小时，停止反应，减压蒸出大部分溶剂，柱色谱分离得黄色产品A4，收率74％。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.86(d，J＝7.9Hz，2H)8.69(d，J＝8.3Hz，1H)，8.43(d，J＝7.2Hz，1H)，8.25(d，J＝8.5Hz，1H)，8.17(d，J＝6.3Hz，2H)，8.03(s，1H)，7.72(d，J＝3.5Hz，2H)，7.64(dt，J＝20.8，6.4Hz，5H)，7.12(d，J＝2.4Hz，1H)，6.91(d，J＝9.0Hz，1H)，6.72(d，J＝8.6Hz，1H)，6.68(dd，J＝9.0，2.5Hz，1H)，4.22(s，1H)，3.48(s，2H)，3.37-3.12(m，16H)，3.08(d，J＝6.1Hz，2H)，2.51(d，J＝1.6Hz，6H)，2.22(s，3H)，1.71-1.57(m，3H)，1.37(ddd，J＝24.7，14.6，6.8Hz，8H)，1.23(s，1H)。
实施例11
探针A4在对肿瘤组织与非肿瘤组织的标记试验
分别将小鼠肺部肿瘤组织切片和小鼠肺部非肿瘤组织切片浸泡于上述实施例10合成的化合物A4的10μM PBS溶液中，30分钟后取出，装片，封存，双光子激光共聚焦拍摄荧光图片。双光子激光共聚焦成像显示在小鼠肺部肿瘤组织切片中有强荧光信号，在小鼠肺部非肿瘤组织切片中未收集到荧光信号。图8(a1)和(a2)为加入探针A4后小鼠肺部肿瘤组织切片的聚焦图片，图8(b1)和(b2)为加入探针A4后小鼠肺部非肿瘤组织切片的聚焦图片。其中图8(a1)与图8(b1)的采集波段为500-550nm，图8(a2)与图8(b2)的采集波段为570-650nm。
实施例12
探针A4的水溶解性检测试验
使用上述合成的化合物A4加入到水中，测定在不同化合物A4浓度的最大吸收波长下吸光度。测试结果显示当化合物A1浓度为24μM时，吸光度值未发生偏移，即化合物A4在水中的溶解度为24μM。图9为不同探针A4浓度的最大吸收波长下吸光度。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计。
实施例13
合成探针化合物A5
(1)中间体1的合成
在单口烧瓶中加入33mmol的苊醌，180mmol液溴，搅拌下，缓慢升温至65℃，并恒温搅拌3h。反应停止倒入300ml含有少量H2SO4的蒸馏水中析出黄色固体，水溶液呈深黄色，加热沸腾去除溴及溴化氢，直到液体呈无色。过滤并多次溶解使滤液呈中性，干燥后得到粗产品，中间体1，粗收率90％。M.p.236-238℃。
(2)中间体2的合成
将20mmol中间体1和30mmol邻苯二胺加入到含有10ml醋酸溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热100℃回流持续反应5h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得红色固体粉末粗产品，中间产物2，收率83％。
(3)中间体3的合成
将上步20mmol中间产物2和25mmol己二胺加入到含有20ml乙二醇单甲醚溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125℃回流持续反应5.5h后停止。混合物倒入冰水中，橙红色沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，柱色谱分离得橙红色固体粉末中间体3，收率72％。
(4)探针A5的合成
将20mmol橙红色固体粉末中间体3，30mmol吲哚美辛，25mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)以及少许4-甲基吡啶加入到无水的二氯甲烷溶液中，室温下搅拌反应25小时，停止反应，减压蒸出大部分溶剂，柱色谱分离得橙红色产品A5，收率69％。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.86(d，J＝7.9Hz，1H)8.69(d，J＝8.3Hz，1H)，8.43(d，J＝7.2Hz，1H)，8.25(d，J＝8.5Hz，1H)，8.23(d，J＝6.9Hz，1H)，8.18(d，J＝6.3Hz，1H)，8.03(s，1H)，7.72(d，J＝3.5Hz，2H)，7.64(dt，J＝20.8，6.4Hz，5H)，7.12(d，J＝2.4Hz，1H)，6.91(d，J＝9.0Hz，1H)，6.72(d，J＝8.6Hz，1H)，6.68(dd，J＝9.0，2.5Hz，1H)，4.22(s，1H)，3.48(s，2H)，3.37-3.12(m，16H)，3.08(d，J＝6.1Hz，2H)，2.51(d，J＝1.6Hz，6H)，2.22(s，3H)，1.71-1.57(m，3H)，1.37(ddd，J＝24.7，14.6，6.8Hz，8H)，1.23(s，1H)。
实施例14
探针A5对肿瘤细胞与非肿瘤细胞的标记试验I
使用实施例13合成的化合物A5，以浓度为4μM的A5-DMSO溶液4μL分别加入到的Hela细胞和HEK293细胞，在37℃，5％CO2下将加入探针A5的Hela细胞和HEK293细胞于培养基中孵育60分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。成像显示Hela细胞中的有强荧光信号，HEK293细胞中无荧光信号。图10(a1)与图10(a2)hela细胞，图10(b1)与图10(b2)HEK293细胞，其中图10(a1)与图10(b1)的采集波段为500-550nm，图10(a2)与图8(b2)的采集波段为570-650nm。
实施例15
探针A5对肿瘤组织与非肿瘤组织的标记试验II
分别将小鼠肺部肿瘤组织切片和小鼠肺部非肿瘤组织切片浸泡于上述实施例13合成的化合物A5的PBS溶液中(浓度10μM)，30分钟后取出，装片，封存，双光子激光共聚焦拍摄荧光图片。双光子激光共聚焦成像显示在小鼠肺部肿瘤组织切片中有强荧光信号，在小鼠肺部非肿瘤组织切片中未收集到荧光信号。图11(a1)与图11(a2)小鼠肺部肿瘤组织，图11(b1)与图11(b2)小鼠肺部非肿瘤组织，其中图11(a1)与图11(b1)的采集波段为500-550nm，图11(a2)与图11(b2)的采集波段为570-650nm。
实施例16
合成探针化合物A6
(1)中间体1的合成
0.5克苊醌，0.2克丙二睛溶解于50毫升的二氯甲烷中，直接加入到短、粗硅胶柱中(直径50毫米，装有硅胶高度为约100毫米)，连续快速用二氯甲烷冲柱，收集Rf＝0.8的成色谱带，蒸出二氯甲烷，得到橙红色固体中间产物1。收率＞97％。
(2)中间体2的合成
1克中间产物1，0.2克碳酸钾，加入到20毫升，加热回流，数分钟后有大量棕色晶体出现。冷却过滤，水洗除去碳酸钾及溶剂，干燥的纯中间产物2。收率＞93％。
(3)中间体3的合成
将上步20mmol中间产物2和25mmol己二胺加入到含有20ml乙腈溶液的圆底烧瓶中，常温搅拌反应1h后停止。减压蒸去溶剂，硅胶柱分离，收集Rf＝0.25的红色谱带，蒸去溶剂的纯中间产物3。收率73％。
(4)探针A6的合成
将20mmol红色固体粉末中间体3，20mmol吲哚美辛，25mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)以及少许4-甲基吡啶加入到无水的二氯甲烷溶液中，室温下搅拌反应24小时，停止反应，减压蒸出大部分溶剂，柱色谱分离得红色产品A6，收率69％。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.95(d，J＝7.6Hz，1H)，8.58(d，J＝7.2Hz，1H)，7.98(d，J＝8.8Hz，1H)，7.88(t，J＝7.8Hz，1H)，7.72(d，J＝3.5Hz，2H)，7.64(dt，J＝20.8，6.4Hz，5H)，7.12(d，J＝2.4Hz，1H)，7.03(d，J＝9.2Hz，1H)，6.91(d，J＝9.0Hz，1H)，6.72(d，J＝8.6Hz，1H)，6.68(dd，J＝9.0，2.5Hz，1H)，4.22(s，1H)，3.48(s，2H)，3.37-3.12(m，16H)，3.08(d，J＝6.1Hz，2H)，2.51(d，J＝1.6Hz，6H)，2.22(s，3H)，1.71-1.57(m，3H)，1.37(ddd，J＝24.7，14.6，6.8Hz，8H)，1.23(s，1H)。
实施例17
探针化合物A6的溶剂化效应检测试验
使用上述实施例16合成的化合物A6分别加入到的甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氧六环、二甲基亚砜、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、水等溶剂中，测定不同溶剂中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。测试结果显示，随着溶剂极性的改变，紫外吸收光谱中的最大吸收波长有相应的移动，荧光发射光谱也同样存在着最大发射波长的移动。图12(a)为探针A6在不同溶剂中的紫外吸收光谱，图12(b)为探针A6在不同溶剂中的荧光发射光谱。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计和Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计。
实施例18
探针化合物A6的双光子有效吸收截面检测试验
采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，进行上述实施例16合成的化合物A6分别加入到的甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氧六环、二甲基亚砜、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、水等溶剂中双光子吸收截面的测试，所用溶液浓度都为1×10-4M，用计算公式2.2所示，就能得到双光子吸收截面值。使用，测定不同溶剂中、不同波长下双光子有效吸收截面(Φδ)图13。双光子激发荧光光谱的激发源是一台锁模飞秒钛蓝宝石激光器，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm，在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一类以萘为母体的双光子荧光探针，所述荧光探针具有通式I的结构：
其中：
X选自X1、X2、X3和X4；X通过虚线键与通式I相连；
R1和R2各自独立地选自-OCH3、-OCOCH3和卤素；
R3选自-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-和-(CH2)8-；
R4选自C1-6烷基、HOCH2-、HO(CH2)2-、HO(CH2)3-、HO(CH2)4-、HO(CH2)5-和HO(CH2)6-；
R5选自-H、-CN、-COOH、-NH2、-NO2、-OH和-SH。
2.权利要求1所述的以萘为母体的双光子荧光探针，其特征在于：所述的R1和R2各自独立地选自-OCH3或卤素。
3.权利要求1所述的以萘为母体的双光子荧光探针，其特征在于：所述的R3为-(CH2)5-或-(CH2)6-。
4.权利要求1所述的以萘为母体的双光子荧光探针，其特征在于：所述的R4选自C1-4烷基。
5.权利要求1所述的以萘为母体的双光子荧光探针，其特征在于：所述的R5选自-H、-CN、-COOH或-NO2。
6.权利要求1所述的以萘为母体的双光子荧光探针，选自化合物A1-A6：
7.权利要求1所述的以萘为母体的双光子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
1)4-溴-1，8-萘酐与R4-NH3按摩尔比1∶1-1∶5反应，制备化合物V：
反应温度为70-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
2)4-溴-1，8-萘酐与式i的化合物按照摩尔比1∶1-1∶5反应，制备化合物VI：
反应温度为70-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
3)4-溴苊醌与式i的化合物按照摩尔比1∶1-1∶5反应，制备化合物VII：
反应温度为70-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
4)使苊醌、丙二腈、二甲基亚砜按照摩尔比1∶1∶5反应，制备化合物VIII：
反应先在室温下进行0.5小时后，逐渐升高反应温度至70-180℃，并在该反应温度下反应4-12小时，反应溶剂为二甲基亚砜、四氢呋喃或它们与水组成的混合物；
5)将步骤1)-4)中制备得到的化合物V，VI，VII，VIII分别与NH2R3NH2按照摩尔比1∶1-1∶2.5反应，制备化合物IX，X，XI，XII：
反应温度为100-175℃，反应时间为1-7小时，反应溶剂为乙醇、乙二醇单甲醚或其混合物；
6)使化合物IX，X，XI，XII与式ii按照摩尔比1∶1-1∶3反应，制备化合物I：
反应温度为0-100℃，反应时间为12-48小时，反应溶剂为二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯或其混合物，反应在有机碱存在条件下进行，以4-二甲氨基吡啶为催化剂。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤4)中的水与二甲基亚砜或四氢呋喃的摩尔比分别为1∶1-1∶1.25。
9.权利要求1-5中任一权利要求所述的以萘为母体的双光子荧光探针在生物样品标记中的应用。
10.权利要求9所述的以萘为母体的双光子荧光探针在生物样品标记中的应用，其特征在于所述的生物样品是肿瘤组织或肿瘤细胞。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20120801 Assignee: DALIAN FUSIDA SPECIAL CHEMICAL Co.,Ltd. Assignor: Dalian University of Technology Contract record no.: 2017210000009 Denomination of invention: Two-photon fluorescent probe taking naphthaline as matrix as well as preparation method and application thereof Granted publication date: 20131120 License type: Common License Record date: 20170331 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20131120 |