CN101153848A - 荧光离子探针及其在离子检测方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类对离子检测具有高选择性、高灵敏度的荧光离子探针(I)以及该类荧光离子探针在重金属离子和过渡金属离子识别和检测方面的应用，其中Y是指芘、萘、4－氨基－1，8－萘酰亚胺、丹磺酰胺、蒽、咔唑、苯并咪唑、苯并恶唑、氟硼二吡咯、荧光素、3，4，9，10－苝四酸二酰亚胺或罗丹明B等具有荧光发射功能的有机共轭基团，X为酰氨基团、磺氨基团或酯基团。本发明中的荧光离子探针是通过荧光生色团聚集体的荧光峰作为响应信号来识别金属离子的，这样可以有效地避免过渡金属和重金属离子对荧光基团的猝灭效应。本发明的荧光离子探针可以在各种溶剂中，特别是在水溶液中选择性地识别重金属离子和过渡金属离子。

Description

荧光离子探针及其在离子检测方面的应用

技术领域

本发明涉及一种具有高选择性、高灵敏度的荧光离子探针以及该类荧光离子探针在重金属离子和过渡金属离子识别和检测方面的应用。

背景技术

重金属离子和过渡金属离子的识别、检测一直是人们广泛关注的问题，因为其中很多金属(如铅、汞、镉、铬等)离子都具有毒性，因此是环境污染的一个主要来源。实现环境领域或生物体系中重金属离子和过渡金属离子的实时检测和原位检测具有十分重要的意义和价值。对于金属离子的检测，传统的电感耦合等离子体法(ICP)和原子吸收光谱法都是十分有效的工具，但是它们通常不但需要大量的样品并且不适合于实时或原位检测。最近，有很多针对金属离子检测的高效荧光化合物逐渐发展起来，它们的应用不但可以实现对微环境的实时和原位检测，而且通常也具有较高的选择性和灵敏度。在设计对重金属离子和过渡金属离子识别的荧光化合物时，首先必须考虑的是如何削弱或消除金属离子对荧光生色基团的荧光猝灭效应，这种荧光猝灭效应是由金属离子与荧光发色团之间通过自旋-轨道耦合、电子转移或者能量转移所引起，是应用过程中应该避免或消除的问题。另外，由于金属离子和荧光化学物的结合位点在水溶液中的溶剂化倾向比相同条件下其在有机溶剂中的要强，使得荧光化合物与被检测离子的结合性能下降；而且作为光信号转换的荧光基团一般都是较大的共轭芳香环，因此，目前所报道的许多离子识别的荧光化合物都只适用于有机溶剂。但实际应用中能够在水溶液中表现出强识别性能的荧光化合物才具有广泛的实用价值。因此，如何设计合成出在水溶液中对金属离子具有强特异识别效应的高灵敏荧光化合物是目前需要面对的另一个挑战。

目前，虽然已有一些在含水溶液中对重金属离子和过渡金属离子荧光识别的荧光离子探针(荧光化合物)相继被报道，但它们所表现出选择性或灵敏度都距离实际应用还相差甚远。因此，设计、合成一类能够对重金属离子和过渡金属离子选择性荧光识别，特别是在水溶液中又具有较强荧光识别能力的荧光离子探针一直是我们研究小组所从事的一项重要课题。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种高选择性、高灵敏度的荧光离子探针；

本发明的目的之二是提供上述荧光离子探针在水溶液中对过渡金属离子和重金属离子进行检测方面的应用。

本发明中荧光离子探针的主体分子结构通式如下：

通式中，

Y：代表荧光生色基团，是指芘、萘、4-氨基-1，8-萘酰亚胺、丹磺酰胺、蒽、咔唑、苯并咪唑、苯并恶唑、氟硼二吡咯、荧光素、3，4，9，10-苝四酸二酰亚胺或罗丹明B等具有荧光发射功能的有机共轭基团，结构式如下：

芘           萘        4-氨基-1，8-    丹磺酰胺        蒽          咔唑            苯并咪唑

                        萘酰亚胺

苯并恶唑    氟硼二吡咯        荧光素     3，4，9，10-苝四酸二酰亚胺        罗丹明B

X：代表酰氨基团()、磺氨基团()或酯基团(

)；

R₁：代表氢、羟基、羧基或芳基；

R₂：代表氢、烷基、羟基、羟烷基、羧基或羧烷基；

m，n代表亚甲基的数目，范围为0-9的整数；

“*”表示该位置的碳具有手性，本发明中包括L-构型、D-构型以及外消旋体D，L-混合构型。

在上述通式所代表的荧光离子探针中，羧酸部分是结合金属离子的有效部位，它与重金属离子或过渡金属离子可以形成比较稳定的鳌合物，同时可以降低碱金属、碱土金属等软金属离子的相互作用和干扰。荧光离子探针中的X基团(酰氨基、磺酰基或酯基)的存在使其很容易形成分子间氢健，氢键的形成可以使两个荧光离子探针分子被拉近，从而使荧光离子探针中具有共轭潜力的荧光生色基团产生π电子的堆积，形成化合物的低聚物或多聚物，进而影响生色团的发射性质，最终表现出对离子的荧光识别效应。

作为本专利通式所示的荧光离子探针，其优选的实施方式是：上述通式所代表的荧光离子探针中，烷基是具有1-16个碳原子的直链或异构烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基等短链烷基，也可以是十二烷基、十四烷基等长链烷基；长链烷基有助于提高荧光离子探针的脂溶性和柔性；

羟烷基是具有1-10个碳原子的羟烷基，如羟甲基、羟乙基、羟丙基、二羟基丙基、4-羟基丁基、3-羟基己基和3-甲基-5-羟基辛基等等，短链羟烷基有利于提高荧光离子探针在水等极性溶剂中的溶解性；

羧烷基是具有1-10个碳原子的羧烷基，荧光离子探针中引入的羧烷基以碳原子数少于6(不包括6)的短链衍生物为最佳，如羧甲基、羧乙基、羧丙基等；

芳基是指苯、吲哚、咪唑、卟啉、吡啶或苯并呋喃等，芳环的引入有助于促进荧光离子探针和金属离子的作用，有助于改善识别选择性，具有荧光发射功能的芳基有助于改善荧光分子探针对重金属离子或过渡金属离子识别的灵敏度。

作为本专利通式所示的荧光离子探针，其更进一步的优选实施方式是：Y是芘、萘、4-氨基-1，8-萘酰亚胺、丹磺酰胺、蒽、咔唑、苯并咪唑、荧光素、3，4，9，10-苝四酸二酰亚胺或罗丹明B；

X是酰氨基或磺酰基团；

R₂是氢原子，此时所述的荧光离子探针属于氨基酸类衍生物，其结构式分别为：

或

对于这一类属于氨基酸类衍生物的荧光离子探针，其原料的来源很容易，二十多种常见的氨基酸和一些小肽分子是主要来源，原料很容易买到。而且整个荧光离子探针分子的合成也比较简单。

作为本专利通式所示的荧光离子探针，其最优选实施方式是：Y是芘、丹磺酰胺，R₂是氢原子，而X是酰氨基或磺酰基团，此时所述的荧光离子探针属于氨基酸类衍生物，其结构式分别为：

或

以芘荧光生色基团为例，该类荧光离子探针(IV)可通过如下的合成路线得到：

同结构通式(II)或(III)中一样，E4荧光离子探针中的R₁可以是氢原子、羧基、羟基和芳环，m、n代表的数值可以位于0-9之间，“*”表示该处的碳原子是手性碳，包括L-构型、D-构型以及外消旋体D，L-混合构型。

其合成步骤如下：

取0.1～1.0g芘的烷基羧酸(E1，该类化合物可以从化学试剂公司购买到)溶于20～100ml的有机溶剂苯中，加入0.5～2.5mL的二氯亚砜，加热回流搅拌7～9h，反应完全后，减压下蒸去有机溶剂苯，得到黄色粗产物，然后用正己烷重结晶3～5次；正己烷结晶液中析出黄褐色固体，为芘的烷基酰氯(E2)，产率57～63％。

氨基酸衍生物(B)包括氨基酸主体部分即酰氨键，它不但可以从常见的氨基酸制备，还可以是一些氨基酸衍生物或类氨基酸衍生物如小肽类。若从氨基酸制备，则可以是多种氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等等，此时B就是氨基酸甲酯，由于其不稳定，所以首先应该将氨基酸制备成氨基酸甲酯盐酸盐，取3.0～6.0mL的无水甲醇，冰盐浴下冷却5～10min后，缓慢滴加氯化亚砜0.5～1.0mL。体系搅拌10～15min后，一次性加入1.0～1.5g氨基酸，混合体系在室温下搅拌2～2.5h。然后将反应体系再放入70～80℃水浴下回流30～50min，之后蒸去一部分甲醇，加入30～50mL无水乙醚，有沉淀析出。反应瓶放入冰箱中冷却2～5h小时，大量沉淀析出并过滤，滤饼经干燥后得氨基酸甲酯盐酸盐1.0～1.8g，产率75～85％。得到的氨基酸甲酯盐酸盐结构式为：

得到的氨基酸甲酯盐酸盐，可以通过酸碱中和反应制备氨基酸甲酯，取0.10～0.40g天冬氨酸二甲酯盐酸盐加入0.15～0.65g碳酸氢钠(过量十倍)，搅拌10～20min后，用氯仿萃取4次以把反应物全部洗出来，有机层用无水硫酸镁干燥，抽滤，蒸去溶剂得油状物氨基酸甲酯0.08～0.38g，产率为58～65％。由于其性质不稳定，所以合成出来后应立即使用进行下一步反应。

取0.1～1.0g的芘的烷基酰氯(E2)溶于经干燥过的10～50ml的无水苯中，在冰盐浴下将其滴加到10～50ml的含0.06～0.8g待连接的氨基酸衍生物(B)和0.1～1.0ml三乙胺(A)的无水苯溶液中。混合体系在冰盐浴下反应搅拌30～50min，然后在室温下反应12～15h。使用TLC(薄层色谱)检测反应是否完全，反应完毕后，含粗产物的苯溶液用碳酸氢钠溶液洗至弱碱性(pH为7.4～8.0)，再用稀盐酸洗至弱酸性(pH为5.3～6.5)，最后用水洗至中性(pH为6.8～7.2)。苯溶液用无水硫酸镁干燥(每10ml溶液用0.5～1.0g干燥剂)，抽滤，蒸干溶剂，最后用氯仿做展开剂进行硅胶柱层析分离得到淡黄色产物芘酰类酯衍生物(E3)，产率52～60％。

芘酰类酯衍生物(E3)也可以通过DCC(N，N-二环己基碳酰亚胺)、HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)等典型催化剂催化羧酸、氨基形成酰氨键来连接荧光团部分和酯部分，具体操作就是将0.1～1.0g的芘的烷基羧酸(E1)和0.06～0.44g的HOSu混合在30～100mL氯仿中，再加入0.09～0.8g的DCC，悬浮液搅拌3～4h，过滤掉DCC反应产生的尿素。滤液中加入0.8～6mL的冰醋酸，再搅拌1～1.5h。反应溶液用饱和碳酸氢钠洗涤2～4次，再用水洗至中性(pH为6.8～7.2)，无水硫酸镁干燥，抽滤，在滤液中加入0.08～0.6g的待连接的氨的衍生物(A)，室温搅拌20～30h。使用TLC监测反应是否完全，反应完全后，混合液用5～10ml的1mol/L HCl洗涤一次，并用水洗三次，无水硫酸镁干燥，抽滤，蒸干溶剂，用氯仿做展开剂进行硅胶柱层析分离提纯，最后得到芘酰类酯衍生物(E3)，产率35～45％

将0.1～1.0g的芘酰类酯衍生物(E3)溶于30～100ml的0.95～1.05mol/L的NaOH溶液中，室温搅拌30～50min后。用乙酸乙酯洗涤水相5～8次以完全洗去反应原料和副产物，水相中加入盐酸调至弱酸性(pH为5.5～6.3)，有大量沉淀产生，再用乙酸乙酯萃取4～6次，有机层用无水硫酸镁干燥(每10ml溶液用0.5～1.0g干燥剂)，抽滤，蒸去溶剂，得固体芘酰类酸衍生物(E4)，也就是本发明中所述的含芘基团的一类荧光离子探针，产率58～61％。

芘酰类酯衍生物的水解也可以在酸性条件下完成，将0.10～1.0g的E3溶于40～100ml的1mol/L盐酸的四氢呋喃溶液中，室温下搅拌12～15h，然后减压蒸馏出去有机溶剂，有大量沉淀产生，加入10～30ml水，然后用乙酸乙酯萃取水相4～6次，后面的处理方法同上面碱性条件水解的处理方法一样，产率35～45％。

芘是一个经典的荧光发色团，它具有荧光寿命长、量子产率高、单线态发射光谱精细结构对环境极性敏感、可作为非辐射能量转移过程的受体和在特定环境下能形成激态(基激)缔合物(excimer)等优点。而其所显示的特殊的excimer荧光峰是研究水溶性分子/离子相互作用的强有力工具，这主要由于excimer荧光峰特殊的位置、形状和其特殊的聚集行为可以有效避免过渡金属离子和重金属离子的猝灭干扰。当溶液中芘的浓度小于10^-5mol/L时，可只观察到具体精细结构单体激发态荧光，在373-430nm范围内出现多重发射峰。而当芘的浓度超过10^-4mol/L时，在470nm附近会观察到一个宽化的没有结构特征的荧光峰，这就是激态缔合物(excimer)的荧光发射峰。Excimer的形成有两种情形，一种是两个芘分子形成面对面空间构象(g-g conformation)形成基态缔合物的(dimer)受激发射，称之稳态excimer；另外一种eximer是由一个激发态芘分子通过电子共振与另一个处在基态的芘分子缔合形成的，最早由Birks提出，称之为动态激基缔合物(dynamic excimer)。

本发明中的荧光离子探针是通过荧光生色团聚集体的荧光峰作为响应信号来识别金属离子的，这样可以有效地避免过渡金属和重金属离子对荧光基团的猝灭效应。而且，本发明的荧光离子探针可以在各种溶剂中，特别是在水溶液中选择性地识别重金属离子和过渡金属离子。如实施例1合成的荧光离子探针F-1在水溶液中对二价铅离子表现相当高的选择性，在铅离子存在下能形成稳态的excimer，而这一现象在水溶液中一直是很难观察到的。F-1在Na⁺，K⁺，Ag⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺和Cr³⁺等十五种金属离子中仅对铅离子表现出特异性选择，对其它离子都没有响应。而且荧光离子探针F-1对铅离子的检测限能够达到1.7×10^-6mol/L。如实施例2中合成的荧光离子探针F-2同样对铅离子表现出特异性选择，铅离子存在下同样能够形成稳态的excimer，在多种金属离子中(如Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ag⁺，Mn²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺和Cr³⁺)，仅对铅离子表现出高的选择性，其他离子没有响应，灵敏度能够达到1.5×10^-6mol/L。如实施例3中合成的荧光离子探针F-3同样在水溶液中对铅离子表现高的选择性，同时还对Zn²⁺和Cd²⁺表现选择性，金属离子能够促使芘基团形成动态的excimer，F-3能够完全避免重金属离子的猝灭，而且其灵敏度高达到1.5×10^-7mol/L。这些优点不但有助于将其应用到水、污水等环境中铅离子的检测，还可扩展到生物组织及细胞等其它微环境。而从上面的结果可以明显看出本发明设计、合成的金属离子的荧光化学传感器是非常成功的。

本发明设计、合成的含荧光生色团的一类荧光离子探针具有结构相对简单、易于合成的特点，能够在各种溶液特别是水溶液中对重金属离子或过渡金属离子有选择性地产生荧光生色团聚集体的荧光峰，从而对其实行检测。并可进一步用于固载识别敏感器件的制作，如本发明的荧光分子探针可以通过分子的反应性基团将其固载于固体表面或制成试纸，那么对于重金属离子的实时检测和原位检测将更加简单和方便。如能通过改变酸碱度、溶液中本体的浓度和适当的缓冲溶液等细节条件来提高灵敏度，对于生物样品中重金属离子的识别和检测也将具有重要的意义。

附图说明

图1：在荧光发射光谱中，Pb²⁺浓度与F-1荧光强度的关系曲线图；

图2：在荧光发射光谱中，F-1对各种常见金属离子的选择关系图；

图3：在荧光发射光谱中，Pb²⁺浓度与F-2荧光强度的关系曲线图；

图4：在荧光发射光谱中，F-2对各种常见金属离子的选择关系图；

图5：在荧光激发光谱中，Pb²⁺浓度与F-2荧光强度的关系曲线图；

图6：在荧光激发光谱中，F-2对各种常见金属离子的选择关系图；

图7：在荧光发射光谱中，Pb²⁺浓度与F-3荧光强度的关系曲线图；

图8：在荧光发射光谱中，F-3对各种常见金属离子的选择关系图。

如图1所示，其中纵坐标代表荧光强度，横坐标代表荧光发射波长(λ_em/nm，激发波长为354nm)。随着铅离子的加入，373-430nm的单体发射峰逐渐下降，并伴随着475nm附近的荧光聚集体发射峰的增强。

如图2所示，其中纵坐标为106.7μM的金属离子存在下在475nm处荧光发射峰强度变化的差值(加入后-加入前)，差值为正表示475nm处有峰出现，而差值为负表示该离子有猝灭效应，横坐标表示不同的金属离子。

如图3所示，其中纵坐标代表荧光强度，横坐标代表荧光发射波长(λ^em/nm，激发波长为354nm)。插图为410-600nm的放大图。随着铅离子的加入，373-430nm的单体发射峰逐渐下降，并伴随着465nm附近的荧光聚集体发射峰的增强。

如图4所示，其中纵坐标为106.7μM的金属离子存在下在465nm处荧光发射峰强度变化的差值(加入后-加入前)，差值为正表示465nm处有峰出现，而差值为负表示该离子有猝灭效应，横坐标表示不同的金属离子。

如图5所示，其中纵坐标代表荧光强度，横坐标代表荧光激发波长(λ_ex/nm，发射波长为465nm)。随着铅离子的加入，310-340nm的荧光团单体的激发峰逐渐下降，并伴随着354nm处荧光团聚集体的激发峰逐渐增加。

如图6所示，其中纵坐标为106.7μM的金属离子存在下在354nm处荧光激发峰强度变化的差值(加入后-加入前)，差值为正表示354nm处有峰出现，而差值为负表示该离子有猝灭效应，横坐标表示不同的金属离子。

如图7所示，其中纵坐标代表荧光强度，横坐标代表荧光发射波长(λ_em/nm，激发波长为340nm)。随着铅离子的加入，373-430nm的单体发射峰逐渐下降，并伴随着470nm附近的荧光聚集体发射峰的增强。

如图8所示，其中纵坐标为173.9μM的金属离子存在下在470nm处荧光发射峰强度变化的差值(加入后-加入前)，差值为正表示470nm处有峰出现，而差值为负表示该离子有猝灭效应，横坐标表示不同的金属离子。

具体实施方式

实施例1：

本实施例中的F-1包括L-构型、D-构型和外消旋体D，L-混合构型，方法一致，现象一致、产率也一致。后面的实施例2-8也都包括三种构型，后面的几个实施例省略说明。在实施例中使用的氨基酸均包括L-构型、D-构型和外消旋体D、L-构型，同样对于后面的实施例省略说明。

在圆底烧瓶中加入无水甲醇5.0mL，置于冰盐浴下冷却5min后，缓慢滴加氯化亚砜0.70mL。体系继续搅拌10min后，一次性加入1.0g天冬氨酸，混合体系在室温下搅拌2h。然后将反应体系再放入70～80℃水浴下回流30min，之后蒸去一部分甲醇，加入40mL无水乙醚，有白色沉淀析出。反应瓶放入冰箱中冷却2h小时，大量沉淀析出并过滤，滤饼经干燥后得白色固体天冬氨酸二甲酯盐酸盐1.2g，产率80％。其结构式为：

所得产物¹H-NMR谱(500MHz，D₂O)显示的化学位移和对应的质子类型归属为：4.407(t，1H)，3.752(s，3H)，3.659(s，3H)，3.135-3.022ppm(m，2H)。(其中，s表示单峰，d表示两重峰，t代表三重峰，m代表多重峰，“H”前面的数字代表氢的个数，后面的相同，不再提及)。

取0.30g天冬氨酸二甲酯盐酸盐加入0.28g(过量)碳酸氢钠，搅拌15min后，用氯仿萃取4次以把反应物全部洗出来，有机层用无水硫酸镁干燥，抽滤，蒸去溶剂得淡黄色油状物天冬氨酸二甲酯(A)0.15g，产率为63％。由于其性质不稳定，所以合成出来后应立即使用进行下一步反应。

将0.15g的芘丁酸(试剂公司可以买到)和0.066g HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)混合在30mL氯仿中，再加入0.12g DCC(N，N-二环己基碳酰亚胺)，悬浮液搅拌3h，过滤掉DCC反应产生的尿素。滤液中加入1mL醋酸，再搅拌1h。反应溶液用饱和碳酸氢钠洗涤两次，再用水洗至中性，无水硫酸镁干燥，抽滤，在滤液中加入0.092g天冬氨酸二甲酯(A)，室温搅拌24h。使用TLC监测反应是否完全，反应完全后，混合液用5ml的1mol/L HCl洗涤一次，并用水洗涤三次，无水硫酸镁干燥，抽滤，蒸干溶剂，用氯仿做展开剂进行硅胶柱层析分离提纯，最后得到粉末状的物质F-1-1为0.10g，产率45％。F-1-1的¹H-NMR谱(500MHz，CDCl₃)化学位移和对应的质子类型归属为：8.316-7.868(m，9H)，6.483(d，1H)，4.924(d，1H)，3.761(s，3H)，3.661(s，3H)，3.396(m，2H)，3.079-2.840(m，2H)，2.364(m，2H)，2.227 ppm(m，2H)。

本实施例中的F-1-1的合成也可以使用实施例2中F-2-1的合成方法，就是将反应中谷氨酸二甲酯换成天冬氨酸二甲酯，反应物的摩尔比率不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，产率54％。

将0.10 g的F-1-1溶于40ml的1mol/LNaOH溶液中，室温搅拌半小时后，基本溶解。用乙酸乙酯萃取5次，水相中加入盐酸至弱酸性(pH为5.5左右)，有大量白色絮状物产生，再用乙酸乙酯萃取至水溶液中无荧光，无水硫酸镁干燥，抽滤，蒸去溶剂，得固体粉末F-1为0.054g，产率58％。F-1的¹H-NMR谱(500MHz，CDCl₃：CD₃OD＝4∶1)化学位移和对应的质子类型归属为：8.322-7.882(m，9H)，4.824(t，1H)，3.408(m，2H)，3.024-2.829(m，2H)，2.399(m，2H)，2.228 ppm(m，2H)。电喷雾质谱测得分子量为403.2(分子量理论值为403.1)，元素分析(碳、氢、氮)实际测得的值为：C为70.6，H为5.4，N为3.2(理论值C为71.4，H为5.3，N为3.4)。以上结果显示荧光离子探针F-1完全复合实际测试要求。

本实施例中F-1的合成也可以在酸性条件下进行，将0.10g的F-1-1溶于40ml的1mol/L盐酸的四氢呋喃溶液中，室温下搅拌12h，然后减压蒸馏除去有机溶剂，有白色沉淀产生，加入20ml水，然后用乙酸乙酯萃取水相5次，后面的处理方法同上面碱性条件水解的处理方法一样，产率40％。

实施例2：

将0.40g芘丁酸溶于40mL苯中，加入1.0mL二氯亚砜，加热回流搅拌7h，反应完全后，减压下蒸去有机溶剂苯，得到黄色粗产物，然后用正己烷重结晶3次。正己烷结晶液中析出黄褐色固体，为芘丁酰氯0.27g，产率62％。

谷氨酸二甲酯盐酸盐以及谷氨酸二甲酯(B)的制备方法与实施例1中天冬氨酸二甲酯盐酸盐以及天冬氨酸二甲酯的制备方法类似，就是将天冬氨酸换成谷氨酸，反应物的摩尔比率不变，反应条件和步骤、处理过程相同，可以得到白色固体谷氨酸二甲酯盐酸盐1.1g，产率77％，其结构式为：

其¹H-NMR谱(500MHz，D₂O)化学位移和对应的质子类型归属为：4.100(t，1H)，3.733(s，3H)，3.611(s，3H)，2.533(m，2H)，2.147ppm(m，2H)。

进而得到淡黄色油状物谷氨酸二甲酯0.2g，产率63％。同样地，得到的谷氨酸二甲酯不稳定应立即使用。

取0.2g芘丁酰氯溶于10mL无水苯中，在冰盐浴下将其滴加到0.11g谷氨酸二甲酯(B)和0.2mL三乙胺的20ml无水苯溶液中，反应搅拌30min，然后在室温下反应12h。使用TLC检测反应进程，反应完毕后，粗产物后处理：苯溶液用碳酸氢钠溶液洗至弱碱性(pH为7.5)，再用稀盐酸洗至弱酸性(pH为6.2)，最后用水洗至中性；苯溶液用无水硫酸镁干燥，抽滤，蒸干溶剂，最后用氯仿做展开剂进行硅胶柱层析分离的到淡黄色固体产物F-2-1为0.16g，产率55％。F-2-1的¹H-NMR谱(500MHz，CDCl₃)化学位移和对应的质子类型归属为：8.312-7.864(m，9H)，6.152(d，1H)，4.654(m，1H)，3.743(s，3H)，3.621(s，3H)，3.405(m，2H)，2.462-2.321(m，4H)，2.219(m，3H)，2.000ppm(m，1H)。

本实施例中F-2-1的合成也可以使用实施例1中F-1-1的合成方法，就是将天冬氨酸换成谷氨酸，反应物的摩尔比率不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，可以得到淡黄色的固体F-2-1，产率48％。

F-2的制备方法如实施例1中F-1，就是将F-1-1换成F-2-1，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，同样可以得到黄色固体粉末F-2为0.061g，产率为64％。F-2的¹H-NMR谱(500MHz，CDCl₃∶CD₃OD＝4∶1)化学位移和对应的质子类型归属为：8.324-7.884(m，9H)，4.558(m，1H)，3.402(m，2H)，2.483-2.356(m，4H)，2.210(m，3H)，2.003 ppm(m，1H)。电喷雾质谱测得分子量为417.3(分子量理论值为417.2)，元素分析(碳、氢、氮)实际测得的值为：C为71.1，H为5.8，N为3.3(理论值C为71.9，H为5.6，N为3.4)。以上结果显示荧光离子探针F-2完全复合实际测试要求。

实施例3：

色氨酸甲酯盐酸盐以及色氨酸甲酯(C)的制备方法与实施例1-1中天冬氨酸二甲酯盐酸盐以及天冬氨酸二甲酯的制备方法相同，就是将天冬氨酸换成色氨酸，反应物的摩尔比率不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，可以得到微粉色的固体粉末色氨酸甲酯盐酸盐1.0g，产率80％，其结构式为：

其¹H-NMR谱(500MHz，D₂O)化学位移和对应的质子类型归属为：7.576-7.134(m，5H)，4.402(m，1H)，3.747(s，3H)，3.483-3.390ppm(m，2H)。

进而得到淡黄色油状物色氨酸甲酯0.17g，产率67％。同样地，得到的色氨酸甲酯不稳定应立即使用。

F-3-1的合成类似于实施例1中F-1-1，就是将天冬氨酸二甲酯换成色氨酸甲酯(C)，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，可以得到黄色固体粉末F-3-1为0.11g，产率45％。¹H-NMR谱(500MHz，CDCl₃)化学位移和对应的质子类型归属为：8.270-7.791(m，9H)，7.503-6.913(m，5H)，5.918(d，1H)，4.993(m，1H)，3.700(s，3H)，3.471-3.315(m，4H)，2.282-2.143(m，4H)。

将0.10g的F-3-1溶于60ml四氢呋喃中，加入盐酸3ml，封口避光反应12h，TLC检测反应进程。反应结束后粗产物后处理：先将THF蒸干，加入10ml水，有黄色沉淀产生，用三氯甲烷萃取4次，合并有机相，水洗至弱酸性(pH为6.2)，然后用无水硫酸镁干燥。抽滤，蒸干溶液得淡黄色固体F-3为0.039g，产率40％。F-3的¹H-NMR谱(500MHz，DMSO)化学位移和对应的质子类型归属为：8.344-7.844(m，9H)，7.519-6.848(m，5H)，4.257(m，1H)，3.231-3.012(m，4H)，2.215(m，2H)，1.930ppm(m，2H)。基质辅助激光解吸电离质谱测得分子量为475.0(分子量理论值为474.6)。以上结果显示荧光离子探针F-3完全复合实际测试要求。

实施例4：

苯丙氨酸甲酯盐酸盐以及苯丙氨酸甲酯(D)的制备方法与实施例1中天冬氨酸二甲酯盐酸盐以及天冬氨酸二甲酯的制备方法相同，就是将天冬氨酸换成苯丙氨酸，反应物的摩尔比率不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，可以得到白色的固体粉末苯丙氨酸甲酯盐酸盐1.1g，产率84％，其结构式为：

其¹H-NMR谱(500MHz，D₂O)化学位移和对应的质子类型归属为：7.388-7.230(m，5H)，4.376(m，1H)，3.780(s，3H)，3.316-3.160ppm(m，2H)。

进而得到淡黄色油状物苯丙氨酸甲酯0.17g，产率67％。同样地，得到的苯丙氨酸甲酯不稳定应立即使用。

F-4-1的合成类似于实施例1中F-1-1，就是将天冬氨酸二甲酯换成苯丙氨酸甲酯(D)，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，可以得到黄色固体粉末F-4-1为0.10g，产率44％。¹H-NMR谱(500MHz，CDCl₃)化学位移和对应的质子类型归属为：8.287-7.817(m，9H)，7.243-7.071(m，5H)，5.841(d，1H)，4.933(m，1H)，3.727(s，3H)，3.350(t，2H)，3.189-3.082(m，2H)，2.296(m，2H)，2.182(m，2H)，2.364ppm(m，2H)。

F-4的制备方法如实施例3中F-3，就是将F-3-1换成F-4-1，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，同样可以得到黄色固体粉末F-4为0.039g，产率为40％。F-4的¹H-NMR谱(500MHz，DMSO)化学位移和对应的质子类型归属为：8.322-7.863(m，9H)，7.213-7.071(m，5H)，4.272(m，1H)，3.214-2.863(m，4H)，2.224(m，2H)，1.932ppm(m，2H)。基质辅助激光解吸电离质谱测得分子量为435.1(分子量理论值为435.2)。以上结果显示荧光离子探针F-4完全复合实际测试要求。

实施例5：

芘甲酰氯的合成方法类似于实施例2中的芘丁酰氯的合成方法，就是将芘丁酸换成芘甲酸，反应物的摩尔比率不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，可以得到金黄色的固体粉末芘甲酰氯0.26g，产率60％。

F-5-1的合成方法类似于实例2中F-2-1的合成方法，就是将芘丁酰氯换成芘甲酰氯，将谷氨酸二甲酯换成天冬氨酸二甲酯，反应物的摩尔比率不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，可以得到淡黄色的固体F-5-1为0.16g，产率54％，F-5-1的¹H-NMR谱(500MHz，CDCl₃)化学位移和对应的质子类型归属为：8.700-8.068(m，9H)，7.191(d，1H)，5.350(d，1H)，3.877(s，3H)，3.729(s，3H)，3.290-3.131ppm(m，2H)。

F-5的合成方法如实施例1中F-1的合成方法，就是将F-1-1换成F-5-1，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，同样可以得到黄色固体粉末F-5为0.054g，产率58％，F-5的¹H-NMR谱(500MHz，DMSO)化学位移和对应的质子类型归属为：9.062-8.099(m，9H)，6.533(d，1H)，4.922(d，1H)，2.951-2.700ppm(m，2H)。

实施例6：

F-6-1的合成方法类似于实例2中F-2-1的合成方法，就是将芘丁酰氯换成芘甲酰氯，反应物的摩尔比率不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，可以得到淡黄色的固体F-6-1为0.17g，产率54％，F-6-1的¹H-NMR谱(500MHz，CDCl₃)化学位移和对应的质子类型归属为：8.703-8.097(m，9H)，6.891(d，1H)，5.091(m，1H)，3.889(s，3H)，3.689(s，3H)，2.632(m，2H)，2.475-2.283ppm(m，2H)。

F-6的合成方法如实施例1中F-1的合成方法，就是将F-1-1换成F-6-1，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，同样可以得到黄色固体粉末F-6为0.052g，产率56％，F-6的¹H-NMR谱(500MHz，DMSO)化学位移和对应的质子类型归属为：9.007-8.118(m，9H)，6.539(d，1H)，4.590(d，1H)，2.504(s，2H)，2.197-1.991ppm(m，2H)。

实施例7：

F-7-1的合成方法类似于实例2中F-2-1的合成方法，就是将芘丁酰氯换成丹酰氯(市场上可以买到该样品，而其中包括的荧光生色团为丹磺酰胺基团)，将谷氨酸二甲酯换成色氨酸甲酯，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤、处理过程相同，可以得到黄色固体F-7-1为0.18g，产率54％。F-7的合成同样类似于实例1中F-1的合成方法，就是将F-1-1换成F-7-1，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，同样可以得到黄色固体粉末F-7为0.054g，产率56％，F-7的¹H-NMR谱(500MHz，DMSO)化学位移和对应的质子类型归属为：8.047-7.271(m，6H)，7.122(m，5H)，3.78(m，1H)，2.47(m，2H)，2.79ppm(s，6H)。

实施例8：

F-8-1的合成方法类似于实例2中F-2-1的合成方法，就是将芘丁酰氯换成丹酰氯，将谷氨酸二甲酯换成天冬氨酸二甲酯，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤、处理过程类似，可以得到黄色固体F-8-1为0.14g，产率48％，F-8-1的¹H-NMR谱(500MHz，CDCl₃)化学位移和对应的质子类型归属为：8.265-7.220(m，6H)，5.857(d，1H)，4.160(m，1H)，3.515(s，3H)，3.401(s，3H)，2.914(s，6H)，2.880-2.700ppm(m，2H)。

F-8的合成同样类似于实例1中F-1的合成方法，就是将F-1-1换成F-8-1，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，同样可以得到黄色固体粉末F-8为0.037g，产率40％，F-8的¹H-NMR谱(500MHz，D₂O)化学位移和对应的质子类型归属为：8.435-7.365(m，6H)，3.865(m，1H)，2.840(s，6H)，2.351-2.229ppm(m，2H)。

实施例9：

F-9-1的合成方法类似于实例2中F-2-1的合成方法，就是将芘丁酰氯换成丹酰氯，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，可以得到黄色固体F-9-1为0.15g，产率49％。F-9的合成同样类似于实例1中F-1的合成方法，就是将F-1-1换成F-9-1，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，同样可以得到黄色固体粉末F-9为0.038g，产率41％，F-9的¹H-NMR谱(500MHz，DMSO)化学位移和对应的质子类型归属为：8.534-7.200(m，6H)，4.070(m，1H)，3.018(s，6H)，2.225(m，2H)，2.029-1.826ppm(m，2H)。

实施例10：

F-10-1的合成方法类似于实例1中F-1-1的合成方法，就是将芘丁酸换成α-萘乙酸(市场可以买到，包括的荧光生色团为萘)，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，可以得到白色固体F-10-1。F-10的合成同样类似于实例1中F-1的合成方法，就是将F-1-1换成F-10-1，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，同样可以得到白色固体粉末F-10。

实施例11：

F-11-1的合成方法类似于实例2中F-2-1的合成方法，就是将芘丁酸换成9-蒽甲酸(市场可以买到，包括的荧光生色团为蒽)，首先将蒽甲酸制备成蒽甲酰氯，然后让其与谷氨酸二甲酯反应，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，可以得到固体F-11-1。F-11的合成同样类似于实例1中F-1的合成方法，就是将F-1-1换成F-11-1，反应物的摩尔比不变，反应条件和步骤类似，处理过程类似，同样可以得到固体粉末F-11。

实施例12：

将实施例1中的荧光离子探针F-1溶于含体积分数为2％的DMSO的水溶液中(DMSO为二甲基亚砜，它的少量加入有助于提高F-1的溶解性，并且实验表明它的加入不会对金属离子识别产生不良影响)，配置成浓度为2.0×10^-5mol/L的溶液。加入不同摩尔分数的PbCl₂，测试F-1溶液的荧光发射光谱(激发波长为354nm)。随着Pb²⁺的加入，在475nm处产生一个新峰并逐渐增强，这个新峰归结为稳态聚集体excimer发射峰，参照图1所示。

实施例13：

在实施例12所述实验条件下，测试荧光离子探针F-1对不同种金属离子的选择性。各组荧光离子探针F-1的浓度均为2.0×10^-5mol/L，分别加入Na⁺，K⁺，Ag⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺和Cr³⁺等十五种常见的金属离子，使其浓度达到106.7μM(1.067×10^-4mol/L)。通过与不存在金属离子相比较发现，这十五种金属离子中只有Pb²⁺能够产生聚集体的发射峰(475nm处的新峰)，其它金属离子没有这种响应，一些离子还会产生猝灭效果。将这一结果整理如图，参照图2。同时，测试了荧光离子探针F-1对Pb²⁺的灵敏度，发现其灵敏度可达到1.7×10^-6mol/L。这样一些结果充分说明了本发明设计、合成的荧光离子探针对于Pb²⁺具有非常高的选择性识别性能和高的灵敏度。

实施例14：

将实施例2中的荧光离子探针F-2溶于含体积分数为2％的DMSO的水溶液中(DMSO少量的加入同样有助于提高F-2的溶解性，并且实验表明它的加入不会对金属离子识别产生不良影响)，配置成浓度为2.0×10^-5mol/L的溶液。加入不同摩尔分数的PbCl₂，测试F-1溶液的荧光发射光谱(激发波长为354nm)。随着Pb²⁺的加入，在465nm处产生一个新峰并逐渐增强，参照图3所示，和图1类似，这个新峰同样归结为稳态聚集体excimer发射峰，只是这个峰的位置稍稍变化了一点(图1为475nm，图3为465nm)，图3峰的强度也要比图1稍稍弱一些，不过性质上是一致的。

实施例15：

在实施例14所述实验条件下，测试荧光离子探针F-2对不同种金属离子的选择性。荧光离子探针F-2的浓度均为2.0×10^-5mol/L，分别加入Na⁺，K⁺，Ag⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺和Cr³⁺等十五种常见的金属离子，使其浓度达到106.7μM(1.067×10^-4mol/L)。通过与不存在金属离子相比较发现，这十五种金属离子中只有Pb²⁺能够产生聚集体的发射峰(465nm处的新峰)，其它金属离子没有这种响应，一些离子还会产生猝灭效果。将这一结果整理如图，参照图4。同时，测试了荧光离子探针F-2对Pb²⁺的灵敏度，发现其灵敏度可达到1.5×10^-6mol/L。这样一些结果充分说明了本发明设计、合成的荧光离子探针对于Pb²⁺具有非常高的选择性识别性能和高的灵敏度。

实施例16：

如实施例14中的条件，将实施例2中的荧光离子探针F-2配置成浓度为2.0×10^-5mol/L的溶液。加入不同摩尔分数的PbCl₂，测试F-2溶液的荧光激发光谱(固定发射波长在465nm)。随着Pb²⁺的加入，在354nm处产生一个新峰并逐渐增强，这个新峰同样归结为稳态聚集体excimer激发峰，参照图5所示。这里稳态聚集体excimer在激发光谱上所产生的新峰(354nm)与其在荧光发射光谱(例14)中产生的新峰(465nm)在本质上是相同的，都反映了稳态聚集体excimer的产生。

实施例17：

在实施例16所述实验条件下，测试荧光离子探针F-2对不同种金属离子的选择性。荧光离子探针F-2的浓度均为2.0×10^-5mol/L，分别加入Na⁺，K⁺，Ag⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺和Cr³⁺等十五种常见的金属离子，使其浓度达到106.7μM(1.067×10^-4mol/L)。通过与不存在金属离子相比较发现，这十五种金属离子中只有Pb²⁺能够产生稳态聚集体的激发峰(354nm处的新峰)，其它金属离子均没有这种响应，一些离子还会产生猝灭效果。将这一结果整理如图，参照图6。同样测试了荧光离子探针F-2对Pb²⁺的灵敏度，发现其灵敏度也为1.5×10^-6mol/L。这样一些结果结合实施例12说明了本发明设计、合成的荧光离子探针对于Pb²⁺不但具有非常高的选择性识别性能和高的灵敏度，同时还具备双重识别功能(不但可以在荧光发射光谱上进行离子识别，还可以从荧光激发光谱上进行离子识别)。

实施例18：

将实施例3中的荧光离子探针F-3溶于含体积分数为2％的DMSO的水溶液中(DMSO的少量加入同样有助于提高F-3的溶解性，并且实验表明它的加入不会对金属离子识别产生不良影响)，配置成浓度为5.0×10^-6mol/L的溶液。加入不同摩尔分数的PbCl₂，测试F-3溶液的荧光发射光谱(固定发射波长在465nm)。随着Pb²⁺的加入，加入不同摩尔分数的PbCl₂，测试F-3溶液的荧光发射光谱(激发波长为340nm)。随着Pb²⁺的加入，在470nm处产生一个新峰并逐渐增强，这个新峰归结为动态聚集体excimer发射峰，参照图7所示。

实施例19：

在实施例18所述实验条件下，测试荧光离子探针F-3对不同种金属离子的选择性。荧光离子探针F-3的浓度均为5.0×10^-6mol/L，分别加入Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺和Cr³⁺等十三种常见的金属离子，使其浓度达到173.9μM(1.739×10^-4mol/L)。通过与不存在金属离子相比较发现，在Pb²⁺，Zn²⁺和Cd²⁺存在下能够产生聚集体的发射峰(470nm处强的新峰)，表现选择性识别。与不存在金属离子条件相比，加入铅后470nm处发射峰强度增加120个单位，加入Zn²⁺增加19个单位，加入Cd²⁺增加17个单位。将这一结果整理如图，参照图8。同时，测试了荧光离子探针F-3对Pb²⁺的灵敏度，发现其灵敏度可高达到1.5×10^-7mol/L。F-3与F-1、F-2相比较，其对离子的检测灵敏度提高了一个数量级，聚集体excimer发射峰能够达到很高的强度，能够很好地避免重金属离子的荧光猝灭，这能保证其达到很好的离子检测效果；但其离子选择性却没有F-1、F-2高，特异性稍差一些。主要差别在于离子促使F-3产生动态的聚集体excimer，而使F-1、F-2产生的是稳态的excimer，本质上不相同。

Claims (10)

1.高选择性、高灵敏度的荧光离子探针，其结构式如下所示：

通式中，

Y为芘、萘、4-氨基-1，8-萘酰亚胺、丹磺酰胺、蒽、咔唑、苯并咪唑、苯并恶唑、氟硼二吡咯、荧光素、3，4，9，10-苝四酸二酰亚胺或罗丹明B；

X为酰氨基团、磺氨基团或酯基团；

R₁为氢、羟基、羧基或芳基；

R₂为氢、烷基、羟基、羟烷基、羧基或羧烷基；

m，n代表亚甲基的数目，范围为0-9的整数；

“^*”表示该位置的碳具有手性，包括L-构型、D-构型以及外消旋体D，L-混合构型。

2.如权利要求1所述的高选择性、高灵敏度的荧光离子探针，其特征在于：烷基是具有1-16个碳原子的直链或异构烷基。

3.如权利要求1所述的高选择性、高灵敏度的荧光离子探针，其特征在于：羟烷基是具有1-10个碳原子的羟烷基。

4.如权利要求1所述的高选择性、高灵敏度的荧光离子探针，其特征在于：羧烷基是具有1-10个碳原子的羧烷基。

5.如权利要求1所述的高选择性、高灵敏度的荧光离子探针，其特征在于：芳基是指苯、吲哚、咪唑、卟啉、吡啶或苯并呋喃。

6.如权利要求1所述的高选择性、高灵敏度的荧光离子探针，其特征在于：Y为芘、萘、4-氨基-1，8-萘酰亚胺、丹磺酰胺、蒽、咔唑、苯并咪唑、荧光素、3，4，9，10-花四酸二酰亚胺或罗丹明B。

7.如权利要求6所述的高选择性、高灵敏度的荧光离子探针，其特征在于：X为酰氨基团或磺氨基团。

8.如权利要求7所述的高选择性、高灵敏度的荧光离子探针，其特征在于：R2为H，其结构式如下所示，

或

9.如权利要求8所述的高选择性、高灵敏度的荧光离子探针，其特征在于：Y为芘或丹磺酰胺，其结构式如下所示，

或

10.权利要求1-9所述的高选择性、高灵敏度的荧光离子探针在重金属离子和过渡金属离子识别和检测方面的应用。

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