CN115046977A - 一种荧光检测碳酸酐酶活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种荧光检测碳酸酐酶活性的方法，属于碳酸酐酶活性检测技术领域。本发明公开了一种荧光检测碳酸酐酶活性的方法，主要是一种由能够杂交形成双链结构的两条碱基序列组成的荧光探针在结合碳酸酐酶(CA)催化得到的氢离子(H+)后荧光发生变化，从而根据荧光响度的变化来检测碳酸酐酶的活性。本发明的检测方法具有干扰小、灵敏高、背景信号低、准确度高的碳酸酐酶酶活检测新技术，解决了现有碳酸酐酶酶活检测方法中存在的缺陷和弊端，为避免利用藻类的吸收、富集和降解作用去除水质污染过程中水体藻类的异常生长(即赤潮现象)而导致的严重威胁水体的生态平衡提供技术支持，同时也为酶活性测定预测藻华提供理论支持。

Description

一种荧光检测碳酸酐酶活性的方法
技术领域
本发明属于碳酸酐酶活性检测技术领域，涉及一种荧光检测碳酸酐酶活性的方法。
背景技术
近年来，随着工业化、城市化的快速发展，各国水体受到严重污染，利用藻类的吸收、富集和降解作用去除污水是目前治理水质污染的新途径。但是这种方法治理水质污染时，当水体富营养化会导致水体藻类的异常生长(即赤潮、水华现象)严重威胁水体的生态平衡。有学者发现藻类生长与藻类碳酸酐酶活性(CA)密切相关，在盐藻培养体系中通入CO2至饱和时，盐藻通过提高细胞内外的碳酸酐酶活性加快对CO2的吸收，进而快速生长，提高生物量。此结果表明碳酸酐酶活性可以作为藻华的早期预警指标。在此过程中，碳酸酐酶活性的灵敏准确的测定是关键。传统碳酸酐酶活性的检测方法有测压法、比色法、电极法、酯酶测定法、pH计法。目前，最常采用的方法是pH计法，其原理是碳酸酐酶催化CO2转换成HCO3 -并伴随着H+，通过pH计测定一定H+的生成量所需要的时间，通过公式换算得到碳酸酐酶的活性。但是采用pH测量藻细胞胞外碳酸酐酶活性时，需要先测量总的碳酸酐酶的活性，然后在加入活性灭活剂将胞外碳酸酐酶灭活，多次测量，操作复杂，干扰较大，从而致使该方法测量结果的灵敏度和准确度较低。
荧光检测法是基于检测目标物诱导荧光物质的荧光信号变化来进行定量分析。由于该方法不需要复杂的样品前处理过程，具有操作简便、灵敏度高、可实时监控、原位检测且能实现原位成像等优点，在酶活性检测领域备受关注。研发荧光检测碳酸酐酶活性方法能够克服现有检测方法的缺点，对监测水体富营养化至关重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种荧光检测碳酸酐酶活性的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种荧光检测碳酸酐酶活性的方法，所述方法具体为：采用荧光探针通过荧光法检测碳酸酐酶活性；
所述荧光探针由能够杂交形成双链结构的两条碱基序列组成，其中Reporter的碱基序列如SEQ ID NO.1所示、5'端连接有荧光基团AlexaFluor532，对应的Capure的碱基序列如SEQ ID NO.2所示、3'端连接有荧光猝灭基团BHQ2。
优选的，所述方法具体为：将所述荧光探针溶解在溶剂中混合均匀形成溶液，向溶液中加入碳酸酐酶，通过检测溶液在加入碳酸酐酶前后的荧光强度的变化，从而确定碳酸酐酶的活性。
进一步优选的，所述溶剂为浓度为100mM、pH＝9.0的PBS缓冲溶液。
进一步优选的，其特征在于，所述含有荧光探针的PBS缓冲溶液中荧光探针的浓度为1μM。
优选的，所述荧光探针与碳酸酐酶的摩尔比的范围为6:1至3×105:1。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种荧光检测碳酸酐酶活性的方法，主要是一种由能够杂交形成双链结构的两条碱基序列组成的荧光探针在结合碳酸酐酶(CA)催化得到的氢离子(H+)后荧光发生变化，从而根据荧光响度的变化来检测碳酸酐酶的活性。现有技术中碳酸酐酶的酶活测定方法因为其精确度较差、灵敏度低、误差大、测定条件苛刻以及线性响应范围小、测定范围有限等原因，使得碳酸酐酶活性的实际研究变得困难；但是本发明的检测方法是利用DNA纳米探针的荧光信号变化，作为碳酸酐酶活性检测新技术，开发了干扰小、灵敏高、背景信号低、准确度高的碳酸酐酶酶活检测新技术来实时监测藻类的生长状况，解决了现有碳酸酐酶酶活检测方法中存在的缺陷和弊端，避免利用藻类的吸收、富集和降解作用去除水质污染过程中水体藻类的异常生长(即赤潮现象)而导致的严重威胁水体的生态平衡，同时也为酶活性测定预测藻华提供理论支持。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中提供可行性思路。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为Capure(C链)DNA和荧光探针(C-R双链DNA)在不同pH下的紫外吸收性能，其中a为Capure(C链)的紫外吸收、b为荧光探针(C-R双链DNA)的紫外吸收；
图2为荧光探针(C-R双链DNA)在识别H+后的荧光复原性能，其中a为荧光探针(C-R双链DNA)在pH＝7.0的PBS的缓冲溶液中的荧光光谱图、b为荧光探针(C-R双链DNA)在含有饱和CO2的PBS缓冲溶液中的荧光光谱图；
图3为在碳酸酐酶催化CO2的过程中荧光探针(C-R双链DNA)的荧光光谱变化；
图4为碳酸酐酶浓度对荧光探针(C-R双链DNA)荧光强度的作用，其中a为荧光光谱变化、b为荧光强度的线性变化；
图5为荧光探针(C-R双链DNA)对碳酸酐酶的选择性；
图6为荧光探针(C-R双链DNA)对碳酸酐酶的检测原理图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
对碳酸酐酶的活性灵敏准确的测定需要满足一下两点要求：①探针所识别H+只来自于碳酸酐酶催化CO2产生；②反应(1)所产生的H+能够尽可能的全部参与到DNA探针的构象变化的反应中，且不发生副反应。然而，在将CO2通入缓冲溶液中时，因为存在反应(2)，该反应将对碳酸酐酶的检测产生很强的干扰，使得上述检测模式不能满足要求①。因此，需要引入适当pH的缓冲溶液来避免反应2带来的干扰。但是缓冲溶液的缓冲能力，浓度等也将会干扰碳酸酐酶活性的检测，使得上述检测模式不能满足要求②。基于以上考量，需要对测试所使用的缓冲溶液的pH、缓冲能力以及浓度要进行优化。
Figure BDA0003724347760000031
Figure BDA0003724347760000032
首先，为了减小反应(2)带来的影响，选取了pH 7.4五个浓度(25mM、50mM、80mM、100mM、120mM)以及pH 9.0四个浓度(100mM、120mM、150mM、200mM)的PBS，在通入15分钟的CO2后pH的变化，结果如表1所示，随着缓冲溶液的浓度的增加，pH的变化值减小，表明缓冲溶液的浓度可以减小反应(2)带来的影响。但是，随着缓冲溶液的浓度的增加，相邻浓度缓冲溶液的pH的差值也在减小，这主要是由于反应(2)是一个可逆反应，H+的消耗，会促使反应正向进行。因此，为了进一步减小反应(2)的影响，考察了同一浓度不同pH的缓冲溶液的变化，如表1所示，pH的增加可以减少反应(2)的影响。为了兼顾达到检测的要求②，选择100mM的pH＝9.0的PBS缓冲溶液为测试溶剂。
表1不同浓度的PBS溶液通入CO2后pH值的变化
Figure BDA0003724347760000033
Figure BDA0003724347760000041
实施例1
设计一种检测碳酸酐酶活性的荧光探针(C-R双链DNA)，由能够杂交形成双链结构的两条碱基序列组成具体如下：
Reporter(R链)的碱基序列为：
5'-AGGGGGGGAAAGGGG-3′(SEQ ID NO.1)；
Capure(C链)的碱基序列为：
5'-CCCCCCCTTTCCCCCCCTTTCCCCCCCTTTCCCCCCC-3′(SEQ ID NO.2)。
其中Reporter的5'端连接有荧光基团AlexaFluor532，Capure的3'端连接有BHQ2，其中AlexaFluor532的结构为
Figure BDA0003724347760000042
BHQ2的结构为：
Figure BDA0003724347760000051
性能测试
1、对Capure(C链)DNA和荧光探针(C-R双链DNA)在不同pH下的紫外吸收性能进行检测，其结果如图1所示，其中a为Capure(C链)的紫外吸收、b为荧光探针(C-R双链DNA)的紫外吸收。从图1中a可以看出，随着pH从8.0下降到5.0，在270nm附近的吸收峰位置逐渐红移动，说明随着pH值减小、酸性增强，单链DNA逐渐出现了一些二级结构；同时，在295nm处逐渐出现明显的吸收峰，该吸收峰归属于i-motif结构的特征峰，说明微酸性条件下，C链可转化成i-motif结构。为了考察互补链(荧光探针即C-R双链DNA)对pH的响应可行性以及是否会影响i-motif形成，进一步研究了荧光探针(C-R双链DNA)随pH变化的紫外吸收情况，如图1中b所示，随着从pH从8.0下降到5.5，荧光探针(C-R双链DNA)在295nm处同样出现了i-motif特征峰，在270nm附近的吸收峰位置逐渐红移动，说明荧光探针(C-R双链DNA)的双链结构对捕获DNA对pH的响应没有影响。
2、荧光探针(C-R双链DNA)在识别H+后的荧光恢复性能
为了验证荧光探针(C-R双链DNA)能够识别氢离子(H+)且具有荧光复原的性能，首先采用pH＝7.0的PBS的缓冲溶液配置浓度为1μM的荧光探针(C-R双链DNA)溶液，检测其荧光峰的强度值在1000(a.u.)左右，随着逐渐加入H+，该溶液的荧光强度逐渐增强，说明当H+逐渐加入时，荧光探针(C-R双链DNA)与H+反应，荧光探针(C-R双链DNA)中的C链形成了i-motif结构，且释放出R链(Reporter链)，使得荧光恢复(如图2中a所示)。为了进一步考察该荧光探针(C-R双链DNA)能够应用在碳酸酐酶的催化饱和CO2体系中，将荧光探针(C-R双链DNA)溶解于含有饱和CO2的PBS缓冲溶液中使荧光探针(C-R双链DNA)的浓度为1μM，其荧光峰的强度值为2200(a.u.)左右，较在pH＝7.0的PBS缓冲溶液中有所增强，这主要是由于饱和CO2磷酸缓冲溶液的pH在6.8左右。同时，当向溶液中加入H+使溶液中的pH在7.0-6.0之间后，H+使得更多的荧光探针(C-R双链DNA)中双链解旋，释放出更多的R链从而使得R链上的荧光信号增强，但是同时其荧光强度低于同浓度的仅有R溶液的荧光强度(如图2中b所示)。由此说明，荧光探针(C-R双链DNA)在pH＝7.0的PBS缓冲溶液和含饱和CO2的PBS缓冲溶液中都是可以识别H+的。
实施例2
将荧光探针(C-R双链DNA)用于碳酸酐酶活性的检测方法中，具体的检测方法如下所示：
1、荧光探针(C-R双链DNA)与碳酸酐酶在含有饱和CO2的PBS缓冲溶液中的实时荧光响应
为了考察荧光探针(C-R双链DNA)在含有饱和CO2的PBS缓冲溶液中检测碳酸酐酶的活性的可行性，采用了实时荧光实时检测在碳酸酐酶催化CO2的过程中荧光探针(C-R双链DNA)的荧光光谱变化情况，其结果如图3所示。从图3可以看出，当向含有1uM的荧光探针(C-R双链DNA)的含有饱和CO2的PBS缓冲溶液中加入碳酸酐酶后，荧光强度迅速增强，在前1000s内增强的较为迅速，随着反应时间进行，在1000-1750s内，荧光强度增强速度减缓；最后在1750s后，几乎没有变化，呈现出平台趋势。由此说明，碳酸酐酶的引入，确实可以引起荧光探针(C-R双链DNA)双链探针的荧光强度增加，初步表明本发明的荧光探针(C-R双链DNA)确实可以用于检测碳酸酐酶的活性。
2、利用荧光探针(C-R双链DNA)检测碳酸酐酶活性的性能
为了进一步评估浓度对荧光恢复，在固定浓度的荧光探针(C-R双链DNA)存在下，通过加入不同活性的碳酸酐酶(其活性分别为17500U到0.35U)，考察不同酶活下荧光探针(C-R双链DNA)的荧光强度，结果如图4所示，a为荧光光谱的变化、b为荧光强度的线性变化。从图4可以看出，随着碳酸酐酶活性的增加，荧光探针(C-R双链DNA)的荧光在逐渐增强，且其荧光强度的变化值与酶活性成良好的线性关系，其拟合后的方程式为I＝655.2514+312.7258lgU(其中R2＝0.9942)。该结果进一步表明，本发明的荧光探针(C-R双链DNA)可以用于碳酸酐酶的活性测定。
3、检测荧光探针(C-R双链DNA)对碳酸酐酶的选择性
为了探究荧光探针(C-R双链DNA)对碳酸酐酶(CA)活性检测的特异性选择，选取了碱性磷酸酯酶(ALP)、牛血清白蛋白(BSA)以及重组蛋白(RELA人核因子P65即NF-kBP65)三种蛋白作为干扰物，在相同的检测条件下将其测试得到的荧光强度进行了对比，结果如图5所示，CA催化的ΔI’快接近2000(a.u.)，而其他蛋白恢复ΔI’值几乎可忽略，得出结论：CA催化H+生成对促进荧光恢复具有良好性能。上述实验成功的关键是碳酸酐酶活性位点包含氢氧化物结合的Zn2+，用于催化二氧化碳和碳酸氢盐之间的相互转化，二氧化碳在水介质中相对溶解，与pKa为6.1的碳酸氢盐平衡；然而，二氧化碳的溶解速度较慢(k＝10-1s-1)。因此，使用CA提高二氧化碳-碳酸氢盐周转频率高达106s-1。
由此，本发明荧光探针(C-R双链DNA)对碳酸酐酶的检测原理如图6所示，具体为：将富C碱基序列(Capure的碱基序列)作为捕获探针并将其标记荧光猝灭基团，其互补序列(Reporter的碱基序列)作为标记荧光分子作为荧光信号输出端。当两条序列杂交形成双链结构时，双链结构表现出非常低的荧光。当加入碳酸酐酶(CA)溶液与饱和CO2溶液时，碳酸酐酶将催化CO2解离产生大量的H+，所释放的H+将与富C碱基的单链DNA(Capure的碱基序列)通过半质子化胞嘧啶-鸟嘌呤(C·G+)碱基对形成折叠成紧凑、刚性的分子内i-motif结构，从而促使捕获探针的双链DNA断开。由于构象的改变，标记荧光基团AlexaFluor532远离猝灭基团，从而得到一个较大的荧光信号的恢复，其荧光信号的大小与H+的量相关，进而可以来反应碳酸酐酶的活性。通过研究以上过程的可行性以及影响因素，建立DNA纳米探针对碳酸酐酶催化产物的识别以及信号转换的机制。
综上所述，本发明公开了一种荧光检测碳酸酐酶活性的方法，主要是一种由能够杂交形成双链结构的两条碱基序列组成的荧光探针(该荧光探针Reporter的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，对应的Capure的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，Reporter的5'端连接有荧光基团AlexaFluor532)在结合碳酸酐酶(CA)催化得到的氢离子(H+)后荧光发生变化，从而根据荧光响度的变化来检测碳酸酐酶的活性。现有技术中碳酸酐酶的酶活测定方法因为其精确度较差、灵敏度低、误差大、测定条件苛刻以及线性响应范围小、测定范围有限等原因，使得碳酸酐酶活性的实际研究变得困难；但是本发明的检测方法是利用DNA纳米探针的荧光信号变化，作为碳酸酐酶活性检测新技术，开发了干扰小、灵敏高、背景信号低、准确度高的碳酸酐酶酶活检测新技术来实时监测藻类的生长状况，解决了现有碳酸酐酶酶活检测方法中存在的缺陷和弊端，避免利用藻类的吸收、富集和降解作用去除水质污染过程中水体藻类的异常生长(即赤潮现象)而导致的严重威胁水体的生态平衡，同时也为酶活性测定预测藻华提供理论支持。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110> 重庆工商大学
<120> 一种荧光检测碳酸酐酶活性的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agggggggaaagggg 15
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccccccctttccccccctttccccccctttccccccc 37

Claims (5)

1.一种荧光检测碳酸酐酶活性的方法，其特征在于，所述方法具体为：采用荧光探针通过荧光法检测碳酸酐酶活性；
所述荧光探针由能够杂交形成双链结构的两条碱基序列组成，其中Reporter的碱基序列如SEQ ID NO.1所示、5'端连接有荧光基团AlexaFluor532，对应的Capure的碱基序列如SEQ ID NO.2所示、3'端连接有荧光猝灭基团BHQ2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体为：将所述荧光探针溶解在溶剂中混合均匀形成溶液，向溶液中加入碳酸酐酶，通过检测溶液在加入碳酸酐酶前后的荧光强度的变化，从而确定碳酸酐酶的活性。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述溶剂为浓度为100mM、pH＝9.0的PBS缓冲溶液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含有荧光探针的PBS缓冲溶液中荧光探针的浓度为1μM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光探针与碳酸酐酶的摩尔比的范围为6:1至3×105:1。
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MEHTA R 等: "A new probe for detecting zinc-bound carbonic anhydrase in cell lysates and cells" *
TERUYA K 等: "Recent developments of small molecule chemical probes for fluorescence-based detection of human carbonic anhydrase II and IX" *
孟姜姜: "用于相邻巯基蛋白分离的磁性纳米粒子和碳酸酐酶荧光探针的设计与合成" *
徐海云 等: "检测氢离子的荧光探针:含稠合外环的硼-二吡咯亚甲基染料的合成、光谱和电化学性质研究" *
李伟 等: "荧光定量PCR的方法" *

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