CN112557384B - 一种基于比色分析的硫化氢检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种基于比色分析的硫化氢检测方法及应用，包括以下步骤：制备四氧化三铁；制备磁珠‑羧基；活化磁珠‑羧基、制备MB/PAMAM/MnO2复合材料；配制NaAc‑HAc缓冲液及TMB；优化检测条件；取硫化钠溶液，加入NaAc‑HAc缓冲液、MB/PAMAM/MnO2、TMB，进行比色检测，测定吸光度。本发明提供的基于比色分析的硫化氢检测方法及应用，MB/PAMAM/MnO2材料具有较强的催化性能，对H2S检测的灵敏度高，通用性强，操作灵活，检测方法简便，经济效益高，在痕量生物小分子分析中有着重要的实际意义和发展前景，为临床生物分子检测提供了一种简单、低廉、快速、高灵敏且性能稳定的检测新方法。
Description
技术领域
本发明属于比色免疫分析技术领域，具体涉及一种基于比色分析的硫化氢检测方法及应用。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
硫化氢（H2S）是一种无色且具有臭鸡蛋气味的气体，一般由工业中含硫物质非完全燃烧产生，被认为是一种有毒环境污染物。近年的研究发现，H2S是生命体内一种重要的内源性气体信号分子，参与多种重要的生理过程，H2S浓度异常与许多疾病有关，如阿尔茨海默氏症、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化等。传统的H2S检测方法包括吸收光谱法、电化学法、气相色谱法和硫沉淀法等，但这些方法通常成本高，耗时长，操作步骤繁琐且需要经过专门训练的人员来执行，所以限制了它们的进一步应用。而比色法发展迅速，可直接对目标物裸眼分析，无需借助昂贵的仪器设备。因此，基于H2S在环境和生命体内的重要作用，开发灵敏有效的分析方法具有重要的意义。
磁珠（MB）由于其独特的特性而获得了广泛的应用，这些特性使它们能够被外部磁场定向，并有可能从反应混合物中分离出来，此外还有比表面积大、物理化学稳定性好、较低的生物相容性和毒性等特点。
二氧化锰（MnO2）是一种经人工制得的纳米酶，在室温下有较好的稳定性，且具有很多大小不同、多孔通道及特定的晶体结构，表面能产生较多吸附位点，这种表层构造特点有助于催化作用的体现。
PAMAM纳米材料，不仅可作为一种优良的纳米级的单分子表面活性剂，具有良好的增溶、破乳和稳定的作用，也可作为一种优良的催化剂载体，用于获得强催化活性的催化剂。因此，将磁珠、二氧化锰和PAMAM纳米材料三种材料混合制备复合材料对于检测H2S具有重要意义。
比色分析是通过检测体系中有色物质在紫外可见光谱中的吸收值来判断待测物的含量，既可以通过肉眼定性分析，也可以通过紫外可见分光光度计定量分析。比色分析测定成本低，无需昂贵的大型仪器，检测耗时短，可通过肉眼快速定性检测，适于快速检测。自创立以来，比色法已经发展为最受欢迎的检测方法之一。比色分析是免疫分析中最常用的检测手段之一，ELISA（Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent Assays）中最后结合在固相载体上的酶与待测物的含量呈相关性，加入酶的底物后，酶催化底物生成有色产物，有色产物的量与待测物的量直接相关，可通过产物颜色的深浅进行定性或者定量分析。由于酶催化的效率很高，比色免疫分析可达到很高的灵敏度。因此，利用比色免疫进行分析开发具有重大的现实意义。
综上所述，现有技术存在的问题包括：
（1）用于检测H2S的现有方法，如吸收光谱法、电化学法、气相色谱法等，成本高，耗时长，需要复杂昂贵的科学仪器和专业的操作人员，且不易于小型化；
（2）目前，用于H2S检测的免疫分析研究较少，且H2S在生物基质中的检测具有挑战性，无法实现低浓度目标物的高灵敏检测。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种基于比色分析的硫化氢检测方法及应用，硫化氢的检测范围为1～100 μM，检测限为0.89 μM。
为实现上述目的，达到上述技术效果，本发明采用的技术方案为：
一种基于比色分析的硫化氢检测方法，包括以下步骤：
S101、制备四氧化三铁
S102、制备磁珠-羧基（MB-COOH）
S103、活化磁珠-羧基、制备MB/PAMAM/MnO2复合材料
S104、配制NaAc-HAc缓冲液及TMB
S105、优化检测条件
S106、取硫化钠溶液，稀释至不同浓度，先加入NaAc-HAc缓冲液反应9～11 min，接着加入MB/PAMAM/MnO2复合材料反应75～85 min，最后加入TMB反应3～5 min进行比色检测，测定吸光度；
S107、硫化氢选择性检测；
步骤S101、步骤S102和步骤S104无先后顺序，步骤S103位于步骤S102之后。
进一步的，步骤S101中，四氧化三铁的制备步骤包括：
FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O与除氧后的HCl溶液混合后充氮气19～21 min，除去氧气，随后快速注入除氧后的NaOH溶液，在氮气保护下强烈搅拌均匀1.9～2.1 h，最后用二次水冲洗数次至中性。
进一步的，步骤S102中，磁珠-羧基的制备步骤包括：
在烧瓶中加入磁珠及二次水，超声分散；接着将柠檬酸溶解在悬浮液中，在N2保护下强烈搅拌均匀，之后在69～71℃下加热回流0.9～1.1 h；最后，磁性分离，并用去离子水彻底清洗，即可得到所需磁珠-羧基。
进一步的，步骤S103中，MB/PAMAM/MnO2复合材料的制备步骤包括：
磁珠-羧基加入二次水中，分散后加入EDC-NHS混合液，反应1.9～2.1 h；接着加入PAMAM纳米材料，反应过夜；随后磁性分离，加入MnCl2溶液并振荡均匀，最后加入KMnO4溶液，振荡反应0.4～0.6 h，再磁性分离后水洗数次，得到所需的MB/PAMAM/MnO2复合材料。
进一步的，步骤S103中，步骤S104中，NaAc-HAc缓冲液的配制步骤包括：
称取乙酸钠8.3 g，稀释定容至100 mL，随后用1.75 mol/L的乙酸调pH至4.5。
进一步的，步骤S103中，步骤S104中，TMB的配制步骤包括：
制备A液：
TMB与DMSO混合并搅拌均匀，备用；
制备B液：
柠檬酸与NaHPO4混合并搅拌均匀，定容至100 mL，备用；
将制备好的B液10 mL加入到100 μL A液中，超声混合均匀后4℃避光保存即可。
进一步的，步骤S105中，分别对MB/PAMAM/MnO2复合材料体积、NaAc-HAc缓冲液的pH值、硫化氢与NaAc-HAc缓冲液的反应时间、MB/PAMAM/MnO2复合材料与硫化氢的反应时间以及MB/PAMAM/MnO2复合材料与TMB的反应时间进行条件优化。
进一步的，步骤S107中进行硫化氢选择性检测，探讨PO4 3−、NO3 -、SO4 2−、Cl-、Zn2+、K+、Ca2+、Mg2+、Ag+在水中对硫化氢是否存在影响。
本发明公开了一种基于比色分析的硫化氢检测方法在检测除硫化氢的目标物中的应用，将步骤S106中的MB/PAMAM/MnO2复合材料替换成掺杂MnO2的其他复合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明公开了一种基于比色分析的硫化氢检测方法及应用，构建了以H2S为检测对象的比色免疫分析方法，与传统的H2S检测方法相比，其避免了贵重仪器的分析方法的建立，降低了搭建分析平台的成本，MB/PAMAM/MnO2复合材料具有较强的催化性能，使得其对H2S检测的灵敏度大大的提高，以TMB显色反应为检测平台，使用MB/PAMAM/MnO2复合材料为识别元件提高了目标物检测的选择性和稳定性，在常见类似物PO4 3−、NO3 -、SO4 2−、Cl-、Zn2+、K+、Ca2+、Mg2+、Ag+等离子干扰物存在下，对H2S均具有良好的选择性，提高了分析的灵敏度；相比于一种非常常用的酶，辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP），MnO2具有较高的化学稳定性、成本低、制备简单、易于修饰等优点，可避免使用高成本且稳定性差的生物酶，通过利用MB/PAMAM/MnO2复合材料，不仅可用于H2S的定量检测，只需将本发明中的MB/PAMAM/MnO2复合材料换成掺杂MnO2的其他复合物即可应用于新目标物的检测分析，通用性强，操作更加灵活；原料易得，检测方法更简便、更灵敏，选择性且经济效益更高，在痕量生物小分子分析中有着重要的实际意义和发展前景，为临床生物分子检测提供了一种简单、低廉、快速、高灵敏且性能稳定的检测新方法。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为本发明的原理示意图；
图3为本发明中不同pH值的NaAc-HAc缓冲液与TMB体系吸光度值的关系曲线图；
图4为本发明中硫化氢与MB/PAMAM/MnO2复合材料的反应时间与TMB体系吸光度值的关系曲线图；
图5为本发明中不同浓度硫化钠与NaAc-HAc缓冲液反应生成硫化氢的UV-vis响应曲线图；
图6为本发明中硫化钠与NaAc-HAc缓冲液反应生成硫化氢的浓度标准曲线图；
图7为本发明硫化钠与NaAc-HAc缓冲液反应生成的硫化氢选择性实验结果示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
如图1-7所示，一种基于比色分析的硫化氢检测方法，以硫化氢检测为例，基本原理是：硫化钠溶液，先稀释至不同浓度，与NaAc-HAc缓冲液反应生成不同浓度的硫化氢，MB/PAMAM/MnO2复合材料作为反应媒介催化TMB（四甲基联苯胺，3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine）发生显色，导致比色响应信号大小随着硫化氢浓度的变化而变化。在H2S的存在条件下，TMB反应体系的吸光度值会随着H2S的浓度变化而变化，从而达到定量检测H2S的目的，利用这个特点，可以建立一种简单、低廉、快速、灵敏且性能稳定的基于比色分析的硫化氢检测新方法，具体包括以下步骤：
S101、四氧化三铁（Fe3O4）的制备步骤如下：
FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O与除氧后的HCl溶液混合后充N220～30 min，除氧，随后快速注入除氧后的NaOH 溶液，在N2保护下强烈搅拌均匀1.9～2.1 h，最后用二次水冲洗数次至中性。
S102、磁珠-羧基（MB-COOH）的制备步骤如下：
在圆底烧瓶中加入磁珠及二次水，超声分散；接着将柠檬酸溶解在悬浮液中，在N2保护下强烈搅拌均匀，之后在69～71℃下加热回流0.9～1.1 h；最后，磁性分离，并用去离子水彻底清洗，即可得到MB-COOH。
S103、MB-COOH的活化及MB/PAMAM/MnO2复合材料的制备步骤包括：
MB-COOH加入二次水中，分散后加入EDC-NHS混合液，反应1.9～2.1 h；接着加入PAMAM纳米材料，反应过夜；之后磁性分离，加入MnCl2溶液并振荡均匀，最后加入KMnO4，接着振荡反应0.4～0.6 h，再磁性分离后水洗数次，定容至2 mL即可得到所需MB/PAMAM/MnO2复合材料。
S104、NaAc-HAc缓冲液的配制如下：
称取乙酸钠8.3 g，稀释定容至100 mL，后用1.75 mol/L的乙酸调pH至4.5。
TMB的配制如下：
A液：TMB+DMSO，搅拌均匀，备用；B液：柠檬酸+NaHPO4搅拌均匀，定容至100 mL，备用；将制备好的B液10mL加入到100 μL A液中，超声混合均匀后4℃避光保存即可。
S105、分别对MB/PAMAM/MnO2复合材料体积、NaAc-HAc缓冲液的pH值、硫化氢与NaAc-HAc缓冲液的反应时间、MB/PAMAM/MnO2与硫化氢的反应时间以及MB/PAMAM/MnO2与TMB的反应时间等条件做优化。
S106、取硫化钠溶液（稀释至不同浓度)，首先加入NaAC-HAC缓冲液反应，接着加入MB/PAMAM/MnO2复合材料反应，最后加入TMB反应3.9～4.1 min进行比色检测，绘制关系曲线图，如图3-6所示；
S107、探讨PO4 3−、NO3 -、SO4 2−、Cl-、Zn2+、K+、Ca2+、Mg2+、Ag+等离子在水中对硫化氢是否存在影响。
本发明还公开了一种基于比色分析的硫化氢检测方法在检测除硫化氢的目标物中的应用，将步骤S106中的MB/PAMAM/MnO2复合材料替换成掺杂MnO2的其他复合物后即可应用于新目标物的检测分析，检测灵敏度高。
实施例1
不同pH值的NaAc-HAc缓冲液对检测硫化氢的影响：
S101、Fe3O4的制备步骤为：
FeCl2·4H2O（0.29815g，50 mmol/L）、FeCl3·6H2O（0.81087g，100 mmol/L）以及除氧后的HCl溶液（1.2mmol/L，30 mL）混合后充氮气20 min，随后快速注入除氧后的NaOH溶液（1.25 mol/L，30mL），在N2保护下强烈搅拌2 h，最后用二次水冲洗三次至中性。
S102、MB-COOH的制备步骤为：
在圆底烧瓶中加入1.0 g磁珠及100 mL二次水，超声分散；随后，将2.5 g的柠檬酸溶解在悬浮液中，在氮气保护下强烈搅拌30 min，之后在70℃下加热回流1 h；最后，磁性分离，并用去离子水彻底清洗，即可得到MB-COOH。
S103、MB-COOH的活化及MB/PAMAM/MnO2的制备步骤为：
3 mg MB-COOH加入至1 mL二次水中，分散后加入20 μL EDC-NHS（20 mmol/L）混合液，反应2 h；接着加入100 μLPAMAM，反应过夜；之后磁性分离，加入50 μLMnCl2（0.1 mol/L）并振荡6 h，最后加入KMnO4（500 μL，10 mmol/L），接着振荡反应0.5 h，再磁性分离后水洗2次，定容至2 mL即可得到所需MB/PAMAM/MnO2复合材料。
S104、NaAc-HAc缓冲液（0.6 mol/L）的配制如下：
称取乙酸钠8.3 g，稀释定容至100 mL，随后用1.75 mol/L的乙酸分别调pH至2、2.5、3、3.5、4.5、5。
TMB（6 mmol/L）的配制如下：
A液：TMB（0.0143g）+ DMSO（100 μL），搅拌均匀，备用；
B液：柠檬酸（24.3 mL，0.1 mol/L ) + NaHPO4（5.7 mL，0.2 mol/L）搅拌均匀，定容至100 mL，备用；
随后，将制备好的B液10mL加入到A液（100 μL）中，超声混合均匀后4℃避光保存即可。
S105、取100 μL的硫化钠溶液（稀释至不同浓度），首先加入800 μL的NaAc-HAc缓冲液（pH = 2、2.5、3.5、4.5、5）反应10 min，接着加入7 μL的MB/PAMAM/MnO2复合材料反应80 min，最后加入100 μL TMB（6 mmol/L）反应4 min进行比色检测，以NaAc-HAc缓冲液的pH值为横坐标，TMB反应体系的吸光度值为纵坐标绘制变化曲线图，如图3所示，在NaAc-HAc缓冲液pH为4.5时，响应最强。
实施例2
硫化氢与MB/PAMAM/MnO2复合材料的反应时间对检测硫化氢的影响：
S101、Fe3O4的制备步骤为：
FeCl2·4H2O（0.29815g，50 mmol/L）、FeCl3·6H2O（0.81087g，100 mmol/L）以及除氧后的HCl溶液（1.2mmol/L，30 mL）混合后充氮气20 min，随后快速注入除氧后的NaOH溶液（1.25 mol/L，30mL），在N2保护下强烈搅拌2 h，最后用二次水冲洗三次至中性。
S102、MB-COOH的制备步骤为：
在圆底烧瓶中加入1.0 g磁珠及100 mL二次水，超声分散；随后，将2.5 g的柠檬酸溶解在悬浮液中，在氮气保护下强烈搅拌30 min，之后在70℃下加热回流1 h；最后，磁性分离，并用去离子水彻底清洗，即可得到MB-COOH。
S103、MB-COOH的活化及MB/PAMAM/MnO2复合材料的制备步骤为：
3 mg MB-COOH加入至1 mL二次水中，分散后加入20 μL EDC-NHS（20 mmol/L）混合液，反应2 h；接着加入100 μLPAMAM，反应过夜；之后磁性分离，加入50 μLMnCl2（0.1 mol/L）并振荡6 h，最后加入KMnO4（500 μL，10 mmol/L），接着振荡反应0.5 h，再磁性分离后水洗2次，定容至2 mL即可得到所需MB/PAMAM/MnO2复合材料。
S104、NaAc-HAc缓冲液（0.6 mol/L）的配制如下：
称取乙酸钠8.3 g，稀释定容至100 mL，后用1.75 mol/L的乙酸调pH为4.5。
TMB（6 mmol/L）的配制如下：
A液：TMB（0.0143g）+ DMSO（100 μL），搅拌均匀，备用；
B液：柠檬酸（24.3 mL，0.1 mol/L ) + NaHPO4（5.7 mL，0.2 mol/L）搅拌均匀，定容至100 mL，备用；
随后，将制备好的B液10mL加入到100 μL A液中，超声混合均匀后4℃避光保存即可。
S105、取100 μL的硫化钠溶液（稀释至不同浓度：1 μM、25 μM、50 μM、75 μM、100 μM），首先加入800 μL的NaAc-HAc缓冲液（pH = 4.5）缓冲液反应10 min，接着加入7 μL的MB/PAMAM/MnO2复合材料分别反应50、60、70、80、90、100、110、120 min，最后加入100 μL TMB（6mmol/L）反应4 min进行比色检测，以硫化氢与MB/PAMAM/MnO2复合材料的反应时间为横坐标，TMB反应体系的吸光度值为纵坐标绘制变化曲线图，检测到的吸光度信号随着硫化氢与MB/PAMAM/MnO2复合材料的反应时间在70-90 min区间内增大而减小，当反应时间超过80min后，信号趋于稳定，如图4所示。
实施例3
一种基于比色分析的硫化氢检测方法，包括以下步骤：
S101、Fe3O4的制备步骤为：
FeCl2·4H2O（0.29815g，50 mmol/L）、FeCl3·6H2O（0.81087g，100 mmol/L）以及除氧后的HCl溶液（1.2mmol/L，30 mL）混合后充氮气20 min，随后快速注入除氧后的NaOH溶液（1.25 mol/L，30mL），在N2保护下强烈搅拌2 h，最后用二次水冲洗三次至中性。
S102、MB-COOH的制备步骤为：
在圆底烧瓶中加入1.0 g磁珠及100 mL二次水，超声分散；随后，将2.5 g的柠檬酸溶解在悬浮液中，在氮气保护下强烈搅拌30 min，之后在70℃下加热回流1 h；最后，磁性分离，并用去离子水彻底清洗，即可得到MB-COOH。
S103、MB-COOH的活化及MB/PAMAM/MnO2复合材料的制备步骤为：
3 mg MB-COOH加入至1 mL二次水中，分散后加入20 μL EDC-NHS（20 mmol/L）混合液，反应2 h；接着加入100 μLPAMAM，反应过夜；之后磁性分离，加入50 μLMnCl2（0.1 mol/L）并振荡6 h，最后加入KMnO4（500 μL，10 mmol/L），接着振荡反应0.5 h，再磁性分离后水洗2次，定容至2 mL即可得到所需MB/PAMAM/MnO2复合材料。
S104、NaAc-HAc缓冲液（pH=4.5，0.6 mol/L）的配制如下：
称取乙酸钠8.3 g，稀释定容至100 mL，随后用1.75 mol/L的乙酸调pH至4.5即可。
TMB（6 mmol/L）的配制如下：
A液：TMB（0.0143g）+ DMSO（100 μL），搅拌均匀，备用；
B液：柠檬酸（24.3 mL，0.1 mol/L ) + NaHPO4（5.7 mL，0.2 mol/L）搅拌均匀，定容至100 mL，备用；
随后，将制备好的B液10mL加入到A液（100 μL）中，超声混合均匀后4℃避光保存即可。
S105、优化检测条件：
分别对MB/PAMAM/MnO2复合材料体积、NaAc-HAc缓冲液pH、硫化氢与NaAc-HAc缓冲液的反应时间、MB/PAMAM/MnO2复合材料与硫化氢的反应时间以及MB/PAMAM/MnO2复合材料与TMB的反应时间等条件做优化。
S106、取100 μL的硫化钠溶液（稀释至不同浓度：1μM、25μM、50μM、75μM、100 μM），首先加入800 μL的NaAc-HAc缓冲液（pH为4.5）反应10 min，接着加入7 μL的MB/PAMAM/MnO2复合材料反应80 min，最后加入100 μL TMB（6 mmol/L）反应4 min进行比色检测，绘制关系曲线图，如图5-6所示，硫化氢浓度越低，TMB反应体系的吸光度信号越强，通过不同浓度的硫化钠与NaAc-HAc缓冲液反应生成硫化氢测定比色信号，信号强度和生成硫化氢的浓度呈线性相关，根据得到的线性关系用于待测样品中硫化氢浓度的检测。
S107、硫化氢选择性检测：
探讨PO4 3−、NO3 -、SO4 2−、Cl-、Zn2+、K+、Ca2+、Mg2+、Ag+等离子在水中对硫化氢是否存在影响（硫化氢浓度为50 μmol/L，其余离子均为0.5 mmol/L），如图7所示，在常见类似物PO4 3 −、NO3 -、SO4 2−、Cl-、Zn2+、K+、Ca2+、Mg2+、Ag+等离子干扰物存在下，该体系依然对H2S均具有良好的选择性（硫化钠浓度为50μM，其他离子浓度均为0.5mM）。
本发明的有益效果为：
以TMB显色反应作为反应平台，硫化钠溶液，稀释至不同浓度，与NaAc-HAc缓冲液生成不同浓度的硫化氢，TMB在MB/PAMAM/MnO2复合材料催化下发生显色，从而达到定量检测硫化氢的目的；
使用MB/PAMAM/MnO2复合材料做催化剂，通过比色免疫分析法对硫化氢进行高灵敏性定量检测，提高了目标物检测的选择性和稳定性，构建以硫化氢为检测对象的比色免疫法，提高分析的灵敏度，为临床生物分子检测提供了一种简单、低廉、快速、高灵敏且性能稳定的检测新方法。
本发明未具体描述的部分采用现有技术即可，在此不做赘述。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种基于比色分析的硫化氢检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S101、制备四氧化三铁
S102、制备磁珠-羧基
S103、活化磁珠-羧基、制备MB/PAMAM/MnO2复合材料
S104、配制NaAc-HAc缓冲液及TMB
S105、优化检测条件
S106、取硫化钠溶液，稀释至不同浓度，先加入NaAc-HAc缓冲液反应9～11 min，接着加入MB/PAMAM/MnO2复合材料反应75～85 min，最后加入TMB反应3～5 min进行比色检测，测定吸光度；
S107、硫化氢选择性检测；
步骤S101、步骤S102和步骤S104无先后顺序，步骤S103位于步骤S102之后；
步骤S103中，MB/PAMAM/MnO2复合材料的制备步骤包括：
磁珠-羧基加入二次水中，分散后加入EDC-NHS混合液，反应1.9～2.1 h；接着加入PAMAM纳米材料，反应过夜；随后磁性分离，加入MnCl2溶液并振荡均匀，最后加入KMnO4溶液，振荡反应0.4～0.6 h，再磁性分离后水洗数次，得到所需的MB/PAMAM/MnO2复合材料；
硫化氢的检测范围为1～100μM，检测限为0.89μM。
2.根据权利要求1所述的一种基于比色分析的硫化氢检测方法，其特征在于，步骤S101中，四氧化三铁的制备步骤包括：
FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O与除氧后的HCl溶液混合后充氮气19～21 min，除去氧气，随后快速注入除氧后的NaOH溶液，在氮气保护下强烈搅拌均匀，最后用二次水冲洗数次至中性。
3.根据权利要求1所述的一种基于比色分析的硫化氢检测方法，其特征在于，步骤S102中，磁珠-羧基的制备步骤包括：
在烧瓶中加入磁珠及二次水，超声分散；接着将柠檬酸溶解在悬浮液中，在N2保护下强烈搅拌均匀，之后在69～71℃下加热回流0.9～1.1 h；最后，磁性分离，并用去离子水彻底清洗，即可得到所需磁珠-羧基。
4.根据权利要求1所述的一种基于比色分析的硫化氢检测方法，其特征在于，步骤S104中，NaAc-HAc缓冲液的配制步骤包括：
称取乙酸钠8.3 g，稀释定容至100 mL，随后用1.75 mol/L的乙酸调pH至4.5。
5.根据权利要求1所述的一种基于比色分析的硫化氢检测方法，其特征在于，步骤S104中，TMB的配制步骤包括：
制备A液：
TMB与DMSO混合并搅拌均匀，备用；
制备B液：
柠檬酸与NaHPO4混合并搅拌均匀，定容至100 mL，备用；
将制备好的B液10 mL加入到100 μL A液中，超声混合均匀后4℃避光保存即可。
6.根据权利要求1所述的一种基于比色分析的硫化氢检测方法，其特征在于，步骤S105中，分别对MB/PAMAM/MnO2复合材料体积、NaAc-HAc缓冲液的pH值、硫化氢与NaAc-HAc缓冲液的反应时间、MB/PAMAM/MnO2复合材料与硫化氢的反应时间以及MB/PAMAM/MnO2复合材料与TMB的反应时间进行条件优化。
7.根据权利要求1所述的一种基于比色分析的硫化氢检测方法，其特征在于，步骤S107中进行硫化氢选择性检测，探讨PO4 3−、NO3 -、SO4 2−、Cl-、Zn2+、K+、Ca2+、Mg2+、Ag+在水中对硫化氢是否存在影响。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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