CN110721321A - 基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针及其应用 - Google Patents

基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针及其应用，纳米探针由以下方法制备得到：(1)取柠檬酸铁和硫酸亚铁配成溶液，调节pH，水热反应，分离干燥；(2)将四氧化三铁纳米颗粒与PEG混合，加入EDC和NHS活化，再加入硼酸盐缓冲溶液，保持pH为7‑10，室温反应；(3)取PAMAM与Fe3O4‑PEG混合均匀，加入EDC和NHS活化，再加入硼酸盐缓冲溶液，保持pH为7‑10，反应，接着再加入MMP2，继续反应；(4)取光敏剂和Fe3O4‑PEG‑PAMAM‑MMP2的溶液混合，避光震荡处理，透析纯化后，得到磁性纳米探针，即为目的产物。与现有技术相比，本发明制备流程简单，操作方便，在肿瘤成像和个性化治疗上具有广阔的应用前景。

Description

基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针及其应用
技术领域
本发明属于生物医药肿瘤成像和治疗药物技术领域，涉及一种基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针及其制备和应用。
背景技术
在我国，癌症已经成为影响人类生命健康的重要杀手。目前临床上最常用来肿瘤诊疗的方式有化疗、放疗和手术切除。这三种方式也都存在一些弊端，比如放疗的治疗周期长、毒副作用大；化疗可能引起骨髓抑制、免疫功能下降等副反应；手术切除不彻底等。另外，通常癌症的早期症状不明显，一旦被发现，大部分已经处于癌症晚期。同时，目前的癌症治疗依然存在癌症转移、耐药性诸多问题，这些问题的解决仍然是巨大的挑战。针对目前癌症治疗手段的匮乏和低效，迫切需要研究出一种癌症诊断和治疗的有效工具。分子影像技术作为新一代肿瘤早期诊疗技术可实现恶性肿瘤分子水平诊断及靶向治疗，具有非侵入式、早期诊断、精确肿瘤位置和毒副反应小等优势。基于多功能纳米平台治疗肿瘤的方式正在蓬勃发展，它们既可以靶向治疗肿瘤，又可以对肿瘤进行精确定位，为实现肿瘤个性化治疗提供了新方法。
在众多的靶向纳米探针中，基于磁性Fe3O4制备的纳米探针在肿瘤的治疗中备受人们关注，目前已有一些研究初步探索了基于磁性Fe3O4制备的纳米探针在恶性肿瘤治疗中的应用，为肿瘤个性化治疗提供了新方法。这一研究方向是当前国内外研究的热点和前沿，也符合国家重大需求。
中国专利ZL201010512272.1公开了一种表面修饰树枝状高分子的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的制备方法，先采用热分解法合成超顺磁性四氧化三铁纳米粒子，然后与带羧基的树枝状高分子反应，进行表面修饰，形成表面修饰树枝状高分子的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；其粒径为6-10nm。该专利采用热分解法制备超顺磁性四氧化三铁纳米粒子，制备过程相对复杂、对温度要求严格而且可能伴随有副产物。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针及其应用。通过荧光成像和MR成像发现该纳米探针能够有效地靶向肿瘤部位，同时在近红外光照射下对肿瘤生长起到抑制效果。因此，该纳米探针可以应用到肿瘤成像和治疗领域。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一在于提供了一种基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针，其由以下方法制备得到：
(1)取柠檬酸铁和硫酸亚铁配成溶液，调节pH至7-10，水热反应，分离干燥，得到四氧化三铁纳米颗粒；
(2)将四氧化三铁纳米颗粒与PEG(聚乙二醇)混合，加入EDC和NHS活化，再加入硼酸盐缓冲溶液，保持pH为7-10，室温反应，得到Fe3O4-PEG；
(3)取PAMAM(聚酰胺-胺型树枝状高分子)与Fe3O4-PEG混合均匀，加入EDC和NHS活化，再加入硼酸盐缓冲溶液，保持pH为7-10，反应，接着再加入MMP2(基质金属蛋白酶)，继续反应，得到Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2；
(4)取光敏剂和Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2的溶液混合，避光震荡处理，透析纯化后，得到磁性纳米探针，即为目的产物。
进一步的，柠檬酸铁和硫酸亚铁的摩尔比为1:2。
进一步的，步骤(1)中，水热反应的条件为：在180-200℃下反应8-10h。
进一步的，步骤(1)中，分离干燥的具体过程为：将反应产物冷却至室温后，置于透析袋中透析2～3天，最后真空冷冻干燥。
进一步的，步骤(2)中，四氧化三铁纳米颗粒与PEG的质量比为2-3:100。更优选的，质量比为2.3:100。
进一步的，步骤(2)中，室温反应的时间为10-12h。
进一步的，步骤(3)中，PAMAM、Fe3O4-PEG和MMP2的质量比为0.7-1.5:1:4-6。
进一步的，步骤(3)中，加入硼酸盐缓冲溶液后反应的时间为2-4h。
进一步的，加入MMP2后继续反应的条件为：在室温下反应10-12h。
进一步的，步骤(4)中，光敏剂与Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2的质量比为65-70:1。
进一步的，所述的光敏剂为二氢卟吩Ce6。
进一步的，步骤(4)中，避光震荡的转速为60-100rpm，时间为1-2天。
本发明的技术方案之二在于提供了一种上述基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)取柠檬酸铁和硫酸亚铁配成溶液，调节pH至7-10，水热反应，分离干燥，得到四氧化三铁纳米颗粒；
(2)将四氧化三铁纳米颗粒与PEG混合，加入EDC和NHS活化，再加入硼酸盐缓冲溶液，保持pH为7-10，室温反应，得到Fe3O4-PEG；
(3)取PAMAM与Fe3O4-PEG混合均匀，加入EDC和NHS活化，再加入硼酸盐缓冲溶液，保持pH为7-10，反应，接着再加入MMP2，继续反应，得到Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2；
(4)取光敏剂和Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2的溶液混合，避光震荡处理，透析纯化后，得到磁性纳米探针，即为目的产物。
本发明的技术方案之三在于提供了一种上述基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针在制备用于肿瘤成像和治疗的药物中的应用。
进一步的，上述用于肿瘤成像和治疗的药物为适用于胃癌细胞，肝癌细胞和肺癌细胞的成像和治疗的药物。
进一步的，所述用于肿瘤成像和治疗的药物在使用时，在近红外光下进行治疗，近红外光的输出功率范围是30～50mW/cm2，近红外光的激发波长范围是600～900nm，照射时间为15-30min。
本发明中主要通过以下机理来制备纳米探针。柠檬酸铁与硫酸亚铁分别含有Fe3+和Fe2+，在碱性环境下发生共沉淀反应生成羧基化的Fe3O4。PEG含有氨基的一端可与Fe3O4上的羧基发生化学反应进行偶联，PEG含有羧基的一端则可以和含有氨基的PAMAM进行偶联，最后含有羧基的MMP2可以与含有氨基的PAMAM进行偶联。
本发明以磁性Fe3O4纳米颗粒为载体，通过化学键的方式将PEG、树枝状分子PAMAM和基质金属蛋白酶MMP2连接起来，最后将光敏剂吸附到上面，所制备的纳米探针利用基质金属蛋白酶(MMP2)对肿瘤细胞的靶向作用以及光敏剂的作用，结合了光学分子影像和MR分子影像，实现了对癌症进行双模态界定以及高效地靶向治疗，主要适用于癌症的荧光成像、MR成像和近红外光治疗。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)所述的纳米探针的制备条件温和，操作简单。
(2)制备的纳米探针具有良好的生物相容性。
(3)制备的纳米探针偶联了靶向多肽，对肿瘤细胞的靶向效果好。
(4)制备的纳米探针结合了的磁性Fe3O4纳米颗粒以及光敏剂，可以对肿瘤部位实现MR成像和荧光成像。
附图说明
图1为纳米探针的制备流程图；
图2为纳米探针的TEM表征图；
图3是纳米探针用于治疗胃癌细胞MGC-803的MTT结果图；
图4是纳米探针用于活体动物体内的荧光成像图；
图5是纳米探针用于活体动物体内的MR成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
其余如无特别说明的原料或处理技术，则表明均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。
实施例1
磁性Fe3O4纳米颗粒的制备方法如下：
用去离子水配制0.1M的柠檬酸铁(Ferric citrate)和硫酸亚铁(FeSO4)溶液，按照摩尔比1∶2的比例混合，室温下磁力搅拌均匀，然后调节pH值为10。接着将得到的混合溶液转移至水热反应釜中，以200℃的温度保温10小时。冷却至室温后，将产物在透析袋中透析3天，最后真空冷冻干燥，收集得到四氧化三铁纳米颗粒。柠檬酸铁和硫酸亚铁从国药集团化学试剂有限公司进行购买。
实施例2
合成Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2：
将0.5mL的实施例1所制得的四氧化三铁纳米颗粒(2.3mg/mL)与0.5mL的PEG(100mg/mL)混合，然后加入1mL的EDC和NHS混合液(6mg/mL)活化2小时，同时加入硼酸盐缓冲溶液1.5mL，保证其pH值维持在9。室温反应12小时后，以2000rpm/min的速度纯化收集产品得到Fe3O4-PEG。
接着，在0.5mL的Fe3O4-PEG溶液中加入2mL的EDC和NHS混合液(12mg/mL)活化2小时，然后加入2.5mL PAMAM溶液和7.5ml的硼酸盐缓冲液，室温反应2小时。之后，将1mL的MMP2(3.5mg/mL)溶液加入到先前的混合液中，室温反应12小时，然后以2000rpm/min的速度纯化10分钟得到产品Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2。其中，PEG从上海亚尔生物技术有限公司购买，PAMAM从西格玛奥德里奇化学有限公司购买，MMP2从上海强耀生物科技有限公司购买。
本实施例中PAMAM、Fe3O4-PEG和MMP2三者的质量比可分别控制为0.7:1:4，或1.5:1:6，或1:1:5，四氧化三铁纳米颗粒与PEG的质量比可分别控制为2:100，或3:100。
实施例3
将光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)修饰到Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2上面：
将1.5mL的Ce6(2.5mg/mL)溶液与1mL的Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2溶液混合。然后将混合液放置在摇床上，以100rpm速度避光震荡1天，最后，用超纯水透析纯化3天得到Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2@Ce6纳米探针。其中Ce6从阿拉丁化学试剂有限公司购买。
本实施例中，光敏剂与Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2的质量比可分别控制为65:1，或70:1，或68:1。
经由实施例1-实施例3即可制得最后的Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2@Ce6纳米探针，其流程如图1所示。
图2是制备的Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2@Ce6纳米探针TEM表征图。从图中可以看出，制备的纳米探针形貌、大小均匀，尺寸在8-10nm范围，有利于其进一步的应用。
在纳米探针的制备过程中，本发明对pH值进行了范围限定。主要是在制备Fe3O4纳米颗粒时，利用了Fe3+和Fe2+的共沉淀反应，该反应需在碱性条件下才能进行，故通过NaOH溶液来调节溶液的pH。反应方程式如下：
2Fe3++Fe2++8OH—＝Fe3O4+4H2O
从上反应述方程式可以看出，反应的正常进行需要提供一个碱性环境，故溶液的pH值应该大于7。而当溶液pH值大于10时，不仅会影响Fe3O4纳米颗粒的晶形，还会使其饱和磁化强度减弱，即磁性能变弱，影响Fe3O4纳米颗粒的后续使用。除此之外，pH值过高，不但会形成三氧化二铁，使产物纯度下降，还浪费原料，使成本增加。因此在制备Fe3O4纳米颗粒时pH值的范围在7-10最佳。
实施例4
评价Ce6和Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2@Ce6纳米探针在激光照射下对胃癌细胞MGC-803的治疗效果。
为检测Ce6以及合成的Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2@Ce6纳米探针对胃癌细胞的治疗效果。将MGC-803细胞(5000个/孔)种植于96孔板中，孵育24小时。然后去除培养液，用PBS清洗三次后，加入含有Ce6和Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2@Ce6培养液。一组避光继续培养12小时，另一组用630nm的功率为30mW/cm2的激光照射10分钟后继续培养12小时后，使用MTT法检测细胞活性。
图3结果显示：在不同的Ce6浓度下，Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2@Ce6纳米探针加激光组的光动力治疗效果最好。
实施例5
评价纳米探针用于肿瘤的荧光成像和MR成像。
在雌性BALB/c裸鼠(5周龄)的皮下注射一定数量的MGC-803细胞来构建胃癌模型，肿瘤长至约150～200mm3即可用于成像。将荷瘤小鼠随机分成两组，每组有3只小鼠。然后分别将Fe3O4-PEG-PAMAM@Ce6和Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2@Ce6(5mg/kg)注射到小鼠体内。使用小动物荧光成像系统Bruker In-Vivo F PRO imaging system仪器采集注射后6小时，12小时和24小时的图像。从图4可以看出，Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2@Ce6纳米探针在注射后6小时，12小时和24小时后，在肿瘤部位有很强的荧光信号，表明Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2@Ce6纳米探针大量聚集在肿瘤部位附近。而Fe3O4-PEG-PAMAM@Ce6处理组的肿瘤部位能观察到很强的荧光信号。以上结果表明Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2@Ce6纳米探针具有很强的肿瘤靶向能力。
图5显示了注射Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2@Ce6纳米探针前和注射2小时后的MR图像。可以看出，肿瘤部位表现出一定的变暗效果，这是由于纳米探针在肿瘤部位的聚集。进一步证明了Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2@Ce6纳米探针的肿瘤靶向作用和MR成像能力。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针，其特征在于，其由以下方法制备得到：
(1)取柠檬酸铁和硫酸亚铁配成溶液，调节pH至7-10，水热反应，分离干燥，得到四氧化三铁纳米颗粒；
(2)将四氧化三铁纳米颗粒与PEG混合，加入EDC和NHS活化，再加入硼酸盐缓冲溶液，保持pH为7-10，室温反应，得到Fe3O4-PEG；
(3)取PAMAM与Fe3O4-PEG混合均匀，加入EDC和NHS活化，再加入硼酸盐缓冲溶液，保持pH为7-10，反应，接着再加入MMP2，继续反应，得到Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2；
(4)取光敏剂和Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2的溶液混合，避光震荡处理，透析纯化后，得到磁性纳米探针，即为目的产物。
2.根据权利要求1所述的一种基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针，其特征在于，柠檬酸铁和硫酸亚铁的摩尔比为1:2。
3.根据权利要求1所述的一种基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针，其特征在于，步骤(1)中，水热反应的条件为：在180-200℃下反应8-10h。
4.根据权利要求1所述的一种基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针，其特征在于，步骤(2)中，四氧化三铁纳米颗粒与PEG的质量比为2-3:100。
5.根据权利要求1所述的一种基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针，其特征在于，步骤(2)中，室温反应的时间为10-12h。
6.根据权利要求1所述的一种基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针，其特征在于，步骤(3)中，PAMAM、Fe3O4-PEG和MMP2的质量比为0.7-1.5:1:4-6。
7.根据权利要求1所述的一种基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针，其特征在于，步骤(3)中，加入硼酸盐缓冲溶液后反应的时间为2-4h；
加入MMP2后继续反应的条件为：在室温下反应10-12h。
8.根据权利要求1所述的一种基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针，其特征在于，步骤(4)中，光敏剂与Fe3O4-PEG-PAMAM-MMP2的质量比为65-70:1；
所述的光敏剂为Ce6。
9.根据权利要求1所述的一种基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针，其特征在于，步骤(4)中，避光震荡的转速为60-100rpm，时间为1-2天。
10.如权利要求1-9任一所述的基于四氧化三铁制备的多肽靶向的磁性纳米探针在制备用于肿瘤成像和治疗的药物中的应用。
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