CN114432458A - 一种细菌载药系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细菌载药系统及其制备方法，该载药系统是在细菌中装载光敏剂并连接抗体而获得的。具体是，首先将光敏剂通过与细菌物理混合或共价连接的方式载入细菌中，然后通过共价连接的方式，将抗体与细菌进行连接。获得的细菌载药系统，在激光或者超声波的刺激下产生活性氧，在激光和超声波的共同刺激下会产生更多的活性氧；获得的细菌载药系统，静脉注射后可靶向输送到肿瘤和炎症组织，在激光或超声波的刺激下或“激光+超声波”的联合刺激下，通过产生的大量活性氧，抑制肿瘤生长；综上所述，本发明提供了能够将药物递送到肿瘤和炎症组织的细菌载药系统及其制备方法。

Description

一种细菌载药系统及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体是一种细菌载药系统及其制备方法。
背景技术
光动力治疗和声动力治疗是肿瘤治疗的重要方法，如何将光敏剂或声敏剂递送至肿瘤组织或炎症部位，是提高治疗效率的关键。由于肿瘤和炎症组织都存在乏氧区域，游离药物和无生命的纳米粒子都难以进入乏氧区域，导致治疗效果不佳。以活的某些细菌和细胞作为载体，则可克服上述缺陷。专性厌氧细菌、微好氧细菌和兼性厌氧细菌，容易在肿瘤及炎症部位的乏氧区域成活和繁殖，繁殖能力要高出在正常组织中繁殖能力的1000倍，成为药物靶向递送较理想的载体。细菌作为载体，理论上可将药物输送到任何一类实体瘤，除了作为载体，其自身也可通过分泌毒素和酶来抑制肿瘤生长和发挥抗炎作用。
研究表明，静脉注射细菌之后，细菌会逐渐在肿瘤组织积累。例如，广泛存在于人和动物的消化道等生物环境中的双歧杆菌是一种严格厌氧的革兰氏阳性细菌，将5×106–6×106个长双歧杆菌通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内后，168h内双歧杆菌在肿瘤组织逐渐积累，而在肺、肝、脾、肾等其它器官中则很快清除[Hu B,et al.,Bifidobacterium longumas a delivery system of TRAIL and endostatin cooperates with chemotherapeuticdrugs to inhibit hypoxic tumor growth.Cancer Gene Therapy.2009,16:655-663.]，目前已用于化疗药物[Sasaki T,Fujimori M,Hamaji Y,Hama Y,Ito K,Amano J,Taniguchi S.Genetically engineered Bifidobacterium longum for tumor-targetingenzyme-prodrug therapy of autochthonous mammary tumors in rats.CancerSci.2006,97:649-657]、基因[Hu B,et al.,Bifidobacterium longum as a deliverysystem of TRAIL and endostatin cooperates with chemotherapeutic drugs toinhibit hypoxic tumor growth.Cancer Gene Therapy.2009,16:655-663.]的载体用于肿瘤靶向治疗。再如，将趋磁细菌AMB-1通过荷瘤小鼠尾静脉注入小鼠体内，该趋磁细菌能长时间定殖于肿瘤组织，随着时间延长，趋磁细菌在肿瘤组织逐渐积累，但在其它主要器官例如肝脏和脾脏则逐渐消退[Benoit,M.R.；et al.,Visualizing implanted tumors inmice with magnetic resonance imaging using magnetotactic bacteria.Clin CancerRes 2009,15(16):5170-5177.]表现出良好的肿瘤靶向性。对于趋磁细菌，还可通过外加磁场的引导，对肿瘤组织进行磁靶向输送。
细菌必须在成活的条件下才能进入肿瘤和炎症组织及其乏氧区域，因此，所装载的药物必须对细菌毒性低。
发明内容
本发明提供了能够将药物递送到肿瘤和炎症组织的细菌载药系统及细菌载药系统的制备方法。
为达此目的，本发明提供如下的技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种细菌载药系统，所述细菌中装载光敏剂，所述细菌的细胞壁上连接抗体。
优选的，所述细菌包括沙门氏菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、梭状芽孢杆菌、柄杆菌、志贺菌、李斯特菌、丁酸梭菌、大肠杆菌、假单胞菌、变形菌、链球菌、双歧杆菌、趋磁细菌。进一步优选的，所述的双歧杆菌包括两岐双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、牛双歧杆菌、乳双歧杆菌、星状双歧杆菌、梭形双歧杆菌、链状双歧杆菌、假链状双歧杆菌、齿状双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、嗜酸热双歧杆菌中的一种。更进一步优选的，所述细菌为两岐双歧杆菌(B.bifidum)。
优选的，所述光敏剂是指：水溶性光敏剂分子、由水溶性光敏剂形成的纳米粒子、由脂溶性光敏剂形成的纳米粒子中的一种；进一步优选的，所述光敏剂为二氢卟吩e6(Ce6)。
优选的，所述抗体是指：单克隆抗体和多克隆抗体，尤其是指针对恶性肿瘤细胞表面抗原的抗体；进一步优选的，所述抗体为抗死亡受体的抗体，进一步是指多克隆抗体Anti-DR5Ab。
本发明的第二个方面，提供了本发明的细菌载药系统在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述细菌载药系统是在激光和/或超声波作用下进行应用。
优选的，所述激光的波长为655nm-808nm，所述超声波的频率为0.5-1MHz。
优选的，所述应用为：细菌载药系统通过激光照射；进一步优选的，所述激光的波长为655nm-808nm。
优选的，所述应用为：细菌载药系统通过超声波处理；进一步优选的，所述超声波的频率为0.5-1MHz。
优选的，所述应用为：细菌载药系统先通过激光照射后再通过超声波处理；进一步优选的，所述激光的波长为655nm-808nm，所述超声波的频率为0.5-1MHz，激光照射时间为1-20min，超声波处理时间为1-10min。
优选的，所述应用为：细菌载药系统先通过超声波处理后再通过激光照射；进一步优选的，所述激光的波长为655nm-808nm，所述超声波的频率为0.5-1MHz，激光照射时间为1-20min，超声波处理时间为1-10min。
细菌载药系统在激光和/或超声波处理后可以产生明显多量的活性氧，而活性氧对于肿瘤或者炎症的抑制具有重要意义。本发明还进一步提供了细菌载药系统产生活性氧的方法，包括以下步骤：
通过激光照射本发明所述的细菌载药系统，使光敏剂和细菌产生活性氧；
或，通过超声波处理本发明所述的细菌载药系统，使光敏剂和细菌产生活性氧；
或，通过激光和超声波共同处理本发明所述的细菌载药系统，使光敏剂和细菌产生更多的活性氧。
优选的，所述的激光，其波长范围在红光和近红外光区，尤其是波长为655nm-808nm之间。
优选的，所述的超声波，是一种低频超声波，频率范围为0.5-1MHz。
优选的，所述的通过激光和超声波共同处理，是指先通过激光照射，紧接着进行超声波处理；或者使先进行超声波处理，紧接着进行激光照射。激光照射时间为1-20min，超声波处理时间为1-10min。
优选的，所述细菌载药系统的细菌中装载光敏剂，所述细菌的细胞壁连接抗体。
优选的，所述细菌包括沙门氏菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、梭状芽孢杆菌、柄杆菌、志贺菌、李斯特菌、丁酸梭菌、大肠杆菌、假单胞菌、变形菌、链球菌、双歧杆菌、趋磁细菌。进一步优选的，所述的双歧杆菌包括两岐双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、牛双歧杆菌、乳双歧杆菌、星状双歧杆菌、梭形双歧杆菌、链状双歧杆菌、假链状双歧杆菌、齿状双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、嗜酸热双歧杆菌中的一种。更进一步优选的，所述细菌为两岐双歧杆菌(B.bifidum)。
优选的，所述光敏剂是指：水溶性光敏剂分子、由水溶性光敏剂形成的纳米粒子、由脂溶性光敏剂形成的纳米粒子中的一种；进一步优选的，所述光敏剂为二氢卟吩e6(Ce6)。
优选的，所述抗体是指：单克隆抗体和多克隆抗体，尤其是指针对恶性肿瘤细胞表面抗原的抗体；进一步优选的，所述抗体为抗死亡受体的抗体，进一步是指多克隆抗体Anti-DR5Ab。
本发明的第三个方面，提供了一种用于治疗肿瘤或炎症的药物，所述药物包含有效量的本发明所述的细菌载药系统。
优选的，所述药物的给药方式包括静脉注射。
优选的，所述肿瘤包括但不限于喉癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌等等。
优选的，所述细菌载药系统的细菌中装载光敏剂，所述细菌的细胞壁连接抗体。
优选的，所述细菌包括沙门氏菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、梭状芽孢杆菌、柄杆菌、志贺菌、李斯特菌、丁酸梭菌、大肠杆菌、假单胞菌、变形菌、链球菌、双歧杆菌、趋磁细菌。进一步优选的，所述的双歧杆菌包括两岐双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、牛双歧杆菌、乳双歧杆菌、星状双歧杆菌、梭形双歧杆菌、链状双歧杆菌、假链状双歧杆菌、齿状双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、嗜酸热双歧杆菌中的一种。更进一步优选的，所述细菌为两岐双歧杆菌(B.bifidum)。
优选的，所述光敏剂是指：水溶性光敏剂分子、由水溶性光敏剂形成的纳米粒子、由脂溶性光敏剂形成的纳米粒子中的一种；进一步优选的，所述光敏剂为二氢卟吩e6(Ce6)。
优选的，所述抗体是指：单克隆抗体和多克隆抗体，尤其是指针对恶性肿瘤细胞表面抗原的抗体；进一步优选的，所述抗体为抗死亡受体的抗体，进一步是指多克隆抗体Anti-DR5Ab。
本发明的第四个方面，提供了一种制备本发明所述的细菌载药系统的方法，包括以下步骤：
S1、在避光以及适宜细菌生长的温度条件下，将细菌和光敏剂混合，使光敏剂进入到细菌中，获得装载光敏剂的细菌；
S2、在避光以及适宜细菌生长的温度条件下，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/E1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的混合液加入到装载光敏剂的细菌中，然后加入抗体，轻轻混合；
S3、混合结束后，离心，洗涤细菌，获得细菌载药系统。
优选的，步骤S1具体包括：将光敏剂分子或光敏剂纳米粒子与细菌在避光以及适宜细菌生长的温度条件下混合；混合结束后，离心，洗涤细菌，获得装载光敏剂的细菌。
优选的，步骤S1具体包括：在避光以及适宜细菌生长的温度条件下，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺混合液加入到细菌中，然后加入含氨基或羧基的光敏剂，轻轻混合，很合结束后，离心，洗涤细菌，获得装载光敏剂的细菌。
优选的，步骤S2中，细菌与抗体的比例为：每数量为1×109个的细菌对应不少于0.02nmol抗体；进一步优选的，细菌与抗体的比例为：每数量为1×109个的细菌对应不少于0.02-1nmol抗体。
优选的，细菌与光敏剂的比例为：每数量为1×109的细菌对应不少于0.5mg的光敏剂；进一步优选的，每数量为1×109的细菌对应不少于0.5-2mg的光敏剂。
优选的，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔量是细菌的1×103-5×104倍。
优选的，E1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2:1-1:1。
优选的，本发明所述混合反应的时间均不少于1h，进一步优选的，混合反应的时间为1-4h。
本发明经过大量的实验筛选发现，光敏剂是较好的药物选择，光敏剂只有在光照下才能产生对细胞或细菌有毒性的活性氧，在避光条件下，由于不存在电子跃迁而基本不产生活性氧，对细胞或细菌毒性低。因此，将光敏剂装载于细菌中，只要避光，药物量适中，理论上细菌均保持较好的活性。细菌进入肿瘤组织后，如何提高细菌在肿瘤组织积累，是提高治疗效率的重要步骤。如果在细菌表面连接可识别肿瘤细胞表面抗原的抗体，则可使细菌长时间滞留在肿瘤组织中。将光敏剂装载于细菌中，同时连接抗体，采用激光和/或超声波使细菌及其所载的光敏剂产生活性氧，从而抑制肿瘤的增长。
与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：本发明首先将光敏剂通过与细菌物理混合或共价连接的方式载入细菌中，然后通过共价连接的方式，将抗体与细菌进行连接，获得细菌载药系统。该细菌载药系统可以用于治疗肿瘤、炎症等疾病。本发明还提供了制备细菌载药系统的方法。
附图说明
为更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的实施例所需使用的附图作一简单介绍。
显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明中的部分实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，但这些其他的附图同样属于本发明实施例所需使用的附图之内。
图1为本发明实施例1的Ce6和Ce6纳米粒子(Ce6 NPs)水溶液的白光和在365nm激发光照射下的荧光；
图2为本发明实施例1的不同浓度Ce6纳米粒子与1×109个B.bifidum混合不同时间后B.bifidum对Ce6的负载量；
图3为本发明实施例1的B.bifidum、Ce6—B.bifidum和Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab的生长曲线；
图4为本发明实施例3的注射样品的荷瘤小鼠在注射第6h和12h时的肿瘤及主要器官的荧光照片；
图5为本发明实施例4的肿瘤大小；
图6为本发明实施例5的Ce6—AMB-1在激光共聚焦荧光显微镜下的荧光照片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合本发明实施例中所提供的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明中的术语“单克隆抗体”是指由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
本发明中的术语“多克隆抗体”是指由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一种抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
本发明中的术语“细菌”包括广义的细菌，即为原核生物。是指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区(nuclear region)的裸露DNA的原始单细胞生物，包括真细菌(eubacteria)和古生菌(archaea)两大类群。人们通常所说的即为狭义的细菌，狭义的细菌为原核微生物的一类，是一类形状细短，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖的原核生物，是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。
本发明中的术语“肿瘤”是指无论在细胞形态和组织结构上，都与其发源的正常组织有不同程度的差异，这种差异称为异型性。异型性是肿瘤异常分化在形态上的表现。异型性小，说明分化程度高，异型性大，说明分化程度低。区别这种异型性的大小是诊断肿瘤，确定其良、恶性的主要组织学依据。良性肿瘤细胞的异型性不明显，一般与其来源组织相似。恶性肿瘤常具有明显的异型性。
本发明中的术语“炎症”是指具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。血管反应是炎症过程的中心环节。炎症，就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症，可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动的防御反应，但是有的时候，炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。
还需要说明的是，以下的具体实施例可以相互结合，对于其中相同或相似的概念或过程可能在某些实施例中不再赘述。
下面，以具体的实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1制备Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab细菌载药系统
(1)制备Ce6纳米粒子
将光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)溶于二甲基亚砜(DMSO)溶液中，得到浓度为3mM的Ce6溶液。取该溶液0.2mL，滴加到10mL去离子水中，超声波分散30min，然后透析除去DMSO，即得Ce6纳米粒子。
如图1所示，由于Ce6纳米粒子在水溶液中因得到很好的溶解(分散)，在365nm发射光激发下发射明亮的红色荧光，而Ce6的荧光很弱，是因为Ce6溶解性差，Ce6分子聚集严重而使荧光淬灭。可见，通过上述方法使Ce6纳米化之后，其在水相中的分散能力显著增强了。
(2)在两岐双歧杆菌(B.bifidum)中装载Ce6纳米粒子
按照下表1的Ce6纳米粒子浓度和混合时间进行试验。
表1
组别序号 Ce6浓度 Ce6体积 B.bifidum数量 混合时间
1 0.5mg/mL 1mL 1×10<sup>9</sup>个 1h
2 0.5mg/mL 1mL 1×10<sup>9</sup>个 2h
3 0.5mg/mL 1mL 1×10<sup>9</sup>个 4h
4 1mg/mL 1mL 1×10<sup>9</sup>个 1h
5 1mg/mL 1mL 1×10<sup>9</sup>个 2h
6 1mg/mL 1mL 1×10<sup>9</sup>个 4h
7 2mg/mL 1mL 1×10<sup>9</sup>个 1h
8 2mg/mL 1mL 1×10<sup>9</sup>个 2h
9 2mg/mL 1mL 1×10<sup>9</sup>个 4h
按Ce6纳米粒子分散于无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)中，制备浓度为0.5mg/mL、1mg/mL和2mg/mL的Ce6纳米粒子混悬液，取该混悬液1mL(即Ce6纳米粒子为0.5mg、1mg和2mg)，加入到含1×109个B.bifidum沉淀中，在避光、无氧和室温条件下按照表1中的混合时间进行混合，然后离心，收集沉淀，沉淀即为装载了Ce6的B.bifidum(简写为Ce6—B.bifidum)。每组实验重复3次。
上述9组方法得到的Ce6—B.bifidum，细菌B.bifidum对Ce6纳米粒子均能很好的负载，装载Ce6的B.bifidum呈现明亮的红色荧光，根据Ce6吸收光谱的标准曲线，可计算上述9组Ce6—B.bifidum中Ce6的量，结果如图2所示，具体的，当Ce6纳米粒子的量为0.5mg(即0.5mg/mL，1mL)与1×109个B.bifidum混合1h、2h、4h时，B.bifidum对Ce6的负载量基本维持在约为485μg(Ce6)/1×109个B.bifidum的水平。也就是，这些细菌能在1h左右的时间内可将0.5mg的Ce6吸附接近完全；当Ce6纳米粒子的量为1mg(即1mg/mL，1mL)与1×109个B.bifidum混合1h、2h、4h时，B.bifidum对Ce6的负载量分别为661.17±6.43、935.58±3.82、968.88±1.45(单位均为：μg(Ce6)/1×109个B.bifidum)；当Ce6纳米粒子的量为2mg(即2mg/mL，1mL)与1×109个B.bifidum混合1h、2h、4h时，B.bifidum对Ce6的负载量分别为885.49±4.34、1018.63±20.25、1100.66±7.57(单位均为：μg(Ce6)/1×109个B.bifidum)。
(3)在Ce6—B.bifidum表面连接抗体
任选第五组(1mg的Ce6纳米粒子与1×109个B.bifidum混合2h)获得的Ce6—B.bifidum，在其表面连接抗死亡受体5的多克隆抗体(Anti-DR5 Ab)。按照下表2的Anti-DR5 Ab浓度和混合时间进行试验。
表2
分组 Anti-DR5Ab浓度 混合时间
第A组 0.1mg/mL 1h
第B组 0.1mg/mL 2h
第C组 0.1mg/mL 3h
第D组 0.2mg/mL 1h
第E组 0.2mg/mL 2h
第F组 0.2mg/mL 3h
第G组 0.4mg/mL 1h
第H组 0.4mg/mL 2h
第I组 0.4mg/mL 3h
例如，向Ce6-B.bifidum(B.bifidum：1×109/mL，1mL)中加入PBS分散的表2浓度的Anti-DR5 Ab(2μL)、EDC(1mol/L,20μL)和NHS(0.7mol/L,20μL)，在避光、无氧和室温条件下按照表2的反应时间反应，然后离心，沉淀即为装载Ce6并连接抗体Anti-DR5Ab的B.bifidum(简写为Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab)。该实验重复3次。
上述9种方法得到的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab，均有明亮的红色荧光，当Anti-DR5Ab的量为“0.1mmol/L，2μL”，与含1×109各细菌的Ce6-B.bifidum反应1、2、4h后，Ce6-B.bifidum对Anti-DR5 Ab的负载量分别为4.03±1.02、5.07±0.95、6.19±1.17(单位均为：μg(Anti-DR5 Ab)/1×109个B.bifidum)；当Anti-DR5 Ab的量为“0.2mmol/L，2μL”，与含1×109各细菌的Ce6-B.bifidum反应1、2、4h后，Ce6-B.bifidum对Anti-DR5 Ab的负载量分别为5.07±1.63、6.43±2.03、7.03±1.46(单位均为：μg(Anti-DR5 Ab)/1×109个B.bifidum)；当Anti-DR5 Ab的量为“0.4mmol/L，2μL”，与含1×109各细菌的Ce6-B.bifidum反应1、2、4h后，Ce6-B.bifidum对Anti-DR5 Ab的负载量分别为5.87±1.36、6.98±1.38、8.09±1.60(单位均为：μg(Anti-DR5 Ab)/1×109个B.bifidum)；
这些负载了Ce6和Anti-DR5 Ab的B.bifidum，仍表现出较好的活性，如图3所示。
实施例2产活性氧实验
(1)B.bifidum在激光和超声波作用下产生活性氧
在96孔板中，无菌PBS(200μL)分散的B.bifidum(～1×108个/mL)经671nm激光(50mW/cm2)照射2、5、10min；另取同样量的B.bifidum，用超声波(1W/cm2，1.0MHz)处理1、2、3min。然后用活性氧检测探针2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)检测总活性氧。每个实验重复5次。
结果表明，671nm激光照射2-10min，B.bifidum产生大约1-4倍于对照组(PBS，无激光照射)的活性氧，在超声波处理1-3min，B.bifidum产生大约5-8倍于对照组的活性氧，处理时间越长，产生的活性氧越多。
(2)Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab在激光和超声波作用下产生活性氧
在96孔板中，无菌PBS(200μL)分散的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab(～1×108个/mL)经671nm激光(50mW/cm2)照射5min；另3组实验分别是：Ce6—B.bifidum—Anti-DR5Ab样品经超声波(1W/cm2，1.0MHz)处理2min；样品先超声波处理2min，紧接着以671nm激光照射5min；样品先经671nm激光照射5min，紧接着超声波处理2min。然后用DCFH-DA检测总活性氧。每个实验重复5次。
结果表明，经671nm激光照射5min后，产生108.47±12.85倍于对照组的活性氧；经超声波处理2min后，产生10.98±2.53倍于对照组的活性氧；在先超声波处理2min，紧接着以671nm激光照射5min，则产生155.57±20.79倍于对照组的活性氧；在以671nm激光照射5min，紧接着超声波处理2min，则产生137.71±19.27倍于对照组的活性氧。综上，本实施例的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab细菌载药系统可以产生更多的活性氧。
实施例3考察Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab对小鼠肿瘤的靶向性。
实验按同济大学动物管理委员会相应管理规定执行，符合实验动物伦理标准(批准伦理号为：TJAB05820102)。将喉癌细胞Tu212细胞注射到裸鼠皮下，当肿瘤尺寸达～9mm时，进行如下实验。
向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL由PBS分散的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab(B.bifidum：1×108，Ce6：～94μg)；
向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL由PBS分散的Ce6—B.bifidum(B.bifidum：1×108，Ce6：～94μg)；
向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL由PBS分散的Ce6纳米颗粒(Ce6：～94μg)
在注射后第6h和12h，处死小鼠，每组每个时间点处死3只小鼠，取出肿瘤和主要器官，进行荧光成像分析。结果表明，B.bifidum能显著延长Ce6在体内的循环时间，能显著提高Ce6在肿瘤组织的分布浓度，在B.bifidum表面连接抗体Anti-DR5 Ab之后，进一步提高了Ce6在肿瘤组织中的浓度，这些结果如附图4所示(荧光图的激发光滤光片波长：640nm、荧光滤光片波长：680nm))。
实施例4考察Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab在激光和超声波作用下对小鼠肿瘤的生长抑制能力
将喉癌细胞Tu212细胞注射到裸鼠皮下，当肿瘤尺寸达～6mm时，进行如下实验。
4.1、向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL由磷酸盐缓冲液(PBS)分散的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab(B.bifidum：1×108，Ce6：～94μg)，每隔1天注射1次，共注射3次；
4.2、向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL由PBS分散的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab(B.bifidum：1×108，Ce6：～94μg)，每隔1天注射1次，共注射3次，在每次注射后的第6h和第24h，对肿瘤进行超声波(1W/cm2，1.0MHz，50％占空比)处理，每个时间点各处理10min。超声处理时，超声探头涂覆超声耦合剂。
4.3、向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL由PBS分散的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab(B.bifidum：1×108，Ce6：～94μg)，每隔1天注射1次，共注射3次，在每次注射后的第6h和第24h，对肿瘤进行671nm激光照射(激光功率密度：50mW/cm2)，每个时间点各照射20min；
4.4、向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL由PBS分散的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab(B.bifidum：1×108，Ce6：～94μg)，每隔1天注射1次，共注射3次，在每次注射后的第6h和第24h，对肿瘤进行超声波和激光双重处理，操作方法是：先对肿瘤进行超声波处理10min，接着用671nm激光照射20min，超声波和激光功率等条件与上述相同；
4.5、向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL的PBS，每隔1天注射1次，共注射3次，在每次注射后的第6h和第24h，对肿瘤进行超声波和激光双重处理，操作方法同上；
4.6、向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL的磷酸盐缓冲液(PBS)，每隔1天注射1次，共注射3次。
结果表明，在向小鼠尾静脉注射Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab后，在激光或超声波作用下，均能显著抑制小鼠肿瘤生长，当先对肿瘤进行超声波处理，然后进行激光照射，则可进一步抑制肿瘤生长，甚至使小鼠肿瘤消失。第21天时，各组小鼠及其肿瘤大小如附图5所示。I-VI分别表示：(I)尾静脉注射Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab；(II)尾静脉注射Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab，超声波处理；(III)尾静脉注射Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab，激光照射；(IV)尾静脉注射Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab，先超声波处理，然后激光照射；(V)尾静脉注射Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab；(VI)尾静脉注射PBS。
实施例5Ce6—AMB-1细菌载药系统
将Ce6粉末溶解于DMSO溶液中，获得含40mg/mL Ce6的DMSO溶液，用EDC和NHS与Ce6于室温下反应2h，Ce6:EDC:NHS＝1:5:5(摩尔比)，取该溶液25μL，加入到10mL细菌培养基分散的趋磁细菌AMB-1中，AMB-1浓度为2.8×108个/mL，在室温下轻轻振荡2h，然后离心，用PBS洗涤AMB-1达3次，沉淀再分散于PBS中，即得负载Ce6的趋磁细菌Ce6—AMB-1。实验结果显示，Ce6—AMB-1有明亮的红色荧光(如图6所示)，表明Ce6成功负载到AMB-1中。在避光条件下，Ce6—AMB-1表现出良好活性，其生长速度与未装载Ce6的AMB-1相当。通过Transwell细胞迁移实验发现，Ce6—AMB-1能迁移至低氧区域，在磁场引导下，可进一步促进Ce6—AMB-1聚集到低氧区域。
在上述说明书的描述过程中：
术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如……所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。
最后应说明的是：
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；
尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。

Claims (13)

1.一种细菌载药系统，其特征在于，所述细菌中装载光敏剂，所述细菌的细胞壁上连接抗体。
2.如权利要求1所述的细菌载药系统，其特征在于，所述细菌包括沙门氏菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、梭状芽孢杆菌、柄杆菌、志贺菌、李斯特菌、丁酸梭菌、大肠杆菌、假单胞菌、变形菌、链球菌、双歧杆菌、趋磁细菌。
3.如权利要求2所述的细菌载药系统，其特征在于，所述的双歧杆菌包括两岐双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、牛双歧杆菌、乳双歧杆菌、星状双歧杆菌、梭形双歧杆菌、链状双歧杆菌、假链状双歧杆菌、齿状双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、嗜酸热双歧杆菌中的一种。
4.权利要求1-3任意一项所述的细菌载药系统在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述细菌载药系统在激光和/或超声波刺激下进行应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述激光的波长为655nm-808nm，所述超声波的频率为0.5-1MHz。
6.一种用于治疗肿瘤或炎症的药物，其特征在于，所述药物包含有效量的权利要求1-3任意一项所述的细菌载药系统。
7.如权利要求6所述的治疗肿瘤或炎症的药物，其特征在于，所述药物的给药方式包括静脉注射。
8.制备权利要求1-3任意一项所述的细菌载药系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在避光以及适宜细菌生长的温度条件下，将细菌和光敏剂混合，使光敏剂进入到细菌中，获得装载光敏剂的细菌；
S2、在避光以及适宜细菌生长的温度条件下，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/E1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的混合液加入到装载光敏剂的细菌中，然后加入抗体，轻轻混合；
S3、混合结束后，离心，洗涤细菌，获得细菌载药系统。
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，步骤S1具体包括：将光敏剂分子或光敏剂纳米粒子与细菌在避光以及适宜细菌生长的温度条件下混合；混合结束后，离心，洗涤细菌，获得装载光敏剂的细菌。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S1具体包括：在避光以及适宜细菌生长的温度条件下，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺混合液加入到细菌中，然后加入含氨基或羧基的光敏剂，轻轻混合，很合结束后，离心，洗涤细菌，获得装载光敏剂的细菌。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S2中，细菌与抗体的比例为：每数量为1×109个的细菌对应不少于0.02nmol抗体。
12.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，细菌与光敏剂的比例为：每数量为1×109的细菌对应不少于0.5mg的光敏剂。
13.如权利要求8或10所述的方法，其特征在于，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔量是细菌的1×103-5×104倍。
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