CN104984358B - 一种单壁碳纳米管温敏胶及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单壁碳纳米管温敏胶以及其制备方法以及用途。本发明所述的单壁碳纳米管温敏胶是明胶与氧化单壁碳纳米管(SWNT)‑三甲氧基硅烷(APTS)的结合物与pNIPAM‑NH₂共聚反应合成的单壁碳纳米管温敏胶(SWNT‑GEL)。本发明所述的单壁碳纳米管温敏胶用于制备可注射的药物运载体系，以及用于制备光热传导介质。本发明还提供了一种用于癌症治疗的药物，包括所述的单壁碳纳米管温敏胶制备的药物载体，以及在所述药物载体上的癌症治疗药物。本发明展现了以SWNT为基础的温敏水凝胶作为一种可注射的药物运载系统及过高热治疗介质的良好运用前景，尤其是在胃癌治疗中的作用。

Description

一种单壁碳纳米管温敏胶及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种单壁碳纳米管温敏胶，以及该单壁碳纳米管温敏胶的制备方法以及用途。

背景技术

pNIPAM温敏聚合物目前已被广泛应用于生物医学领域，并且不具有细胞毒性。它的应用依赖于临界共溶温度(CST)，即在高于33℃的情况下pNIPAM会经历溶胶-凝胶转变，因此在正常体温条件下有助于水凝胶的形成(G.ER，L.JC，E.J，Pharm Biopharm 2004，58，409.)。已有文献报道，作为一类药物载体，pH敏感的pNIPAM微凝胶可以在体内运输化疗药物并有效地杀死肿瘤细胞(Y.Guan，Y.Zhang，Soft Matter 2011，7，6375.)。目前已有很多文献报道单独运用pNIPAM胶或者CNT治疗肿瘤，但目前仍无将pNIPAM及CNT互相整合共同作用治疗胃癌的相关体内外研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单壁碳纳米管温敏胶，它是一种以单壁碳纳米管为基础的可注射温敏水凝胶载药运输系统。

本发明所述的单壁碳纳米管温敏胶是明胶与氧化单壁碳纳米管(SWNT)-三甲氧基硅烷(APTS)的结合物与pNIPAM-NH₂共聚反应合成的单壁碳纳米管温敏胶(SWNT-GEL)。

根据本发明所述的单壁碳纳米管温敏胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)氧化单壁碳纳米管(SWNT)的制备：将98％的H₂SO₄及65％的HNO₃及以3：1的体积比混合成溶液；其次，将50mgSWNT加入上述溶液中，混合物在0℃条件下超声24小时；再次，利用超纯水(18.2MΩ)将氧化的SWNT洗涤5次，再将上述混合物在13000rpm的条件下离心3次，每次10分钟；最后便可在沉淀中收集氧化SWNT，通过冻干法得到黑色粉末，即为SWNT；

(2)SWNT-APTS的制备：100mg处理后的SWNT加入10g三甲氧基硅烷(3-Aminopropyl-trimethoxysilan，APTs)，100ml 95％的乙醇及1ml 99.7％的乙酸。将上述混合物超声10分钟，接着以12000rpm的转速离心3次，每次10分钟，之后将混合物用去离子水润洗3遍，最后通过冻干法从沉淀中得到的黑色粉末即是SWNT-APTS；

(3)明胶/SWNT-APTS的制备：将1g明胶溶解于100ml三氟乙醇中24小时后，将60mgSWNT-APTS黑色粉末加入上述100ml 1％的明胶溶液中，超声震荡30分钟，并持续搅拌24小时，随后以12,000rpm转速离心3次，每次20分钟，之后将混合物用去离子水润洗3遍，收集沉淀，即为明胶/SWNT-APTS；

(4)pNIPAM-NH₂复合物的合成：将550mg NIPAM、25mg半胱胺、100μlAPS及6mlMilli-Q超纯水混合后在氮气条件下加热至70℃3小时，随后将上述溶液在Milli-Q超纯水中透析2天，通过冻干法收集pNIPAM-NH₂聚合物；

(5)明胶/SWNT-APTS-NH₂的制备：将10mg明胶/SWNT-APTS复合物加入由10ml 0.1MpH值7.4的PBS，120mgEDC及70mgNHS的混合溶液中沉淀析出，再将154mg pNIPAM-NH₂加入上述溶液中产生交联；最后将其置于PBS溶液中透析4天(截留分子量：1000D)，通过冻干法得到最终产物。

本发明还提供了根据本发明所述的单壁碳纳米管温敏胶的用途。

本发明所述的单壁碳纳米管温敏胶可用于制备可注射的药物运载体系。

本发明所述的单壁碳纳米管温敏胶也可用于制备光热传导介质。

本发明进一步提供了一种用于癌症治疗的药物。

本发明所述的药物包括由本发明所述的单壁碳纳米管温敏胶制备的药物载体，以及在所述药物载体上的癌症治疗药物。

根据本发明所述的药物的进一步特征，所述的癌症可以是胃癌，所述的癌症治疗药物可以是阿霉素。

本发明所述的一种单壁碳纳米管温敏胶(SWNT-GEL)既可作为一种可注射的药物运载体系，也可作为一类光热传导介质。单独的SWNT-GEL并不对胃癌细胞株(BGC-823)产生毒性作用，但经过近红外光(NIR)照射后可通过过高热效应促进肿瘤细胞凋亡。本发明还提供了载有阿霉素的SWNT-GEL(DOX/SWNT-GEL)，它辅以NIR的照射，相比于游离的DOX对胃癌裸鼠移植瘤模型有更好的抑制肿瘤生长的效果，这是通过将过高热疗法及原位DOX控制释放相结合而达到的效果，并且在体内注射SWNT-GEL时并没有引起主要器官的毒性。因此，本发明所建立的载药体系提高了化疗药物的效率，克服了全身给药带来的不良反应，在胃癌治疗中展现出极大的潜能。

本发明所述的DOX/SWNT-GEL经实验证实在体内外受到NIR激发后产生光热转换效应而产生过高热；同时，可注射的水凝胶又能直接将DOX运送至肿瘤局部，以共同发挥原位抗肿瘤效应。本发明通过体外实验和体内实验分别证实了其促凋亡效应和肿瘤生长抑制效应，并且想比DOX具有更好的效果。本发明利用小动物PET/CT扫描进一步验证了DOX/SWNT-GEL的良好抑瘤效果，主要表现为减少的¹⁸F-FDG摄取及更低的肿瘤糖代谢。主要器官的病理切片证实SWNT-GEL并不引起体内毒性，具有良好的生物兼容性。总言之，本发明展现了以SWNT为基础的温敏水凝胶作为一种可注射的药物运载系统及过高热治疗介质的良好运用前景，尤其是在胃癌治疗中的作用。

附图说明

图1A至图1D是明胶/SWNT-APTS-NH2的基本特征描述。

图1A是明胶、SWNT-APTS、明胶/SWNT-APTS、NIPAM、pNIPAM-NH₂和明胶/SWNT-APTS-NH₂的傅立的叶变换红外光谱分析(FT-IR)比对。

图1B是明胶/SWNT-APTS-NH₂成胶实验。左图摄于室温下(25℃)，右图摄于在37℃水浴箱加热1分钟后。

图1C是明胶/SWNT-APTS-NH₂水凝胶透射电镜图。

图1D是DOX/SWNT-GEL在PBS中的释放曲线，共记录28天内的DOX累积释放，曲线计算为3个独立实验中的均数±标准差。

图2是DOX/SWNT-GEL的体外细胞摄取实验的结果。利用DOX/SWNT-GEL孵育BGC-823细胞，并在不同时间段(0.5h、2h和24h)采用荧光显微镜观察其细胞摄取情况。比例尺：100μm。

图3A至图3C是体外细胞毒性试验结果。图3A是DOX作用于BGC-823细胞的MTT试验。图3B是SWNT-GEL作用于BGC-823细胞的MTT试验。图3C是DOX/SWNT-GEL对于BGC-823细胞的促凋亡作用的流式细胞试验。数据表示为3个独立实验的均数±标准差。

图4A至图4B是经不同处理后的体内肿瘤生长曲线。图4A显示经NIR照射后的小鼠肿瘤生长率；图4B显示未经NIR照射后的小鼠肿瘤生长率。数据表示为：均数±标准差(*p＜0.05，**p≤0.01，对比DOX/SWNT-GEL/NIR或者DOX/SWNT-GEL组)。

图5A至图5B是肿瘤组织的HE染色及冰冻切片荧光显微镜观察结果。图5A显示4个组中肿瘤组织的HE染色，每一列代表一个组别，其中在第3、4列(SWNT-GEL及DOX/SWNT-GEL组)中的黑色短箭头代表SWNT的聚集，放大倍数：上行200×，中行400×，下行1000×；图5B显示荧光显微镜检测给药后第28天肿瘤组织中的DOX残留量。图中，红色：DOX荧光；蓝色：肿瘤细胞核；融合图像：DOX在肿瘤组织中的定位。比例尺：100μm。

图6是裸鼠移植瘤模型小动物PET/CT不同时间点成像图。裸鼠给药治疗前，治疗15天后及治疗28天后的小动物PET/CT扫描。白色的虚线圈代表每只裸鼠的皮下移植瘤位置。

图7是DOX/SWNT-GEL在体毒性试验结果图。4组中裸鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏的切片HE染色。比例尺：100μm。

具体实施方式

实施例一：本发明所述的单壁碳纳米管温敏胶(SWNT-GEL)的制备

首先合成了明胶/SWNT-APTS，并且通过与NIPAM-NH₂共聚反应合成SWNT-GEL，SWNT-GEL被同时用作载送抗肿瘤药物及过高热治疗的介质。

1.材料

所有的化学试剂购自于Aldrich Chemical公司(St.Louis，MO，美国)，使用前未经进一步纯化(除非特殊说明)。Ethyl(dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC)和N-Hydroxysuccinimide(NHS)购自于JenKem Technology USA Inc.(Allen，TX，美国)。透析膜(截留分子量＝7kDa MWCO)，异丙基丙烯酰胺(NIPAM)，盐酸半胱胺，3-Aminopropyl-trimethoxysilan(APTS)，Ammonium persulfate，N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine(TMED)以及明胶购自于ACROS(New Jersey，美国)。SWNTs购自于US Research nanomaterials。光动力治疗仪630(型号II，976nm波长)激光肿瘤治疗仪(中国，兴达公司)作为近红外(NIR)激光仪。

2.实验方法

(1)氧化单壁碳纳米管的制备

氧化的SWNT是根据之前的文献报道而制备的(J.Ren,S.Shen,D.Wang,Z.Xi,L.Guo,Z.Pang,Y.Qian,X.Sun,X.Jiang,Biomaterials 2012,33,3324.)。简言之，首先，将98％的H₂SO₄及65％的HNO₃及以3：1的体积比混合成溶液；其次，将50mgSWNT加入上述溶液中，混合物在0℃条件下超声24小时；再次，利用超纯水(18.2MΩ)将氧化的SWNT洗涤5次，再将上述混合物在13000rpm的条件下离心3次，每次10分钟；最后便可在沉淀中收集氧化SWNT，通过冻干法得到黑色粉末。

(2)SWNT-APTS的制备

100mg处理后的SWNT加入10g三甲氧基硅烷(3-Aminopropyl-trimethoxysilan，APTs)，100ml 95％的乙醇及1ml 99.7％的乙酸。将上述混合物超声10分钟，接着以12000rpm的转速离心3次，每次10分钟，之后将混合物用去离子水润洗3遍，最后通过冻干法从沉淀中得到的黑色粉末即是SWNT-APTS。通过在红外线分光光度计(Bruker IFS 66v/s，德国)进行傅立叶变换红外光谱(FTIR)测试(4000–400cm^-1)检验所制备的SWNT-APTS。

(3)明胶/SWNT-APTS的制备

将1g明胶溶解于100ml三氟乙醇中24小时后，将60mgSWNT-APTS黑色粉末加入上述100ml 1％的明胶溶液中，超声震荡30分钟，并持续搅拌24小时，随后以12,000rpm转速离心3次，每次20分钟，之后将混合物用去离子水润洗3遍，收集沉淀。在高真空中干燥24小时后收集明胶/SWNT-APTS。通过FTIR测试检验所制备的明胶/SWNT-APTS。

(4)pNIPAM-NH₂复合物的合成

将550mg NIPAM、25mg半胱胺、100μlAPS及6ml Milli-Q超纯水混合后在氮气条件下加热至70℃3小时，随后将上述溶液在Milli-Q超纯水中透析2天，通过冻干法收集pNIPAM-NH₂聚合物。通过FTIR测试检验pNIPAM-NH₂聚合物的合成。

(5)明胶/SWNT-APTS-NH₂的制备

将10mg明胶/SWNT-APTS复合物加入由10ml 0.1M pH值7.4的PBS，120mgEDC及70mgNHS的混合溶液中沉淀析出，再将154mg pNIPAM-NH₂加入上述溶液中产生交联。最后将其置于PBS溶液中透析4天(截留分子量：1000D)，通过冻干法得到最终产物，CNT含量约在6％左右。通过FTIR测试检验明胶/SWNT-APTS-NH2的特征。

3.实验结果

采用FTIR测定明胶、SWNT-APTS、明胶/SWNT-APTS、NIPAM、pNIPAM-NH₂、明胶/SWNT-APTS-NH₂这几种物质的特征。从图1A中可以得知，明胶/SWNT-APTS光谱在1104cm^-1处的条带是SWNT-APTS中的Si-O-Si键产生的。明胶/SWNT-APTS-NH2光谱在1103cm^-1处的条带是明胶/SWNT-APTS中的Si-O-Si键产生的。因此，从图1A可知，由明胶/SWNT-APTS和pNIPAM-NH₂的共聚结合成功合成了明胶/SWNT-APTS-NH₂。

实施例二：本发明所述的单壁碳纳米管温敏胶(SWNT-GEL)的性能测定

(1)SWNT-GEL的透射电子显微镜(TEM)观察

将SWNT-GEL粉末置于冰上溶于去离子水中，混悬震荡，得到浓度为20mg/ml的SWNT-GEL混悬液，储存于4℃。将2μl SWNT-GEL溶液吸取至TEM专用的铜载网上制样并静置固定。通过Hitachi TEM系统(电压80kV条件下)获取并拍摄SWNT-GEL的总体形态及显微结构。图片放大倍数在10,000×至40,000×之间。

pNIPAM是众所周知的温度敏感性聚合物。当温度低于其最低临界溶液温度(LCST，33℃)时，在中间键及水分子之间的氮、氧原子形成氢键；但温度高于LCST时，氢键被阻断，聚合物的分子链则转变成一种缠绕的结构。在低温情况下，SWNT可以分散在pNIPAM溶液中，这是因为pNIPAM两亲性的聚合链可以覆盖于SWNT的表面。当温度高于33℃时，pNIPAM聚合物链构象的收缩使得疏水的SWNT表面暴露于水中，SWNT则会聚集成束。

将制备好的SWNT-GEL粉末溶解于去离子水中，得到浓度为20mg ml^-1(w/v)的溶液，图1B(左图)展示了溶液在室温(25℃)下的液态性状，而当温度达到37℃(即高于pNIPAM的LCST)时，水凝胶便形成了。进一步利用透射电子显微镜探索了SWNT-GEL的显微结构，如图1C所示，SWNT被包绕于水凝胶之间。此外，DOX/SWNT-GEL的药物释放曲线也通过28天的监测得出(图1D)，在恒温孵育第1天，超过20％的DOX从温敏胶载药系统中释放，在接下来的10天内，DOX在PBS中的累积释放接近50％。而剩余的DOX也在接下来的监测时间内缓慢释放，在记录第28天时DOX的累积释放达到了96％左右，体现了SWNT-GEL缓慢、持续释放药物的运载功能。

(2)DOX/SWNT-GEL在PBS中的药物释放

将DOX粉末溶解于PBS(pH 7.4)中，得到浓度为1.25μg μL^-1的阿霉素溶液。另按前述方法制备浓度为30mg ml^-1的SWNT-GEL混悬液。在每个样品中，将100μg阿霉素加入到300μLSWNT-GEL混悬液中，剧烈震荡并混合均匀，以得到均一稳定的DOX/SWNT-GEL混悬液。将DOX/SWNT-GEL转移到新的1.5mlEP管中并在整个实验过程中置于恒温孵育箱(43℃)。恒温箱内放置24小时后，水凝胶稳定形成，将1ml预热至43℃的新鲜PBS溶液缓慢加入EP管内(水凝胶的上方)。随后，每间隔24小时便将EP管内100μL悬液吸出用于测定从SWNT-GEL中释放出的DOX的含量，并将100μL新鲜PBS替换入EP管中。DOX的测定是通过测定悬液在480nm处的吸光度实现的(SpectraMax M5，Molecular Devices，美国)。上述实验重复3次。

实验结果如图1D所示。

(3)细胞摄取实验

为了验证DOX/SWNT-GEL是否能够将DOX运送至肿瘤细胞，接下来进行了细胞摄取的实验观察。

将BGC-823胃癌细胞株(来自南方医科大学南方医院肿瘤科实验室)按以上提及的方法培养，并以2×10⁵个/孔细胞密度种于6孔板内。在新鲜的培养基中加入灭菌的DOX/SWNT-GEL混悬液(DOX浓度：2μg mL^-1)，分别在加入药物后0.5小时、2小时及24小时后将培养基吸去，新鲜PBS将细胞润洗3遍，加入4％甲醇固定后，使用DAPI将细胞核染色5分钟，最后再将多余的DAPI润洗干净，利用荧光显微镜观察细胞对DOX的摄取情况。以荧光显微镜下红色荧光的强度来衡量，红色荧光即表示肿瘤细胞内DOX积聚的浓度。

如图2所示，随着培养时间的延长(从0.5小时至24小时)，红色荧光的强度增加。同时可以看出，大部分红色荧光可以与蓝色荧光(代表细胞核)重叠，证实了DOX是进入细胞核内发挥其作用的。

(4)细胞活性实验

为了测定DOX及SWNT-GEL两者分别对BGC-823细胞的毒性作用，进行了MTT试验以测定细胞活性。

将BGC-823胃癌细胞株在加有10％胎牛血清、1.0×10⁵U L^-1青霉素及100mg L^-1链霉素的RPMI1640培养基中培养，培养板置于CO₂含量为5％，湿度1％的37℃恒温孵箱中。BGC-823细胞种在96孔组织培养板中，细胞密度为5000个/孔。经过24小时孵育后，将培养基移除，并加入新鲜的分别含有DOX或SWNT-GEL的培养基。将DOX或SWNT-GEL加入不同的孔内，并且加入SWNT-GEL的孔分别接受0秒、15秒及3分钟的NIR激光照射(λ＝976nm)。再经过24小时的孵育后，将20μL MTT溶液加入各个孔内，继续孵育4小时。随后将每个孔内的溶液吸去，各孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)用于溶解甲醇最后利用酶标仪测定各个孔在570nm处的吸光度。细胞存活率按以下公式计算：细胞存活率＝实验样本的吸光度/对照组吸光度×100％。其中I样品本指不同处理后实验组的吸光度，I对照指未经任何处理的对照组的吸光度。

结果表明，加入DOX的分组体现了剂量依赖的细胞毒性作用，其对于BGC细胞的半数致死浓度大约在3μg ml-1左右(图3A)。不接受激光刺激的SWNT-GEL在所给予的浓度下对BGC细胞不产生毒性作用。接受NIR刺激的SWNT-GEL则分别随着照射时间的延长及培养浓度的升高而使存活的细胞减少(图3B)，这便说明了纳米颗粒本身并不影响细胞的增殖，而通过NIR照射后的SWNT在局部产生了过高热，从而使得经过照射后的细胞活性较未照射组下降了30％左右。空白对照组(即SWNT-GEL浓度为0μg ml^-1)即使经过NIR照射，细胞活性也并未受到明显影响，这说明了由NIR照射产生的能量并不损害肿瘤细胞。

(5)流式细胞仪检测

为了明确经过NIR照射的DOX/SWNT-GEL后是否比DOX单药有更好的促进肿瘤细胞凋亡的效应，采用了流式细胞仪分析细胞凋亡率及死亡的影响。

将培养于6孔板内的BGC-823胃癌细胞作以下分组处理：组1，加入新鲜PBS；组2，加入DOX；组3，加入DOX/SWNT-GEL并给予NIR照射。

经过6小时的孵育后，胰酶消化并离心收集不同处理组的细胞，并按照凋亡检测试剂盒的实验方案分别予Annexin V-FITC及碘化丙啶(PI)染色，染色后立即使用流式细胞仪检测细胞的染色情况。

结果如图3C所示，代表细胞的散点分别分布于四个不同的象限(上行)，右上象限及右下象限分别表示早期及晚期凋亡细胞的比例，两者都被涵盖于凋亡细胞的计算之中。经过NIR照射的DOX/SWNT-GEL处理的BGC细胞较DOX单独给药组有更高的凋亡率(下行)。而PBS对照组则基本都是完整的存活细胞而凋亡细胞所占比例非常小。以上结果可能提示NIR照射后的SWNT通过产生过高热而引起了促凋亡效应。

(6)DOX/SWNT-GEL体内试验

将BGC-823胃癌细胞株培养于37℃，5％CO₂含量的恒温孵箱中，培养基为胎牛血清含量为10％的RPMI1640(Hyclone)。细胞贴壁后在培养瓶内得到80％的密度时使用胰酶消化并用PBS重悬细胞。

为了研究DOX/SWNT-GEL对肿瘤生长的抑制效应，利用Balb/c裸鼠建立了皮下移植瘤胃癌模型。

24只4周龄BALB/c雄性裸鼠购自于南方医科大学南方医院实验动物中心。动物实验遵照动物中心的相关协定。裸鼠饲养1周适应环境后在左侧背部皮下注射150μl含有2.5×10⁶个BGC细胞的混悬液以建立裸鼠移植瘤模型。

当肿瘤体积达到100-150mm³左右时，将24只裸鼠随机分成4组(每组6只)并分别给予不同处理：组1为PBS，组2为阿霉素组(以下简写成DOX)，组3为碳纳米管温敏胶组(以下简写成SWNT-GEL)，组4为DOX/SWNT-GEL。此外，每组中将随机选择一半的裸鼠(3只)在处理后对肿瘤局部进行NIR激光照射(λ＝976nm，200mW/cm²，10分钟)，另一半则不接受激光处理。在上述提及的处理中，DOX以2mg/kg的剂量，SWNT-GEL以20mgml^-1的给药浓度均进行瘤内注射。给予不同处理后，每3天测量一次肿瘤体积，连续测量4周。肿瘤体积(VT)按以下公式计算：VT＝最长径×最短径2/2。并在每周记录裸鼠的体重变化情况。

经过4周的观察，结果表明，在经过NIR照射的裸鼠中，DOX/SWNT-GEL组相较于其它三个组有显著的肿瘤体积减小(与PBS/NIR组相比，p＝0.004；与DOX/NIR组相比，p＝0.01；与SWNT-GEL/NIR组相比，p＝0.036，参见图4A)。在给药后27天，DOX组平均的肿瘤体积增长率达到了166％，而DOX/SWNT-GEL组则降至61.3％。这证明了联合应用DOX及NIR照射的SWNT-GEL具有更好的抑瘤效应。在未经过NIR照射的裸鼠中，PBS组的肿瘤体积平均增长率达到了282％，而SWNT-GEL组则为261％，这说明了未经NIR照射的SWNT-GEL并不对肿瘤增值产生任何抑制效应(图4B)。单就DOX/SWNT-GEL治疗组而言，NIR照射组的肿瘤体积生长率(61.3％)大约是未照射组的一半(126％)，揭示了激光激发后的SWNT纳米颗粒产生了不可忽略的过高热肿瘤杀伤效应。再详细分析PBS对照组，可以看出，NIR照射的裸鼠较未经照射的裸鼠并没有显著的肿瘤体积减少(p>0.05)。相反，在SWNT-GEL组内，NIR照射后的裸鼠较未经照射者却有明显的肿瘤体积减少，其在处理后第27天的增长率分别为156％(接受NIR刺激)和261％(未接受NIR刺激)(p值<0.05)。以上结论共同说明了经NIR照射后的SWNT通过光热转换效应在肿瘤组织局部产生过高热而达到抑瘤效果，并且也进一步证实了在没有SWNT存在条件下，单纯的NIR照射并不引起肿瘤死亡。简言之，DOX与以NIR激光照射SWNT为基础的水凝胶相结合，展现了最强的肿瘤抑制效果，而不经NIR照射的SWNT-GEL并不产生任何抑制作用。

(7)组织HE染色及荧光显微镜观察

为了进一步验证给药后的抑瘤效果，在给予不同处理后第28天处死所有小鼠，收集每组小鼠的肿瘤组织，四个主要器官(心、肝、脾、肾)，利用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，并切片行HE染色。同时，还对给予DOX或DOX/SWNT-GEL处理组的小鼠肿瘤组织进行冰冻切片，将得到的切片进行DAPI染色，并使用荧光显微镜观察DOX在瘤内的残留情况。

将处理28天后的裸鼠肿瘤组织进行HE染色，可以看出不同处理后的组织有截然不同的形态变化(图5A)。在DOX/SWNT-GEL组可以观察到明显的细胞核变形、收缩，失去原有的形态，而PBS对照组的肿瘤组织却保持有完整、饱满的肿瘤细胞核。而在DOX或SWNT-GEL/NIR处理组的肿瘤组织切片中，可以观察到部分细胞的皱缩及不规则的心态改变。在含有SWNT-GEL处理的分组中，在高倍镜下可以观察到黑色小点(黑箭头)，即是聚集的SWNT颗粒。

为了验证给予DOX/SWNT-GEL处理的肿瘤组织具有更多、更长时间的DOX残留，进一步将肿瘤组织进行荧光显微镜观察。可以在图5B中看出，DOX/SWNT-GEL组比DOX组有更多的DOX残留在组织中。这表明了原位成胶使得药物在肿瘤内的存留比单药注射DOX更多，停留时间更长，这可能是因为DOX与SWNT之间形成了pi键堆叠或pi-pi连接。

(8)小动物PET/CT检查

使用小动物PET/CT检测活体肿瘤糖代谢情况。¹⁸氟-脱氧葡萄糖(¹⁸F-FDG)作为放射示踪剂。每个分组中取1只小鼠进行PET/CT扫描。所有将进行扫描的小鼠采用1％戊巴比妥(6ml kg^-1)腹腔注射麻醉，麻醉后通过尾静脉注射18F-FDG(10mCi/kg)，1小时后进行PET/CT扫描。显像分别于给药前，给药后15天及给药后28天完成。

¹⁸F-FDG示踪的PET/CT扫描是肿瘤病人常用于检查原发及转移肿瘤病灶的肿瘤成像方法。它通过测量肿瘤对¹⁸F-FDG这一放射性示踪剂的摄取从而判定肿瘤生物代谢活性，是一种良好的肿瘤检测方法。¹⁸F-FDG是一种非侵入性的放射活性示踪剂，常被应用于肿瘤生物学及糖代谢活性的检测及显像，这常常是通过其对¹⁸F-FDG的摄取能力而体现的。PET图像的亮度代表活体生物糖代谢的活性，CT图像则能良好展现整体的解剖结构。通过对各组PET与CT的融合图像分析可以得出，在PBS对照组肿瘤有最高的FDG摄取，而在DOX/SWNT-GEL组则最低(图6及补充材料3D视频)。通常而言，具有更高¹⁸F-FDG摄取的肿瘤意味着更高的糖代谢活性及更大的可能倾向恶性生物学行为。PET/CT扫描与肿瘤体积变化曲线及肿瘤组织HE染色改变得到的结论是一致的，即给予DOX/SWNT-GEL处理的裸鼠肿瘤生长率最低。

(9)SWNT-GEL的体内毒性评估

为评估SWNT-GEL是否存在体内毒性，同时观察了裸鼠的体重变化及给药28后各器官的病理改变。各个组裸鼠的平均体重没有显著差别(数据未显示)。四个主要器官(心、肝、脾、肾)的石蜡切片HE染色也提示注射SWNT-GEL的实验组与其它组相比没有可观察的器官损害或组织变性(图7)。这些结果表明了SWNT-GEL在给药28天的期间内对移植瘤裸鼠并没有产生毒性作用。尽管DOX最常见的副作用是心脏毒性，但本实验中并没有观察到相关的改变，可能是由于瘤注射的给药途径降低了全身给药带来的不良反应。

上述实验中，重复测量一般线性模型用于分析组间裸鼠移植瘤体积差异。数据表示为重复测量的均数±标准差。P值<0.05被认作为有统计学显著性。所有数据使用IBMSPSS 20.0软件分析。

Claims (6)

1.一种单壁碳纳米管温敏胶，其特征在于：是明胶与氧化的单壁碳纳米管（SWNT）-三甲氧基硅烷（APTS）的结合物与pNIPAM-NH₂共聚反应合成的单壁碳纳米管温敏胶（SWNT-GEL）。

2.根据权利要求1所述的单壁碳纳米管温敏胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）氧化的单壁碳纳米管（SWNT）的制备：将98%的H₂SO₄及65%的HNO₃及以3：1的体积比混合成溶液；其次，将50mgSWNT加入上述溶液中，混合物在0 ℃条件下超声24小时；再次，利用超纯水将氧化的SWNT洗涤5次，再将上述混合物在13000rpm的条件下离心3次，每次10分钟；最后便可在沉淀中收集氧化的SWNT，通过冻干法得到黑色粉末，即为SWNT；

（2）SWNT-APTS的制备：100mg处理后的SWNT加入10g三甲氧基硅烷（3-Aminopropyl-trimethoxysilan，APTs），100ml 95%的乙醇及1ml 99.7%的乙酸；将上述混合物超声10分钟，接着以12000rpm的转速离心3次，每次10分钟，之后将混合物用去离子水润洗3遍，最后通过冻干法从沉淀中得到的黑色粉末即是SWNT-APTS；

（3）明胶/SWNT-APTS的制备：将1g明胶溶解于100ml三氟乙醇中24小时后，将60mgSWNT-APTS黑色粉末加入上述100ml 1%的明胶溶液中，超声震荡30分钟，并持续搅拌24小时，随后以12,000rpm转速离心3次，每次20分钟，之后将混合物用去离子水润洗3遍，收集沉淀，即为明胶/SWNT-APTS；

（4）pNIPAM-NH₂复合物的合成：将550mg NIPAM、25mg半胱胺、100μlAPS及6ml Milli-Q超纯水混合后在氮气条件下加热至70℃ 3小时，随后将上述溶液在Milli-Q超纯水中透析2天，通过冻干法收集pNIPAM-NH₂聚合物；

（5）明胶/SWNT-APTS-NH₂的制备：将10mg 明胶/SWNT-APTS复合物加入由10ml 0.1M pH值7.4的PBS，120mgEDC及70mgNHS的混合溶液中沉淀析出，再将154mg pNIPAM-NH₂加入上述溶液中产生交联；最后将其置于PBS溶液中透析4天，透析膜的截留分子量为1000D，通过冻干法得到最终产物。

3.根据权利要求1所述的单壁碳纳米管温敏胶用于制备可注射的药物运载体系的用途。

4.根据权利要求1所述的单壁碳纳米管温敏胶用于制备光热传导介质的用途。

5.一种用于癌症治疗的药物，其特征在于：包括由权利要求1所述的单壁碳纳米管温敏胶制备的药物载体，以及在所述药物载体上的癌症治疗药物。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于：所述的癌症是胃癌，所述的癌症治疗药物是阿霉素。