CN103191440B - 以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法及其应用，可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大，不能很好的抑制肿瘤细胞增殖的问题，解决的技术方案是，对原始的碳纳米材料进行修饰，再与氨化试剂反应，将碳纳米材料表面连接上反应活性的氨基后，再与对羧基苯肼反应，生成碳纳米材料的对羧基苯肼衍生物，然后与含羰基的抗肿瘤药物反应得到以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统，所述的碳纳米材料为富勒烯、碳纳米管、氧化石墨烯的一种，本发明生物相容性好，比表面积大，化学惰性高，具有缓释性和靶向性，是抗肿瘤药物上的创新。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法及其应用。
背景技术
近年来碳纳米材料在作为药物载体上的应用越来越广泛。在纳米材料中，包括富勒烯、碳纳米管和氧化石墨烯在内的碳纳米材料一直是近年来国际科学的前沿领域之一。碳纳米管(CNTs)以其独特的电学、力学、光学和热力学性质引起了各学科的广泛关注。巨大的比表面积(～2600m2/g)、超高的机械强度、较低的密度、出众的化学和热稳定性和富电子等特性、独特的跨膜能力以及大离域π键，可以与许多生物医药分子之间形成较强的π-π键相互作用，使其在生物医药领域具有巨大的应用潜力。碳纳米管用作药物载体,主要是利用其细胞穿透能力,携带目标生物活性分子进入细胞。CNTs可以有效携带蛋白质、抗体、多肽、药物和核酸等生物活性物质进入细胞，从而成为人们关注的载体。生物系统对700～1,1O0nm范围的近红外光具有高度透过性，而SWNTs在此范围内具有高吸收的特性，可以利用SWNTs在此范围内的光热转换特性对肿瘤进行激光热疗。将SWNTs肿瘤靶向给药系统和激光热疗联合应用可以达到更加有效的抗肿瘤作用。
富勒烯以其独特的结构和性质倍受人们重视，近十年来，几乎全世界所有著名大学和研究所的科学家都进行了与富勒烯有关的研究。它已成为当今物理、化学、材料及生命科学研究者共同关心的课题。富勒烯分子的重要科学意义，被美国《Science》杂志评为1991年的“明星分子”。近年来,富勒烯在生物医药领域的研究相当引人瞩目,研究发现富勒烯具有多种特殊的生物学效应: (1)可抑制多种酶的活性,包括 HIV 蛋白酶以及逆转录酶；(2)对肿瘤细胞显示出细胞毒性；(3)具有神经保护剂的作用； (4)还具有在可见光照射下产生氧自由基、切割 DNA的作用。富勒烯作为一种优良的光敏剂表现在其在可见光照射的情况下可以产生活性氧，活性氧包括单线态氧、超氧负离子等，可以表现出明显的细胞毒性，比如裂解细胞中的DNA，抑制细胞的有丝分裂以及生长，还可以抑制细胞蛋白水解酶的活性。富勒烯作为光敏剂可以用于肿瘤的治疗。
富勒烯作为一种优良的光敏剂表现在其在可见光照射的情况下可以产生活性氧，活性氧包括单线态氧、超氧负离子等。富勒烯光照下产生活性氧为高度反应性的，并且可以表现出明显的细胞毒性，比如裂解细胞中的DNA，抑制细胞的有丝分裂以及生长，还可以抑制细胞蛋白水解酶的活性。由此推断，富勒烯可以用于肿瘤的治疗。为此利用富勒烯作为光敏剂开展光动力疗法，即使其在肿瘤组织中蓄积，利用光照产生活性氧来选择性的破坏肿瘤组织。
近年来氧化石墨烯的研究在全世界科学家的共同努力下取得了巨大进展。氧化石墨烯表面由于存在大量的含氧官能团，表面呈现为极性，因而亲水性较强，另外由于这些官能团的存在使得大量的sp2杂化的碳原子转化为sp3杂化的碳原子，从而使大量的分子，特别是那些具备一定功能性的有机小分子都可以通过化学反应接枝到氧化石墨烯的表面上。又由于氧化石墨烯是单原子层结构，比表面积大，非常适合做药物载体。据报道，氧化石墨烯也具有良好的热性能。
通过腙键连接含羰基的抗肿瘤药物，pH敏感的机理主要是利用腙键的不稳定性，在pH小于6时腙键断裂，鉴于一些肿瘤组织局部缺血时，肿瘤间质液会出现异常酸化现象及pH比正常组织低的事实，因而通过腙键连接的药物能够有效释放在酸性的肿瘤微环境中，从而发挥抗肿瘤作用。
目前将碳纳米材料通过修饰与抗肿瘤药物形成腙键，从而构建以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统，及其作为光敏剂和热敏剂和药物转运载体在肿瘤治疗中的应用尚未见报道，因此，本发明的研制成功具有统计学上的意义和实际的临床意义。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法及其应用，可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大，不能很好的抑制肿瘤细胞增殖的问题。
本发明解决的技术方案是，对原始的碳纳米材料进行修饰，与氨化试剂反应，将碳纳米材料表面连接上反应活性的氨基后，再与对羧基苯肼反应，生成碳纳米材料的对羧基苯肼衍生物，然后与含羰基的抗肿瘤药物反应得到以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统，在该以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统中，含羰基的抗肿瘤药物和碳纳米材料的质量含量比为0.12-0.30:1；所述的碳纳米材料为富勒烯、碳纳米管、氧化石墨烯。
以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法：
1）将富勒烯按专利申请号为201210406707.3的“一种水溶性富勒烯及其应用”中说出的方法进行氨基化修饰；
2）将上述含氨基的富勒烯50mg、对羧基苯肼（HBA）40mg和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC ·HCl）100mg和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）60mg在20ml磷酸盐缓冲液（PBS）中混合均匀，在室温下，400r/min搅拌24h使其充分反应，加入无水乙醇或丙酮50-100mL，静置2h，再通过0.22μm的聚偏氟乙烯微孔滤膜抽滤，重复操作5-10次，在20-60℃真空干燥24-56h，得到富勒烯的对羧基苯肼衍生物；
3）将上述得到的富勒烯的对羧基苯肼衍生物20mg和含羰基的抗肿瘤药物40mg在20mL二甲基亚砜（DMSO）中混合均匀，在室温下，400r/min搅拌24-48h使其充分反应，经无水乙醇沉淀后，再用甲醇或二氯甲烷或水洗净后，在20-60℃真空干燥24-56h，得到以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统；所述的含羰基的抗肿瘤药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、盐酸吡柔比星、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或二种以上的混合物。
以碳纳米管为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法：
1）将碳纳米管110-120mg加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液40mL中，再加入10-15ml质量浓度为30%的过氧化氢溶液，在功率为300～400W的超声波清洗器中超声1h后，用超纯水稀释，使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，并不断用超纯水冲洗至pH=7，放入烘箱中80℃恒温干燥，得羧基化的碳纳米管；
2）将上述羧基化的碳纳米管45-50mg加入20mL氨化试剂，再加入1g N,N'-二环己基碳二亚胺，超声分散10min后，放入油浴锅中，在120℃、100 r/min下搅拌，冷凝回流48h，反应结束后，将反应物冷却至室温，用0.22μm聚碳酸酯滤膜和布氏漏斗过滤10遍，用无水乙醇洗去多余的N,N'-二环己基碳二亚胺、乙二胺以及其他的副产物，在40-80℃下，真空干燥24-56h，得氨基化的碳纳米管；所述的氨化试剂为乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一种；
3）将上述氨基化的碳纳米管50mg、对羧基苯肼（HBA）40mg和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC ·HCl）100mg和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）60mg在20mL磷酸盐缓冲液（PBS）中混合均匀，室温下，400r/min搅拌24h；使其充分反应，经无水乙醇或丙酮50-100mL洗净后，静置2h，再通过0.22μm的聚偏氟乙烯微孔滤膜抽滤，如此重复操作5-10次，在20-60℃真空干燥24-56h，得到碳纳米管对羧基苯肼衍生物。
4）将上述得到的碳纳米管对羧基苯肼衍生物20mg和含羰基的抗肿瘤药物40mg在20mL二甲基亚砜（DMSO）中混合均匀，室温下，400r/min避光搅拌24h使其充分反应，经无水乙醇沉淀后，再用溶剂A洗净，在20-60℃真空干燥24-56h，得到以碳纳米管为载体的pH敏感型药物传递系统；所述的含羰基的抗肿瘤药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、盐酸吡柔比星、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或几种；所述的溶剂A为甲醇、二氯甲烷和水中的一种或两种以上的混合物。
以氧化石墨烯为载体的药物传递系统的制备方法：
1）将氧化石墨烯50mg加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液120mL中，再加入4-12mL质量浓度为30%的过氧化氢溶液，在超声功率为300～400W的超声波清洗器中超声1h后，用超纯水稀释，使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，并不断用超纯水冲洗至pH为中性为止，放入烘箱中80℃恒温干燥，即得羧基化的氧化石墨烯；
2）将上述羧基化的氧化石墨烯50mg加入20mL 氨化试剂，再加入1gN,N'-二环己基碳二亚胺，超声分散10min后，放入油浴锅中，在120℃、100 r/min下搅拌，冷凝回流48h，反应结束后，将反应物冷却至室温，用无水乙醇洗去多余的N,N'-二环己基碳二亚胺、乙二胺以及其他的副产物，用0.22μm聚偏氟乙烯微孔滤膜和布氏漏斗过滤10遍，在40-80℃真空干燥24-56h，即得到氨基化的氧化石墨烯；所述的氨化试剂为乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一种；
3）将上述氨基化的氧化石墨烯50mg、对羧基苯肼（HBA）40mg和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC ·HCl）100mg和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）60mg在20mL磷酸盐缓冲液（PBS）中混合均匀，室温下，400r/min搅拌24h使其充分反应，加入无水乙醇或丙酮50-100mL，静置2h，再通过0.22μm的聚偏氟乙烯微孔滤膜抽滤，如此重复操作5-10次，在20-60℃真空干燥24-56h，得到氧化石墨烯对羧基苯肼衍生物；
4）将上述得到的氧化石墨烯对羧基苯肼衍生物20mg和含羰基的抗肿瘤药物40mg在20mL二甲基亚砜（DMSO）中混合均匀，室温下，400r/min避光搅拌24h使其充分反应，经无水乙醇沉淀后，再经甲醇、二氯甲烷和水逐次洗涤，在20-60℃真空干燥24-56h，得到以氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统；所述的含羰基的抗肿瘤药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、盐酸吡柔比星、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或二种以上的混合物。
以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统作为光敏剂在肿瘤治疗中的应用分为体外和体内两部分：
1）将制得的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统溶于水中制成溶液加入到癌细胞A中进行培养，给药后3h后用光源B光照，光照30-120min，继续培养24小时，测定癌细胞A的存活率。
2）将制得的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统溶于水中制成溶液，静脉注射到荷瘤小鼠C体内，给药后3h后用光源D光照，光照时间为30-120min，测量荷瘤小鼠C的肿瘤体积大小。
上述步骤1中的癌细胞A为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。
上述步骤1中的光源B为：400-800nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选532nm激光。
上述步骤2中的荷瘤小鼠C为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。
上述步骤2中的光源D为：400-800nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选532nm激光。
本发明的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统作为光敏剂来进行光动力治疗体内深度肿瘤时，这些光源不能够穿透照射时，可以通过适用与所述部位的方法来改善外部光源照射的穿透力进行肿瘤的治疗。
本发明的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统作为光敏剂可以制成任意的药物制剂剂型，比如：注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统可以加入各种制剂的添加剂，比如：生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等以便于制备成需要的剂型。给药方式可以为：静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射、透皮给药、体内植入方式等。
以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统作为热敏剂在肿瘤治疗中的应用分为体外和体内两部分：
1）将制得的以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统溶于水中制成溶液，加入到癌细胞A中进行培养，给药后3h后用光源B光照，光照1-5min，继续培养24小时，测定癌细胞A的存活率。
2）将制得的以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统溶于水中制成溶液，静脉注射到荷瘤小鼠C体内，给药后3h后用光源D光照，光照时间为1-5min，测量荷瘤小鼠C的肿瘤体积大小。
上述步骤1中的癌细胞A为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。
上述步骤1中的光源B为：780-1100nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选808nm激光。
上述步骤2中的荷瘤小鼠C为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。
上述步骤2中的光源D为：780-1100nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选808nm激光。
本发明的以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统作为热敏剂来进行热敏治疗体内深度肿瘤时，808nm激光能够深度穿透生物体，可以用于治疗生物肿瘤。
本发明的以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统作为热敏剂可以制成任意的药物制剂剂型，比如：注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统可以加入各种制剂的添加剂，比如：生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等以便于制备成需要的剂型。给药方式可以为：静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射、透皮给药、体内植入方式等。
以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统作为药物转运载体在肿瘤治疗中的应用，步骤为：将装载药物的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统进行抗肿瘤细胞C和体内的抗肿瘤D的评价。
上述步骤中的肿瘤细胞C为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。
上述步骤中的肿瘤D为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。
本发明的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统作为药物转运载体可以更多的分布在肿瘤组织中，与正常组织相比，它可以长期的高浓度的保留在肿瘤组织中，这样当采用适当的手段使用光源进行照射时，富勒烯能够在肿瘤组织中产生更多的活性氧，碳纳米管和氧化石墨烯能够在肿瘤组织中产热，这些都可以使其装载的药物在肿瘤部位浓度提高。但这也会分布在正常的组织器官中，为了避免产生的活性氧和热量对正常组织产生损伤，可以通过一些手段来加以改善，比如：可以在以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统上装载一些具有靶向性质的靶头，也可以使用抗体等手段介导，可以使用临床手段比如说内窥镜的方式来直接输送载药系统到达靶组织，聚焦光照面积等方式。
本发明的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统作为药物转运载体可以制成任意的药物制剂剂型，比如：注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统可以加入各种制剂的添加剂，比如：生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等以便于制备成需要的剂型。给药方式可以为：静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射等。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
1）将富勒烯按专利申请号为201210406707.3的“一种水溶性富勒烯及其应用”中说出的方法进行氨基化修饰；
2）将上述含氨基的富勒烯50mg、对羧基苯肼（HBA）40mg和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC ·HCl）100mg和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）60mg在20ml磷酸盐缓冲液（PBS）中混合均匀，在室温下，400r/min搅拌24h使其充分反应，加入无水乙醇或丙酮50-100mL，静置2h，再通过0.22μm的聚偏氟乙烯微孔滤膜抽滤，重复操作5-10次，在20-60℃真空干燥24-56h，得到富勒烯的对羧基苯肼衍生物；
3）将上述得到的富勒烯的对羧基苯肼衍生物20mg和含羰基的抗肿瘤药物40mg在20mL二甲基亚砜（DMSO）中混合均匀，在室温下，400r/min搅拌24-48h使其充分反应，经无水乙醇沉淀后，再用甲醇或二氯甲烷或水洗净后，在20-60℃真空干燥24-56h，得到以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统；所述的含羰基的抗肿瘤药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、盐酸吡柔比星、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或二种以上的混合物。
实施例2
1）将碳纳米管110-120mg加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液40mL中，再加入10-15ml质量浓度为30%的过氧化氢溶液，在功率为300～400W的超声波清洗器中超声1h后，用超纯水稀释，使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，并不断用超纯水冲洗至pH=7，放入烘箱中80℃恒温干燥，得羧基化的碳纳米管；
2）将上述羧基化的碳纳米管45-50mg加入20mL氨化试剂，再加入1g N,N'-二环己基碳二亚胺，超声分散10min后，放入油浴锅中，在120℃、100 r/min下搅拌，冷凝回流48h，反应结束后，将反应物冷却至室温，用0.22μm聚碳酸酯滤膜和布氏漏斗过滤10遍，用无水乙醇洗去多余的N,N'-二环己基碳二亚胺、乙二胺以及其他的副产物，在40-80℃下，真空干燥24-56h，得氨基化的碳纳米管；所述的氨化试剂为乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一种；
3）将上述氨基化的碳纳米管50mg、对羧基苯肼（HBA）40mg和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC ·HCl）100mg和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）60mg在20mL磷酸盐缓冲液（PBS）中混合均匀，室温下，400r/min搅拌24-48h；使其充分反应，经无水乙醇或丙酮50-100mL洗净后，静置2h，再通过0.22μm的聚偏氟乙烯微孔滤膜抽滤，如此重复操作5-10次，在20-60℃真空干燥24-56h，得到碳纳米管对羧基苯肼衍生物；
4）将上述得到的碳纳米管对羧基苯肼衍生物20mg和含羰基的抗肿瘤药物40mg在20mL二甲基亚砜（DMSO）中混合均匀，室温下，400r/min避光搅拌24h使其充分反应，经无水乙醇沉淀后，再用溶剂A洗净，在20-60℃真空干燥24-56h，得到以碳纳米管为载体的pH敏感型药物传递系统；所述的含羰基的抗肿瘤药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、盐酸吡柔比星、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或几种；所述的溶剂A为甲醇、二氯甲烷和水中的一种或两种以上的混合物。
实施例3
1）将氧化石墨烯50mg加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液120mL中，再加入4-12mL质量浓度为30%的过氧化氢溶液，在超声功率为300～400W的超声波清洗器中超声1h后，用超纯水稀释，使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，并不断用超纯水冲洗至pH为中性为止，放入烘箱中80℃恒温干燥，即得羧基化的氧化石墨烯；
2）将上述羧基化的氧化石墨烯50mg加入20mL 氨化试剂，再加入1gN,N'-二环己基碳二亚胺，超声分散10min后，放入油浴锅中，在120℃、100 r/min下搅拌，冷凝回流48h，反应结束后，将反应物冷却至室温，用无水乙醇洗去多余的N,N'-二环己基碳二亚胺、乙二胺以及其他的副产物，用0.22μm聚偏氟乙烯微孔滤膜和布氏漏斗过滤10遍，在40-80℃真空干燥24-56h，即得到氨基化的氧化石墨烯；所述的氨化试剂为乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一种；
3）将上述氨基化的氧化石墨烯50mg、对羧基苯肼（HBA）40mg和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC ·HCl）100mg和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）60mg在20mL磷酸盐缓冲液（PBS）中混合均匀，室温下，400r/min搅拌24h使其充分反应，加入无水乙醇或丙酮50-100mL，静置2h，再通过0.22μm的聚偏氟乙烯微孔滤膜抽滤，如此重复操作5-10次，在20-60℃真空干燥24-56h，得到氧化石墨烯对羧基苯肼衍生物；
4）将上述得到的氧化石墨烯对羧基苯肼衍生物20mg和含羰基的抗肿瘤药物40mg在20mL二甲基亚砜（DMSO）中混合均匀，室温下，400r/min避光搅拌24h使其充分反应，经无水乙醇沉淀后，再经甲醇、二氯甲烷和水逐次洗涤，在20-60℃真空干燥24-56h，得到以氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统；所述的含羰基的抗肿瘤药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、盐酸吡柔比星、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或二种以上的混合物。
相关试验资料如下：
一、本发明在具体实施中，使用光照射以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统对肿瘤细胞生长的抑制活性的测定：
通过光照射以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统在体外抗肿瘤活性。将黑色素瘤细胞(B16-F10)（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。将B16-F10细胞培养在含胎牛血清(FBS)10%，青链霉素混合液1%的DMEM培养基中，培养箱条件为37℃、5% CO2，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200 μl，铺板使待测细胞调密度至6×103个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5% CO2，37 ℃孵育24 h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度（12.5、25、50、100μg/mL）的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统，设置复孔为4～6个。光照组放置在400W可见光中60min，保持光照过程中温度在37℃，光照结束后用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24 h，对于不光照组而言，则直接用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24 h，终止培养，吸出含药培养基，每孔用150 μl PBS洗2遍，加入预冷的10% TCA 200 μl，4 ℃放置1 h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100 μl的SRB溶液，静置放置10 min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150 μl 10 mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在515 nm处测定每孔的OD值。存活率的计算公式：存活率=实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。
已经证实当用光照射60min，以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统的加入直接影响了B16-F10细胞的增殖。
二、本发明在具体实施中，使用光照射以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统对肿瘤细胞生长的抑制活性的测定：
通过光照射以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统在体外抗肿瘤活性。将黑色素瘤细胞(B16-F10)（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。将B16-F10细胞培养在含胎牛血清(FBS)10%，青链霉素混合液1%的DMEM培养基中，培养箱条件为37℃、5% CO2，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200 μl，铺板使待测细胞调密度至6×103个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5% CO2，37 ℃孵育24 h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度（12.5、25、50、100μg/ml）的实例2和实例3中的以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统，设置复孔为4～6个。光照组放置在808nm近红外光2W中2min，保持光照过程中温度在37℃，光照结束后用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24 h，对于不光照组而言，则直接用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24 h，终止培养，吸出含药培养基，每孔用150 μl PBS洗2遍，加入预冷的10% TCA 200 μl，4℃放置1 h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100 μl的SRB溶液，静置放置10 min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150 μl 10 mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在515 nm处测定每孔的OD值。存活率的计算公式：存活率=实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。
已经证实当用光照射2min，以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统的加入直接影响了B16-F10细胞的增殖。
三、光照射时，以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统的体内抗肿瘤活性测定：
取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3 mL，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×106个/mL的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7 d后，取其中24只肿瘤体积≥100 mm3昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下：(1)对照组(NS组)：生理盐水；(2)生理盐水激光组；(3)以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统组；(4)以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统激光组。4组均采用静脉给药的方式，其中光照组使用的光源为532nm绿相光源，功率为300mW，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为10min。每2 d给药一次，每次注射生理盐水或者2mg/mL的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统100μl，共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2 d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积V= 计算肿瘤体积。
当给药以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统合并激光照射时，小鼠的肿瘤体积的增加得到了明显的抑制。
四、光照射时，以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统的体内抗肿瘤活性测定：
取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3 ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×106个/ml的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7 d后，取其中24只肿瘤体积≥100 mm3昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下：(1)对照组(NS组)：生理盐水；(2)生理盐水激光组；(3)以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统组；(4)以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统激光组。4组均采用静脉给药的方式，其中光照组使用的光源为808nm近红外光源，功率为2W，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为2min。每2 d给药一次，每次注射生理盐水或者2mg/ml的以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统100μl，共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2 d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积V= 计算肿瘤体积。
当给药以碳纳米管和氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统合并激光照射时，小鼠的肿瘤体积的增加得到了明显的抑制。
五、以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统作为药物转运载体在肿瘤治疗中的应用：
取以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统10mg，加入PBS2mL，混合均匀后，探头超声（工作3s，间隔6s，工作12次，功率为400W），得到以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统溶液。紫外分光光度计测定实例1、2、3中盐酸阿霉素的含量，载药量为分别为2.1 mg/mL、1.8mg/mL、1.5mg/mL。
已经证实，以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统，提高了药物的渗透性和停留时间，可以作为抗肿瘤药物的载体使用。
在做上述实验的同时，还采用其他光源以及抗肿瘤药物做了类似的实验，均取得了相同和相类似的结果，本发明分组科学，方法稳定可靠，其他实验结果不再一一列举。
本发明提供了三种新的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统，其制备方法以及其作为光敏剂、热敏剂和在药物转运载体中的应用。本发明的新的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统不会对碳纳米材料本身的特性进行破坏，测试结果表明，本发明的新的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统，对生物体的毒性很低，物理以及化学稳定性良好，质量好，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低。
本发明提供的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统可以作为抗肿瘤光动力治疗的一种良好的光敏剂，测试表明无论是体外还是体内在光照的情况下都可以很好的抑制肿瘤细胞以及组织的发生和发展，而在不光照的情况下本发明提供的新的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统对正常细胞以及组织毒副作用很小。
本发明提供的以碳纳米管为载体的pH敏感型药物传递系统可以作为抗肿瘤热敏治疗的一种良好的热敏剂，测试表明无论是体外还是体内在光照的情况下都可以很好的抑制肿瘤细胞以及组织的发生和发展，而在不光照的情况下本发明提供的新的以碳纳米管为载体的pH敏感型药物传递系统对正常细胞以及组织毒副作用很小。
本发明提供的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统可以作为一种良好的抗肿瘤药物的载体，本身有着极小的毒性，较强的水溶性，生物相容性好，比表面积大，化学惰性高等优点。测试结果表明，本发明提供的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统作为抗肿瘤药物的载体时，粒径均匀，能够提高水不溶性抗肿瘤药物的水溶性，能够起到一定的缓释作用，而且还能够更多的到达肿瘤组织中起到靶向给药的作用，结合光照还可以发挥出更为优秀的抗肿瘤活性。
预期可以用于治疗肿瘤的一种良好的光敏剂和热敏剂，具有良好的pH敏感性，还可以作为化学药物、蛋白质、核酸的转运载体，是药物制备上的一大创新。
本发明与现有技术相比具有以下突出的有益技术效果：
1）本发明的新的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统不会对碳纳米材料本身的特性进行破坏，对生物体的毒性很低，物理以及化学稳定性良好，质量好，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低。
2）本发明提供的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统可以作为抗肿瘤光动力治疗的一种良好的光敏剂，光照时能够发挥抗肿瘤的活性，而不光照时则副作用很小，可以根据光的聚焦等手段来选择性的杀伤肿瘤组织和细胞。
3）本发明提供的以碳纳米管为载体的pH敏感型药物传递系统可以作为抗肿瘤热敏治疗的一种良好的热敏剂，测试表明无论是体外还是体内在光照的情况下都可以很好的抑制肿瘤细胞以及组织的发生和发展，而在不光照的情况下本发明提供的新的以碳纳米管为载体的pH敏感型药物传递系统对正常细胞以及组织毒副作用很小。
4）本发明提供的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统可以作为一种良好的抗肿瘤药物的载体，有着极小的毒性，较强的水溶性，生物相容性好，比表面积大，化学惰性高，具有缓释性和靶向性，结合光照还可以发挥出更为优秀的抗肿瘤活性。
Claims (9)
1.一种以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法，其特征在于，1）将富勒烯按专利申请号为201210406707.3的“一种水溶性富勒烯及其应用”中给出的方法进行氨基化修饰；具体是：将氨化试剂20mL和氢氧化钠1g混合，再加入水和无水乙醇的重量比为1:5 的混合溶剂60mL，搅拌均匀后，逐滴加入含有富勒烯的有机溶液50mL，在30-50℃、200r/min 下搅拌反应1-7天，除去上层的有机溶剂，蒸除水和无水乙醇的混合溶剂，再用无水乙醇或甲醇500mL 抽滤洗涤15 次，在20-60℃下，真空干燥24-72h，得氨基富勒烯；所述的氨化试剂为乙二胺、1,3- 丙二胺、1,6- 己二胺中的一种；所述的含有富勒烯的有机溶液由富勒烯和有机溶剂组成，每1mL 的有机溶液中含富勒烯1mg；所述的有机溶剂为甲苯、苯、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合物；
2）将上述氨基化修饰的富勒烯50mg、对羧基苯肼40mg和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐100mg和N-羟基琥珀酰亚胺60mg在20ml磷酸盐缓冲液中混合均匀，在室温下，400r/min搅拌24h，使其充分反应，加入无水乙醇或丙酮50-100mL，静置2h，再通过0.22μm的聚偏氟乙烯微孔滤膜抽滤，重复操作5-10次，在20-60℃真空干燥24-56h，得到富勒烯的对羧基苯肼衍生物；
3）将上述得到的富勒烯的对羧基苯肼衍生物20mg和含羰基的抗肿瘤药物40mg在20mL二甲基亚砜中混合均匀，在室温下，400r/min搅拌24-48h使其充分反应，经无水乙醇沉淀后，再用甲醇或二氯甲烷或水洗净后，在20-60℃真空干燥24-56h，得到以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统；所述的含羰基的抗肿瘤药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、盐酸吡柔比星、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或二种以上的混合物。
2.一种以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法，其特征在于，1）将碳纳米管110-120mg加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液40mL中，再加入10-15ml质量浓度为30%的过氧化氢溶液，在功率为300～400W的超声波清洗器中超声1h后，用超纯水稀释，使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，并不断用超纯水冲洗至pH=7，放入烘箱中80℃恒温干燥，得羧基化的碳纳米管；
2）将上述羧基化的碳纳米管45-50mg加入20mL氨化试剂，再加入1g N,N'-二环己基碳二亚胺，超声分散10min后，放入油浴锅中，在120℃、100 r/min下搅拌，冷凝回流48h，反应结束后，将反应物冷却至室温，用0.22μm聚碳酸酯滤膜和布氏漏斗过滤10遍，用无水乙醇洗去多余的N,N'-二环己基碳二亚胺、乙二胺以及其他的副产物，在40-80℃下，真空干燥24-56h，得氨基化的碳纳米管；所述的氨化试剂为乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一种；
3）将上述氨基化的碳纳米管50mg、对羧基苯肼40mg和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐100mg和N-羟基琥珀酰亚胺60mg在20mL磷酸盐缓冲液中混合均匀，室温下，400r/min搅拌24-48h；使其充分反应，经无水乙醇或丙酮50-100mL洗净后，静置2h，再通过0.22μm的聚偏氟乙烯微孔滤膜抽滤，如此重复操作5-10次，在20-60℃真空干燥24-56h，得到碳纳米管对羧基苯肼衍生物；
4）将上述得到的碳纳米管对羧基苯肼衍生物20mg和含羰基的抗肿瘤药物40mg在20mL二甲基亚砜中混合均匀，室温下，400r/min避光搅拌24h使其充分反应，经无水乙醇沉淀后，再用溶剂A洗净，在20-60℃真空干燥24-56h，得到以碳纳米管为载体的pH敏感型药物传递系统；所述的含羰基的抗肿瘤药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、盐酸吡柔比星、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或二种以上的混合物；所述的溶剂A为甲醇、二氯甲烷和水中的一种或两种以上的混合物。
3.一种以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法，其特征在于，1）将氧化石墨烯50mg加入体积比为3︰1的质量浓度为98%的硫酸和质量浓度为65-68%的硝酸组成的混酸溶液120mL中，再加入4-12mL质量浓度为30%的过氧化氢溶液，在超声功率为300～400W的超声波清洗器中超声1h后，用超纯水稀释，使用0.45μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，并不断用超纯水冲洗至pH为中性为止，放入烘箱中80℃恒温干燥，即得羧基化的氧化石墨烯；
2）将上述羧基化的氧化石墨烯50mg加入20mL 氨化试剂，再加入1gN,N'-二环己基碳二亚胺，超声分散10min后，放入油浴锅中，在120℃、100 r/min下搅拌，冷凝回流48h，反应结束后，将反应物冷却至室温，用无水乙醇洗去多余的N,N'-二环己基碳二亚胺、乙二胺以及其他的副产物，用0.22μm聚偏氟乙烯微孔滤膜和布氏漏斗过滤10遍，在40-80℃真空干燥24-56h，即得到氨基化的氧化石墨烯；所述的氨化试剂为乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一种；
3）将上述氨基化的氧化石墨烯50mg、对羧基苯肼40mg和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐100mg和N-羟基琥珀酰亚胺60mg在20mL磷酸盐缓冲液中混合均匀，室温下，400r/min搅拌24h使其充分反应，加入无水乙醇或丙酮50-100mL，静置2h，再通过0.22μm的聚偏氟乙烯微孔滤膜抽滤，如此重复操作5-10次，在20-60℃真空干燥24-56h，得到氧化石墨烯对羧基苯肼衍生物；
4）将上述得到的氧化石墨烯对羧基苯肼衍生物20mg和含羰基的抗肿瘤药物40mg在20mL二甲基亚砜中混合均匀，室温下，400r/min避光搅拌24h使其充分反应，经无水乙醇沉淀后，再经甲醇、二氯甲烷和水逐次洗涤，在20-60℃真空干燥24-56h，得到以氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统；所述的含羰基的抗肿瘤药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、盐酸吡柔比星、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或二种以上的混合物。
4.权利要求1或2-3任一项所述的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法，其特征在于，所述的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统粒径为30-500nm。
5.根据权利要求1或2-3任一项所述的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统的制备方法，其特征在于，所述的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统具有明显的pH敏感特性。
6.权利要求1所述的以富勒烯为载体的pH敏感型药物传递系统在制备抗肿瘤光动力治疗的光敏剂中的应用。
7.权利要求2所述的以碳纳米管为载体的pH敏感型药物传递系统在制备抗肿瘤光动力治疗的热敏剂中的应用。
8.权利要求3所述的以氧化石墨烯为载体的pH敏感型药物传递系统在制备抗肿瘤光动力治疗的热敏剂中的应用。
9.权利要求1或2-3任一项所述的以碳纳米材料为载体的pH敏感型药物传递系统在制备抗肿瘤药物载体中的应用。
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