CN101120088A - 包含展示异源蛋白质化合物的细菌细胞的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于制备包含具有受控量的表面偶联的蛋白质或蛋白质化合物的活或死细菌的药物的组合物和制备该组合物的方法。所述的细菌提供了可以用于制备通过粘膜递送的疫苗或药物的多价异源蛋白展示载体。

Description

包含展示异源蛋白质化合物的细菌细胞的药物组合物

发明背景

近年来，粘膜疫苗接种已经受到了越来越多的关注，因为：i)对免疫系统机制的新认识；ii)模拟大部分病原体感染途径的原理，而且还因为：iii)对易于给药和对新的和新出现的疾病有效的疫苗的需求。此外，全球生物恐怖的威胁要求有效的疫苗，它们易于生产并且在无受过训练的人员的情况下能够快速给药。

粘膜免疫系统对获得有效的免疫反应而言表现理想，因为在粘膜的一个部位上诱导可以在整个免疫系统中产生特异性反应。在粘膜部位上诱导通常还可以产生全身免疫反应(Huang J.等，2004 Vaccine6：794-801；Verdonck F.等，2004 Vaccine 31-32：4291-9)。大部分病原体通过粘膜表面感染其宿主。这一事实使得可以有利地产生在该感染途径早期阶段发挥其作用的疫苗。因此，尝试集中在研发能够递送针对病原体的特异性疫苗成分的非致病性或减毒的致病微生物。

在近几十年中，已经在使用重组微生物表面展示异源蛋白质的方法的研发中取得了显著进展。已经使用重组DNA技术(Grangette C.等2004 Infect Immun.5：2731-7)在减毒的致病菌诸如沙门氏菌属(Arnold H.等2004 Infect Immun.11：6546-53)和非致病菌诸如葡萄球菌属(Wernerus H.等2002 Biotechnol J.1：67-78)或乳杆菌属中证实了异源蛋白质的表面展示。异源蛋白质由重组细胞产生，由此使该蛋白质定向于细胞表面。已经描述了几种表面锚定微生物中分泌的蛋白质的方法。在葡萄球菌属中证实的一种手段在于将一段锚定细胞壁的氨基酸导入分泌的蛋白质。嵌合蛋白在其分泌过程中整合入细胞壁，在那里它通过锚定氨基酸片段与细胞壁结合(Wernerus H.等2002Biotechnol J.1：67-78)。在可选择的手段中，通过细胞裂解产生的细菌空胞用作活性物质诸如抗体或治疗有效多肽类的载体或靶向载体(CA2,370,714)。诱导包含裂解基因例如噬菌体基因E的合适的菌株进行细胞裂解以便形成空胞。然后将所需的活性物质转入空胞，在其中它可以被固定在细胞膜内表面上。在这种情况中，活性物质包囊在细胞空胞的内部而非暴露在细胞表面上。

几篇公开文献中描述了使用活细菌的表面展示特性用于疫苗递送技术的显著生物学潜能(Wernerus H.等2004 Biotechnol ApplBiochem.40(3)：209-28)。然而，这些手段依赖于重组微生物，其中使用和释放遗传修饰的生物体的风险和总体反对已经成为将这种活疫苗递送技术应用于人和动物的障碍。另外，认为包含重组DNA的灭活细菌也具有风险，因为它们携带最终可能在环境中播散的重组DNA。在某些情况下，例如在生物恐怖分子袭击时，可以将基于GMO的技术的应用视为可接受的风险。

对提供不依赖于遗传修饰的菌株的抗原展示载体而言几乎没有进行尝试。美国专利申请US2003/0180816A1中披露了用于从对与AcmA细胞壁结合结构域融合的蛋白具有改进的结合能力的非-GM革兰氏阳性菌中获得细胞壁物质的方法(WO99/25836)。按照披露的方法，用酸性溶液处理革兰氏阳性菌以便除去细胞壁成分，包括蛋白质、脂磷壁酸和碳水化合物。所得细胞壁物质由此大量脱去了天然蛋白，但仍然保留了对外部环境的屏障，并且命名为空胞。包含AcmA结构域蛋白的嵌合蛋白可以以非共价方式与这些空胞结合。

需要改进的抗原和变应原呈递方式满足为患有变态反应的患者和那些患有感染性疾病的患者提供治疗而设计的疫苗接种程序的需要。疫苗接种的构思基于免疫系统的两种基本特征，即特异性和记忆力。疫苗接种使接受者的免疫系统致敏，并且在反复接触类似蛋白时，免疫系统将处于对例如微生物感染的攻击起更剧烈的反应的状态。疫苗为旨在在目的在于在接受者中产生这类保护性免疫反应的疫苗接种中使用的蛋白质的混合物。这种保护将仅包含存在于疫苗和同源性抗原中的成分。

与其它类型的疫苗接种相比，变态反应疫苗接种因在过敏患者中存在进行中的免疫反应而复杂化。这种免疫反应的特征在于存在接触变应原时介导过敏性症状释放的变应原特异性IgE。因此，使用来自天然来源的变应原的变态反应疫苗接种存在内在副作用的风险，其对患者而言最严重的后果是威胁生命。

可以将防止发生这一问题的手段分成三类。实践中，通常合并来自一类以上的措施。第一类措施包括在延长时间期限内给予几个小剂量以便达到实质性的累积剂量。第二类措施包括通过将变应原引入凝胶物质诸如氢氧化铝对变应原进行物理修饰。氢氧化铝制剂具有佐剂作用和缓慢变应原释放的长效作用，从而降低活性变应原成分的组织浓度。第三类措施包括对变应原进行化学修饰，目的在于减少变应原性，即IgE结合。

常规的特异性变态反应疫苗接种为过敏性疾病的病因治疗。它可以干扰基本的免疫机制，从而对患者的免疫状态产生持续的改善。因此，特异性变态反应疫苗接种的保护作用可以延长超过治疗期限，这与症状性的药物治疗形成对比。某些接受这种治疗的患者得到治愈，且此外，大部分患者经历了所发生疾病严重程度和症状的缓解，或至少使疾病恶化得以抑制。因此，特异性变态反应疫苗接种在降低花粉热发展成哮喘的风险和降低发生新的易感性的风险中具有预防作用。

成功变态反应疫苗接种潜在的免疫学机理尚未得到详细了解。特异性免疫反应，诸如产生针对特定病原体的抗体，称作适应性免疫反应。该反应可以区分于对病原体而言为非特异性反应的先天性免疫反应。变态反应疫苗旨在针对适应性免疫反应，包括具有抗原特异性的细胞和分子，诸如T-细胞和产生抗体的B-细胞。B-细胞在无来自具有相应特异性的T-细胞辅助下不能发育成熟为产生抗体的细胞。参与刺激过敏性免疫反应的T-细胞主要为Th2类型。已经提出在Th1与Th2细胞之间建立新的平衡对特异性变态反应疫苗接种的免疫学机理而言是有益的和关键的。这是因Th2细胞减少，从Th2转移至Th1细胞，还是Th1细胞的增量调节引起是有争论的。近来，已经提出调节T-细胞对变态反应疫苗接种机理而言是重要的。根据这一模型，调节T-细胞，即Th3或Tr1细胞，减量调节具有相应抗原特异性的Th1和Th2细胞。尽管存在这些不明确的情况，但是一般认为活性疫苗必需具有刺激变应原特异性T-细胞优选TH1细胞的能力。

尽管其存在优点，但是特异性变态反应疫苗接种并未广泛应用，主要是两个原因。一个原因在于与包含在几个月内反复疫苗接种尤其是注射的传统疫苗接种程序相关的不便利性。更重要的是，另一个原因在于过敏性副反应的风险。使用单一或几次高剂量免疫接种可有效进行对感染因子的普通疫苗接种。然而，这一策略不能用于变态反应疫苗接种，因为已经发生了病理性免疫反应。

由此使用在延长时间期限内施用的多次皮下免疫接种进行常规的特异性变态反应疫苗接种。将该过程分成两个阶段，增加剂量期和维持期。在增加剂量期中，从最小剂量开始通常在16-周期限内施用增加的剂量。当达到推荐的维持剂量时，将该剂量施用维持期，一般每6周进行一次注射。在每次注射后，患者必须处于医疗护理下保持30分钟，因为存在过敏性副反应的风险，其在原则上极为罕见但可能威胁生命。此外，临床诊所应配备设备以便支持急救治疗。毫无疑问基于不同给药途径的疫苗可以消除或降低目前基于皮下的疫苗内在的过敏性副反应的风险并且可以有利于更广泛应用，甚至能够在家中自我接种疫苗。

已经尝试改善疫苗以用于特异性变态反应疫苗接种超过30年并且包括多种手段。几种手段通过改变IgE反应性针对变应原自身。其它手段针对给药途径。

能够通过口腔接近免疫系统并且舌下给予变应原为已知的给药途径。可以通过将疫苗制品置于舌下并且使其保持在那里较短时间期限例如30-60秒来进行给药。

使用口腔粘膜途径的变态反应疫苗常规由至多每日给予变应原溶液组成。相比之下，给予的治疗性(累积)维持剂量超过相当的皮下剂量的维持达5-500倍。

对能够呈递选择的蛋白质化合物(例如变应原或抗原)用于制备疫苗的改进的生物载体存在需求。

发明概述

本发明涉及用作包含表面展示一种或多种异源蛋白质化合物的生物载体的药物的药物组合物，包含：

a.一种或多种非致病菌株的细胞；和

b.通过双官能交联剂与所述细胞表面上的易接近的化学实体共价结合的一种或多种蛋白质化合物；

其中所述的细胞不包含编码所述一种或多种蛋白质化合物的转基因核酸分子，并且所述的双官能交联剂与所述细胞的氨基通过希夫碱键合，且所述的蛋白质化合物和所述的交联剂对所述细胞而言为异源来源的。优选所述的药物用于治疗或预防性治疗动物或人患者。

在一个优选的实施方案中，所述的双官能交联剂选自戊二醛、聚氮杂环丁烷和低聚甲醛。

此外，组合物的生物载体可以包含非遗传修饰的菌株或遗传修饰的菌株或其组合的细胞。在一个优选的实施方案中，组合物中的菌株为选自乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、N群链球菌属、肠球菌属、双歧杆菌属、非致病性葡萄球菌属和非致病性芽孢杆菌属的细菌属中的成员。

在一个实施方案中，所述的一种或多种蛋白质化合物为来自动物或人病原体的抗原或其变体。或者，一种或多种蛋白质化合物为变应原，动物或人癌抗原或动物或人来源的自体抗原或其变体。

本发明的组合物还可以包含双官能交联剂和/或间隔物化合物。包含双官能交联剂或间隔物的组合物中每个细胞结合的蛋白质化合物分子的数量可以在1-约100,000的范围。在无间隔物存在下，每个细胞结合的蛋白质化合物分子的数量可以在1-约10,000的范围。该组合物还可以包含在包囊的制剂中。

可以将该组合物作为药物使用。特别地，该组合物可以用于制备预防和/或治疗选自下列的疾病的药物：动物或人患者的感染性疾病、癌症、变态反应和自身免疫性疾病。因此，本发明的组合物可以用于预防和/或治疗动物或人患者的疾病或变态反应，对患者给予有效剂量的所述组合物。

本发明进一步提供了制备本发明药物组合物的方法，该组合物包含表面展示一种或多种异源蛋白质化合物的生物载体，所述的方法包括下列步骤：制备混合物，其包含：i)一种或多种菌株的细胞；和ii)一种或多种异源蛋白质化合物；和iii)异源双官能交联剂；并且温育所述的混合物以便形成所述的生物载体，其中所述的双官能交联剂与所述细胞的氨基通过希夫碱键合；和从所述的混合物中分离所述的生物载体；其中所述的细胞不含编码所述一种或多种蛋白质化合物的转基因核酸分子。在一个优选的实施方案中，在低于0℃的温度下，优选在-1℃到-30℃，最优选在-20℃的温度下温育所述的混合物。

按照本发明的方法，所述的生物载体可以包含非遗传修饰的菌株或遗传修饰的菌株的细胞。此外，优选使用这样的菌株实施本发明，该菌株为选自乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、N群链球菌属、肠球菌属、双歧杆菌属、非致病性葡萄球菌属和非致病性芽孢杆菌属的细菌属中的成员。

按照本发明的方法，所述的一种或多种蛋白质化合物可为来自动物或人病原体的抗原或其变体。在一个备选实施方案中，一种或多种蛋白质化合物可以为变应原或其变体；或所述的一种或多种化合物可以为动物或人癌抗原及其变体或者自体抗原或其变体。

在本发明方法的另一个实施方案中，所述的混合物可以进一步包含双官能交联剂和/或间隔物化合物。该方法可以进一步包含包囊包含所述生物载体的组合物的步骤。

本发明的描述

I.附图简述

附图1.使用1ug/ml或2ug/mlβ-半乳糖苷酶与乳杆菌属的化学交联。在包含10¹⁰个细胞的交联反应混合物的细胞级分或上清液级分中检测到的β-半乳糖苷酶的活性的量。

附图2.阿拉伯糖异构酶与乳杆菌属的化学交联。在包含10¹⁰个细胞的交联反应混合物的细胞级分或上清液级分中检测到的阿拉伯糖异构酶的活性的量。使用三角形符号描绘表面交联酶并且使用正方形符号描绘酶的总量。

附图3.使用脱乙酰壳多糖作为增强剂分子使β-半乳糖苷酶与乳杆菌属化学交联。

附图4.如实施例11中所述使用戊二醛使Betv1蛋白与乳杆菌属细胞化学交联。A图显示已经使用戊二醛交联的沉淀物质的相差图。B图显示来自Betv1蛋白和乳杆菌属细胞的混合物的细胞，其中未加入戊二醛。每图的右图显示在较高放大倍数下观测的从在左图中分析的物质中选择的细胞。

附图5.使用戊二醛与乳杆菌属细胞交联的Betv1的表面分布。A和B图显示如实施例12中所述制备的颗粒物质中的细胞照片。A图显示来源于存在Betv1蛋白的交联反应的细胞；而B图显示来源于不存在Betv1蛋白的阴性对照反应的细胞。如实施例12中所述使用来自家兔的抗-Betv1一抗和Cy-3标记的抗-家兔二抗对Betv1蛋白进行检测。左侧的图为相差图像，而右侧的图为使用相同显微镜和照相机的设定值对相同细胞观测的荧光图像(用于激发和发射光的滤波器极限值分别为545-575nm和610-680nm)。

附图6.SLIT处理、免疫接种和随后体外再刺激后的脾细胞增殖。4组小鼠每天一次接受下列物质，持续3周：BetV-Lb：包含与嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)X37偶联的BetV1的疫苗缀合物；Lb：未处理的嗜酸乳杆菌X37；BetV1 2.5ug：纯化的BetV1蛋白2.5ug/天；BetV1 5ug：纯化的BetV1蛋白5ug/天；缓冲液：接受缓冲液的阴性对照组。

附图7.使用未处理的乳杆菌属，LacS缀合的乳杆菌属或单独的LacS蛋白的体外树突细胞刺激。LX37：未处理的嗜酸乳杆菌X37；LX37+lacS+glut：使用戊二醛与乳杆菌属表面偶联的B-半乳糖苷酶；

LacS：单独的蛋白质LacS。

II.术语的定义

变应原：为引起超敏反应或变态反应的抗原。

抗原：能够诱导免疫反应的任意蛋白质物质。

抗原变体：任意的抗原，其中氨基酸组成与天然抗原相比已经改变。

API：活性药物组分。

交联剂：包含两个反应基团，由此提供共价连接两个靶基团的方式的化学试剂。在同双官能交联剂中，反应基团为相同的，在类似基团之间形成共价键。在异双官能交联剂中，反应基团具有不同的化学特性，从而在不同官能团之间形成交联。将异源双官能交联剂定义为具有对其所连接的细胞而言不同来源(即非天然的)的化学试剂。

DC：树突细胞

FDA：食品与药品监督管理局

GM：遗传修饰的

GMO：遗传修饰的生物体

GLA：戊二醛

将异源蛋白质化合物定义为包含蛋白质的化合物，它具有与通过共价或非共价键与其表面结合或交联的细胞不同的来源(即非天然的)。

M9缓冲液：包含0.6％Na₂HPO₄、0.3％KH₂PO₄、0.5％NaCl、0.025％MgSO₄的水溶液。

MRS：适合于乳杆菌属培养的培养基

ONPG：邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷

PCR：聚合酶链式反应

间隔物：促进交联反应的带有多个反应基团的分子。用作细胞表面与靶蛋白之间的桥。

靶蛋白：(有待)在细菌细胞表面上展示的蛋白质化合物

转基因核酸分子：导入和稳定整合入宿主生物体基因组(包含质粒、附加型和染色体DNA)的核酸分子，其中所述的DNA包含蛋白质编码序列，并且其中所述的转基因核酸分子在自然界中不存在于宿主生物体中，但通过遗传修饰技术被导入宿主细胞。

室温：15-25℃，优选18℃。

III详细描述

本发明提供了生物载体，其特征在于一种或多种蛋白质化合物的表面展示，其特性具有在疫苗递送、完整细胞生物吸收剂、生物过滤剂、微生物催化剂和诊断工具领域中的具体应用。本发明在于认识到治疗有效的安全和公众可接受的疫苗应包含下列成分和特性：

a)优选能够定位并且暂时附着到动物或人(患者)粘膜中的免疫活性细胞的生物非致病性载体；

b)其中所述的载体提供一种或多种异源抗原的表面展示，所述的异源抗原能够呈递给免疫活性细胞，从而产生特异性免疫应答；和

c)能够作为佐剂或免疫调节剂刺激免疫细胞且由此刺激整个免疫系统并且优选诱导所述患者的宿主细胞分泌所需细胞因子；和

d)其中包含具有一种或多种表面展示的异源抗原的载体的疫苗为在生产上低廉和简便的且避免了合成复杂连接物例如细菌壁胞壁质前体的需求。

非致病性细菌提供了特性a)和c)，由此位于这些细菌表面上的特异性蛋白能够使其定位并且结合粘膜中的靶细胞，并且通过细菌-细胞通讯启动各种反应，例如细胞因子和粘蛋白产生(Christensen H.R.等2002，J Immunology 168：171-8，Mack D.R.等2003 Gut 52：827-33)。细菌细胞向粘膜上的定位可以如Adlerberth I.等，1996 ApplEnviron Microbiol 7：2244-51所述通过与哺乳动物细胞的甘露糖敏感性结合来介导。因此，本发明使用了非致病性菌株，其表面成分仍然存在并且由此可以支持表面定位的抗原的有效呈递。本发明通过提供表面结合一种或多种异源蛋白质化合物的非致病性细菌细胞满足了b)的需求。异源化合物可以与细菌细胞表面亲和性结合或吸附在其上或使用偶联试剂使它们共价结合。分离自天然来源或通过化学方式合成或使用重组DNA技术生产的蛋白质化合物可以与本发明的细菌表面偶联。与本发明细菌表面结合并且在其上展示的异源蛋白质化合物并不限于可以由细菌细胞自身合成和分泌的化合物。所述的异源蛋白质化合物可以包含翻译后修饰，其合成依赖于未在本发明细菌中发现的催化步骤。在此本发明的一个显著优点在于在细菌表面上展示的异源蛋白质化合物可以为其组成和结构可为具体应用定制的化合物，但不限于属于展示它的细菌细胞生物合成能力内的化合物。本发明的方法可以提供蛋白质化合物的紧密填充的表面展示，其用于提高它们在抗原呈递过程中的免疫原性。因为可以精确测定在本发明给定细菌样品中的表面结合的蛋白质化合物的量，所以这有利于准确控制作为治疗制品的抗原剂量，这是本发明的另一个显著的优点。

与已知基于GM细菌对异源抗原蛋白的表面展示的技术相比，并未将本发明一个实施方案中的非致病性菌株分类为遗传修饰的，因为异源表面展示的蛋白质化合物并非由细胞自身重组表达。在一个备选的实施方案中，一种或多种异源蛋白质化合物结合的非致病性菌株自身为遗传修饰的。

适合于实施本发明的非致病性菌株包括革兰氏阳性菌株，优选选自乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、N群链球菌属、肠球菌属、双歧杆菌属、非致病性葡萄球菌属、非致病性芽孢杆菌细菌属的物种。更优选所述的非致病性菌株选自如下物种，该物种选自乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、N群链球菌属、肠球菌属、双歧杆菌属、非致病性葡萄球菌属的细菌属。甚至更优选非致病性菌株选自如下物种，该物种选自乳杆菌属和双歧杆菌属的细菌属。更具体地说，优选的非致病性菌株选自如下物种，该物种类选自下列细菌物种：耐酸乳杆菌，Lactobacillus acidipiscis，嗜酸乳杆菌，敏捷乳杆菌，Lactobacillus algidus，消化乳杆菌，Lactobacillus amylolyticus，嗜淀粉乳杆菌，食淀粉乳杆菌，动物乳杆菌，Lactobacillusarizonensis，鸟乳杆菌，双发酵乳杆菌，短乳杆菌，布氏乳杆菌，干酪乳杆菌，Lactobacillus coelohominis，丘状菌落乳杆菌，棒状乳杆菌棒状亚种，棒状乳杆菌极曲亚种，卷曲乳杆菌，弯曲乳杆菌，Lactobacillus cypricasei，德氏乳杆菌保加利亚亚种，德氏乳杆菌德氏亚种，德氏乳杆菌乳亚种，Lactobacillus durianus，Lactobacillus equi，香肠乳杆菌，Lactobacillus ferintoshensis，发酵乳杆菌，Lactobacillus fornicalis，食果糖乳杆菌，Lactobacillus frumenti，Lactobacillus fuchuensis，鸡乳杆菌，加氏乳杆菌，草乳杆菌，哈氏乳杆菌，瑞士乳杆菌，瑞士乳杆菌jugurti亚种，异型腐酒乳杆菌，希氏乳杆菌，同型腐酒乳杆菌，肠乳杆菌，Lactobacillus japonicus，詹氏乳杆菌，约氏乳杆菌，高加索酸奶乳杆菌，Lactobacillus kimchii，Lactobacillus kunkeei，Lactobacillus leichmannii，Lactobacillus letivazi，林氏乳杆菌，坏发酵乳杆菌，马里乳杆菌，麦芽香乳杆菌，Lactobacillusmanihotivorans，Lactobacillus mindensis，Lactobacillusmucosae，鼠乳杆菌，Lactobacillus nagelii，口乳杆菌，面包乳杆菌，Lactobacillus pantheri，类布氏乳杆菌，类干酪乳杆菌类干酪亚种，类干酪乳杆菌subsp.pseudoplantarum，类干酪乳杆菌坚韧亚种，类高加索酸奶乳杆菌，类消化乳杆菌，类植物乳杆菌，戊糖乳杆菌，Lactobacillus perolens，植物乳杆菌，桥乳杆菌，Lactobacillus psittaci，路氏乳杆菌，鼠李糖乳杆菌，瘤胃乳杆菌，清酒乳杆菌，唾液乳杆菌，唾液乳杆菌水杨苷亚种，唾液乳杆菌唾液亚种，旧金山乳杆菌，沙氏乳杆菌，猪双臼乳杆菌，嗜热乳杆菌，Lactobacillus thermotolerans，牛痘乳杆菌，阴道乳杆菌，Lactobacillus  versmoldensis，犊乳杆菌，Lactobacillusvermiforme，玉米乳杆菌，青春双歧杆菌，Bifidobacteriumaerophilum，角双歧杆菌，动物双歧杆菌，星状双歧杆菌，双歧双歧杆菌，牛双歧杆菌，短双歧杆菌，链状双歧杆菌，豚双歧杆菌，棒状双歧杆菌，兔双歧杆菌，齿双歧杆菌，高卢双歧杆菌，鸡胚双歧杆菌，蜜蜂双歧杆菌，长双歧杆菌，长双歧杆菌长亚种，长双歧杆菌subsp.infantis，长双歧杆菌subsp.suis，大双歧杆菌，瘤胃双歧杆菌，最小双歧杆菌，假小链双歧杆菌，假长双歧杆菌，假长双歧杆菌球形亚种，假长双歧杆菌假长亚种，Bifidobacteriumpsychroaerophilum，小鸡双歧杆菌，反刍双歧杆菌，波伦亚双歧杆菌，Bifidobacterium scardovii，纤细双歧杆菌，Bifidobacteriumthermoacidophilum，Bifidobacterium thermoacidophilum subsp.suis，嗜热双歧杆菌，Bifidobacterium urinalis。

结合到非致病性细菌并且在其表面上展示的一种或多种蛋白质化合物可以选自广泛的化合物，其中所述的蛋白质可以进一步包含碳水化合物、脂质或其它翻译后添加的修饰。优选化合物为取代的，即翻译后修饰的，或未被取代的蛋白质或肽，其中所述的化合物能够诱导动物或人体液或细胞应答的发生，例如抗原、变应原、类变应原、肽、蛋白质、半抗原、糖蛋白、肽核酸(PNA，一种合成的遗传模拟物)和病毒或细菌材料及其类似物或衍生物。这类修饰可以通过化学修饰或合成修饰进行，例如PEG化(PEG＝聚乙二醇)、生物素化、脱氨基、马来化、一个或多个氨基酸的置换，通过交联、通过糖基化或通过其它重组或合成技术。该术语还旨在包括天然存在的突变、同种型和逆反向(retroinverse)类似物。更优选所述的化合物能够诱导动物或人的特异性抗体和/或特异性T-细胞应答发生。或者，所述的化合物能够诱导动物或人细胞毒性T-细胞应答的发生或该化合物能够诱导变态反应的发生。此外，化合物能够与预存在的抗体或T-细胞反应或为能够结合肥大细胞上的IgE抗体或介导预先致敏的哺乳动物I型变态反应的化合物。在一个优选的实施方案中，蛋白质化合物能够诱导对动物或人的一种或多种感染因子或变应原的免疫性发生。或者，所述的蛋白质化合物能够诱导对动物或人的自身免疫性疾病的免疫性的发生。在另一个实施方案中，所述的蛋白质化合物或其变体为作为动物或人的癌抗原起作用的化合物。

诱导动物或人免疫性发生的蛋白质化合物可以来源于下列来源中的一种或多种或为其变体：细菌、病毒、真菌、原生动物和朊病毒，例如选自下组：

抗原来源

痘病毒科，疱疹病毒科，腺病毒科，微小病毒科，乳多空病毒科，肝DNA病毒科，小RNA病毒科，杯状病毒科，呼肠孤病毒科，披盖病毒科，黄病毒科，沙粒病毒科，逆转录病毒科，本扬病毒科，正粘病毒科，副粘病毒科，弹状病毒科，虫媒病毒，肿瘤病毒，未分类的病毒，例如选自肝炎病毒、星状病毒和环曲病毒，芽孢杆菌属，分枝杆菌属，疟虫属，朊病毒(例如导致克-雅病或变型)，霍乱，志贺氏菌属，埃希氏菌属，沙门氏菌属，棒杆菌属，疏螺旋体属，嗜血杆菌属，盘尾属，博德特氏菌属，肺炎球菌，裂体吸虫属，梭菌属，衣原体属，链球菌属，葡萄球菌属，弯曲杆菌属，军团菌属，弓形体，李斯特氏菌属，弧菌属，诺卡氏菌属，梭菌属，奈瑟氏菌属，念珠菌属，毛滴虫属，加德纳菌属，密螺旋体属，嗜血杆菌属，克雷伯氏菌属，肠杆菌属，变形菌属，假单胞菌属，沙雷氏菌属，钩端螺旋体属，表皮癣菌属，小孢子菌属，发癣菌属，支顶孢属，曲霉属，念珠菌属，镰孢霉属，帚霉属，Onychocola，小柱孢属，组织胞浆菌属，隐球菌属，芽生菌属，球孢子菌属，类球孢子菌属接合菌，孢子丝菌属，博德特氏菌属，布氏杆菌属，巴斯德氏菌属，立克次氏体，巴尔通氏体属，耶尔森氏菌属，贾第虫属，红球菌属，耶尔森氏菌属和弓形体属。

用于治疗或缓解变态反应或治疗或预防性变态反应疫苗接种的蛋白质化合物可以来源于下列来源中的一种或多种：

变应原来源

术语″变应原″意指任意天然存在的蛋白质或蛋白质混合物，据报导它们反复接触个体时诱导过敏性，即IgE介导的反应。就本发明的目的而言，变应原可以来源于植物、宠物、农场动物、昆虫、蜘蛛类节肢动物和食物，包括来自白桦和分类学相关的树、日本雪松树、橄榄树、豚草、杂草或草的花粉、螫刺昆虫、蚊/蠓、蟑螂、尘螨类、户内真菌、户外霉菌、牛、猫、狗、马、啮齿动物、花生、坚果、水果、奶、大豆、小麦、蛋、鱼和有壳水生动物。特别地，变应原适合地可为特别来源于树、草、草药、真菌、房尘螨、仓库螨、蟑螂和动物毛发和皮屑的可吸入变应原。来自树、草和草药的重要花粉变应原诸如来源于下列分类学目：山毛榉目(Fagales)、Oleales和松目(Pinales)，特别包括：白桦(桦属(Betula))、桤木(桤木属(Alnus))、榛子(榛属(Corylus))、鹅耳枥(鹅耳枥属(Carpinus))和橄榄(木犀榄属(Olea))；Poale目，特别包括黑麦草属(Lolium)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)和黑麦属(Secale)的草；Asterales和Rosales、Urticales目，特别包括豚草属(Ambrosia)、蒿属(Artemisia)和墙草属(Parietaria)的草药。来自真菌的重要的可吸入变应原特别为来自链格孢属(Alternaria)和分支孢子菌属(Cladosporium)这类属。其它重要的可吸入变应原来自表皮螨属(Dermatophagoides)的房尘螨和Blomia、Euroglyphus和Lepidoglyphus属的仓库螨的螨；来自蟑螂和来自哺乳动物，诸如猫、狗、马和啮齿动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠和家兔。此外，本发明的重组变应原可以为毒液变应原，包括来源于螫刺或刺咬昆虫这类，诸如来自分类学目的膜翅目(Hymenoptera)，包括蜜蜂(蜜蜂(Apidae)总科)、黄蜂(胡蜂(Vespidea)总科)和蚂蚁(蚁(Formicoidae)总科)。

特异性变应原成分包括：例如山毛榉目的Betv1(B.verrucosa，白桦)，Alng1(欧洲桤木(Alnus glutinosa)，桤木)、Cora1(欧洲榛(Corylus avelana)，榛子)和Carb1(欧洲鹅耳枥(Carpinusbetulus)，鹅耳枥)。其它为Cryj1(松目)、Amba1和2，Art v1(Asterales)、Parj 1(Urticales)、Ole e1(Oleales)、Ave e1、Cyn d1、Dac g1、Fes p1、Hol l1、Lol p1和5，Pas n1、Phlp1和5、Poa p1、2和5、Sec c1和5和Sor h1(各种草花粉)、Alt al和Cla h1(真菌)、Der f1和2、Der p1和2、Der m1(分别为房尘螨、美洲家刺皮螨(D.farinae)、欧洲家刺皮螨(D.pteronyssinus)和D.microceras)、Lep d1和2和Blo l1和2、Eur m1和2、Gly d1和2(Lepidoglyphus destructor；热带无爪螨(Blomia Tropicalis)和Glyphagus domesticus仓库螨和Euroglyphus maynei)、Bla g1和2，Per a1(蟑螂，分别为德国小蠊(Blatella germanica)和美洲非蠊(Periplaneta americana))、Feld1(猫)、Can f1(狗)、Equ c1，2和3(马)、Apis m1和2(蜜蜂)、Ves v1、2和5、Pol a1、2和5(所有的黄蜂)和Sol i1、2、3和4(火蚁)。

变应原可以为变应原提取物、分离纯化的变应原及其变体或片段的形式。

还可以通过重组基因表达技术获得变应原，即重组变应原及其变体或片段或其突变体和片段。例如，重组变应原可以为重组Betv1、Fel d1、Phl p1或5、Lol p1或5、Sor h1、Cyn d1、Dag g1和5、Der f或p1或2、Amb a1和2、Cry j1和2、Ves v1、2和5或Dol m1、2和5、Api m1或蟑螂Bla g1和2、Per a1。其组成被修饰的Bet v1突变体和可能适合于置换的Betv1中的氨基酸描述在例如WO99/47680、WO02040676、WO03/096869中。

本文所用的表达方式″变应原提取物″意指通过如″Allergenicextracts″，H.lpsen等，chapter20-Allergy，principle andpractise(Ed.S.Manning)1993，Mosby-Year Book，St.Louis中所总述提取生物变应原来源物质获得的提取物。可以通过水性提取水溶性物质，随后进行纯化步骤，如过滤而获得溶液即提取物来获得这类提取物。然后可对提取物进行进一步纯化和/或加工，如冷冻干燥，从而基本上除去所有的水。一般而言，变应原提取物包含蛋白质和其它分子的混合物。通常将变应原蛋白质分类为主要变应原、中间变应原、次要变应原或无分类。变应原提取物一般包含主要和次要变应原。主要变应原一般占平均变应原提取物的约5-15％，更通常的是约占10％。本文涉及的变应原提取物的量意指这类变应原提取物的干物质含量。

优选干物质的水含量不超过10％重量，更优选5％重量。

生物变应原来源物质可以包含污染物质，诸如对于变应原花粉来源物质为外来花粉及植物和花碎片。

应使污染的程度降至最低限度。优选污染物的含量不应超过生物来源物质的10％(WTW)。

通常变应原提取物包含至少占变应原提取物干物质含量10％的蛋白质，正如在标准蛋白质测定诸如BCA或Lowry中测定的，并且剩余部分由其它″非-蛋白质物质″组成，其可以为诸如来源于生物变应原来源的脂质、碳水化合物或结合水这类成分。

可以配制变应原提取物并且以可通过在低于800微巴的压力下冷冻干燥液体变应原提取物持续至100小时以除去水而获得的冷冻干燥物质形式储存，在变应原提取领域中，尚无国际上公认的标准化方法。存在许多不同的提取物浓度即生物效能单位。所用的方法和所用的单位通常衡量变应原含量和生物活性。其实例为SQ-单位(标准化质量单位)、BAU(生物变应原单位)、BU(生物单位)、UM(质量单位)、IU(国际单位)和IR(反应性指数)。因此，如果使用非本文披露来源的提取物，那么需要将它们对本文披露的提取物标准化以便测定其以SQ单位或任意上述单位计的效能。在″Allergenic extracts″，H.lpsen等，chapter 20-Allergy，principle and practise(Ed.S.Manning)1993，Mosby-Year Book，St.Louis和Lowenstein H.(1980)Arb PaulEhrlich Inst 75：122中涉及了该主题。给定提取物的生物效能即体内变应原活性取决于许多因素，最重要的是提取物中主要变应原的含量，它随生物来源物质的组成的不同而改变。

用于获得所需生物效能的以克计的变应原提取物的量随所述提取物的类型改变，并且就指定类型的提取物而言，变应原提取物的量在各批量之间随提取物实际生物效能的不同而改变。

就指定批次的提取物而言，可以使用下列操作步骤测定用于获得所需生物效能的以克计的变应原提取物的量：

a)使用一种或多种免疫学体内试验测定不同量参比提取物的生物效能，以便建立生物效能与参比提取物量之间的相关性。所述免疫学体内试验的实例为皮肤单刺试验(SPT)、结膜激发试验(CPT)、用变应原进行支气管攻击(BCA)和监测一种或多种过敏症状的各种临床试验，例如，参见Haugaard等，J Allergy Clin Immunol，Vol.91，No.3，pp 709-722，1993年3月。

b)基于建立的生物效能与参比提取物之间的相关性，对如下因素的平衡作适当考虑，选择用于本发明剂型的一种或多种相关剂量的生物效能：i)治疗或缓解变态反应的症状的作用；ii)在免疫体内试验中记录的副作用；和iii)个体彼此之间i)和ii)的变异性。进行平衡以便获得最大的适当治疗作用，而不会经历不可接受水平的副作用。使各因素平衡的方式为本领域技术人员众所周知。

可以以任何可利用的生物效能单位表示所发现的一种或多种相关剂量的生物效能，诸如SQ单位、BAU、IR单位、IU，见上文。

c)由参比提取物制备一种或多种生物效能参比标准提取物，并且如果使用，那么基于对一种或多种相关剂量指定的生物效能单位值计算该参比标准提取物的生物效能单位值，例如，这类用于BAU的标准品可以如下所述获自FDA。

d)就每种提取物类型的参比标准提取物而言，选择用于评价提取物生物效能的多种参数。这类评价参数的实例为总变应原活性、确定的主要变应原的量和提取物的总体分子组成。可以使用体外竞争性免疫测定，诸如ELISA和MagicLite发光免疫测定(LIA)，应用针对使用标准方法获得的提取物而产生的标准化抗体混合物，例如在小鼠或家兔中产生的抗体或过敏性患者血清库，测定总变应原活性。例如，可以通过火箭免疫电泳(RIE)对主要变应原的含量进行定量并且与参比标准品进行比较。例如，可以使用交叉免疫电泳(CIE)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检验总体分子组成。

e)就指定批次的未知生物效能的提取物(测试提取物)而言，用于获得所需生物效能水平(用于本发明固体剂型的有效剂量)的提取物量可以如下测定：就选择的每一评价参数而言，使用如上所述的相关测定方法将测试提取物与参比标准提取物进行比较并且基于测定结果计算具有所需生物效能的提取物的量。

用于变态反应治疗或治疗性或预防性变态反应疫苗接种的变应原的有效量应指以单剂量或增加剂量使用一次或反复使用时导致例如产生适应性免疫反应且由此用作使过敏性患者脱敏的方式的剂量。优选该术语应指在按照治疗方案反复给予所述固体剂型后(在几个月内从几次施用到至少每天施用一次的期限内)诱导适应性免疫反应所必需的每种剂型中变应原的量。优选脱敏包括在给予所述剂量时缓解变态反应症状。临床变态反应症状包括鼻炎、结膜炎、哮喘、荨麻疹、湿疹，包括皮肤、眼部、鼻部、上下气道的反应，常见症状诸如眼和鼻发红和瘙痒、瘙痒和流鼻涕、咳嗽、喘鸣、呼吸急促、瘙痒和组织肿胀。

在一个实施方案中，变应原的剂量可以为约0.15ug-10mg/剂量的变应原提取物含量，更优选变应原提取物含量约为0.5ug-5mg/剂量，更优选变应原提取物含量约为0.5ug-3.75mg/剂量，更优选变应原提取物含量约为2.5ug-3.75mg/剂量，更优选变应原提取物含量约为2.5ug-2.5mg/剂量，更优选变应原提取物含量约为25ug-2.5mg/剂量，更优选约为25ug-1.25mg/剂量，甚至更优选约25ug-1mg/剂量，最优选约25ug-0.75mg/剂量。

在另一个实施方案中，变应原的剂量具有约0.015ug-1mg/剂量的单一变应原含量，更优选约0.05ug-500ug/剂量，更优选约0.05ug-375ug/剂量，更优选约0.25ug-375ug/剂量，更优选约0.25ug-250ug/剂量，更优选约2.5ug-250ug/剂量，更优选约2.5ug-125ug/剂量，甚至更优选约2.5ug-100ug/剂量，最优选约2.5ug-75ug/剂量。

在另一个实施方案中，变应原的剂量具有约0.015ug-1mg/剂型的单一变应原含量，更优选约0.05ug-500ug/剂型，更优选约0.05ug-375ug/剂型，更优选约0.25ug-375ug/剂型，更优选约0.25ug-250ug/剂型，更优选约2.5ug-250ug/剂型，更优选约2.5ug-125ug/剂型，甚至更优选约2.5ug-100ug/剂型，最优选约2.5ug-75ug/剂型。

蛋白质与本发明生物载体的表面-偶联

一种或多种蛋白质化合物通过非共价或共价键与非致病菌表面结合。本发明进一步披露了使用能够通过共价键连接两种或多种分子的化学交联剂使所述一种或多种蛋白质化合物与非致病性细菌细胞结合的方法。一般而言，化学交联试剂包含与蛋白质或其它分子上最常见为胺类或硫氢基的特异性官能基的反应端。适合于实施本发明的交联剂的实例包括戊二醛、聚氮杂环丁烷和低聚甲醛。实施例1、2、6和7中披露了双官能交联剂戊二醛在蛋白质β-半乳糖苷酶与植物乳杆菌(植物乳杆菌)的细胞表面化学交联中的应用。

或者，使用催化剂以酶促方式催化一种或多种蛋白质化合物与非致病菌表面之间的共价键，所述的催化剂选自：转移酶，例如转谷氨酰胺酶(该酶按照International Union of Biochemistry andMolecular Biology的建议(1992)分类在酶分类号E.C.2下)；氧化还原酶，例如漆酶或辣根过氧化物酶(该酶分类在酶分类号E.C.1下)；肽连接酶(该酶分类在酶分类号E.C.6下)；或水解酶，例如转肽酶、羧肽酶或内肽酶(该酶分类在酶分类号E.C.3下)。实施例5中披露了转谷氨酰胺酶在蛋白质β-半乳糖苷酶与植物乳杆菌的细胞表面共价连接中的应用。

或者，如实施例4中所例示，可以通过较弱的非特异性键以非共价方式使一种或多种蛋白质化合物与非致病菌表面结合。

例如，可以通过改变待偶联的细胞与蛋白质之比，pH，缓冲剂的离子强度和反应混合物的温度，调节一种或多种蛋白质化合物与非致病菌表面化学或催化交联或结合的反应条件，以改变每个细胞结合的蛋白质化合物的分子数目。因此，在本发明的一个实施方案中，交联反应在低温下进行，优选在低于0℃的温度下进行，更优选在-1℃到-20℃，例如-20℃下进行，其中低温令人意外地显示出导致较高数量的蛋白质分子与细菌细胞表面共价结合(参见实施例9-12)。

还可以通过如实施例3和8中所披露的在反应混合物中包括间隔物分子提高结合的蛋白质化合物的分子数目。本发明的具体优点之一涉及可以在本发明细菌细胞表面上结合和展示的蛋白质化合物分子的数量和密度。正如实施例1和3中例示的，蛋白质化合物分子可以与细菌表面上的化学实体直接交联或通过多价间隔物间接交联，由此结合的分子数目并不限于细菌细胞可以在体内在其细胞表面上结合的天然蛋白质分子的数量。

异源蛋白质化合物与本发明非致病性细菌细胞表面交联的键为细菌细胞表面上易接近的化学实体与蛋白质化合物末端或内部取代基之间的共价键。异源蛋白质化合物与所述易接近实体之间的交联可以进一步包含异源双官能交联剂，其中所述的交联剂为交联产物的整合成分。本发明的细菌细胞具有外表面，它包含可以通过化学方式接近并且异源蛋白质化合物可以交联的壁。更具体地说，本发明细菌细胞表面上易于通过化学方式接近的实体为包含细胞壁或外细胞膜的细菌细胞外膜的成分，其中所述的实体直接接触存在于细胞外部环境中的化合物。

在本发明的一个实施方案中，其中异源蛋白质化合物与细菌细胞表面非共价结合，每个细菌细胞结合的化合物的分子数目至少为100。

本发明疫苗的制备和测试：

本发明提供了制备具有一种或多种表面结合的蛋白质化合物的非致病菌的方法，正如实施例17中所例示的，它可以用于制备疫苗并且进一步测试并且在治疗上应用于动物或人。在第一步中，如实施例例如实施例1或9中所述，通过化学交联技术制备具有与细胞表面共价结合的蛋白质化合物(例如抗原)的非致病菌。或者，如实施例5中所述使用交联酶或如实施例4中所述使用非特异性结合制备细菌与抗原的缀合物。因此，举例而言，生产具有表面结合的蛋白质化合物的细菌细胞，其中结合的化合物为人致病性结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)或流感病毒的特异性抗原或动物病原体大肠杆菌(E.coli)的表面抗原。具有表面结合的大肠杆菌抗原的细菌细胞用于制备应用于家畜猪的兽用疫苗，特别用于预防或治疗小猪的腹泻。制备包含具有特异性表面结合抗原的细菌细胞用于治疗因结核分枝杆菌、流感病毒或兽医大肠杆菌导致的疾病的疫苗的步骤类似并且如下所述。

1.用于表面结合的抗原呈递的非致病菌株的选择

选择已经描述可短暂定殖受体宿主的的多种菌株进行进一步分析。如Christensen H.R.等在2002，J Immunology 168：171-8和实施例18中所述在体外树突细胞模型中分析所述菌株。优选的菌株为特征在于诱导炎性细胞因子包括IL1、IL2、IL6、IL12、TNFα和/或TGFβ的菌株。

2.用于非致病菌上表面结合的呈递的抗原生产

使用表达系统，例如P170表达系统(Madsen S.等1999 MolMicrobiol.32：75-87)在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中以重组方式产生结核分枝杆菌抗原，例如ESAT6(Sorensen A.L.等1999Infect Immun.63：1710-17)。将编码该抗原的基因插入表达载体例如pAMJ297并且转化入乳酸乳球菌菌株，随后如先前所述在发酵罐中的生长培养基中培养(Madsen S.等1999，文献同上)。在发酵过程中由转化的乳酸乳球菌细胞合成并且分泌该抗原。然后例如使用交叉流过滤从乳酸乳球菌细胞培养物中分离上清液。使用传统的蛋白质纯化方法(包括例如凝胶过滤)纯化上清液中存在的结核分枝杆菌抗原。如实施例1中所述将纯化的抗原溶于合适的缓冲液例如M9。通过重组基因表达或通过纯化来自如Tree J.A.等2001 Vaccine 19(25-26)：3444-50所述在鸡蛋中培养的完整病毒的抗原产生流感病毒抗原。

3.用于细菌上表面结合抗原呈递的非致病菌细胞的产生

就制备用于动物实验和兽医应用的情况而言，在为复合培养基例如MRS(Oxoid)的生长培养基中培养步骤1中选择的菌株。在制备用于人体应用的疫苗时，仅基于合成成分的生长培养基用于菌株培养，这是因动物来源的生长培养基成分中可能存在诸如病毒和阮病毒这类感染因子的风险。此外，选择的菌株生长培养基为满足例如FDA颁布的治疗性人体应用的安全指导原则的培养基。在发酵罐中培养后，例如，通过离心或交叉流过滤从生长培养基中分离细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮于新鲜培养基或合适的缓冲液诸如M9缓冲液中。在添加等体积的50％高压灭菌甘油后，可将这些细胞储存在-80℃下至少1年。

4.交联反应和配制

使用实施例1，3-12中所述的方法的一种或多种使步骤3中产生的细菌与步骤2中产生的抗原表面结合。在下列试验中评价所得的表面结合抗原的非致病菌：

使用免疫-检测技术，例如应用对结合抗原具有特异性的荧光标记的抗体的ELISA试验或使用对结合抗原具有特异性的抗体对细菌细胞提取物进行蛋白质印迹分析，测定与细菌细胞表面偶联的抗原的量。此外，在基于显微镜的分析中使用相同抗体分析细菌表面上抗原的分布。将包含表面偶联的抗原的细胞悬浮于合适的缓冲液例如M9缓冲液并且如步骤3中所述储存在-80℃甘油中。可以使用细胞自身。然而，还可以使用新的或众所周知的方法包囊疫苗。包囊必须确保疫苗在储存和在不利环境诸如胃液中输送过程中保持原始特性。此外，包囊应确保疫苗在所需粘膜位置上释放。描述了各种包囊方法并且可以在商业上利用它们对活的或死亡的微生物进行保存，例如参见，http://www.encapdrugdelivery.com(Encap Drug Delivery，UK)。

5.产品在动物模型中的试验

将包含按照步骤4制备和配制的具有表面偶联抗原的细菌的测试疫苗分成包含约10⁸-约10¹¹个细胞的等份。如下给各自包含10只小鼠的4个动物组接种测试疫苗或对照疫苗：2个组接受不同剂量的测试疫苗；1个组接受包含不具有表面偶联抗原的细菌细胞的对照疫苗；并且1个组接受纯化的抗原。通过口服或鼻部或通过鼻空肠管给予疫苗。疫苗方案如下。在第1，2，3，14，15，16，42，43和44天给予剂量。在第0天开始每周取血和粘膜样品，其中第一份血液和粘膜样品构成免疫前血清。在第63天取最终的血液和粘膜样品并且处死小鼠，此后摘除脾并且任选摘除淋巴结。使用标准技术例如ELISA技术分析血液和粘膜的抗原特异性抗体。例如，使用铬释放试验对脾分析抗原特异性细胞毒性T-细胞的存在。

根据上述动物疫苗接种试验有用的测试疫苗表现出如下特性：

-在用包含本发明无表面偶联抗原的细菌细胞的对照疫苗治疗的小鼠中检测不到抗原特异性抗体或抗原特异性细胞毒性T-细胞反应；和

-使用测试疫苗(至少在较高剂量下)治疗的小鼠中抗原特异性抗体和/或抗原特异性细胞毒性T-细胞反应水平高于在使用纯化抗原治疗的小鼠中检测到的水平，其中差异具有统计学显著性。

通过调整抗原浓度，每个细胞可以偶联约1个抗原分子。包含具有1个表面偶联抗原分子的单一细胞的1个剂量确定了剂量下限。预期交联条件的最优化(实施例13)导致每个细胞至少10,000个表面偶联的分子。如果交联反应使每个细胞交联了1个靶蛋白分子，那么10¹²个细胞的1个剂量将包含83ng的交联靶蛋白。因此，本发明的有效化学交联可导致每个细胞交联10,000个靶蛋白分子，从而提供每10¹²个细胞剂量约1mg交联蛋白。双官能交联剂或间隔物更优选其组合的应用能够进一步使可以结合到单一细胞的靶蛋白的分子数目增加至约100,000。

还可以使单剂量中的细胞数量最优化，由此增加单剂量中抗原的总量。细胞数和表面偶联分子的数量确定了剂量上限。

本发明疫苗的配制和给药：

本发明的一个实施方案提供了用于制备药物的药物组合物，该药物包含表面展示一种或多种异源蛋白质化合物的生物载体，所述的药物组合物包括：a)一种或多种非致病菌株的细胞；和b)通过双官能交联剂与所述细胞表面上易于接近的化学实体结合的的一种或多种蛋白质化合物，其中所述的细胞不包含编码所述一种或多种蛋白质化合物的转基因核酸分子，并且所述的双官能交联剂与所述细胞的氨基通过希夫碱共价键合，并且所述的蛋白质化合物和所述的交联剂对所述细胞而言为异源来源的。如果表面展示的蛋白质化合物为抗原并且生物载体为活的或死亡的细菌，那么可以将该组合物自身用作用于任意粘膜给药(包括口腔粘膜、口、鼻、舌下、阴道或肛门给药)的疫苗。

术语″口腔粘膜给药″意指将本发明的药物组合物置于舌下或口腔中任何其它地方以便活性组分接触患者口腔或咽部粘膜，从而获得活性组分的局部或全身作用的给药途径。口腔粘膜给药途径的实例为舌下给药。

术语″舌下给药″意指给药途径，其中将剂型置于舌下以便获得活性组分的局部或全身作用。为了进行该应用，将疫苗配制成溶液，或与保存疫苗原始特性并且提供最佳贮存期限的合适物质一起结晶、干燥或冷冻干燥的物质。不过，还可以使用新的或众所周知的方法包囊疫苗。包囊必须确保疫苗在储存和在不利环境诸如胃液中输送过程中保持原始特性。此外，包囊应确保疫苗在所需粘膜位置上释放。描述了各种包囊方法并且可以在商业上利用它们保存活的或死亡的微生物，例如参见http://www.encapdruqdelivery.com。

可以根据实施例13中所述的方法计算每个微生物细胞上表面偶联的抗原的平均量和每个疫苗接种剂量中非致病菌的数量。

除了粘膜给药外，真皮或皮下给药对针对选择的疾病进行疫苗接种或治疗这些疾病而言是有利的。此外，非肠道给药也可用于针对选择的疾病诸如癌症进行疫苗接种或治疗。将包含表面偶联的抗原的非致病菌呈递给肿瘤、离体的树突细胞或其它哺乳动物细胞在移植或再移植前是有用的。

可以以多种形式给予配制的疫苗，诸如流体、气溶胶、粉末、结晶和片剂。配制的疫苗还可以包含调整疫苗活性或提供额外特性的活性物质。这些活性物质可以为复杂或简单的免疫调节化合物，诸如白细胞介素或其它活性药物组分(API)。API可以为一种或多种新的或众所周知的药物，它们在同时给药时可以提高疫苗的治疗作用或从疫苗衍生有用的特性。

为每种特异性疫苗的成分的合适的菌株的鉴定和对本发明疫苗的 预分析：

疫苗通常由佐剂和具体的疫苗成分组成。佐剂的作用在于刺激免疫系统且由此提高特异性病原体或抗原的作用。疫苗中微生物细胞的重要特性在于用作粘膜佐剂和/或指导免疫系统以所需方式做出除对特异性抗原反应以外的反应的复合成分。在某些方面中，对疫苗合适的免疫反应可以为体液的，而在其它方面中，它可以为细胞的或两者的组合。此外，反应可以极化成所谓的Th1或Th2反应或向炎性反应或抗炎反应极化或诱导耐受性。通过使用合适的菌株，对结合蛋白的免疫极化可以受到控制。

粘膜的免疫系统为整个免疫系统的组成部分，且由此在粘膜中的免疫反应在整个体内反映出来。它由组织、淋巴样和非淋巴样细胞和诸如抗体和细胞因子这类效应分子的整合网络组成。抗原呈递细胞、T淋巴细胞和细胞因子之间的相互作用为提供正确的特异性免疫反应的关键。免疫系统细胞与病原体或抗原之间的接触导致白细胞介素产生。白细胞介素为指导剩余免疫系统如何针对病原体或抗原起作用的介质分子。本质上将白细胞介素分成指导促炎或抗炎免疫反应的两类。然而，必然存在庞大数量的亚类，因为已知20种以上的白细胞介素并且对不同感染的各种反应产生了每种白细胞介素不同的水平。

已经在离体条件下建立了用于分析对各种细菌的免疫反应的方法(Christensen H.R.等2002，J Immunology 168：171-8)。这些方法基于认为是免疫系统关键介体的树突细胞(DC)。DC在遇到外源性细胞或抗原时发育成成熟免疫活性细胞。在相遇过程中，DC分泌细胞因子进行自体刺激和刺激免疫系统其它细胞。在离体方法中，在接触灭活或活的微生物后，通过定性和定量方式测定了来自DC的细胞因子。已经使用这类方法测试了不同的微生物并且结果显示在不同细菌之间存在显著性变异，包括在相同属且甚至在相同种的成员之间存在变异性。因此，DC方法用于鉴定指定疫苗的细菌候选物，因为合适的候选物为那些指导如细胞因子释放分布谱所示的所需免疫反应的候选物。这些候选物还应指导所需的免疫反应，同时呈递特异性抗原。因此，还可以如实施例18中例示的使用DC方法测试具有与细胞表面偶联的外源抗原的细菌候选物。

在未来，预计可以研发更为复杂的方法以便改善不同免疫反应之间的区分并且接近模拟体内情况。这类方法用于更精确地鉴定用于特异性疫苗的正确候选物。

本发明疫苗用于兽用目的的动物实验和应用：

例如，可以使用实施例中披露的方法设计并且制备疫苗。该疫苗可以包含用作针对病原体的疫苗的成分，所述的病原体例如选自分别在抗原来源和变应原来源中所列的病原体和变应原。它还可以包含用作针对其它疾病的疫苗的成分，所述的其它疾病例如选自感染性疾病、癌症、变态反应和自身免疫性疾病。

可以使用选自实施例的配制方法在动物实验中测试疫苗。测试动物可以属于任意动物种类。可以给动物饲喂疫苗或将疫苗与饮用水混合。还可以通过阴道或肛门给予疫苗或可以将疫苗通过例如使用鼻空肠管跃过胃和胃液的装置直接给予小肠。可以通过给动物口-鼻或鳃区直接喷雾或单纯通过将疫苗喷在动物厩棚而给予疫苗。还可以将疫苗加入到水中，鱼和其它水生动物生活在其中。可以进行一次给药或定期随访以便确保加强接种和维持免疫记忆。在使用病原体攻击或诱导类似于所述疾病的疾病之前和/或之后使用疫苗接种或安慰剂治疗进行实验。实验的终点可以包括但不限于分析存活动物和健康动物相对于死亡或患病动物的数量。在存活动物中疾病的严重程度也可以为重要参数。来自治疗动物的活检和特异性抗体滴度也可以表明疫苗接种的作用。还可以在免疫测定(包括对所述抗原的特异性反应)中测试来自活检的细胞。

可以设计动物实验以便鉴定：

-用于特定疫苗的大量候选物中的正确非致病菌；

-具有理想平均数量的表面偶联抗原的非致病菌的理想剂量；

-最佳给药途径；

-提高疫苗作用的物质；和

-疫苗接种频率和疫苗接种期限。

动物实验的结果用于建立对驯养动物、宠物、农场动物、兽群、家畜或野生动物进行疫苗接种的方案。此后，将疫苗用于兽用目的。

在某些方面中，动物结果可以用于人体疫苗试验设计。此外，动物实验可以用于在临床前期试验中测试人体疫苗。

用于人体目的的疫苗的人体试验和应用

如上述实例中所述，例如，可以使用如上所述的方法设计并且制备疫苗。该疫苗可以包含用作针对病原体或上述变应原来源中所列的任意变态反应的疫苗的成分。它还可以包含用作针对癌症或自身免疫性疾病或其它例如选自上述抗原来源中所列的疾病的疫苗的成分。如对兽用疫苗所述在临床前期试验完成后可在临床试验中测试疫苗。配制方法可以选自实施例中所述的任意一种。可以将健康人和/或病人包括在临床试验中。可以将疫苗作为片剂，作为食物或饮料的组成部分服用。可以将疫苗经舌下给药或喷在口鼻区域中。还可以通过阴道或肛门给予疫苗或可以将疫苗通过例如使用鼻空肠管跃过胃和胃液的装置直接给予小肠。可以进行一次给药或定期随访以便确保加强接种和维持免疫记忆。可以使用疫苗和/或安慰剂进行疫苗接种和可以使用随机化双盲手段进行疫苗接种。实验的终点可以包括但不限于分析存活者和健康人与死亡或患病人的数量。在存活者中疾病的严重程度也可以为重要参数。来自治疗存活者、治疗的健康和患病人的活检可以用于分析来自临床试验的结果。此外，特异性抗体滴度可以指示疫苗接种的作用。还可以在免疫测定(包括对所述抗原的特异性反应)中测试来自活检的细胞。

可以设计临床试验以便鉴定和选择：

-用于特定疫苗的大量候选物中的非致病菌；

-具有最佳平均数量的表面偶联抗原的非致病菌的最佳剂量；

-最佳给药途径；

-提高疫苗作用的物质；和

-疫苗接种频率和疫苗接种期限。

来自临床试验的结果用于建立对人进行疫苗接种的方案，此时，将疫苗用于人体疫苗接种目的。

离体接触包含涉及疾病诸如癌症的表面偶联抗原的疫苗的DC还可以用于治疗疾病。离体接触可以在将DC再移植入患者前进行。此外，可以通过非肠道使用相同类型的抗原与活的或死亡的非致病菌表面偶联的疫苗，以便提供对诸如癌症疫苗这类疫苗的适当佐剂作用。

本发明的方法还可以用于生产针对生物恐怖袭击中的病原体的有效和易于给药的疫苗。例如，已知现存的经过批准的炭疽疫苗必须通过非肠道给予并且需要多剂量以便诱导保护性免疫(Flick-Smith H.C.等2002，Infection and Immunity，70：2022)。这就需要受过训练的工作人员并且并非刺激粘膜免疫反应的最佳途径。此外，这种给药对于在极短时间内给大量人免疫接种疫苗而言并非理想。

III实施例

实施例1.β-半乳糖苷酶与乳杆菌属通过戊二醛的化学交联

本实施例展示使用为5-碳二醛的双官能交联试剂戊二醛(GLA)使来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的蛋白质β-半乳糖苷酶(PisaniF.M.等1990 Eur J Biochem.，187：321-8)与植物乳杆菌UP1的细胞表面发生化学交联。GLA作为交联剂通过与蛋白质的氨基形成希夫碱(-H＝N-)起作用。因此，预计GLA介导的β-半乳糖苷酶与细菌表面的交联在存在于β-半乳糖苷酶蛋白质中的赖氨酸或精氨酸残基与细菌细胞表面上或接近其表面上的易接近的赖氨酸或精氨酸残基之间发生。

用于交联研究的β-半乳糖苷酶通过使用pET-3a载体系统(Invitrogen，CA)在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行重组表达而获得。简言之，通过标准PCR技术从硫磺矿硫化叶菌基因组DNA扩增编码β-半乳糖苷酶的lacS基因，将其克隆入pGET-3a载体并且转化入大肠杆菌。在胞内表达β-半乳糖苷酶且然后裂解大肠杆菌细胞。通过热沉淀，通过将裂解物加热至80℃下30分钟而部分纯化释放入裂解物的β-半乳糖苷酶。使植物乳杆菌UP1生长在30℃下和无通风条件下的MRS(Oxoid，Hampshire UK)中24小时。通过离心收集细胞并且将其重新悬浮于M9缓冲液(0.6％Na₂HPO₄，0.3％KH₂PO₄，0.5％NaCl，0.025％MgSO₄)中且调整至10¹⁰个细胞/mL的细胞密度。将固定量的植物乳杆菌细胞(10¹⁰)与不同量的β-半乳糖苷酶和0.2％GLA(Sigma-AIdrich，St.Lois MO)一起在室温下温育50分钟。通过将细胞混合物铺展在MRS琼脂上测试GLA处理的细胞的存活力。无存活菌落产生，表明GLA-处理已经杀灭了大部分细胞。在GLA处理后，将细胞混合物进行离心以便得到细胞级分和上清液。用M9缓冲液将分离的细胞充分洗涤两次。为了监测GLA-介导的β-半乳糖苷酶与植物乳杆菌细胞的交联，通过使用Sambrook J等，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Press，Plainview，NY)所述的ONPG操作步骤检测β-半乳糖苷酶活性来测定β-半乳糖苷酶在上清液与细胞级分之间的分布。由于反复用M9洗涤细胞，所以细胞级分中未结合的β-半乳糖苷酶的量可以忽略不计。因此，将细胞级分中测定的酶的活性视为相当于与植物乳杆菌细胞表面结合的酶的量。使用1ug/mL和2ug/mL β-半乳糖苷酶和10¹⁰个细胞/mL交联导致与细胞表面的结合率分别为酶总量的33％和40％(基于酶活性的可检测单位)(附图1)，而在不含GLA的对照反应中的表面结合低于5％(数据未显示)。使用1ug/mL或2ug/mLβ-半乳糖苷酶进行GLA交联后获得的细胞级分具有480U和610U的酶活性，分别相当于每个细胞600和800个β-半乳糖苷酶分子。结论是本实施例证实GLA能够使酶促活性蛋白与乳杆菌属细胞表面交联。与细胞表面交联的酶保持了其酶促活性，从而表明GLA-介导的蛋白质与细胞表面交联不会危害蛋白质的功能性。

实施例2.阿拉伯糖异构酶与乳杆菌属通过戊二醛的化学交联

为了证实蛋白质与细菌细胞表面的化学交联并不限于β-半乳糖苷酶，我们显示了来自嗜热的Thermoanaerobacter mathrani的阿拉伯糖异构体酶与细菌细胞的交联。阿拉伯糖异构酶将D-半乳糖转化成D-塔格糖并且如Jorgensen和合作者所述在大肠杆菌中重组胞内表达获得(Jorgensen F等2004，Appl Microbiol Biotechnol 64：816-22)。在重组大肠杆菌中生长和表达后，使用French压榨机裂解细胞。离心这一裂解的混合物并且将包含阿拉伯糖异构酶的上清液用于随后的交联实验。如实施例1中所述使植物乳杆菌UP1生长并且洗涤。将洗涤的细胞(10¹⁰个细胞)与不同量的包含阿拉伯糖异构酶的裂解物与终浓度为0.1％GLA一起温育。使交联反应在37℃下进行60分钟。此后，收集细胞并且如实施例1中所述洗涤。如前所述分析细胞级分与上清液中的酶活性(Jorgensen F等2004，Appl Microbiol Biotechnol64：816-22)。附图2显示阿拉伯糖异构酶与乳杆菌属细胞表面以浓度依赖性方式交联。由于阿拉伯糖异构酶不受GLA处理抑制(数据未显示)，所以在细胞和上清液级分中可检测到的总催化活性(附图2)对应于在GLA处理前加入到洗涤的植物乳杆菌细胞中的酶的量。附图2显示基于将细胞级分中的阿拉伯糖异构酶活性与合并的细胞和上清液中的酶活性总量进行比较，在所有三种交联条件下超过50％的阿拉伯糖异构酶与植物乳杆菌细胞表面结合。结论是本实施例表明GLA可以有效地使活性阿拉伯糖异构酶与乳杆菌属细胞表面交联。

实施例3.脱乙酰壳多糖作为间隔物分子提高通过戊二醛与乳杆菌属交联的β-半乳糖苷酶的水平

脱乙酰壳多糖为包含多个反应基团的天然存在的分子，它可以用作间隔物分子提高通过化学交联与细菌细胞表面结合的蛋白质量。如实施例1中所述使植物乳杆菌细胞生长并且洗涤，且以10¹⁰个细胞/ml的浓度悬浮于M9缓冲液中，向其中加入0.5％w/v脱乙酰壳多糖500kDA(Cognis Deutschland GmbH，Germany)和0.2％GLA与1ug/mL或2ug/mLβ-半乳糖苷酶。将脱乙酰壳多糖对β-半乳糖苷酶与细胞交联的作用与不使用脱乙酰壳多糖的对照交联反应比较。如实施例1中所述收集和洗涤植物乳杆菌细胞并且测定交联反应混合物中洗涤的细胞级分和上清液中的β-半乳糖苷酶催化活性。附图3证实脱乙酰壳多糖促进交联反应，因为超过90％的总β-半乳糖苷酶活性与细胞级分结合，而不存在脱乙酰壳多糖时仅35％的β-半乳糖苷酶活性与细胞级分结合。本实施例表明将脱乙酰壳多糖用作分子间隔物促进了交联反应并且将结合的β-半乳糖苷酶的量从800个分子/细胞增加至约2000个分子/细胞。

实施例4.蛋白质与乳杆菌属表面的非共价结合

使用交联试剂对乳杆菌属进行化学处理产生无活性细胞。本实施例证实未处理的活的细菌可以以非共价方式结合β-半乳糖苷酶。尽管不受理论约束，但是细胞表面与蛋白质之间的相互作用为离子的，疏水性的或在β-半乳糖苷酶与细胞表面上的糖部分之间。

如实施例1中所述使植物乳杆菌UP1生长并且洗涤。在37℃下将将细胞(10¹⁰)与2ug/mlβ-半乳糖苷酶一起温育60分钟。离心细胞并且用500ulM9缓冲液洗涤两次。分析来自交联反应混合物的洗涤的细胞级分和上清液中的β-半乳糖苷酶的催化活性。在细胞级分中，检测到了538U，而在上清液中测定到5455U，相当于9％的总β-半乳糖苷酶与细胞表面结合。本实施例表明在不使用交联介体的情况下，乳杆菌属可以在细胞表面结合β-半乳糖苷酶。然而，通过所述的非共价交联仅结合了9％的添加的β-半乳糖苷酶，而如实施例1中所述，使用GLA试剂和类似量的β-半乳糖苷酶导致结合40％的添加的β-半乳糖苷酶。非共价结合方法由此比使用GLA法的共价结合法的有效性低4倍。结合的β-gal的减少(从40％到9％)相当于从800减少至180个β-半乳糖苷酶分子/细胞。可使该反应最优化以便获得更高量的结合蛋白。可以通过控制pH，缓冲液的离子强度，温度或其它参数来实现最优化。

实施例5.酶促催化的β-半乳糖苷酶与乳杆菌属的交联

转谷氨酰胺酶(TG)能够形成蛋白质中和之间的分子间和分子内交联。因此，TG可催化外部添加的蛋白质与细菌细胞壁成分中的氨基酸残基之间的交联。通过酰基转移反应，TG催化作为酰基供体的肽-或蛋白质-结合的谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺基与作为酰基受体的几种伯胺类包括肽-或蛋白质-结合的赖氨酸残基的ε-氨基之间的交联。该反应在蛋白质结合的赖氨酸残基作为酰基受体时导致形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸异肽类形式的交联物。通过将细菌细胞与靶蛋白(例如抗原或变应原)和TG混合进行该反应，其中交联随时间逐步增加。反应条件优选在约6.5-约8.0的pH下缓冲并且包含≥10mM CaCl₂，以便使交联反应最优化。此外，在≤90℃下热处理靶蛋白并且添加20mM二硫苏糖醇可以促进交联。因为已经报导了乳蛋白中的TG抑制物质(Benisch等2004，Jour Food Science 69(8))，所以可以在交联反应前进行对来源于奶的细菌细胞的热处理。此外，有待交联的靶蛋白可以在N或C末端延伸含有多个反应残基的氨基酸，所述的反应残基可以作为TG底物起作用并且促进交联反应。通过分析洗涤的细胞级分和上清液中的靶蛋白，通过测定其功能活性(例如催化活性)或通过使用对诸如酶、抗原或变应原这类靶蛋白具有特异性的抗体的免疫化学技术，检测TG-介导的靶蛋白与细菌细胞表面的交联。

实施例6.

β-乳球蛋白与乳杆菌属通过使用戊二醛的交联

β-乳球蛋白(BLG)为产生变态反应的乳清级分乳蛋白。能够在口服给药后引起粘膜免疫反应的包含BLG的组合物的制品可以用于治疗患有这类变态反应的患者的BLG变态反应。在进行证实BLG与乳杆菌属细胞交联的试验中包括下列成分：

乳杆菌属细胞：使植物乳杆菌培养物(299v)在30℃下和MRS肉汤(Flukka 69966)中生长过夜。离心1ml过夜(o/n)培养物的等分部分并且用1ml M9缓冲液洗涤所得沉淀，此后将它们冷冻在-20℃下以备后用。在使用前，融化冷冻的沉淀并且重新悬浮于M9缓冲液中(将来自1mlo/n培养物的沉淀重新悬浮于500ml M9缓冲液中)。

BLG：在无菌蒸馏水中制备的1％的BLG(L6879，Sigma-Aldrich)溶液。

戊二醛(GLA)：25％戊二醛水溶液(1.04239，Merck)。

戊二醛为通过与伯氨基(就蛋白质而言，主要是赖氨酸)形成希夫碱(＞C＝N-)起交联剂作用的5-碳二醛。

混合包含表1中所示体积的乳杆菌细胞、BGL蛋白和戊二醛的样品并且在室温下通过定期混合温育60分钟。

表1

试管编号	细胞	BLG	H20	GLA
					1	250μl	25μl	225μl	5μl
2	250μl	0μl	250μl	5μl
					3	250μl	25μl	225μl	0μl
4	250μl	0μl	250μl	0μl

在60分钟温育后，离心样品并且用500ul M9缓冲液(M9缓冲液：溶于水至1升总体积的7.3克Na₂HPO₄、2.9克KH₂PO₄和2.0克NH₄Cl)将细胞沉淀洗涤2次。

使用具有一定修改的牛β-乳球蛋白ELI SA定量试剂盒(目录号E10-125，Bethyl Laboratories)，应用试剂盒制造商所述的溶液，测定沉淀中交联的BLG的量。因为检测的BLG蛋白已与乳杆菌属细胞表面交联，所以改变ELISA试剂盒操作步骤，使得将混悬液中的完整细胞用于基于抗体的测定。简言之，使用与HRP(辣根过氧化物酶)缀合的家兔抗-BGL抗体进行检测。将沉淀重新悬浮于100ul封闭溶液中，与100ul检测溶液(1ml稀释缓冲液+0.1ul HRP抗体)混合并且在至温下通过定期混合温育60分钟。然后离心细胞并且用200ul洗涤溶液洗涤3次，此后重新悬浮于100ul稀释缓冲液中。最终，在微量滴定板中通过将100ul TMB试剂(T 0440，Sigma Aldrich)添加到50ul体积的连续稀释的物质中进行TMB(四甲基联苯胺)颜色反应。将微量滴度板在室温下温育5-30分钟，此后通过添加100ul 2M H₂SO₄终止反应并且在平板读出器中测定450nm处的吸光度。如试剂盒的操作手册中所述在微量滴定板方案中包括关联OD₄₅₀值和BGL浓度的标准曲线。

表2

试管编号	4×稀释的OD420	8×稀释的OD420	计算的BLG
				1	0.974	0.526	65ng/ml
2	0.386	0.217	19ng/ml
				3	0.621	0.353	38ng/ml
4	0.298	0.157	11ng/ml

表2中计算的BLG为通过使用标准曲线来源于测定的OD₄₂₀值的蛋白质浓度。在没有向反应试管中添加BGL的情况下检测背景值OD₄₅₀吸光度，它可反映出HRP抗体的非特异性结合。BLG蛋白与乳杆菌属细胞的非特异性粘着可能解释样品3中BLG的水平，其中无戊二醛。

实施例7.

通过使用戊二醛使金黄色葡萄球菌核酸酶与乳杆菌属交联

金黄色葡萄球菌为重要的细菌病原体，其中治疗因多重耐药菌株的出现而尤其困难。候选疫苗成分为来自金黄色葡萄球菌的分泌的核酸酶(Nuc)，它通过在乳酸乳球菌中的异源蛋白表达而产生(Poquet I.等1998J Bact.，180：1904-1912)。

在证实Nuc蛋白与乳杆菌属细胞交联而进行的试验中包括下列成分：

乳杆菌属细胞：如实施例6中所述生长和制备的嗜酸乳杆菌(X37)培养物。

Nuc蛋白(A)：纯化的Nuc蛋白(1mg/ml，Calbiochem)

Nuc蛋白(B)：在乳酸乳球菌中产生的重组Nuc蛋白(187ug/ml)。

M9缓冲液和戊二醛(GLA)如实施例6中所述。混合包含表3中所示体积的乳杆菌属细胞、M9缓冲液、Nuc蛋白和戊二醛的样品并且在室温下通过定期混合温育60分钟。

表3

试管编号	X37细胞	Nuc	M9缓冲液	GLA
					1	100μl	20μl	0μl	2μl
2	50μl	10μl	60μl	2μl
					3	25μl	5μl	90μl	2μl
4	100μl	20μl	0μl	2μl
					5	50μl	10μl	60μl	2μl
6	25μl	5μl	90μl	2μl

在60分钟温育后，离心样品并且用1ml M9缓冲液将沉淀洗涤2次。使用基于抗体的试验与Nuc一抗(家兔抗-Nuc抗体)和AP-连接的抗-家兔二抗(磷酸酶-标记的亲和纯化的在山羊中产生的对家兔IgG的抗体，目录号075-1506，KPL)，应用实施例1中所述的溶液，测定沉淀物质中Nuc蛋白质浓度。简言之，将沉淀重新悬浮于100ul封闭缓冲液中，与100ul检测溶液(1ml稀释缓冲液+1ul Nuc抗体)混合并且在室温下通过定期混合温育60分钟。然后离心细胞并且用500ul洗涤溶液洗涤2次，此后重新悬浮于100ul稀释缓冲液中。接下来加入100ul检测溶液(4ml稀释缓冲液+1ul AP抗体)并且在室温下通过定期混合温育样品60分钟。然后离心样品，用500ul洗涤溶液洗涤3次并且重新悬浮于100ul稀释缓冲液中。最终，在微量滴定板中通过将100ul Blue Phos Microwell Phosphatase SubstrateSystem(50-88-02，KPL)添加到50ul体积的连续稀释的物质中进行AP(碱性磷酸酶)颜色反应。将微量滴度板在室温下温育10-30分钟，此后通过添加100ul 2.5％EDTA终止反应并且在平板读出器中测定595nm处的吸光度。使用相同的实验方案分别生成交联OD₅₉₅值和Nuc浓度的标准曲线。

表4

试管编号	4×稀释的OD595	8×稀释的OD595	计算的Nuc
				1	0.089	0.074	13μg/ml
2	0.074	0.061	8μg/ml
				3	0.061	0.054	5μg/ml
4	0.131	0.091	22μg/ml
				5	0.112	0.079	18μg/ml
6	0.091	0.070	13μg/ml

表4中给出的计算的Nuc值为使用标准曲线扣除背景值后来源于测定的OD₅₉₅值的蛋白质浓度。证实了Nuc蛋白与嗜酸乳杆菌细胞的交联并且交联的Nuc的量与试验中存在的Nuc蛋白质和细胞的量成比例。

实施例8.

通过使用戊二醛与脱乙酰壳多糖使lacS β-半乳糖苷酶与乳杆菌属交联

脱乙酰壳多糖为天然存在的包含多个氨基的分子，它可以参与戊二醛交联反应。常将所谓的间隔物分子加入到交联反应混合物中，以便改善结果。

在证实β-半乳糖苷酶与乳杆菌属细胞通过脱乙酰壳多糖交联而进行的试验中使用下列成分：

通过使用pET-3a载体系统(Invitrogen，CA)在大肠杆菌中重组表达来自硫磺矿硫化叶菌的lacS基因(Pisani F.M.等1990Eur JBiochem.，187：321-8)获得β-半乳糖苷酶。简言之，使用标准PCR技术扩增编码β-半乳糖苷酶的PCR片段，将其克隆入pGET-3a载体并且转化入大肠杆菌以用于β-半乳糖苷酶的胞内表达。通过裂解大肠杆菌细胞，随后部分纯化(热沉淀)，获得表达的lacS蛋白的制品，其中将裂解物加热至80℃下30分钟并且离心以便除去裂解物中的大部分其它蛋白质(lacS β-半乳糖苷酶为热稳定酶)。基于考马斯蓝染色凝胶中可检测的蛋白质将lacS β-半乳糖苷酶蛋白质的浓度估计为大约400ug/ml。

乳杆菌属细胞：如实施例6中所述生长和制备的植物乳杆菌(299v)培养物。

通过将7.3mg脱乙酰壳多糖(500kDa)(Cognis Deutchland GmbH，Germany)、730ul H₂O和20ul 2N HCl混合制备1％脱乙酰壳多糖溶液。

M9缓冲液和戊二醛(GLA)描述在实施例6中。

将包含表5中所示体积的乳杆菌属细胞、M9缓冲液和脱乙酰壳多糖的样品混合并且在室温下温育5分钟。然后加入表5中所示体积的lacS β-半乳糖苷酶和戊二醛，并且将样品在室温下混合15分钟。

表5

试管编号	细胞	M9缓冲液	脱乙酰壳多糖	lacS	GLA
						1	50μl	50μl	2.5μl	20μl	2μl
2	50μl	50μl	5μl	20μl	2μl
						3	50μl	50μl	10μl	20μl	2μl
4	50μl	50μl	20μl	20μl	2μl

15分钟温育后，离心样品并且将沉淀重新悬浮于100ul M9缓冲液中。在65℃下对沉淀和上清液溶液进行使用ONPG操作步骤的β-半乳糖苷酶活性标准测定(Sambrook J等，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbour Press，Plainview，NY)，以便测定lacS蛋白质分布。所得β-半乳糖苷酶的相对量如表6中所示，其中表中显示的值计算为酶活性(单位/ml)×溶液体积(ml)。

表6

试管编号	沉淀	上清液	交联率
				1	151	2427	6％
2	371	2172	14％
				3	653	1790	25％
4	1305	1347	50％

交联率为沉淀与测定的总lacS β-半乳糖苷酶活性之比。

本实施例证实包含脱乙酰壳多糖作为间隔物显著增加了交联物质的产率。

实施例9.偶氮酪蛋白与乳杆菌属通过戊二醛的冷交联

我们已经令人意外地反向，可以使用冷冻方案进行通过戊二醛的交联(冷交联)，并且可以使用该方案获得高交联蛋白质产率。在证实偶氮酪蛋白与乳杆菌属细胞交联进行的试验中包括下列成分：

偶氮酪蛋白：众所周知为普遍的蛋白酶底物。它由与偶氮染料缀合的酪蛋白组成，可以用于定量分光光度测定。为了进行交联实验，制备溶于无菌蒸馏水的1％的偶氮酪蛋白(A2765，Sigma-Aldrich)溶液(10mg/ml)。

乳杆菌属细胞：如实施例6中所述生长和制备的植物乳杆菌(299v)培养物。

M9缓冲液和戊二醛(GLA)如实施例6中所述。

将包含表7中所示体积的乳杆菌属细胞、偶氮酪蛋白、M9-缓冲液和戊二醛的样品混合并且使用液氮迅速冷冻，此后置于-20℃的冷藏箱中将样品保持3天。

表7

299v细胞	偶氮酪蛋白	M9缓冲液	GLA	回收率
					100μl	50μl	50μl	0μl	90％
100μl	50μl	50μl	2μl	5％
					0μl	50μl	150μl	2μl	10％
299v细胞	偶氮酪蛋白	M9缓冲液	GLA	回收率
					100μl	100μl	0μl	0μl	78％
100μl	100μl	0μl	2μl	6％
					0μl	100μl	100μl	2μl	5％

为了评价交联，融化样品，离心并且通过在420nm处检测偶氮-基团吸光度测定上清液中偶氮-酪蛋白含量。将表7中给出的回收率值计算为在上清液中保留的偶氮-染料与对照品(与起始浓度类似的在水中的纯偶氮酪蛋白)相比的百分比。根据上述冷方案使用0.25％戊二醛，发现2.5mg/ml和5.0mg/ml的偶氮酪蛋白溶液可有效交联。离心得到坚实的沉淀，它不可能重新悬浮。这表明已经发生了高度交联。添加和不添加乳杆菌属细胞的交联结果极为类似。由于使用了冷冻方案，其中在温育过程中固定了细胞的位置，所以冷交联导致细胞和偶氮-酪蛋白均匀地连接成聚集物。

实施例10.

β-半乳糖苷酶与乳杆菌属通过戊二醛的冷交联

用于戊二醛-介导的蛋白质与乳杆菌属表面交联的冷冻方案(冷交联)也得到了与乳杆菌属交联的β-半乳糖苷酶(lacS)的更高产率。在使用冷冻方案证实lacS与乳杆菌属细胞交联而进行的试验中包括下列成分：

乳杆菌属细胞：如实施例6中所述生长和制备嗜酸乳杆菌(X37)培养物。

如实施例8中所述制备lacS。

如实施例6中所述制备M9缓冲液和戊二醛(GLA)。

以表8中所示体积将包含乳杆菌属细胞、lacS β-半乳糖苷酶蛋白质溶液、M9-缓冲液和戊二醛的样品混合并且使用液氮迅速冷冻，此后置于-20℃的冷藏箱中将样品保持3天。

表8

试管编号	X37细胞	lacS	M9缓冲液	GLA
					1	100μl	0μl	50μl	2μl
2	100μl	10μl	40μl	2μl
					3	100μl	20μl	30μl	2μl
4	100μl	50μl	0μl	2μl
					5	100μl	50μl	0μl	0μl
6	0μl	10μl	140μl	2μl
					7	0μl	20μl	130μl	2μl
8	0μl	50μl	100μl	2μl

为了评价交联，融化样品，离心并且用200ul M9缓冲液将沉淀洗涤1次。最终将沉淀重新悬浮于100ul M9缓冲液中。

如实施例7中所述使用ONPG测定在65℃下测定β-半乳糖苷酶活性。所得β-半乳糖苷酶活性的相对量如表9中所示。将表中显示的值计算为酶活性(单位/ml)×溶液的体积(ml)。

表9

试管编号	沉淀	上清液	洗涤液	回收率	交联率
						1	18	22	13	-	-
2	583	139	8	73％	80％
						3	1331	77	4	70％	94％
4	3708	10	46	75％	99％
						5	3	5016	4	100％	-
6	317	188	4	51％	62％
						7	1321	14	4	67％	99％
8	2711	18	27	55％	98％

回收率为在合并的沉淀+上清液+洗涤溶液中交联后检测到的添加的lacS活性的分数。戊二醛处理导致酶失活，这很可能解释观察到的可回收总活性中的丢失。添加X 37细胞改善了回收率，这可能是因存在更多靶标参与戊二醛反应所致。

交联值为表示为总lacS β-半乳糖苷酶活性百分比的沉淀的β-半乳糖苷酶活性。总体而言，大部分添加的lacS β-半乳糖苷酶蛋白质为交联的并且发现大部分酶活性在沉淀部分中，与是否包括299v细胞无关。就较高蛋白质浓度而言，回收率接近100％。

对沉淀部分的显微镜检查显示对不使用GLA的样品而言为正常X37单一细胞(试管编号5)。当在不添加细胞情况下进行交联时(试管6-8)，观察到小聚集物，其大小与细菌细胞类似。对加入细胞和lacS

β-半乳糖苷酶蛋白质的实验而言，观察到表现出由细胞和蛋白质物质组成的混合聚集物(试管2-4)。在不添加lacS情况下温育的细胞也展示出小块的交联细胞(试管编号1)。

实施例11.

与在室温下交联相比的Betv1与乳杆菌属通过戊二醛的冷交联

来自白桦(Betula verrucosa)的主要花粉抗原Betv1为17kd蛋白质(Breiteneder H.等1989EMBO J.，8：1935-1938)，并且其为I型变态反应(过敏性支气管哮喘)的主要原因之一。测定Betv1与乳杆菌属细胞冷交联的效率而进行的试验中包括下列成分：

按照Spangfort等(1996)Prot.Exp.Purification，8，365-373所述的操作步骤获得纯化的重组Betv1蛋白。使用体外蛋白质合成系统(RTS 100E.coli HY Kit，Roche Applied Science)生产放射性标记的Betv1蛋白。简言之，通过加入到用于扩增的PCR引物中的Nde1和Sall限制位点将包含Betv1读框的PCR片段克隆入plVEX2.3d载体(Roche)。通过序列分析发现包含无差错Betv1编码序列的来自所得克隆的纯化质粒DNA用作体外蛋白质合成的DNA模板。使用L-[³⁵S]甲硫氨酸(SJ235，Amersham Biosciences)如制造商所述进行放射性标记。将能够保留Betv1蛋白的离心30K滤膜(Ultrafree，AmiconBioseparations，Millpore)用于从体外合成的蛋白质中洗掉低分子量产物。通过该步骤纯化³⁵S-标记的Betv1蛋白，在SDS PAGE上得到单一显性放射性条带。最终，将³⁵S-标记的Betv1蛋白与M9缓冲液和非放射性载体Betv1(40ug/ml)混合以便产生用于放射性标记实验的混合物(10ul³⁵S标记的Betv1蛋白，490ul M9缓冲液，550ul载体Betv1)。

乳杆菌属细胞：如实施例6中所述生长和制备嗜酸乳杆菌(X37)培养物。

Betv1：在包含50％甘油的磷酸钠缓冲液中1.32mg/ml。

如实施例6中所述制备M9缓冲液和戊二醛(GLA)。

以表10中所示体积混合乳杆菌属细胞、Betv1蛋白质溶液和戊二醛并且使用液氮迅速冷冻，此后置于-20℃的冷藏箱中。

表10

试管编号	X37细胞	Betv1	35S-Betv1	GLA
					1	100μl	5μl	10μl	2μl
2	100μl	5μl	10μl	2μl
					3	100μl	5μl	10μl	2μl
4	100μl	5μl	10μl	2μl
					5	100μl	5μl	10μl	0μl
6	100μl	5μl	10μl	0μl

在-20℃下3天后，将样品融化离心。用200ul M9缓冲液洗涤沉淀并且重新悬浮于100ul M9缓冲液中。通过下列步骤对沉淀、上清液和洗涤溶液中的³⁵S-放射性进行测定：将5ul滴置于非吸收性纸表面，在50℃下干燥液滴并且将超敏感的Storage PhosphorScreen(Pachard Instrument Company)置于胶片暗盒中干燥的液滴上。扫描曝光的Phosphor Screen(Cyclone，Pachard InstrumentCompany)，并且对所有分析点，对于具有相同直径的圆形面积，将检测到的光单位(DLU)信号进行积分。结果如表11中所示(相对单位)，其中将表中显示的值计算为扫描结果(DLU/ml)×溶液体积(ml)。

表11

试管编号	沉淀	上清液	洗涤液	回收率	交联率
						1	713	5362	431	79％	9％
2	916	7829	355	110％	11％
						3	1339	6873	542	106％	16％
4	508	4215	371	62％	6％
						5	-	6282	-	76％	-
6	-	7146	-	87％	-

回收率为在沉淀+上清液+洗涤溶液中交联后检测到的添加的³⁵S-Betv1活性的分数。交联率为沉淀中检测到的总³⁵S-Betv1活性的百分比。³⁵S-Betv1溶液的稀释度用于确定加入的总放射性，并且样品未位于的非吸收性纸的面积用于从测定的DLU值中扣除背景。

对沉淀部分的显微镜检查显示对不使用GLA的样品而言为正常X37单一细胞，而GLA交联产生装饰有Betv1蛋白物质的小聚集物形式的细胞(附图4)。发现沉淀部分中观察到的大部分Betv1蛋白与细胞结合，而较大的蛋白聚集物在反复细胞洗涤步骤过程中被除去，小的聚集物会被除去。

戊二醛为广泛使用的蛋白交联剂(Migneault I.等2004BioTechniques，37：790-802)。在对比实验中，在室温下戊二醛用于使Betv1交联2种不同类型的乳杆菌属细胞。

在测定室温下Betv1与乳杆菌属细胞交联效率进行的试验中包括下列成分：

乳杆菌属细胞(A)：如实施例6中所述生长和制备的嗜酸乳杆菌(X37)培养物。

乳杆菌属细胞(B)：如实施例6中所述生长和制备的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)(616)培养物。

Betv1：在包含50％甘油的磷酸钠缓冲液中1.32mg/ml。

如上所述制备³⁵S-Betv1。

如实施例6中所述制备M9缓冲液和戊二醛(GLA)。

按照表12中所示体积将乳杆菌属细胞、Betv1蛋白质溶液和戊二醛混合并且在室温下通过定期混合温育60分钟。

表12

试管编号	细胞	M9缓冲液	Betv1	35S-Betv1	GLA
						1	100μl(A)	0μl	3μl	10μl	1μl
2	100μl(A)	0μl	3μl	10μl	2μl
						3	100μl(A)	0μl	6μl	10μl	1μl
4	100μl(A)	0μl	6μl	10μl	2μl
						5	100μl(B)	0μl	3μl	10μl	1μl
6	100μl(B)	0μl	3μl	10μl	2μl
						7	100μl(B)	0μl	6μl	10μl	1μl
8	100μl(B)	0μl	6μl	10μl	2μl
						9	0μl	100μl	3μl	10μl	1μl
10	0μl	100μl	6μl	10μl	1μl

在室温温育后，离心样品并且用100ul M9缓冲液将沉淀洗涤3次且重新悬浮于50ul M9缓冲液中。通过下列步骤对沉淀、上清液和洗涤溶液中的³⁵S-活性进行测定：将5ul样品液滴置于非吸收性纸表面上并且如上所述处理。结果如表13中所示(相对单位)，并且将表中显示的值计算为扫描结果(DLU/ml)×溶液体积(ml)。

表13

试管编号	沉淀	上清液	洗涤液-1	洗涤液-2	回收率	交联率
							1	342	16278	712	74	78％	1.5％
2	478	16837	1278	74	84％	2.1％
							3	258	15134	642	58	72％	1.2％
4	367	13520	615	79	65％	1.6％
							5	316	21299	816	79	101％	1.4％
6	604	11829	958	33	60％	3.6％
							7	312	15682	803	59	76％	1.6％
8	154	10072	1347	77	52％	0.7％
							9	38	15011	529	45	70％	0.2％
10	28	12613	787	56	61％	0.1％

如上所述计算表中显示的回收率和交联率值。在显微镜下检查沉淀物质并且发现两种乳杆菌属菌株细胞均产生稍微较大细胞聚集物作为交联结果，不过，在将M9缓冲液用于在类似实验中稀释细胞浓度时，细胞聚集减少(数据未显示)。

发现与乳杆菌属细胞交联的Betv1蛋白小聚集物的产率在于室温下进行时为1-3％，而使用冷交联操作步骤增加至11％的交联平均值，这一结果在交联水平上是显著的和令人意外的改善。

可以将按照上述两种交联操作步骤制备的表面偶联Betv1的乳杆菌属缀合物浓缩100倍。在实施例15的S.L.I.T.类型实验中对小鼠给药时，5ul各浓缩物的等分部分会产生一种剂量，其分别包含0.330mg或0.075mg的按照冷或室温交联制备的与乳杆菌属细胞结合的Betv1蛋白。

实施例12.

与乳杆菌属通过戊二醛交联的Betv1的表面分布

使用基于抗体的检测方法检验与乳杆菌属通过戊二醛交联的Betv1的表面分布。混合下列体积并且使用液氮迅速冷冻，此后置于-20℃的冷藏箱中：100ul嗜酸乳杆菌(X37)细胞、5ul Betv1蛋白和2ul GLA。所有溶液均如实施例8中所述。按照与实验中其它样品相同的方式处理从交联混合物中除去Betv1的阴性对照。

在-20℃下3天后，融化该混合物，离心并且用M9缓冲液洗涤沉淀。为了避免来自残留戊二醛的自身荧光，首先将沉淀重新悬浮于500ul 40mM乙醇胺中并且在室温下温育2小时。然后离心各样品且随后将沉淀在室温下重新悬浮于2ml NaBH₄溶液(在PBS缓冲液中1mg/ml，pH8.0)中10分钟。最终用500ul M9缓冲液将沉淀物质洗涤3次。

通过使用家兔抗-Betv1抗体(ALK-AbellóA/S)与Cy-3标记的抗-家兔二抗(PA43004，Amersham Biosciences)观察存在的Betv1。简言之，将沉淀重新悬浮于500ul TBS(50mM Tris，0.9％NaCl，pH7.6)与1ul一抗(家兔抗-Betv1)中并且在室温下温育60分钟。然后离心样品并且用500ul TBS缓冲液洗涤3次且将沉淀重新悬浮于500ulTBS与1ul二抗(Cy-3抗-家兔)中并且在暗处和室温下温育60分钟。最终用500ul PBS将沉淀洗涤3次，重新悬浮于500ul PBS中并且通过带有CCD照相机(Princeton Instuments)的荧光显微镜(Axioskop 2，Zeiss)分析，其中通过使用MetaMorph软件(UniversalImaging Company)产生图像。

当在使用相同设置的显微镜和照相机下观测样品时，清晰的荧光信号定位于乳杆菌属细胞表面上。这表明Betv1蛋白可以与乳杆菌属细胞表面交联(附图5)，并且交联的结合蛋白(betv1)保持了其抗体识别特性。

实施例13.蛋白质化合物与非致病菌表面的化学交联的最优化和控制

可以通过交联反应条件调节靶蛋白质化合物与细菌细胞表面之间化学交联的形成率和每个细胞结合的靶蛋白的量。例如，设定温育时间和温度以便获得所需的交联度。在交联反应中调节化学交联剂浓度和靶蛋白与细胞之比，以便产生约1ng-至少约1mg交联的靶蛋白/10¹²个细胞的交联密度。此外，确定反应过程中试剂混合以便确保试剂之间的有效接触，细菌细胞外表面上蛋白质的均匀分布并且预防细胞聚集物形成。通过免疫化学方法和显微镜检查法分析调节与细菌细胞结合的靶蛋白质化合物的丰度、密度和分布的交联反应条件。可以测试用于交联的可选择的双官能化学试剂和可选择的间隔物。本发明披露的方法能够生产在其外表面上包含受控量的交联蛋白的一种或多种细菌细胞。

实施例14.与非致病菌交联的靶蛋白质化合物的剂量估计

如下计算与细菌细胞交联或配制成疫苗的靶蛋白化合物(例如酶、抗原或变应原)的剂量：

交联蛋白剂量＝N×M×CFU/A

其中N为每个细胞交联的蛋白质分子的数量，M为分子量，CFU为1个剂量中菌落形成单位的数量，且A为阿伏加德罗常数6.02×1023mol^-1。

在实施例1中，基于细菌表面上β-半乳糖苷酶活性，将表面偶联的β-半乳糖苷酶分子数目估计为每个细胞约600-800个分子。这种估计推定在抗原分子与细菌表面偶联完成后，酶活性得以保存。然而，例如，因GLA处理和/或底物分子无法完全接近所有交联的β-半乳糖苷酶而可导致酶活性显著降低。因此，表面偶联的分子数目可以高于估计的600-800。如果酶活性因GLA处理而降低2-3倍，每个细胞的分子数目可以在1,200-2,400。例如，可以使用同位素标记的抗原或基于免疫的技术精确测定表面偶联的分子的正确数量。

在实施例1和2中，用于使抗原分子与细菌表面偶联的方案不是饱和的，因为证实在偶联反应中添加增加量的抗原可以增加表面偶联的抗原的量(附图1和2)。如实施例7详细描述的，可以通过调节交联反应条件(包括GLA浓度、温度和/或温育时间)进一步增加表面偶联的抗原的量。

在实施例6中，交联的BLG蛋白的量约为46ng/ml。BGL蛋白具有约18,300的分子量。由于对生长过夜的乳杆菌属培养物而言推定2×10⁹个细胞/ml，所以对于所用的反应体积而言总计为4.6ng BLG蛋白/1×10⁹个细胞或151个交联分子/细胞。

在实施例7中，就所用最高Nuc浓度而言，交联的Nuc蛋白的量约为22ug/ml。Nuc蛋白分子量约为18kd。由于对生长过夜的乳杆菌属培养物而言推定2×10⁹个细胞/ml，所以对于所用的反应体积而言总计为2.2ug Nuc蛋白/4×10⁸个细胞或184×10³个交联分子/细胞。

在实施例8中，发现交联的lacS分子数目为6-50％，这取决于所用的脱乙酰壳多糖的量。lacS β-半乳糖苷酶为57kd蛋白质。由于对生长过夜的乳杆菌属培养物而言推定2×10⁹个细胞/ml，所以总计为0.48-4.0ug lacS蛋白/2×10⁸个细胞或25×10³-211×10³个交联分子/细胞。

在实施例9中，发现交联的偶氮酪蛋白分子的数量约为90％的添加的物质，总计为450ug/100ul所用的细胞溶液。发现酪蛋白为具有20-25kd范围的分子量的几种不同形式。由于对生长过夜的乳杆菌属培养物而言推定2×10⁹个细胞/ml，所以总计为450ug酪蛋白/4×10⁸个细胞或约27×10⁶个交联分子/细胞。

在实施例10中，发现交联的lacS分子的数量在80-90％，总计约为18ug/100ul所用最高lacS体积的细胞溶液。由于对生长过夜的乳杆菌属培养物而言推定2×10⁹个细胞/ml，所以总计为18ug lacS蛋白/4×10⁸个细胞或约475×10³个交联分子/细胞。

在实施例11中，发现使用冷操作步骤交联的Betv1分子数目约为10％添加的物质，总计为0.66ug/100ul所用的细胞溶液。Betv1为17kd蛋白。由于对生长过夜的乳杆菌属培养物而言推定2×10⁹个细胞/ml，所以总计为0.66ug Betv1蛋白/4×10⁸个细胞或约58×10³个交联分子/细胞。

另外在实施例11中，发现使用室温操作步骤交联的Betvl分子数目在1-2％的范围，总计约为0.2ug/100ul所用最高Betv1蛋白体积的细胞溶液。由于对生长过夜的乳杆菌属培养物而言推定2×10⁹个细胞/ml，所以总计为0.2ug Betv1蛋白/4×10⁸个细胞或约18×10³个交联分子/细胞。

在实施例1中，与细菌细胞交联的靶蛋白(β-半乳糖苷酶)具有的质量约为50kDa。因此，在包含10¹²个细胞和每个细胞约1,000个交联靶蛋白分子的1个剂量中靶蛋白的量为：

交联靶蛋白剂量＝1,000×50,000g×mol^-1×10¹²/6.02×10²³mol^-1＝83ug

实施例15.

包含表面偶联的白桦花粉变应原BetV1的乳杆菌属缀合物作为药物在通过舌下给药治疗动物模型的变态反应中的应用

15.1方法

动物：内部饲养雌性6-10周龄Balb/cJ小鼠并且使其寄居在12-小时光照、12-小时黑暗周期中的特定无病原体环境中。本文所述的所有实验均按照丹麦法规进行。

15.2BetV1嗜酸乳杆菌X37缀合物的制备

通过如下所述的反复戊二醛反应制备共价偶联的嗜酸乳杆菌X 37/BetV1变应原缀合物：

在30℃和无通风下使获自Bioneer A/S内部菌株保藏所的嗜酸乳杆菌X37在250ml MRS培养基中生长2天。收集细胞并且用100ml M9缓冲液洗涤且将所得细胞沉淀保持在-20℃下直到使用时为止。将细胞沉淀溶于125ml M9缓冲液，分成10ml部分于12支50ml Nunc试管中。向该细胞混悬液和各支10ml M9缓冲液试管中混合150ul 25％戊二醛(1.04239，Mer ck)和150ul BetV1(浓度为2.56mg/ml)且在室温下温育60分钟并且频繁混合。以4000RPM离心该混合物并且保留上清液且储存在-20℃下，以便随后使用。用10ml M9缓冲液洗涤所得细胞沉淀，重新悬浮于5ml M9中，汇集且然后离心(4000RPM)并且将所得细胞沉淀溶于最小体积的M9缓冲液。产物为2.5ml细胞混悬液，将其保持在-80℃下过夜。使用从起始交联反应保存的上清液对该细胞混悬液进行反复交联反应。将细胞混悬液分成500ul的部分加入到4支50ml Nunc试管中并且向各支试管中加入25mlBetV1(保存的上清液)、10ml丙酮和50ul 25％戊二醛。使该反应在室温下进行60分钟并且频繁混合。通过离心收集细胞，用10ml M9缓冲液洗涤并且溶于最少量的M9。产物为1.5ml细胞混悬液，将其保持在-80℃下，直到用作为免疫疗法处理时。

15.3舌下免疫疗法(SLIT)治疗

用下列产品将小鼠每周治疗5天，持续3周期限：包含通过如实施例15.2中所述室温交联法制造的与嗜酸乳杆菌X-37表面结合的Bet v1的药物(2.5ug Betv1和2.5×10⁹个细菌/剂量)；或对照组合物，其包含：a)未处理的嗜酸乳杆菌X-37(2.5×10⁹个细菌/剂量)；b)具有两种不同浓度的Bet v1(2.5和5.0ug/剂量)；或c)缓冲液。在2周SLIT处理后，给小鼠免疫接种吸附在明矾上的10ug Bet v1并且在3周治疗后再次进行。在最后一次免疫接种后11天处死小鼠，分离出脾，并且在体外如下所述再刺激脾细胞。

15.4T-细胞增殖和细胞因子产生

将来源于治疗小鼠的脾组织挑成单细胞混悬液并且用RPMI-1640(BioWhittaker，Belgium)洗涤。对细胞进行计数并且在包含50ug/mL庆大霉素(Gibco，UK)、1％Nutridoma(Roche，Germany)和1.5mM硫代甘油(Sigma，USA)的RPMI-1640中调整至1.67×10⁶个细胞/mL。将3×10⁵细胞加入到96孔平底培养板(Nunc，Denmark)的各孔中并且用Bet v1(0，5和40ug/mL)刺激细胞。将细胞在37℃下和5％CO₂气体环境中培养6天。通过在培养期的最后18小时将0.5uCi³H-胸苷加入到各孔中，随后将细胞收集在Tomtec 96孔平板收集器(Tomtec，USA)上并且使用Wallac Microbeta 1450液体闪烁计数器(Wallac，Finland)对掺入的放射性标记进行计数测定增殖。

15.5结果：

在体外使用Bet v1再刺激时，通过测定脾细胞增殖评价T-细胞反应，所述的脾细胞分离自使用包含共价偶联的白桦花粉变应原BetV1的乳杆菌属缀合物或对照组合物治疗的小鼠。附图6显示用Betv1嗜酸乳杆菌X-37缀合物预处理导致脾细胞增殖显著减少，这表明变应原反应性T细胞受到抑制且由此过敏性反应受到抑制。当使用单独的嗜酸乳杆菌X-37或Bet v1预治疗小鼠时，结果并非如此。

实施例16.

基于包含表面偶联的金黄色葡萄球菌核酸酶的乳杆菌属缀合物的金黄色葡萄球菌疫苗作为药物在治疗动物模型细菌感染中的应用

可以使用乳酸乳球菌表达系统(Madsen等，1999 Mol Microbiol.32：75-87)和实施例7中所述的方法生产用于本发明的金黄色葡萄球菌核酸酶。如实施例7中所述或使用实施例11中所述的最优化方案制备疫苗缀合物。所用的乳杆菌属菌株为嗜酸乳杆菌X37，还测试了表现出高度佐剂作用的其它菌株。如实施例18中所述在树突细胞模型中测试了不同菌株的佐剂作用。

在小鼠实验中将包含与选择的乳杆菌属菌株表面偶联的核酸酶的疫苗缀合物作为口服疫苗测试。将首次接受试验的小鼠分成4组。第1组口服接受300ul的10⁸-10¹²个细菌/ml；第2组接受相同浓度未处理的细菌；第3组接受浓度相当于所述缀合物浓度的单独的核酸酶蛋白质；且第4组接受单独的磷酸盐缓冲液。对小鼠每天一次口服给予不同治疗，持续3周。采集血样并且使用ELISA方法分析对核酸酶具有特异性的抗体。此外，测试了其它疫苗方案和策略，例如每周免疫接种一次，持续5周，或使用鼻部给药而非口服给药。

实施例17.

按照本发明方法制备变态反应疫苗和该疫苗在动物模型中的给药

将实施例11中所述的最优化化学交联技术用于制备具有与细胞表面共价结合的变应原的非致病菌。本实施例集中在生产具有来自花生或奶变应原B-乳球蛋白的变应原的疫苗。变态反应疫苗的制备使用下列步骤。

17.1.菌株选择

如实施例18和Christensen H.R.等2002，J Immunology168：171-8中所述在体外树突细胞模型中分析大量细菌菌株，优选的菌株为特征在于显著诱导Th1极化免疫反应或诱导对展示的变应原的耐受性的菌株。

17.2.变应原产生

使用基因表达系统在大肠杆菌中生产花生变应原Ara H2。将编码变应原的基因插入相容性表达载体pAMJ297并且导入乳酸乳球菌菌株，随后如Madsen S.等1999 Mol Microbiol.32：75-87所述在发酵罐中的生长培养基中培养。在发酵生长过程中由重组乳酸乳球菌细胞合成和分泌变应原。然后使用例如交叉流过滤从细胞培养物中分离上清液。使用传统的蛋白质纯化方法，例如凝胶过滤，纯化上清液中的重组变应原。将所得变应原溶于合适的缓冲液，例如M9。如实施例1中所述获得B-乳球蛋白变应原。

17.3.非致病菌细胞生物质的产生

在使用复合培养基的合适生长培养基例如用于制备动物实验和兽用疫苗的MRS(Oxoid)中培养步骤1中选择的菌株。将仅基于合成成分的生长培养基用于菌株培养以便制备应用于人体应用的疫苗，因在动物来源的生长培养基成分中存在病原体例如病毒和朊病毒的风险。用于制备人体应用的疫苗的生长培养基还应满足例如FDA颁布的安全指导原则。在发酵罐中培养后，使用例如交叉流过滤从生长培养基中分离细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮于新鲜的生长培养基或合适的缓冲液例如M9缓冲液中。通过添加等体积的50％高压灭菌甘油，可以将细胞储存在-80℃下至少1年。

17.4.交联反应和配制

使用实施例6中所述的方法交联步骤3中产生的细菌和步骤2中产生的变应原。在下列试验中评价所得的具有表面结合的变应原的菌株：使用免疫-技术，例如通过在ELISA试验中应用变应原特异性荧光标记的抗体测定表面偶联的变应原的量。或者，使用放射性标记的变应原，按照实施例6中的方法测定存在于来自交联反应的细胞提取物中的表面结合的变应原的量。此外，在显微镜分析中使用相同的抗体分析细菌表面上变应原的分布。将包含表面偶联的变应原的细胞悬浮于缓冲液例如M9缓冲液并且如步骤3中所述储存在-80℃下的甘油中。

17.5.具有表面偶联的抗原的细菌在动物变态反应模型中的测试

来自步骤4的包含表面偶联的变应原的细胞构成分成包含10⁸-10¹¹个细胞的等分部分的测试疫苗。按照下列方案给各自包含10只小鼠的4组接种测试疫苗或对照疫苗：2组接受不同量的测试疫苗；1组接受包含无表面偶联变应原的细菌细胞的对照疫苗；且剩余一组接受包含纯化的变应原的对照疫苗。使用如Repa等2004 Clln ExpImmunol.1：12-8所述的动物模型口服或鼻部给予疫苗。或者，使用变态反应模型，其中最初给小鼠免疫接种组合霍乱毒素佐剂的5ug/mL变应原以便使动物对变应原致敏。此后，通过口服以疫苗缀合物处理小鼠以便对所述反应脱敏。通过如实施例15中所述的脾细胞活化试验和IgE抗体评价来评价这一过程。花生变态反应的变态反应模型描述在Xiu-Min Li等的J allergy Clin Immunol 2000 106：1中，而对于B-乳球蛋白而言，描述在Xiu-Min Li等的Jallergy Clin Immunol2001 107：4中。将这些方案用于本发明的测试。

实施例18.

未处理的细菌和缀合物的免疫刺激作用

树突细胞(DC)在Th1、Th2和Th3细胞平衡中起关键的免疫调节作用并且存在遍及动物或人的粘膜表面。因此，DC可以为疫苗缀合物的调节靶标。在本实施例中，我们分析了本发明的疫苗缀合物在体外对DC的免疫-刺激作用。DC模型用于选择刺激所需免疫反应的细菌菌株。因此，就传统的病原体疫苗而言，优选具有高度佐剂作用的细菌菌株。然而，使免疫系统对Th1-型反应极化的细菌菌株对变态反应疫苗而言可能是理想的，而在研发癌症疫苗过程中可能优选有利于强CD8+细胞毒性T细胞反应的细菌菌株。类似地，在设计用于治疗自身免疫性疾病的疫苗缀合物中可优选诱导耐受性或抗炎作用的细菌菌株。

18.1.疫苗缀合物

如实施例10中所述制备包含与嗜酸乳杆菌X37表面偶联的β-半乳糖苷酶的疫苗缀合物。

如Lutz等在J.Immunol.Methods 1999 223：77中所述，经过少量修改，分离和培养骨髓细胞。简言之，取出来自2只8-12周龄雌性C57BL/6小鼠(Charles River Breeding Laboratories，Portage，M1)的股骨和胫骨并且剥离肌肉和腱。在将骨浸入70％乙醇2分钟并且用PBS冲洗后，用剪刀切下两端并且用27-号针头使用PBS冲洗骨髓。通过反复吸移解离细胞簇。以300×g将所得细胞混悬液离心10分钟并且用PBS洗涤一次。将细胞重新悬浮于补充了4mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、50uM 2-ME、10％(v/v)热灭活的FBS(Atlanta Biologicals，Norcross，GA)和15ng/ml鼠GM-CSF的RPMI 1640(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中。将GM-CSF作为5-10％(v/v)收集自产生GM-CSF的细胞系(GM-CSF转染的Ag 8.653骨髓瘤细胞系)的培养物上清液加入(Zal等1994 J.Immunol.Methods223：77)。使用特异性ELISA试剂盒(BD PharMingen，San Diego，CA)对产生的GM-CSF进行定量。为了富集DC，每100-mm细菌培养皿中接种包含3×10⁶个白细胞的10ml细胞混悬液(第0天)并且在37℃下和5％CO₂气体环境中温育8天。在第3天向各平板中再加入10ml新鲜制备的培养基。在第6天时，以300×g将来自各平板的9ml离心5分钟并且将所得细胞沉淀重新悬浮于10ml新鲜培养基中并且将该混悬液返回平皿中。在第8天时，如下所述将细胞用于评价乳杆菌对细胞因子释放和表面标记表达的作用。

18.2细胞因子释放的诱导

从包含8-日龄DC-富集培养物的培养皿中轻轻吸移未贴壁细胞。以300×g将收集的细胞离心5分钟并且重新悬浮于仅补充了10ng/ml GM-CSF的培养基中。以1.4×10⁶/500ul/孔将细胞接种在48-孔组织培养平板中且然后向各孔中加入下列溶液之一(100ul/孔)：a)具有表面-偶联的LacS的缀合的嗜酸乳杆菌X37(1-1000ug/ml)溶液；b)未处理的嗜酸乳杆菌X37(1-1000ug/ml)溶液；c)纯化的LacS B-半乳糖苷酶(如实施例3中所述制备，LacS浓度类似于LacS缀合物)；d)向某些培养物中加入1ug/ml LPS(大肠杆菌026：B6；Sigma-Aldrich)作为阳性对照。将单独的培养基或包含2-um胶乳珠(Polysciences，Warrington，PA)的培养基分别用作未刺激对照和阴性对照。在37℃下和5％CO₂气体环境中刺激15小时期限后，收集培养物上清液并且储存在-80℃下，直到进行细胞因子分析。

18.3培养物上清液中的细胞因子定量

使用商购ELISA试剂盒(BD PharMingen)，按照制造商的说明，分析IL-12(p70)和TNF-α。类似地使用购自BD PharMingen的匹配的Ab对分析IL-10和IL-6。

18.4结果

使用疫苗缀合物刺激的树突细胞表现出IL-12诱导作用(附图7)。此外，IL-12诱导随缀合物浓度的增加而增加。该疫苗缀合物表现出与未处理的嗜酸乳杆菌类似的IL-12诱导作用，这表明在疫苗缀合物中保存了细菌的佐剂成分。用于缀合的蛋白质(LacS)单独未显示出免疫诱导作用。

Claims (45)

1.用作包含表面展示一种或多种异源蛋白质化合物的生物载体的药物的药物组合物，包括：

a.一种或多种非致病菌株的细胞；和

b.通过双官能交联剂与所述细胞表面上的易接近的化学实体结合的一种或多种蛋白质化合物；

其中所述的细胞不包含编码所述一种或多种蛋白质化合物的转基因核酸分子，并且所述的双官能交联剂与所述细胞的氨基通过希夫碱共价键合，且

所述的蛋白质化合物和所述的交联剂对所述细胞而言为异源来源的。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述的双官能交联剂选自戊二醛、聚氮杂环丁烷和低聚甲醛。

3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述的生物载体包含非遗传修饰的菌株或遗传修饰的菌株或其组合的细胞。

4.权利要求1-3中任意一项所述的组合物，其中所述的菌株为选自乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、N群链球菌属、肠球菌属、双歧杆菌属、非致病性葡萄球菌属和非致病性芽孢杆菌属的细菌属中的成员。

5.权利要求1-4中任意一项所述的组合物，其中所述的菌株为选自乳杆菌属和双歧杆菌属的细菌属中的成员。

6.权利要求1-5中任意一项所述的组合物，其中所述的菌株为选自耐酸乳杆菌，Lactobacillus acidipiscis，嗜酸乳杆菌，敏捷乳杆菌，Lactobacillus algidus，消化乳杆菌，Lactobacillusamylolyticus，嗜淀粉乳杆菌，食淀粉乳杆菌，动物乳杆菌，Lactobacillus arizonensis，鸟乳杆菌，双发酵乳杆菌，短乳杆菌，布氏乳杆菌，干酪乳杆菌，Lactobacillus coelohominis，丘状菌落乳杆菌，棒状乳杆菌棒状亚种，棒状乳杆菌极曲亚种，卷曲乳杆菌，弯曲乳杆菌，Lactobacillus cypricasei，德氏乳杆菌保加利亚亚种，德氏乳杆菌德氏亚种，德氏乳杆菌乳亚种，Lactobacillus durianus，Lactobacillus equi，香肠乳杆菌，Lactobacillus ferintoshensis，发酵乳杆菌，Lactobacillus fornicalis，食果糖乳杆菌，Lactobacillus frumenti，Lactobacillus fuchuensis，鸡乳杆菌，加氏乳杆菌，草乳杆菌，哈氏乳杆菌，瑞士乳杆菌，瑞士乳杆菌jugurti亚种，异型腐酒乳杆菌，希氏乳杆菌，同型腐酒乳杆菌，肠乳杆菌，Lactobacillus japonicus，詹氏乳杆菌，约氏乳杆菌，高加索酸奶乳杆菌，Lactobacillus kimchii，Lactobacillus kunkeei，Lactobacillus leichmannii，Lactobacillus letivazi，林氏乳杆菌，坏发酵乳杆菌，马里乳杆菌，麦芽香乳杆菌，Lactobacillusmanihotivorans，Lactobacillus mindensis，Lactobacillusmucosae，鼠乳杆菌，Lactobacillus nagelii，口乳杆菌，面包乳杆菌，Lactobacillus pantheri，类布氏乳杆菌，类干酪乳杆菌类干酪亚种，类干酪乳杆菌subsp.pseudoplantarum，，类干酪乳杆菌坚韧亚种，类高加索酸奶乳杆菌，类消化乳杆菌，类植物乳杆菌，戊糖乳杆菌，Lactobacillus perolens，植物乳杆菌，桥乳杆菌，Lactobacillus psittaci，路氏乳杆菌，鼠李糖乳杆菌，瘤胃乳杆菌，清酒乳杆菌，唾液乳杆菌，唾液乳杆菌水杨苷亚种，唾液乳杆菌唾液亚种，旧金山乳杆菌，沙氏乳杆菌，猪双臼乳杆菌，嗜热乳杆菌，Lactobacillus thermotolerans，牛痘乳杆菌，阴道乳杆菌，Lactobacillus versmoldensis，犊乳杆菌，Lactobacillusvermiforme，玉米乳杆菌，青春双歧杆菌，Bifidobacteriumaerophilum，Bifidobacterium ahgulatum，动物双歧杆菌，星状双歧杆菌，双歧双歧杆菌，牛双歧杆菌，短双歧杆菌，链状双歧杆菌，豚双歧杆菌，棒状双歧杆菌，兔双歧杆菌，齿双歧杆菌，高卢双歧杆菌，鸡胚双歧杆菌，蜜蜂双歧杆菌，长双歧杆菌，长双歧杆菌长亚种，长双歧杆菌bv.Infantis，长双歧杆菌bv.Suis，大双歧杆菌，瘤胃双歧杆菌，最小双歧杆菌，假小链双歧杆菌，假长双歧杆菌，假长双歧杆菌球形亚种，假长双歧杆菌假长亚种，Bifidobacterium psychroaerophilum，小鸡双歧杆菌，反刍双歧杆菌，波伦亚双歧杆菌，Bifidobacterium scardovii，纤细双歧杆菌，Bifidobacterium thermoacidophilum，Bifidobacteriumthemoacidophilum subsp.suis，嗜热双歧杆菌和Bifidobacteriumurinalis的细菌属中的成员。

7.权利要求1-6中任意一项的组合物，其中所述的一种或多种蛋白质化合物为来自动物或人病原体的抗原或其变体。

8.权利要求7的组合物，其中所述的动物或人病原体选自痘病毒科，疱疹病毒科，腺病毒科，微小病毒科，乳多空病毒科，肝DNA病毒科，小RNA病毒科，杯状病毒科，呼肠孤病毒科，披盖病毒科，黄病毒科，沙粒病毒科，逆转录病毒科，本扬病毒科，正粘病毒科，副粘病毒科，弹状病毒科，虫媒病毒，肿瘤病毒，选自肝炎病毒、星状病毒和环曲病毒的未分类病毒，芽孢杆菌属，分枝杆菌属，疟虫属，朊病毒(例如导致克-雅病或变型)，霍乱，志贺氏菌属，埃希氏菌属，沙门氏菌属，棒杆菌属，疏螺旋体属，嗜血杆菌属，盘尾属，博德特氏菌属，肺炎球菌，裂体吸虫属，梭菌属，衣原体属，链球菌属，葡萄球菌属，弯曲杆菌属，军团菌属，弓形体，李斯特氏菌属，弧菌属，诺卡氏菌属，梭菌属，奈瑟氏菌属，念珠菌属，毛滴虫属，加德纳菌属，密螺旋体属，嗜血杆菌属，克雷伯氏菌属，肠杆菌属，变形菌属，假单胞菌属，沙雷氏菌属，钩端螺旋体属，表皮癣菌属，小孢子菌属，发癣菌属，支顶孢属，曲霉属，念珠菌属，镰孢霉属，帚霉属，Onychocola，小柱孢属，组织胞浆菌属，隐球菌属，芽生菌属，球孢子菌属，类球孢子菌属，接合菌，孢子丝菌属，博德特氏菌属，布氏杆菌属，巴斯德氏菌属，立克次氏体，巴尔通氏体属，耶尔森氏菌属，贾第虫属，红球菌属，耶尔森氏菌属和弓形体属。

9.权利要求1-6中任意一项的组合物，其中所述的一种或多种蛋白质化合物包含提取、纯化、重组、突变或肽来源的变应原或其变体。

10.权利要求9的组合物，其中所述的变应原的来源选自：白桦树、猫、雪松树、橄榄树、豚草、其它杂草、螫刺昆虫、蚊/蠓、蟑螂、牛、狗、尘螨类、草、户外霉菌、户内真菌、啮齿动物、马、坚果、奶、大豆、小麦、蛋、有壳水生动物和鱼。

11.权利要求9的组合物，其中所述的变应原的来源选自：白桦花粉(Bet v)、草花粉(Phl p，Lol p，Cyn d或Sor h)、房尘螨(Derp或Der f)、螨(Eur m，Blo t，Gly m，Lep d)、豚草花粉(Amb a)、雪松花粉(Cry j)、猫(Fel d)、黄蜂(Ves v或Dol m)、蜜蜂(Api m)和蟑螂(Bla g，Per a)。

12.权利要求9的组合物，其中所述的变应原为选自Bet v 1、Bet v 2、Phl p 1、Phl p 5、Lol p 1 Lol p 5、Cyn d 1、Sor h 1、Der p 1 Der p 2、Der f 1或Der f 2、Eur m 1、Blo t 1、Gly m 1、Lep d 1、Amb a 1、Cry j 1、Fel d 1、Ves v 1、2或5、Dol m 1、Dol m 2、Dol m 5、Api m 1、Bla g 1和Per a 1的蛋白质或肽。

13.权利要求1-6中任意一项的组合物，其中所述的一种或多种蛋白质化合物为动物或人癌抗原或其变体。

14.权利要求1-6中任意一项的组合物，其中所述的一种或多种蛋白质化合物为动物或人来源的自体抗原或其变体。

15.权利要求1-14中任意一项的组合物，进一步包含间隔物化合物。

16.权利要求15的组合物，其中所述的间隔物为脱乙酰壳多糖。

17.权利要求1-16中任意一项的组合物，其中每个细胞结合的蛋白质化合物的分子数目在1-约100,000的范围。

18.权利要求1-16中任意一项的组合物，其中每个细胞结合的蛋白质化合物的分子数目在1-约10,000的范围。

19.包囊制剂，包含权利要求1-18中任意一项所述的组合物。

20.权利要求1-19中任意一项的组合物在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的应用，所述的疾病选自：动物或人患者的感染性疾病、癌症、变态反应和自身免疫性疾病。

21.权利要求9-11中任意一项的组合物在制备用于预防和/或治疗动物或人患者的变态反应的药物中的应用。

22.权利要求20的组合物的应用，其中所述的感染性疾病由动物或人病原体导致，其选自：痘病毒科，疱疹病毒科，腺病毒科，微小病毒科，乳多空病毒科，肝DNA病毒科，小RNA病毒科，杯状病毒科，呼肠孤病毒科，披盖病毒科，黄病毒科，沙粒病毒科，逆转录病毒科，本扬病毒科，正粘病毒科，副粘病毒科，弹状病毒科，虫媒病毒，肿瘤病毒；未分类的病毒，其选自：肝炎病毒、星状病毒和环曲病毒，芽孢杆菌属，分枝杆菌属，疟虫属，朊病毒(例如导致克-雅病或变型)，霍乱，志贺氏菌属，埃希氏菌属，沙门氏菌属，棒杆菌属，疏螺旋体属，嗜血杆菌属，盘尾属，博德特氏菌属，肺炎球菌，裂体吸虫属，梭菌属，衣原体属，链球菌属，葡萄球菌属，弯曲杆菌属，军团菌属，弓形体，李斯特氏菌属，弧菌属，诺卡氏菌属，梭菌属，奈瑟氏菌属，念珠菌属，毛滴虫属，加德纳菌属，密螺旋体属，嗜血杆菌属，克雷伯氏菌属，肠杆菌属，变形菌属，假单胞菌属，沙雷氏菌属，钩端螺旋体属，表皮癣菌属，小孢子菌属，发癣菌属，支顶孢属，曲霉属，念珠菌属，镰孢霉属，帚霉属，Onychocola，小柱孢属，组织胞浆菌属，隐球菌属，芽生菌属，球孢子菌属，类球孢子菌属，接合菌，孢子丝菌属，博德特氏菌属，布氏杆菌属，巴斯德氏菌属，立克次氏体，巴尔通氏体属，耶尔森氏菌属，贾第虫属，红球菌属，耶尔森氏菌属和弓形体属。

23.用于预防和/或治疗动物或人患者的疾病或变态反应的方法，其中对所述的患者给予有效剂量的权利要求1-22中任意一项所述的组合物。

24.权利要求23的方法，其中所述的疾病选自感染性疾病、癌症、变态反应和自身免疫性疾病。

25.制备权利要求1所述的药物组合物的方法，该药物组合物包含表面展示一种或多种异源蛋白质化合物的生物载体，所述的方法包含下列步骤：

a.制备混合物，其包含：

i.一种或多种菌株的细胞；和

ii.一种或多种异源蛋白质化合物；和

iii.异源双官能交联剂；

b.温育所述的混合物以便形成所述的生物载体，其中所述的双官能交联剂与所述细胞的氨基通过希夫碱共价键合；和

c.从所述的混合物中分离所述的生物载体；

其中所述的细胞不含编码所述一种或多种蛋白质化合物的转基因核酸分子。

26.权利要求25所述的方法，其中所述的双官能交联剂选自戊二醛、聚氮杂环丁烷和低聚甲醛。

27.权利要求25或26所述的方法，其中在低于0℃的温度下温育步骤(b)中所述的混合物。

28.权利要求25或26所述的方法，其中所述的温度为-1℃到-30℃。

29.权利要求25-28中任意一项的方法，其中所述的生物载体包含非遗传修饰的菌株或遗传修饰的菌株的细胞。

30.权利要求25-29中任意一项的方法，其中所述的菌株为选自乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、N群链球菌属、肠球菌属、双歧杆菌属、非致病性葡萄球菌属和非致病性芽孢杆菌属的细菌属中的成员。

31.权利要求30所述的方法，其中所述的菌株为选自乳杆菌属和双歧杆菌属的细菌属中的成员。

32.权利要求31所述的方法，其中所述的菌株为选自耐酸乳杆菌，Lactobacillus acidipiscis，嗜酸乳杆菌，敏捷乳杆菌，Lactobacillus algidus，消化乳杆菌，Lactobacillus amylolyticus，嗜淀粉乳杆菌，食淀粉乳杆菌，动物乳杆菌，Lactobacillusarizonensis，鸟乳杆菌，双发酵乳杆菌，短乳杆菌，布氏乳杆菌，干酪乳杆菌，Lactobacillus coelohominis，丘状菌落乳杆菌，棒状乳杆菌棒状亚种，棒状乳杆菌极曲亚种，卷曲乳杆菌，弯曲乳杆菌，Lactobacillus cypricasei，德氏乳杆菌保加利亚亚种，德氏乳杆菌德氏亚种，德氏乳杆菌乳亚种，Lactobacillus durianus，Lactobacillus equi，香肠乳杆菌，Lactobacillus ferintoshensis，发酵乳杆菌，Lactobacillus fornicalis，食果糖乳杆菌，Lactobacillus frumenti，Lactobacillus fuchuensis，鸡乳杆菌，加氏乳杆菌，草乳杆菌，哈氏乳杆菌，瑞士乳杆菌，瑞士乳杆菌jugurti亚种，异型腐酒乳杆菌，希氏乳杆菌，同型腐酒乳杆菌，肠乳杆菌，Lactobacillus japonicus，詹氏乳杆菌，约氏乳杆菌，高加索酸奶乳杆菌，Lactobacillus kimchii，Lactobacillus kunkeei，Lactobacillus leichmannii，Lactobacillus letivazi，林氏乳杆菌，坏发酵乳杆菌，马里乳杆菌，麦芽香乳杆菌，Lactobacillusmanihotivorans，Lactobacillus mindensis，Lactobacillusmucosae，鼠乳杆菌，Lactobacillus nagelii，口乳杆菌，面包乳杆菌，Lactobacillus pantheri，类布氏乳杆菌，类干酪乳杆菌类干酪亚种，类干酪乳杆菌pseudoplantarum亚种，类干酪乳杆菌坚韧亚种，类高加索酸奶乳杆菌，类消化乳杆菌，类植物乳杆菌，戊糖乳杆菌，Lactobacillus perolens，植物乳杆菌，桥乳杆菌，Lactobacilluspsittaci，路氏乳杆菌，鼠李糖乳杆菌，瘤胃乳杆菌，清酒乳杆菌，唾液乳杆菌，唾液乳杆菌水杨苷亚种，唾液乳杆菌唾液亚种，旧金山乳杆菌，沙氏乳杆菌，猪双臼乳杆菌，嗜热乳杆菌，Lactobacillus thermotolerans，牛痘乳杆菌，阴道乳杆菌，Lactobacillus versmoldensis，犊乳杆菌，Lactobacillusvermiforme，玉米乳杆菌，青春双歧杆菌，Bifidobacteriumaerophilum，角双歧杆菌，动物双歧杆菌，星状双歧杆菌，双歧双歧杆菌，牛双歧杆菌，短双歧杆菌，链状双歧杆菌，豚双歧杆菌，棒状双歧杆菌，兔双歧杆菌，齿双歧杆菌，高卢双歧杆菌，鸡胚双歧杆菌，蜜蜂双歧杆菌，长双歧杆菌，长双歧杆菌长亚种，长双歧杆菌bv.Infantis，长双歧杆菌bv.Suis，大双歧杆菌，瘤胃双歧杆菌，最小双歧杆菌，假小链双歧杆菌，假长双歧杆菌，假长双歧杆菌球形亚种，假长双歧杆菌假长亚种，Bifidobacteriumpsychroaerophilum，小鸡双歧杆菌，反刍双歧杆菌，波伦亚双歧杆菌，Bifidobacterium scardovii，纤细双歧杆菌，Bifidobacteriumthermoacidophilum，Bifidobacterium thermoacidophilum subsp.suis，嗜热双歧杆菌和Bifidobacterium urinalis的细菌物种的成员。

33.权利要求25-32中任意一项的方法，其中所述的一种或多种蛋白质化合物为来自动物或人病原体的抗原或其变体。

34.权利要求33的方法，其中所述的动物或人病原体选自痘病毒科，疱疹病毒科，腺病毒科，微小病毒科，乳多空病毒科，肝DNA病毒科，小RNA病毒科，杯状病毒科，呼肠孤病毒科，披盖病毒科，黄病毒科，沙粒病毒科，逆转录病毒科，本扬病毒科，正粘病毒科，副粘病毒科，弹状病毒科，虫媒病毒，肿瘤病毒；未分类的病毒，其选自肝炎病毒、星状病毒和环曲病毒；芽孢杆菌属，分枝杆菌属，疟虫属，朊病毒(例如导致克-雅病或变型)，霍乱，志贺氏菌属，埃希氏菌属，沙门氏菌属，棒杆菌属，疏螺旋体属，嗜血杆菌属，盘尾属，博德特氏菌属，肺炎球菌，裂体吸虫属，梭菌属，衣原体属，链球菌属，葡萄球菌属，弯曲杆菌属，军团菌属，弓形体，李斯特氏菌属，弧菌属，诺卡氏菌属，梭菌属，奈瑟氏菌属，念珠菌属，毛滴虫属，加德纳菌属，密螺旋体属，嗜血杆菌属，克雷伯氏菌属，肠杆菌属，变形菌属，假单胞菌属，沙雷氏菌属，钩端螺旋体属，表皮癣菌属，小孢子菌属，发癣菌属，支顶孢属，曲霉属，念珠菌属，镰孢霉属，帚霉属，Onychocola，小柱孢属，组织胞浆菌属，隐球菌属，芽生菌属，球孢子菌属，类球孢子菌属，接合菌，孢子丝菌属，博德特氏菌属，布氏杆菌属，巴斯德氏菌属，立克次氏体，巴尔通氏体属，耶尔森氏菌属，贾第虫属，红球菌属，耶尔森氏菌属和弓形体属。

35.权利要求25-34中任意一项的方法，其中所述的一种或多种蛋白质化合物为提取、纯化、重组、突变或肽来源的变应原或其变体。

36.权利要求33的方法，其所述的变应原的来源选自：白桦树、猫、雪松树、橄榄树、豚草、其它杂草、螫刺昆虫、蚊/蠓、蟑螂、牛、狗、尘螨类、草、户外霉菌、户内真菌、啮齿动物、马、坚果、奶、大豆、小麦、蛋、有壳水生动物和鱼。

37.权利要求35的方法，其中所述的变应原的来源选自白桦花粉(Bet v)、草花粉(Phl p，Lol p，Cyn d或Sor h)、房尘螨(Der p或Der f)、螨(Eur m，Blo t，Gly m，Lep d)、豚草花粉(Amb a)、雪松花粉(Cry j)、猫(Fel d)、黄蜂(Ves v或Dol m)、蜜蜂(Api m)和蟑螂(Bla g，Per a)。

38.权利要求35的方法，其中所述的变应原为选自Bet v 1，Betv 2、Phl p 1、Phl p 5、Lol p 1、Lol p 5、Cyn d 1、Sor h 1、Der p 1、Der p 2、Der f 1或Der f 2、Eur m 1、Blo t 1、Gly m1、Lep d 1、Amb a 1、Cry j 1、Fel d 1、Ves v 1，2或5、Dol m 1、Dol m 2、Dol m 5、Api m 1、Bla g 1和Per a 1的蛋白质或肽。

39.权利要求25-32中任意一项的方法，其中所述的一种或多种蛋白质化合物为动物或人癌抗原或其变体。

40.权利要求25-34中任意一项的方法，其中所述的一种或多种蛋白质化合物为动物或人来源的自体抗原或其变体。

41.权利要求25-40中任意一项的方法，其中所述的混合物进一步包含间隔物化合物。

42.权利要求37的方法，其中所述的间隔物为脱乙酰壳多糖。

43.权利要求23-38中任意一项的方法，其中每个细胞结合的蛋白质化合物的分子数目为1-约100,000。

44.权利要求23-38中任意一项的方法，其中每个细胞结合的蛋白质化合物的分子数目为1-约10,000。

45.权利要求23-40中任意一项的方法，进一步包括包囊所述的生物载体的步骤。

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