CN112159377B - 一种近红外发射同时识别h2s、hso3-的荧光探针及其应用 - Google Patents

一种近红外发射同时识别h2s、hso3-的荧光探针及其应用 Download PDF

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Abstract

一种近红外发射同时识别H2S、HSO3 ‑的荧光探针及其应用，该荧光探针L的结构式为：
Figure DDA0002727154180000011
通过简单温和的反应即可制备具有D‑π‑A结构同时识别H2S和HSO3 ‑的荧光探针L；荧光探针L合成方法简单，可在EtOH:HEPES＝2:8(v/v,pH＝7.4)缓冲溶液中同时识别H2S和HSO3 ‑，具有高度的选择性和良好的灵敏度，并可应用到实际水样、细胞和红酒中检测H2S，在白糖样品中检测HSO3 ‑。

Description

一种近红外发射同时识别H2S、HSO3-的荧光探针及其应用
技术领域
本发明涉及一种具有供体-π-受体(D-π-A)结构、近红外发射识别H2S、HSO3 -荧光探针及其合成方法和应用。
背景技术
硫化氢(H2S)具有非常强烈的臭鸡蛋气味，被认为是除了一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)之外第三个气态信号分子。多项研究结果表明，H2S作为一种生物调节剂和气态信号传导因子，在缺血性心脏病，动脉粥样硬化，高血压，唐氏综合症和其他多种心血管疾病中起着重要的病理作用。H2S也是葡萄酒发酵的常见成分，对葡萄酒的质量产生负面影响，会导致了葡萄酒的质量下降，可能带来巨大的经济损失，还可能面临食品安全方面的问题。由于H2S的分解速度快，会导致浓度的波动变化，难以精确分析。因此，需要快速响应和高选择性地检测H2S。
亚硫酸氢盐/亚硫酸盐(HSO3 -/SO3 2-)阴离子广泛用作食品，饮料和药品的基本防腐剂，以防止生产和储存过程中的氧化、褐变和微生物反应。然而，长期和频繁接触高剂量亚硫酸盐可引起不良反应和急性症状，包括皮炎，荨麻疹，低血压，腹痛和腹泻等症状。由于潜在的健康问题，许多国家的食品中HSO3 -(或SO3 2-)的含量受到严格限制。因此，开发简便，快速的有效方法，在环境和生物科学中灵敏的监测HSO3 -(或SO3 2-)是非常重要的。
目前，已开发出几种技术，如电化学分析，气相色谱和硫化沉淀，用于检测H2S和SO3 2-。然而，这些方法需要繁琐的样品和试剂制备或复杂的仪器，不适合常规实验室和现场分析。荧光和紫外分析提供了良好的替代品，因为它们成本低，操作简单，仪器实施简单，响应速度快，选择性好。目前，已经设计了很多用于H2S检测的荧光探针，它们利用了一些特定的化学反应，包括叠氮化物/硝基的还原，Cu(II)配合物脱除金属，亲核取代反应及二硝基苯醚硫解等原理实现对H2S的识别。同样，许多识别HSO3 -(或SO3 2-)的荧光探针也被开发，一般基于乙酰丙酸基团的选择性脱除，与醛基的加成以及迈克尔加成反应等原理。但是目前能实现同时识别H2S和HSO3 -的荧光探针报道的相对较少。Analyst(2014),139,3373和Sensors&Actuators:B.Chemical(2018),277,647-653两篇文献虽然能对HSO3 -和HS-进行双识别，但是合成复杂，不能近红外发射，不能在食品样品中进行识别。Dyes and Pigments(2019),160,757-764，虽然能在食品样品中检测HSO3 -，但是合成复杂，发射波长较短，不能排除背景荧光的干扰。RSC Advances(2016),6,85529-85537，虽然能近红外发射，但是合成复杂，不能在食品样品中检测HSO3 -和H2S。可见，现有报道的荧光探针均有一定的局限性，因此开发合成简单，能近红外发射，可以在水样、细胞和食品样品中检测HSO3 -和H2S的荧光探针具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种近红外发射同时识别H2S和HSO3 -的荧光探针及其应用，该荧光探针具有合成路线简单，近红外发射，可在水介质、细胞和食品样品中对H2S和HSO3 -实现识别，具有特异选择性、灵敏性和识别快速等优点。
本发明的技术方案是：
一种近红外发射同时识别H2S、HSO3 -的荧光探针，该荧光探针L具有D-π-A结构，其结构式如下：
Figure BDA0002727154160000021
进一步的，所述近红外发射同时识别H2S、HSO3 -的荧光探针，其具体合成步骤如下：
以干CH2Cl2为溶剂，将三氰基呋喃衍生物、2,4-二硝基苯磺酰氯、三乙胺按照摩尔比1:(1～2):(1～3)进行投料，冰浴条件下加入2,4-二硝基苯磺酰氯，室温下搅拌8小时～24小时，反应结束后，干燥旋干得到的粗产物用柱层析进行洗脱，用乙酸乙酯(EA)和石油醚(PE)作为洗脱剂进行分离，得到荧光探针L
Figure BDA0002727154160000022
所述乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:3～1:10。
一种近红外发射同时识别H2S和HSO3 -荧光探针的应用，其特殊之处在于：在pH＝4～10、体积比为2:8的乙醇与HEPES的缓冲溶液中对H2S、HSO3 -进行检测，所述应用为非疾病诊断和非疾病治疗目的。
一种近红外发射同时识别H2S和HSO3 -荧光探针的应用，其特殊之处在于：在体积比为2:8的乙醇与水样中对H2S、HSO3 -进行检测，所述应用为非疾病诊断和非疾病治疗目的。
一种近红外发射同时识别H2S和HSO3 -荧光探针的应用，其特殊之处在于：在体积比为2:8的乙醇与酒样中对H2S、HSO3 -进行检测，所述应用为非疾病诊断和非疾病治疗目的。
一种近红外发射同时识别H2S和HSO3 -荧光探针的应用，其特殊之处在于：在细胞中对H2S进行检测，所述应用为非疾病诊断和非疾病治疗目的。
本发明的有益效果：
所设计合成的荧光探针合成过程简单，分离提纯容易；荧光探针可以在水介质中近红外发射(643nm)荧光增强识别H2S，荧光淬灭识别HSO3 -，具有高度的选择性和良好的灵敏度，并可应用到水样和食品样品中检测H2S和HSO3 -；识别H2S的检测限达到10-8mol/L，识别HSO3 -的检测限达到10-6mol/L；此外，该荧光探针可以作为非疾病诊断和非疾病治疗目的应用到细胞中检测H2S。
附图说明
图1是本发明荧光探针L的1H NMR谱图；
图2是本发明荧光探针L的13C NMR谱图；
图3是本发明荧光探针L的质谱谱图；
图4是本发明荧光探针L与Br-，CrO4 2-，I-，NO2 -，CO3 2-，HCO3 -，CH3COO-，HPO4 2-，H2PO4 -，PO4 3-，SCN-，HS-，SO4 2-，SO3 2-，HSO3 -，HSO4 -，N3 -，S2O3 2-作用前后的荧光发射光谱图；
图5是本发明荧光探针L对HS-识别时抗其他金属离子干扰的荧光检测图；
图6是本发明荧光探针L对HSO3 -识别时抗其他金属离子干扰的荧光检测图；
图7是本发明荧光探针L与不同倍数H2S作用前后的荧光发射光谱变化图；
图8是本发明荧光探针L与不同倍数HSO3 -作用前后的荧光发射光谱变化图；
图9是本发明荧光探针L识别H2S的检测限图；
图10是本发明荧光探针L识别HSO3 -的检测限图；
图11是本发明荧光探针L识别H2S时间响应图；
图12是本发明荧光探针L识别HSO3 -时间响应图；
图13是本发明荧光探针L识别H2S、HSO3 -pH响应图；
图14是本发明荧光探针L在实际水样中与不同浓度H2S作用后的变化图；
表1是本发明荧光探针L在红酒样品中检测不同浓度H2S的回收率表；
表2是本发明荧光探针L在白糖样品中与不同浓度HSO3 -作用后的回收率表；
图15是本发明荧光探针L在MCF-7细胞中与不同浓度H2S作用后的变化图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1：
荧光探针L的具体合成步骤如下：
Figure BDA0002727154160000041
化合物1(374.4mg，1.0mmol)，三乙胺(101.0mg，1.0mmol)溶解在干CH2Cl2中，在冰浴搅拌条件下缓慢滴加2,4-二硝基苯磺酰氯(266.6mg，1.0mmol)，然后在室温下搅拌8小时。反应结束后旋干，所得粗产物经薄层柱色谱纯化，利用EA：PE＝1:10～1:3(v/v)做梯度洗脱，得到302.07mg探针L，产率50％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.15(d,J＝2.2Hz,1H),8.70(dd,J＝8.6,2.0Hz,1H),8.42(d,J＝8.7Hz,1H),8.05(d,J＝9.3Hz,1H),7.93(d,J＝15.9Hz,1H),6.95(d,J＝15.9Hz,1H),6.87(d,J＝7.4Hz,1H),6.31(d,J＝2.1Hz,1H),3.39(dd,J＝14.0,7.0Hz,4H),1.69(s,6H),1.03(t,J＝7.0Hz,6H).
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ177.87,140.51,134.07,131.12,129.09,128.14,112.38,44.99,40.56,40.35,40.14,39.93,39.72,39.51,39.31,25.62,12.68.
HRMS(ESI+)calcd for:C28H24N6NaO8S+[M+Na]+:627.1269,found:627.0507.
实施例2：
荧光探针L的具体合成步骤如下：
化合物1(374.4mg，1.0mmol)，三乙胺(202.0mg，2mmol)溶解在干CH2Cl2中，在冰浴搅拌条件下缓慢滴加2,4-二硝基苯磺酰氯(399.9mg，1.5mmol)，随后室温搅拌16小时。结束后旋干得到粗产物，粗产物经薄层柱色谱纯化，利用EA：PE＝1:10～1:3(v/v)做梯度洗脱，得到392.67mg探针L，产率65％。本实施例荧光探针L的1H NMR谱图如图1，13C NMR谱图如图2，高分辨质谱如图3所示。
实施例3：
荧光探针L的具体合成步骤如下：
化合物1(374.4mg，1.0mmol)，三乙胺(303.0mg，3mmol)，溶解在干CH2Cl2中，在冰浴搅拌条件下缓慢滴加2,4-二硝基苯磺酰氯(533.2mg，2mmol)，然后室温搅拌24小时。反应结束后旋干溶剂，所得粗产物经薄层柱色谱纯化，用EA：PE＝1:0～1:3(v/v)做梯度洗脱，得到362.48mg探针L，产率60％。本实施例荧光探针L的1H NMR谱图如图1，13C NMR谱图如图2，高分辨质谱如图3所示。
荧光探针L对H2S和HSO3 -选择性的检测：
10μmol/L荧光探针L的EtOH:HEPES＝2:8(v/v,pH＝7.4)缓冲溶液，向其中分别加入20μL(50mmol/L)18种阴离子(Br-，CrO4 2-，I-，NO2 -，CO3 2-，HCO3 -，CH3COO-，HPO4 2-，H2PO4 -，PO4 3-，SCN-，HS-，SO4 2-，SO3 2-，HSO3 -，HSO4 -，N3 -，S2O3 2-)，用560nm激发波长下激发后，检测溶液的荧光发射光谱变化。从图4中可以看出，当加入阴离子时，只有HS-(作为H2S的来源)可以引起荧光强度显著变化，即加入HS-后发射波长643nm处的荧光强度显著增强，而其他阴离子的加入对荧光强度没有明显影响，由此可知，荧光探针L对H2S有高度的选择性。此外，加入HSO3 -后能引起643nm处的荧光强度淬灭，而其他阴离子没有引起此变化，说明探针L可荧光淬灭识别HSO3 -，具有较高的选择性。
荧光探针L识别H2S的抗干扰检测：
10μmol/L荧光探针L的EtOH:HEPES＝2:8(v/v,pH＝7.4)溶液，向其中分别加入20μL(50mmol/L)18种阴离子(Br-，I-，NO2 -，CrO4 2-，CO3 2-，HCO3 -，CH3COO-，HPO4 2-，H2PO4 -，PO4 3-，SCN-，HS-，SO4 2-，SO3 2-，HSO3 -，HSO4 -，N3 -，S2O3 2-)，检测溶液的荧光发射光谱，然后向含有各个阴离子的溶液中分别再加入20μL(50mmol/L)的HS-，检测溶液的荧光发射光谱，取最大发射波长643nm处所对应的强度值作图，如图5所示。由图5可知，即使有其他阴离子存在时，HS-均能使探针L荧光增强，说明探针L只对H2S有荧光增强识别，不受其他阴离子的干扰。
荧光探针L识别HSO3 -的抗干扰检测：
10μmol/L荧光探针L的EtOH:HEPES＝2:8(v/v,pH＝7.4)溶液，向其中分别加入20μL(50mmol/L)18种阴离子(Br-，CrO4 2-，I-，NO2 -，CO3 2-，HCO3 -，CH3COO-，HPO4 2-，H2PO4 -，PO4 3-，SCN-，HS-，SO4 2-，SO3 2-，HSO3 -，HSO4 -，N3 -，S2O3 2-)，检测溶液的荧光发射光谱，然后向含有各个阴离子的溶液中分别再加入20μL(50mmol/L)的HSO3 -，检测溶液的荧光发射光谱，取最大发射波长643nm处所对应的值作图，如图6所示。由图6可知，即使有其他阴离子存在时，HSO3 -也能导致探针L荧光淬灭，说明探针L荧光淬灭识别HSO3 -不受其他阴离子的干扰。
荧光探针L对H2S的滴定测试：
10μmol/L的荧光探针L的EtOH:HEPES＝2:8(v/v,pH＝7.4)缓冲溶液，分别加入0～4.8倍(50mmol/L)的HS-，检测溶液的荧光发射光谱变化，如图7所示。从图7中可以看出，随着HS-浓度的不断加入，在643nm处的发射峰强度逐渐升高，当加入4.8倍的HS-时，在643nm处的发射峰强度不再升高，说明此时达到了饱和。
荧光探针L对HSO3 -的滴定测试：
10μmol/L的荧光探针L的EtOH:HEPES＝2:8(v/v,pH＝7.4)缓冲溶液，分别加入0～60倍(50mmol/L)的HSO3 -，检测溶液的荧光发射光谱变化，如图8所示。从图8中可以看出，随着HSO3 -不断加入，在643nm处的发射峰强度逐渐下降，当加入60倍的HSO3 -时，荧光发射强度达到最低，说明此时达到了饱和。
荧光探针L对H2S的检测限测试：
在探针L的EtOH:HEPES＝2:8(v/v,pH＝7.4)缓冲溶液中，测试了不少于11个平行样的荧光强度，根据公式∑(Xi-X)2＝(X1-X)2+(X2-X)2+……+(Xn-X)2求出平方差的总和(Xi为每次测量受体本身荧光强度值，X为荧光强度平均值，n为测试次数，n大于等于11)，然后根据公式S＝[∑(Xi-X)2/(n-1)]0.5求出S，再根据检测限公式3S/K，K为所选直线部分的斜率(注：直线是根据滴定做点图，横坐标为离子浓度，纵坐标为荧光强度)，求出检测线为1.34×10-8mol/L(见图9)，达到了纳摩尔级，这说明该探针有较低的检测限，可检测含量较低浓度的H2S，具有较高的灵敏度，有一定的实际应用价值。
荧光探针L对HSO3 -的检测限测试：
在探针L的EtOH:HEPES＝2:8(v/v,pH＝7.4)缓冲溶液中，根据猝灭型公式：横坐标X＝Log[HSO3 -]，纵坐标Y＝(Imax-I)/(Imax-Imin)(其中Imax＝荧光最大值，Imin＝荧光最小值，I为变量)。求出：Y＝A+BX，Y＝0时，求出检测限＝10-A/B。经计算检测限为4.67×10-6mol/L(见图10)，达到了微摩尔级，这说明该探针有较低的检测限，可检测低浓度的HSO3 -，具有较高的灵敏度，有潜在的实际应用价值。
荧光探针L对H2S的响应时间测试：
在探针L的EtOH:HEPES＝2:8(v/v,pH＝7.4)缓冲溶液中，加入4.8倍HS-后测试不同时间643nm处的荧光强度变化，从图11中可以看出，随着时间延长探针荧光强度逐渐增强，在2分钟左右达到最高值并呈稳定趋势，说明探针L对H2S的识别在2分钟内即可完成，具有快速检测的能力。
荧光探针L对HSO3 -的响应时间测试：
在探针L的EtOH:HEPES＝2:8(v/v,pH＝7.4)缓冲溶液中，加入60倍HSO3 -后测试不同时间643nm处的荧光强度变化，从图12中可以看出，随着时间延长探针荧光强度逐渐降低，在80分钟左右达到最低值并呈稳定趋势，说明探针L对HSO3 -的识别在80分钟内完成。
荧光探针L对H2S、HSO3 -的pH响应测试：
为了证实探针L的实用性，我们验证了pH对L加H2S、HSO3 -前后的荧光变化。如图13所示，探针L在pH 3-11时有一定的荧光强度，随后向探针L中加入HS-，在pH 4-9时有明显的荧光增强，说明探针L能够在较宽的pH范围内检测H2S。向探针溶液中加入HSO3 -，在pH为2-13范围内有明显的荧光减弱，说明探针L可在3-11范围内检测HSO3 -。通过综合分析，探针L只在pH为4-9范围内可同时对H2S、HSO3 -进行检测，
本发明的荧光探针对H2S和HSO3 -的检测原理如下：
Figure BDA0002727154160000071
含有2,4-二硝基苯磺酰基的荧光探针L，由于具有供体激发态光诱导电子转移(d-PET)作用，使L的荧光淬灭；当加入HS-时，由于HS-可以使2,4-二硝基苯磺酸酯硫解，脱除二硝基化合物，生成具有D-π-A结构的前体化合物1，由于化合物1中存在分子内电荷转移(ICT)作用，进而使L具有较长的发射波长，而且可以荧光增强识别H2S。当加入HSO3 -时，由于HSO3 -可以与L中的C-C双键发生亲核加成，加成后破坏了D-π-A结构，抑制了ICT作用，从而使荧光淬灭。
荧光探针L在实际水样中检测H2S：
为了检验探针L对H2S的实际应用性，我们首先研究了L在实际水样中的应用。每个水样品中分别掺入不同浓度的HS-离子，然后向样品中加入探针L(10μM)在这些实际水样中可以观察到荧光强度和加入HS-浓度(0.5～4.5μM)之间呈现良好的线性关系，如图14所示。因此，探针L具有在环境水样中定量检测H2S的潜在应用。
荧光探针L在红酒样品中检测H2S：
为了检验探针L对H2S的实际应用性，我们测试了在红酒样品中L的潜在应用。将超市购买的3种不同品牌的红酒稀释100倍，将乙醇与红酒按体积比为2:8做成混合溶液，在用混合溶液制备10μM的探针L溶液，然后向探针L溶液中分别加入50μM，100μM，150μM三个浓度的HS-，测试荧光强度，做3组平行样，计算浓度，得到的回收率如表1所示，回收率在88％～106％之间，标准偏差在2.5％以内，说明探针L可灵敏检测红酒中的H2S，具有在食品样品中检测H2S的潜在应用。
荧光探针L在白糖样品中检测HSO3 -：
为了检验探针L对HSO3 -的实际应用性，我们测试了L在白糖样品中的应用。将购买的两种白糖分别称量0.5克，加入25mL的EtOH:HEPES＝2:8(v/v,pH＝7.4)缓冲溶液使其溶解，用此溶液配置10μM的探针L溶液，然后向探针L溶液中分别加入不同浓度的HSO3 -，测试荧光强度，做3组平行样，计算浓度，得到的回收率如表2所示，回收率在102％～140％之间，说明探针L可检测白糖中的HSO3 -，可潜在应用于食品样品中检测HSO3 -。
荧光探针L在细胞中检测H2S：
我们用MTT法检测探针L对MCF-7细胞的毒性，把10μM探针L与MCF-7细胞培养24小时，细胞存活率仍接近100％，说明探针L对MCF-7细胞的毒性很低。随后用MCF-7细胞进行活细胞成像实验，将MCF-7细胞与探针L(10μM)在37℃培养30分钟，然后MCF-7细胞用PBS缓冲液洗三次，再加入HS-(1，10μM)培养30分钟，观察红色荧光亮度随HS-浓度增加而增强(见图15)，这些结果表明探针L具有良好的细胞渗透性，能够检测MCF-7细胞中的H2S，也表明探针L具有在生物中检测H2S作为非疾病诊断和非疾病治疗目的潜在应用。
以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种近红外发射同时识别H2S、HSO3 -的荧光探针，其特征是：该荧光探针L具有D-π-A结构，其结构式如下：
Figure QLYQS_1
。
2.根据权利要求1所述的近红外发射同时识别H2S、HSO3 -的荧光探针L的应用，其特征是：在体积比为2:8的EtOH与HEPES缓冲溶液中，探针L可对H2S、HSO3 -进行检测，所述应用为非疾病诊断和非疾病治疗目的。
3.根据权利要求2所述的近红外发射同时识别H2S、HSO3 -的荧光探针L的应用，其特征是：在pH为4～9，体积比为2:8的EtOH与HEPES缓冲溶液中，探针L可同时对H2S、HSO3 -进行检测，所述应用为非疾病诊断和非疾病治疗目的。
4.根据权利要求1所述的近红外发射同时识别H2S、HSO3 -的荧光探针L的应用，其特征是：在乙醇与实际水样体积比为2:8的混合溶液中对H2S进行检测，所述应用为非疾病诊断和非疾病治疗目的。
5.根据权利要求1所述的近红外发射同时识别H2S、HSO3 -的荧光探针L的应用，其特征是：在乙醇与红酒体积比为2:8的混合溶液中对H2S进行检测，所述应用为非疾病诊断和非疾病治疗目的。
6.根据权利要求1所述的近红外发射同时识别H2S、HSO3 -的荧光探针L的应用，其特征是：在细胞中对H2S进行检测，所述应用为非疾病诊断和非疾病治疗目的。
7.根据权利要求1所述的近红外发射同时识别H2S、HSO3 -的荧光探针L的应用，其特征是：在白糖样品中检测HSO3 -，所述应用为非疾病诊断和非疾病治疗目的。
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