CN108051415B

CN108051415B - 一种荧光比率检测六价铬离子的方法

Info

Publication number: CN108051415B
Application number: CN201711309447.7A
Authority: CN
Inventors: 张迪; 贾斌; 刘冬梅; 尹海燕; 刘继红; 李漫; 王铁良; 王允; 王红旗
Original assignee: Institute Of Agricultural Quality Standards And Testing Technology Henan Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Agricultural Quality Standards And Testing Technology Henan Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2037-12-11
Also published as: CN108051415A

Abstract

本发明提供了一种荧光比率检测六价铬离子的方法，是基于一种罗丹明衍生物（Rhodol hydrazide）比率检测六价铬离子（Cr(VI)）的方法。具体检测方法是：将Rhodol hydrazide作为荧光试剂，在10 mM的硫酸溶液中，通过测定两个不同波长（577 nm和502 nm）的荧光发射强度比率作为定量依据，实现对六价铬离子的比率检测。该检测方法，对六价铬离子显示了高的选择性和灵敏性，检测过程简便、抗干扰能力强、快速、灵敏，检测结果准确。

Description

一种荧光比率检测六价铬离子的方法

技术领域

本发明涉及六价铬离子的检测技术，具体涉及一种荧光比率检测六价铬离子的方法。

背景技术

铬是人体必须是微量元素之一，但是自然界中铬的存在是多样性的，适量的三价态的铬是人体必须的，而六价铬是致癌物质，它的毒性是三价铬的100倍。六价铬离子（Cr(VI)）是铬的最高氧化态形式，在酸性水溶液中，Cr(VI)以重铬酸根（Cr₂O₇ ²⁻）形式存在，而在碱性水溶液中，Cr(VI)以重铬酸根（CrO₄ ²⁻）形式存在。不管以哪种形式存在，六价铬离子都具有剧毒，人体在接触或摄入含有该离子的水或者食物后，会对皮肤、粘膜、呼吸道、肺和肾脏等组织器官造成严重损害，甚至引发癌变。因此，准确分析测定样品中六价铬离子的含量对于监控环境质量、饮用水、农产品质量安全非常重要。

近年来，铬离子的分析检测技术不断发展，科学家们开发出了多种铬离子测定的方法和仪器，例如：离子色谱法、分光光度法、荧光光谱法和原子吸收/发射光谱法等，但这些检测方法多是对总铬浓度的测定，不能专一的检测六价铬的浓度。这些常规检测存在检测成本高、样品前处理过程复杂、测试过程时间较长等问题。因此，研究一种简单、方便、快捷检测饮用水及农产品中六价铬的快速检测方法非常重要。

近年来发展起来的有机荧光分子传感技术，因其高灵敏性、高选择性、无需分离、易于观测等优点而被应用于各种离子的检测。因此，设计荧光探针用来快速检测六价铬离子变得非常有意义。荧光探针法与传统检测方法相比表现出了更为吸引人的优点。第一，具有高的选择性和特异性，可以实现对靶标分子、离子的专一性识别；第二，荧光探针法的灵敏度比较高，从而使得它的检测限相比于其他方法比较低，实现了对被检测物的痕量检测；第四，荧光探针法的操作是比较简单的，并且可以实现实时在线检测，避免了传统样品在处理阶段的耗时以及其他干扰因素。因此基于荧光探针法检测饮用水及农产品中六价铬的方法可以满足简单、快速、灵敏的检测要求。

发明内容

本发明提出一种荧光比率检测六价铬离子的方法，解决了饮用水及农产品中六价铬的检测难、检测灵敏度低的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种荧光比率检测六价铬离子的方法，步骤如下：

（1）配制浓度为10 mM的硫酸溶液，配制浓度为1 mM的罗丹明衍生物探针的乙醇溶液；

（2）用蒸馏水配置浓度为10 mg/L的六价铬离子溶液，把3 mL的硫酸溶液和30 μL罗丹明衍生物的乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，依次加入体积为0、6 μL、15 μL、30 μL、60 μL 的六价铬离子溶液，同时在荧光光谱仪上测定502 nm和577 nm处的荧光发射强度，以六价铬离子的浓度为横坐标，以F_{577 nm}/F_{502 nm}的比值为纵坐标，得到六价铬离子浓度的工作曲线，线性回归方程为：F_{577 nm}/F_{502 nm}=0.481C+0.20352，C的单位为mg/L；

（3）将3000 μL的硫酸溶液和30 μL罗丹明衍生物探针的乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取V μL待测样品溶液，加到荧光比色皿中，在荧光光谱仪上测定502 nm和577 nm处的荧光发射强度，将测得的F_{577 nm}/F_{502 nm}比值，代入步骤（2）的线性回归方程中，得到浓度C的值，待测样品中六价铬离子的浓度C_待测样=3000μL·C/VμL。

所述罗丹明衍生物探针参照文献（Chem. Comm, 2013, 49, 4956-4958.）合成，探针的合成路线为：

。

所述步骤（2）中六价铬离子溶液为重铬酸钾溶液或重铬酸钠溶液。

一种荧光比率检测六价铬离子的方法，所述方法比率检测六价铬离子的浓度线性范围为0-0.5 µM，最低检测限为7 nM。

本技术方案能产生的有益效果：

1. 本发明的用于六价铬离子（Cr(VI)）比率检测的荧光探针通过使用在两个不同波长出测定的荧光强度比值作为定量依据，可以进行探针分子内自校准，能够消除或者有效消除环境温度、酸碱度、检测器效率等外界因素对测量荧光强度的干扰，从而实现对痕量六价铬离子含量的实时定性定量检测。

2. 本发明的用于六价铬离子（Cr(VI)）比率检测的荧光探针对六价铬离子的最低检测限为7 nM（0.37 ng/mL），可满足国家标准对六价铬离子的限量要求(50 ng/mL)，为已报道同类六价铬离子荧光探针最低，具备较强的实际应用价值。

3. 本申请选择10 mM的硫酸溶液为探针识别体系，六价铬离子（Cr(VI)）是铬的最高氧化态形式，在酸性水溶液中，Cr(VI)以重铬酸根（Cr₂O₇ ²⁻）形式存在，而在碱性水溶液中，Cr(VI)以铬酸根（CrO₄ ²⁻）形式存在；在酸性环境中重铬酸根的氧化性强，中性或碱性条件下铬酸根基本不显氧化性，利用六价铬离子在酸性条件下的氧化性，促使荧光探针Cr6P1开环，生成具有强烈荧光的罗丹明开环衍生物，荧光探针Cr6P1本身没有荧光，当在酸性体系下与足量的六价铬离子发生反应后释放出强烈的荧光信号，最常用的强酸有盐酸、硝酸和硫酸。盐酸本身可以与重铬酸根（Cr₂O₇ ²⁻）发生反应，Cl^-被氧化成Cl₂，六价铬离子被还原为三价铬离子，这样识别体系溶液将失去氧化性，不能促使荧光探针Cr6P1开环；硝酸本身具有强氧化性，可以使得荧光探针Cr6P1开环，从而干扰探针Cr6P1对六价铬离子的特异性选择；浓硫酸也具有较强的氧化性，也可以使得荧光探针Cr6P1开环，干扰探针Cr6P1对六价铬离子的特异性选择，也不适宜作为识别体系溶液；稀硫酸氧化性不强，又可以发挥出六价铬离子在酸性条件下的氧化性的特点，促使探针Cr6P1开环，释放出强烈的荧光，实现对六价铬离子的特异性识别，因此选用稀硫酸作为识别体系溶液。

4. 本发明的用于六价铬离子（Cr(VI)）比率检测的荧光探针检测六价铬离子的溶液体系为10 mM的硫酸体系，该体系能够满足传统的农产品前处理（硝化）后导致的样品pH为酸性体系的要求，具备较强的在农产品中检测六价铬离子的实际应用价值。

附图说明

图1为本发明的荧光探针Cr6P1荧光选择性图，激发波长400 nm。

图2为本发明的荧光探针Cr6P1荧光选择性比率型柱状图，激发波长400 nm，发射波长577 nm和502 nm。

图3为本发明的荧光探针Cr6P1识别Cr⁶⁺的抗金属阳离子干扰性图（比率型柱状图），激发波长400 nm，发射波长577 nm和502 nm。

图4为本发明的荧光探针Cr6P1识别Cr⁶⁺的抗阴离子干扰性图（比率型柱状图），激发波长400 nm，发射波长577 nm和502 nm。

图5为本发明的荧光探针Cr6P1识别Cr⁶⁺的荧光滴定图，激发波长400 nm。

图6为本发明的荧光探针Cr6P1识别Cr⁶⁺的最低检测限图（比率型柱状图），激发波长400 nm，发射波长577 nm和502 nm。

图7为本发明的工作曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中制备荧光探针Cr6P1的过程中所使用的化学试剂、溶剂、金属离子等均购自阿拉丁试剂公司。在荧光探针Cr6P1的确证和性能测试过程采用Bruke公司DTX-400型核磁共振谱仪，溶剂为氘代氯仿，以TMS为内标记录核磁共振氢谱和碳谱；采用Thermo公司的Q-Exactive HR-MS质谱仪记录高分辨质谱数据。采用美国安捷伦公司Cary100紫外可见分光光度计记录吸收光谱。

一、荧光探针Cr6P1的制备

1、中间产物Ⅰ的制备：

在50 mL圆底烧瓶中，将2-氨基苯硫酚 (3.12 mmol, 0.33 mL) 和2, 4-二羟基苯甲醛(3.16 mmol, 0.446 g)混合溶解于10 mL的N’N-二甲基酰胺溶液中，搅拌条件下加入0.610 g的焦亚硫酸钠，回流反应2小时，反应结束后，冷却至室温，将反应液滴加入200 mL的水中，有固体析出，过滤，将滤饼用水洗(20 mL × 3)，干燥即得到中间体Ⅰ(0.38 g, 产率为 50%)。

2、中间产物Ⅱ的制备：

将2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸（626 mg，2 mmol）溶解于10 mL的三氟乙酸中，搅拌条件下向其中加入729 mg（3 mmol）中间产物Ⅰ，氮气保护条件下回流反应12小时，反应温度为85℃，将反应体系冷却至室温后，减压蒸馏除去溶剂，将残余固体溶解于30mL 水中，并用2 M的NaOH水溶液溶于调节溶液体系pH为12，用乙酸乙酯（100 mL）萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压去除溶剂得到鲜红色的泡沫状粗产物，粗产物经柱层析分离（洗脱剂体积比为CH₃OH:CH₂Cl₂ = 1:5），得624 mg 红色泡沫状固体即中间产物Ⅱ，产率为60 %。

3、探针Cr6P1的制备：

将中间产物Ⅱ（520 mg, 1 mmol）溶解于20 mL的乙醇中，搅拌条件下加入0.486mL的80%wt水合肼溶液，回流反应8小时，反应温度为79 ℃，反应结束后减压蒸馏去除乙醇，所得水溶液用二氯甲烷（40 mL）萃取三次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液（40 mL）洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，柱层析分离（洗脱剂体积比为CH₃OH:CH₂Cl₂ =1:6），得 267 mg白色泡沫状固体即为中间产物Ⅱ，产率为50 %。

核磁共振氢谱测定：¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, ppm) δ: 1.08 (t, 6 H, J = 7.0Hz), 3.32 (q, 4 H, J = 6.8 Hz), 4.53 (s, 2 H), 6.39 (m, 2 H), 6.45 (d, 1 H, J= 2.0 Hz), 6.94 (s, 1 H), 7.10 (m, 1 H), 7.36 (m, 1 H), 7.45 (m, 1 H), 7.54(m, 3 H), 7.88 (q, 1 H, J = 1.0 Hz), 7.93 (t, 1 H, J = 10.0 Hz), 8.05 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 11.80 (s, 1 H)；

核磁共振碳谱测定：¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃, ppm) δ: 165.65, 163.31,154.62, 152.55, 151.68, 151.37, 148.39, 134.73, 132.92, 129.68, 128.73,127.82, 126.26, 124.68, 123.72, 122.68, 122.03, 121.86, 116.12, 111.83,109.41, 108.53, 105.03, 103.45, 97.59, 64.74, 43.81, 12.54;

高分辨质谱测定：HR-MS m/z: Calcd for C₃₁H₂₇N₄O₃S⁺ ([M+H⁺]⁺) 535.1804,found 535.1732 [M+H⁺]⁺。

二、荧光比率检测六价铬离子的方法

1. 溶液的配制及检测六价铬离子的方法

金属无机盐：硝酸铅，硝酸银，硝酸镉，重铬酸钾，其他均为氯化物(K⁺, Na⁺, Ca²⁺,Mg²⁺, Ba²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Mn²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Hg²⁺)且厂家均为阿拉丁试剂公司或者天津科密欧试剂公司。准确称量相应金属盐，溶解在高纯水中配制10 mM的溶液备用。

1 mM的探针溶液配制：准确称量相应探针(Cr6P1)，Cr6P1溶解在乙醇溶液中配制1mM的溶液备用。

一种荧光比率检测六价铬离子的方法，步骤如下：

2. 选择性实验：

专一的选择性是考察荧光探针分子是否高效的重要标准之一。用荧光光谱仪考察了探针Cr6P1对金属离子选择性。如图1所示，在400 nm处激发条件下，单独的探针Cr6P1(10 µM)在10 mM的硫酸溶液中只在502 nm处具有较强的荧光发射强度，当加入重铬酸钾（Cr⁶⁺）(100 µM)后，在502 nm出的荧光发射强度明显降低，在577 nm处的荧光发射强度明显增强，但是加入其它金属离子 (100 µM) 时，溶液体系的荧光发射强度与单独探针体系的荧光发射强度相比没有明显变化。附图2为上述结果以荧光发射强度比率（F_{577 nm}/F_{502 nm}）柱状图。以上实验结果表明，该探针对Cr⁶⁺具有较好的专一选择性。

3. 荧光干扰性实验：

为了测试探针Cr6P1对Cr⁶⁺识别作用在复杂体系中的抗干扰能力，在荧光发射光谱中分别测试了其抗金属阳离子干扰性和阴离子干扰性。如图3所示，在Cr6P1 (10 µM)在10mM的硫酸溶液中分别加入测试的各种金属阳离子(100 µM)测试其荧光发射强度比率（F_{577 nm}/F_{502 nm}），然后再向含有各种金属离子的溶液中加入100 µM的Cr⁶⁺溶液，由图3可知，在其他金属阳离子存在时加入重铬酸钾与单独加入重铬酸钾时所得到的荧光发射强度比率（F_{577 nm}/F_{502 nm}）基本相同，该结果表明探针Cr6P1对Cr⁶⁺的检测具有较强的抗金属阳离子干扰能力。按照类似的方法，测试了探针Cr6P1对常见阴离子(Cl^-, F^-, NO₃ ^-, CO₃ ^2-, PO₄ ^3-,SO₄ ^2-)的抗干扰能力，如图4所示，探针Cr6P1对Cr⁶⁺的检测具有较强的抗阴离子干扰能力。

4 最低检测限实验：

良好的检测限是检验一个探针分子是否具有应用价值的标准之一。采用荧光光谱仪来测定探针Cr6P1对Cr⁶⁺的最低检测限，在10 mM的硫酸溶液中，固定探针Cr6P1浓度为10µM，测定其对不同浓度的Cr⁶⁺的响应强度，随着Cr⁶⁺浓度的增加，体系荧光发射强度在502nm处不断降低，同时在577 nm处不断增强（图5），研究发现溶液荧光发射强度比率（F_{577 nm}/F_{502 nm}）在Cr⁶⁺浓度为0-0.5 µM间呈线性（R² = 0.998）（图6），经计算(3σ/k)得出该探针分子对Cr⁶⁺的检测限为7 nM（0.37 ng/mL），该检测限可满足国家对食品中六价铬离子含量的限量要求，表明该探针Cr6P1在食品质量安全方面具有较大的应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种荧光比率检测六价铬离子的方法，其特征在于，步骤如下：

（2）用蒸馏水配置浓度为10 mg/L的六价铬离子溶液，把3 mL的硫酸溶液和30 μL罗丹明衍生物的乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，依次加入体积为0、6 μL、15 μL、30 μL、60μL 的六价铬离子溶液，同时在荧光光谱仪上测定502 nm和577 nm处的荧光发射强度，以六价铬离子的浓度为横坐标，以F_{577 nm}/F_{502 nm}的比值为纵坐标，得到六价铬离子浓度的工作曲线，线性回归方程为：F_{577 nm}/F_{502 nm}=0.481C+0.20352，C的单位为mg/L；

（3）将3000 μL的硫酸溶液和30 μL罗丹明衍生物探针的乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取V μL待测样品溶液，加到荧光比色皿中，在荧光光谱仪上测定502nm和577 nm处的荧光发射强度，将测得的F_{577 nm}/F_{502 nm}比值，代入步骤（2）的线性回归方程中，得到浓度C的值，待测样品中六价铬离子的浓度C_待测样=3000μL·C/VμL；

所述罗丹明衍生物探针的结构式为

。

2.如权利要求1所述的荧光比率检测六价铬离子的方法，其特征在于：所述步骤（2）中六价铬离子溶液为重铬酸钾溶液或重铬酸钠溶液。