CN113666898B - 含香豆素的选择性识别Hg2+的荧光探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含香豆素的选择性识别Hg2+的荧光探针及其制备方法，选用了香豆素作为荧光基团，作为分子探针的构建单元。并对香豆素荧光团进行进一步修饰，将香豆素荧光团中羰基替换成硫羰基，使原本分子结构的荧光进一步降低，而硫羰基的引入加深了荧光探针溶液的颜色，与汞离子作用时溶液颜色会发生较大改变，更容易被肉眼观察到，而分子与汞离子作用前后所产生的荧光差别也会扩大，进一步提高了探针的灵敏度，最低检出限可达7.84×10‑9 mol/L。该系列探针具有结构简单，合成方便，成本低，可以高选择性和荧光强度增强地检测汞离子。

Description

含香豆素的选择性识别Hg2+的荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及的是化学分析检测技术领域，具体涉及一种含香豆素的选择性识别Hg2+的荧光探针及其制备方法。
背景技术
环境中的重金属离子会对土壤和水体造成破坏，严重影响生态环境的平衡。由于汞在工业中的广泛应用，汞是有毒的重金属之一，广泛地分布在空气、水和土壤中，已成为重要的环境污染物。汞进入人类食物链，并最终在人体中积累。汞离子可以轻松通过生物膜，并与蛋白质中的巯基、羧基、羰基和氨基形成螯合物，从而对中枢神经和内分泌系统造成破坏，严重损害人类健康。因此对环境中汞离子的检测是非常有必要的。
在众多的检测分析方法中，传统的检测法如火焰光度法、原子吸收光谱法等都相对费用较高，往往需要较多的样品，制备步骤繁复，不能追踪其动态变化，检测时间较长，不能满足在实际检测工作中的应用。与之相比，基于荧光探针检测的方法在灵敏度、选择性、响应时间、局部观察(如荧光成像光谱)等方面具有明显的优势。现今，荧光探针的应用取得了重大的进展，并越来越受到人们的重视，已经被广泛的应用于各种生活生产领域。
在过去的若干年里，已经开发出许多基于有机荧光体的Hg2+选择性探针分子。然而已报道的荧光探针分子主要是通过络合作用来识别Hg2+离子, 表现出选择性较差且识别时抗干扰能力普遍不好特点。而基于化学反应的识别过程对Hg2+离子的选择性好，抗干扰能力强，但是为设计出能与Hg2+离子反应后能使荧光信号大幅改变的荧光探针，设计的分子结构较为复杂，过程繁琐。因此，研发一个具有高灵敏度、高特异性、结构简单、合成方便、成本低的荧光探针，对环境中汞离子检测，具有非常重要的意义。
发明内容
一种含香豆素的荧光探针的中间体化合物5，结构式为：
Figure 577780DEST_PATH_IMAGE001
；
一种含香豆素的荧光探针的中间体化合物5的制备方法，它包括：
（1）7-(二乙胺基)香豆素的制备
在常温下加入0.01mol 4-(二乙基氨基)水杨醛，0.02mol丙二酸二乙酯，0.1mL哌啶，溶于30mL无水乙醇；氮气保护85℃下，回流11h，蒸发，加入10mL AcOH/HCl，温度升至100℃回流10h；反应后调pH为中性。抽滤干燥，正相色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：石油醚=2:1；所述的AcOH与HCl的体积比为1:1；
（2）中间体化合物5的制备
量取DMF与POCl3液体各5mL在常温氮气下搅拌0.5h，温度升至60℃；缓慢将溶于15mL DMF的 7-(二乙基氨基)香豆素(1.08g, 0.005mol)滴加到反应液中；反应12h，加冰水淬灭反应液，调pH为中性；抽滤干燥，正相色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：乙酸乙酯=10:1；
一种含香豆素的荧光探针化合物，该化合物为7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫戊环-2-基)香豆素，其结构式为：
Figure 549540DEST_PATH_IMAGE002
或7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫己环-2-基)香豆素，其结构式为：
Figure 951703DEST_PATH_IMAGE003
或7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫戊环-2-基)硫代香豆素，结构式为：
Figure 823844DEST_PATH_IMAGE004
；
一种含香豆素的荧光探针化合物，
所述的7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫戊环-2-基)香豆素的制备方法：
在0℃冰浴下取1.00g上述的中间体化合物5，343μL 1,2-乙二硫醇溶于10mL二氯甲烷中；加入BF3的乙醚溶液（4.8M）0.1mL；氮气下反应8h，蒸发得粗产物，正相色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：石油醚=1:1；得7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫戊环-2-基)香豆素；
所述的7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫戊环-2-基)硫代香豆素的制备方法：
取1.60 g的7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫戊环-2-基)香豆素，溶于50 mL甲苯；130℃氮气下，取1.62 g劳森试剂分为四等分加入至反应体系中，用时2 h，回流反应12 h；蒸发浓缩反应液，用水、二氯甲烷萃取，收集有机相干燥，正相色谱洗脱，洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚=1:1；
所述的7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫己环-2-基)香豆素的制备方法：
在0℃冰浴下取1.00g上述的中间体化合物5，412μL 1,3-丙二硫醇溶于10mL二氯甲烷中；加入BF3的乙醚溶液（4.8M）0.1mL；氮气下反应8h，蒸发得粗产物，正相色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：石油醚=1:1；
一种含香豆素的荧光探针化合物在汞离子检测中的应用。
本发明提供了一种含香豆素的选择性识别Hg2+的荧光探针及其制备方法，选用了香豆素作为荧光基团，作为分子探针的构建单元。并对香豆素荧光团进行进一步修饰，将香豆素荧光团中羰基替换成硫羰基，使原本分子结构的荧光进一步降低，而硫羰基的引入加深了荧光探针溶液的颜色，与汞离子作用时溶液颜色会发生较大改变，更容易被肉眼观察到，而分子与汞离子作用前后所产生的荧光差别也会扩大，进一步提高了探针的灵敏度，最低检出限可达7.84×10-9 mol/L。该系列探针具有结构简单，合成方便，成本低，可以高选择性和荧光强度增强地检测汞离子。
附图说明
图1为7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫戊环-2-基)香豆素(6)与7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫戊环-2-基)香豆素(7)的制备途径；
图2 ： (a)化合物6浓度为10-5mol/L的EtOH/H2O（v/v=1:1）溶液中分别加入不同的金属阳离子溶液使浓度到10-5mol/L为止的紫外-可见吸收光谱。(b) 为相同条件下化合物3的紫外-可见吸收光谱；
图3为化合物6,7浓度为10-5 mol/L的EtOH/H2O（v/v=1:1）溶液中分别加入不同的金属阳离子溶液(10-5 mol/L)，最大荧光发射强度的比较；和目标化合物7(10 μmol/L)加入不同的金属阳离子(10 μmol/L)后的溶液颜色的变化；
图4 ： (a)化合物6浓度为10-5mol/L的EtOH/H2O（v/v=1:1）溶液的紫外-可见吸收光谱随汞离子的加入的变化情况。(b) 化合物7在相同条件下的紫外-可见吸收光谱；
图5 ： (a) 化合物6浓度为10-5mol/L的EtOH/H2O（v/v=1:1）溶液的荧光发射光谱随汞离子的加入的变化情况。(b) 化合物7在相同条件下的荧光发射光谱；
图6： (a)为化合物6与Hg2+的浓度总和20 μmol/L，随着Hg2+离子浓度所占比的上升的最大吸光强度与荧光最大发射强度的变化。(b)化合物7与Hg2+的浓度总和20 μmol/L，随着Hg2+离子浓度所占比的上升的最大吸光强度与荧光最大发射强度的变化；
图7： (a)化合物6随汞离子加入的最大荧光发射强度的变化的拟合曲线 (b) 目标化合物7随汞离子加入的最大荧光发射强度的变化的校准曲线；
图8化合物6,7的随环境pH变化和时间变化时最大荧光强度的变化；
图9化合物6,7对Hg2+离子可能存在的识别机理；
图10加入Hg2+离子前后化合物6,7核磁共振氢谱的变化与化合物5的核磁共振氢谱的对比；
图11为 7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫戊环-2-基)硫代香豆素(目标化合物6a)合的制备途径；
图12化合物6a浓度为10-5 mol/L的EtOH/H2O（v/v=1:1）溶液的紫外-可见吸收光谱随汞离子的加入的变化情况；
图13化合物6a与Hg2+离子可能存在的反应过程及溶液颜色的变化；
图14化合物6a溶液加入Hg2+离子后产生变化的核磁共振氢谱；
图15化合物6a浓度为10-5 mol/L的EtOH/H2O（v/v=1:1）溶液的荧光发射光谱随汞离子的加入的变化情况；
图16化合物6a随汞离子加入的最大荧光发射强度的变化的工作曲线；
图17化合物6a随汞离子加入的最大吸收峰强度变化的校准曲线；
图18化合物6a浓度为10-5 mol/L的EtOH/H2O（v/v=1:1）溶液中分别加入不同的金属阳离子溶液使浓度到10-4 mol/L为止的紫外-可见吸收光谱；
图19化合物6a浓度为10-5 mol/L的EtOH/H2O（v/v=1:1）溶液中分别加入不同的金属阳离子溶液(10-4 mol/L)后的最大荧光发射强度；
图20化合物6a (10 μmol/L)加入不同的金属阳离子后的溶液颜色的变化；
图21： (a)化合物6a的溶液加入Hg2+离子后最大荧光发射强度随时间的变化; (b)化合物6a在不同pH的溶液中加入Hg2+离子前后的最大荧光强度的差值。
具体实施方式
实施例1含香豆素的选择性识别汞离子的荧光探针的制备
含香豆素的选择性识别汞离子的荧光探针的制备途径如图1所示。
（1）7-(二乙胺基)香豆素的制备
在常温下加入4-(二乙基氨基)水杨醛（1.93g，0.01mol)，丙二酸二乙酯(2.4g，0.02mol)，0.1mL哌啶，溶于30mL无水乙醇中。氮气保护85℃下，回流反应11h后，蒸发出多余溶剂，加入AcOH/HCl (1:1) 10mL，温度升至100℃继续回流反应10h。反应完成后调节pH为中性。抽滤收集滤饼干燥即得粗产物，用正相色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：石油醚=2:1。得暗黄色油固体2.05g，收率为94.4%。
（2）中间体化合物5的制备
量取DMF与POCl3液体各5mL在常温氮气保护下搅拌0.5h后，温度升至60℃。缓慢将溶于15mL DMF的(1.08g, 0.005mol)的7-(二乙胺基)香豆素滴加到反应液中。反应12h后，加冰水淬灭反应液，调pH为中性。抽滤收集滤饼干燥即得粗产物，用正相色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：乙酸乙酯=10:1。得橙红色固体0.98g，收率为80.4%。
（3）荧光探针化合物6（7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫戊环-2-基)香豆素）的制备
在0℃冰浴下取化合物5(1.00g，4.1mmol)，1,2-乙二硫醇(343μL，4.1mmol)，溶于10mL 二氯甲烷中。加入BF3(乙醚溶液，4.8M) 0.1mL。在氮气保护下反应8h。蒸发出多余溶剂即得粗产物。用正相色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：石油醚=1:1。得黄色固体1.13 g，收率为86.2%。
荧光探针化合物6：1H NMR (CDCl3 ,400MHz): δ=7.91(s, 1H), 7.28(s, 1H),6.57(dd, J=8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.49(d, J=2.4 Hz, 1H), 5.74(s, 1H), 3.40(q, J=7.2 Hz, 4H), 3.32(s, 4H), 1.20(t, J=7.2Hz, 6H); 13C NMR(CDCl3 ,100MHz): δ=161.7, 155.7, 150.5, 138.98 , 128.9, 121.6, 108.8, 108.2, 97.2, 50.3, 44.8,38.9, 12.4; FTIR (cm-1):3660, 2989, 2900, 1493, 1379, 1269, 1064, 882, 785,741, 526; MALDI-TOF-MS (m/z): 322.09 (100%, M+-1, calcd. 321.45)。
（4）荧光探针化合物7（7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫己环-2-基) ）香豆素的制备
在0℃冰浴下取化合物5(1.00g，4.1mmol)，1,3-丙二硫醇(412μL，4.1mmol)，溶于10mL 二氯甲烷中。加入BF3(乙醚溶液，4.8M) 0.1mL。在氮气保护下反应8h。蒸发出多余溶剂即得粗产物。用正相色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：石油醚=1:1。得黄色固体1.04g，收率为76.1%。
荧光探针化合物7：1H NMR (CDCl3 ,400MHz): δ=7.82(s, 1H), 7.24(s, 1H),6.58(dd, J=8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.47(d, J=2.4 Hz, 1H), 5.45(s, 1H), 3.40(q, J=7.2 Hz, 4H), 3.14-3.07(m, 2H), 2.92-2.87(m, 2H), 2.20-2.15(m, 1H), 1.95-1.85(m, 1H), 1.20(t, J=6.8Hz, 6H);13C NMR(CDCl3 ,100MHz):δ=160.9, 156.1, 150.9,142.0, 129.0, 118.9, 109.0, 108.4, 97.1, 44.8, ; FTIR (cm-1):3677, 2988, 2900,1491, 1379, 1268, 1066, 867, 808, 785, 741, 675, 528; MALDI-TOF-MS (m/z):336.11 (100%, M+-1, calcd. 335.48)。
实施例2 荧光探针对Hg2+的识别能力的检测
（1）阳离子选择性实验
移取化合物6,7的溶液(EtOH/H2O=1:1,v/v, 10-5 mol/L)，分别加入Hg2+，Co2+，Ca2 +，Al3+，Mg2+，Fe3+，Pb2+，Ag+，Cd2+，Cr2+，Ni+，Na+的阳离子溶液(DMF:H2O=1:1,v/v)至其浓度为10-5 mol/L，进行阳离子选择性实验，得到实验结果图2所示。
实验结果表明，化合物6, 7的吸收光谱中，均在380 nm处有较强的吸收峰。而加入不同的金属阳离子之后，大部分的金属阳离子都不能使吸收光谱产生明显变化，而加入Hg2+离子之后，化合物6, 7的吸收光谱的吸收峰由原来的380 nm红移至450 nm(图2)。而溶液颜色的变化也从无色变为浅绿色（图3）。加入Hg2+离子后化合物6,7出现了荧光增强现象(图3)。与之相比的其他阳离子则没有发生明显的吸收峰或溶液颜色的变化(图3)。表明了化合物6,7对Hg2+离子的高度选择性。
（2）采用紫外-可见吸收光谱的滴定实验
通过紫外-可见吸收光谱的滴定实验，等比例地改变Hg2+离子浓度，在未加入Hg2+离子时溶液呈无色，随着Hg2+离子的不断加入，380 nm处吸收峰逐渐减弱，而红移后450 nm处的吸收峰逐渐增强。当Hg2+离子与化合物6, 7浓度为1:1时，380 nm处吸收峰基本消失，而红移后450 nm处的吸收峰达到最强，如图4所示。然后继续增加Hg2+离子浓度，发现化合物6,7的吸收光谱与溶液颜色均无明显变化。该过程表明了化合物6,7与Hg2+离子的反应过程，化学反应计量比为1:1。
（3）采用荧光发射光谱的滴定实验
为进一步探究Hg2+离子对化合物6,7荧光发射光谱的影响的实验，选用在紫外可见最大吸收波长为激发波长测试了化合物6,7的荧光发射光谱，在化合物6,7浓度为10μmol/L的EtOH/H2O（v/v=1:1）溶液下进行了荧光滴定实验。如图5所示，随着Hg2+离子浓度上升(0-10 μmol/L)荧光强度逐渐增强，且当Hg2+离子浓度低至1 μmol/L时，仍能检出明显的荧光强度信号变化。增加Hg2+离子浓度到10μmol/L，即化学计量比为1:1时荧光强度达到最强，之后继续增加Hg2+离子浓度，荧光强度基本不发生改变，与紫外-可见吸收光谱的滴定实验结果一致，表明了化合物6,7符合化学反应计量比为1:1的反应过程。证明了该分子探针对Hg2+离子的灵敏性以及检测Hg2+离子时总是伴随着荧光增强的过程。故化合物6,7具有选择性检测Hg2+离子的潜力，具有较高的效率和灵敏度。
（4）Job’s点实验
为了测定化合物6,7的反应计量比，进行了Job’s点实验，并通过其450nm处最大吸光度以及最大荧光发射强度绘制了两探针分子的工作曲线，如图6 中 (a、b)所示，当Hg2+离子与探针分子浓度和一定时(20 μmol/L)，逐渐增加Hg2+离子比例至Hg2+离子的所占比例达到0.5时，紫外-可见吸收光谱450 nm处的最大吸光度与荧光发射光谱550 nm处的最大荧光强度达到最大，实验结果与滴定实验的实验结果相符。
随Hg2+离子的加入，绘制了化合物6,7的最大荧光发射强度的变化的校准曲线。如图7所示，根据校准曲线的斜率计算得化合物6,7检出限分别为2.53×10-8 mol/L和3.56×10-8 mol/L（90%置信水平）。低于我国规定的饮用水中Hg2+离子的最大允许浓度(约 0.05 μM)，表明了目标化合物6,7具有在实际检测中的应用潜力。
实施例3荧光探针化合物6,7的竞争性实验
为了证明荧光探针化合物有良好的应用潜力，进行了抗干扰性能的测试。通过在EtOH/H2O(1:1, v/v)溶液中的离子竞争实验，探究荧光探针化合物6,7的抗干扰性。以化合物6 (10 μmol/L)与其他金属离子(Co2+，Ca2+，Al3+，Mg2+，Fe3+，Pb2+，Ag+，Cd2+，Cr2+，Ni+，Na+,10 μmol/L)混合，加入到含Hg2+离子的溶液中分别测定其加入前后的荧光发生强度。如表1所示。可以看出，常见的金属阳离子并不能对Hg2+离子识别产生明显的干扰作用。表明了目标化合物6,7对Hg2+离子的高选择性，且具有对环境中其他阳离子的抗干扰能力。
Figure 489311DEST_PATH_IMAGE005
实施例4荧光探针化合物6,7的响应时间与响应pH范围
将荧光探针化合物6,7和Hg2+离子(10 μmol/L)混合后，考察了Hg2+离子诱导荧光探针化合物6,7脱硫去保护所需时间，如图8所示荧光强度随时间经过呈现逐渐增强的趋势，并在3 min时达到最大而后稳定在同一水平，表明了该探针分子能在3 min之内快速识别Hg2+离子，能满足实际样品中Hg2+离子实时监测的响应时间要求，具有较高的灵敏度。
此外研究了酸碱度和响应时间对荧光性能的影响。将荧光探针化合物6,7在pH=2.0-12.0的酸碱度宽度范围内处理，而后加入少量Hg2+离子溶液至其浓度为10 μmol/L，分别测定在加入Hg2+离子前后的荧光发射光谱，并计算其最大荧光强度的差值。如图8所示，在较大酸碱度范围下(pH=3.0-12.0)的探针分子的最大荧光强度差值能保持在正常且较高水平，当pH=3.0和pH=12.0时最大荧光强度稍有下降。pH=2.0时溶液迅速发生荧光强度的变化，而加入Hg2+离子后荧光强度发生变化较小。故该探针分子可以适应较大的酸碱度范围(pH=4-11)检测Hg2+离子。
实施例5荧光探针化合物6,7识别Hg2+机理
为了阐明分子探针选择性识别Hg2+离子的机理，将荧光探针化合物6,7与Hg2+离子等比例混合(两者浓度均为10 μmol/L)的紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱和相等浓度下测试的化合物5作对比，发现两者均有相似的吸收峰波长，可能发生了如图9所示的反应过程。
为进一步证明将目标化合物6,7与Hg2+离子等比例混合的溶液水洗、萃取、干燥后的1H NMR谱图的与化合物6,7的1H NMR谱图进行对比，如图10所示。发现原有的缩硫醛环上的氢所对应化学位移的峰消失，在低场处出现可能为醛基氢的单峰，且与化合物5的1H NMR谱图基本一致。Hg2+离子在夺取了目标化合物6,7分子中的硫后，将其还原成了化合物5。Hg2 +离子由于能使缩硫醛脱硫去保护生成相应的醛，而其他金属离子则不能与其发生反应，因此该过程总是用于开发一些基于化学反应机理的探针用来检测Hg2+离子。在目标化合物6,7中，7号位修饰的香豆素，以富电子结构作为电子供体，同时是具有刚性平面共轭大π键体系的荧光基团，而在取代基上修饰了缩硫醛也是一个弱的电子供体，所以该分子是两个供电子基团相连，分子内ICT过程是难以发生的。而C=O键可作为一个电子受体，使分子内ICT通道打开从而导致吸收峰和发射光谱发生红移。且引入的缩硫醛使得分子的平面构型被破坏，导致荧光猝灭。当Hg2+离子将缩硫醛还原为相应的醛时，扩大了π电子的共轭程度，分子荧光增强。
实施例6硫代香豆素类选择性识别汞离子的荧光探针的制备
硫代香豆素类选择性识别汞离子的荧光探针的制备途径如图11所示。
荧光探针化合物6a（7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫戊环-2-基)硫代香豆素）的制备：
在100 mL单口瓶中加入化合物6(1.60 g，5.0 mmol)，溶于50 mL 已精制的甲苯中。氮气保护，130℃下，称取劳森试剂1.62 g分为四等分加入至反应体系中，用时为2 h。添加完毕后回流反应12 h。蒸发浓缩反应液，后用水、二氯甲烷萃取，收集有机相干燥。蒸发多余溶剂即得粗产物。用正相色谱洗脱，洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚=1:1。得红色粉末固体1.36 g，收率为80.7%。
荧光探针化合物6a：1H NMR (CDCl3 ,400MHz): δ=7.97(s, 1H), 7.37(d, J=8.0Hz, 1H), 6.70-6.67(m, 2H), 6.26(s, 1H), 3.45(q, J=7.2 Hz, 4H), 3.35(s,4H), 1.23(t, J=7.2Hz, 6H); 13C NMR(CDCl3 ,100MHz): δ=196.4, 158.7, 151.2,133.6, 132.7, 129.3, 110.7, 110.7, 96.5, 53.4, 45.0, 39.1, 12.4, ;FTIR (cm-1):3660, 2989, 2900, 1493, 1379, 1269, 1064, 882, 785, 741, 526。
实施例7Hg2+对荧光探针化合物6a吸收与荧光光谱的影响
为了探究化合物6a的光谱性能，移取化合物6a的溶液(EtOH:H2O=1:1, 10 μmol/L)，等比例地改变Hg2+离子浓度，研究了与Hg2+离子作用前后的化合物6a的吸收光谱（图12)。在未加入Hg2+离子时化合物6a，最大吸收峰在480 nm处，溶液呈呈橙红色。随着汞离子浓度逐渐上升，该处的吸收峰逐渐降低，在380 nm处形成新的吸收峰，化合物6a的溶液逐渐褪色。当加入1倍当量的Hg2+离子(10 μmol/L)时，380 nm吸收峰达到最高，而原来480 nm处吸收峰消失，溶液由橙红色变为无色。继续升高汞离子浓度，380 nm处吸收峰逐渐下降，在450 nm处形成新的吸收峰。当加入2倍当量的Hg2+离子(20 μmol/L)时，380 nm处吸收峰消失，450 nm处吸收峰达到最强，溶液颜色从无色变为浅绿色(图13)。在汞离子加入的全过程中，吸收峰分为两个阶段出现和消失，在480 nm处的吸收峰消失前，450 nm处吸收峰不会出现。表明了目标化合物6a与汞离子的反应也是分两步进行。由上文可知，目标化合物6与汞离子的作用会导致吸收峰从380 nm到450 nm的迁移，故汞离子对目标化合物6a的反应应该是先水解硫羰基使变为羰基，再与缩硫醛反应使其变为醛基，如图13所示。
为了证明该反应过程，在化合物6a的溶液中加入一倍与两倍当量的Hg2+离子分别测试了核磁共振氢谱（图14），可以发现在加入一倍和两倍当量的Hg2+离子后得到的谱图分别与化合物6和5吻合。证明了如图13所示的反应过程。
为了验证目标化合物6a的荧光发光性能，研究了与Hg2+离子作用前后的目标化合物6a的发射光谱。如图15所示，当目标化合物6a在加入Hg2+离子当量不足1倍时，目标化合物6a的荧光发射强度变化较小，当加入Hg2+离子的当量超过1倍而不足2倍时，目标化合物6a的荧光发射强度迅速增强，Hg2+离子浓度达到目标化合物6a的2倍时，荧光发射强度达到最强，之后再提高Hg2+离子浓度荧光发射强度基本保持不变，由吸收光谱和发射光谱滴定实验可知目标化合物6a与Hg2+离子的反应计量比为1:2。进行了Job’s点实验，如图16所示，当Hg2+离子与化合物6a浓度和一定时(15 μmol/L)，逐渐增加Hg2+离子比例至探针分子浓度的两倍时，发射光谱的最大荧光强度达到最大，实验结果与滴定实验的实验结果相符。在低汞离子浓度下，根据吸收光谱随Hg2+离子浓度的变化测定了目标化合物6a校准曲线（图17），由校准曲线的斜率计算化合物6a的检出限LOD=7.84×10-9 mol/L。相较于实施例1所介绍的含香豆素荧光探针，化合物6a的检出限已经下降了约80%。表明了目标化合物6a对Hg2+离子的灵敏度更高，更能直观地检出环境中的Hg2+离子。
实施例8化合物6a对Hg2+离子的选择性
移取化合物6a的溶液(EtOH:H2O=1:1，10μmol/L)，向其中分别加入极少量Hg2+，Co2 +，Ca2+，Al3+，Mg2+，Fe3+，Pb2+，Ag+，Cd2+，Cr2+，Ni+，Na+阳离子溶液(EtOH:H2O=1:1)使其浓度为100μmol/L，进行了以上的阳离子选择性实验，分别测定其吸收光谱及荧光发射光谱。在吸收光谱中，只有在含Hg2+离子的溶液中化合物6a才能使吸收峰蓝移，如图18所示。在荧光发射光谱中，只有在加入Hg2+离子的溶液中才出现了发射峰，荧光强度是加入其他离子时的数百倍，如图19所示。表明了化合物6a对Hg2+离子的高度选择性。值得注意的是Ag+离子也能使化合物6a产生变化，在加入过量Ag+离子后，化合物6a溶液颜色由橙红色迅速变为红色，而吸收光谱的吸收峰也有略微红移（图18）。经过数小时后溶液会从红色变为无色，仅有微弱荧光现象。加入各种阳离子的目标化合物6a溶液裸眼比色如图20所示，溶液颜色的剧烈变化能更容易的识别Hg2+离子。
实施例9荧光探针化合物6a的响应时间与响应pH范围
将荧光探针化合物6a和Hg2+离子(10μmol/L)混合后，考察了Hg2+离子诱导脱硫去保护所需时间，如图21中 (a)所示荧光强度随时间经过呈现逐渐增强的趋势，并在3 min时达到最大而后稳定在同一水平，表明了该探针分子能在3 min之内快速识别Hg2+离子，能满足实际样品中Hg2+离子实时监测的响应时间要求，具有较高的灵敏度。
此外研究了酸碱度和响应时间对荧光性能的影响。如图21中 (b)所示，荧光探针化合物6a在pH=2.0-12.0的酸碱度宽度范围内处理，而后加入少量Hg2+离子溶液至其浓度为10μmol/L，分别测定在加入Hg2+离子前后的荧光发射光谱，比较其变化。发现在较大酸碱度范围下(pH=3.0-12.0)的探针分子的最大荧光强度差值能保持在正常且较高水平，当pH=3.0和pH=12.0时最大荧光强度稍有下降。pH=2.0时溶液迅速发生颜色及荧光强度的变化，而加入Hg2+离子后溶液颜色及荧光强度发生变化较小，引入的硫羰基并没有减弱荧光探针的环境耐受度。故该探针分子可以在较大的酸碱度范围(pH=4-11)灵敏地检测Hg2+离子。

Claims (2)

1.一种含香豆素的荧光探针化合物，其特征在于，该化合物为 7-(二乙基氨基)-3-(1,3-二硫戊环-2-基)硫代香豆素，结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.权利要求1所述的一种含香豆素的荧光探针化合物在汞离子检测中的应用。
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