CN104177351A - 一种比率法测Ag+、F-或AcO-的荧光探针试剂及制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂及制备和应用属有机合成和分析化学技术领域。制备方法是以硫杂杯[4]芳烃为平台分子，通过分步反应，分别在杯芳烃的下沿2,4-位连接萘酰亚胺和4-氯-7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑基团，1,3-位连接两个甲氧基乙基，得到的一种双荧光基团硫杂杯[4]芳烃试剂，化学名称为1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-[(7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑-4-基)氨基]乙基-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃，是一种高灵敏、高选择性检测Ag⁺、F^-或AcO^-比率荧光、比率吸收试剂。化学结构式如图所示。

Description

一种比率法测Ag+、F-或AcO-的荧光探针试剂及制备和应用

技术领域

本发明属有机合成和分析化学领域，具体地说是一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂及其制备方法和应用。 

背景技术：荧光探针分子对目标物质的有效识别主要取决于识别位点的性能，能同时实现金属离子和阴离子分别检测是探针分子设计追求的目标。利用荧光增强或猝灭实现对特定目标分子、离子的检测是荧光探针应用的主要方法。与荧光探针在单一波长范围荧光强度的变化相比，在识别过程中表现出不同波长荧光发射的比率变化而具备比率荧光性能的探针具有更高的灵敏度和准确度。对仅仅荧光增强或减弱型的探针而言，在实际应用中会受到探针自身浓度、测试条件、光源强度波动及仪器敏感性等因素的影响，降低了测定的准确度。比率荧光探针的优点则是通过两个不同波长下荧光的比值变化，能够将这些影响测定准确性的因素降低，使检测的响应线性范围和检测限等显著提高。这种内在校准特点使得荧光比率测量技术的实际应用更稳定、更方便，从而扩大了这类探针试剂的应用范围。目前，利用比率荧光或比率吸收进行离子测定的探针试剂报道相对较少。Masayasu Taki等合成的香豆素-吡啶衍生物，利用形成比率荧光可识别和检测微量 Cd²⁺；Masatoshi等以1,10-邻菲啰啉-2,9-二甲醛为原料，经过缩合、环化反应得到系列2,9-位取代的菲啰啉衍生物可作为一类识别Mg²⁺的比率荧光和比色探针。Wang等报道了基于分子内电荷转移机理的氮、硫、氧杂冠-呋喃喹啉衍生物，在乙醇介质中为一种Ag⁺比率荧光探针；以及合成的氮、硫、氧杂冠-甲氧基喹那啶探针，分别利用探针和Ag-探针配合物建立了比率荧光选择性识别Ag⁺和 I^-，均呈现较大的波长位移。Kumar等报道了带有丹酰基团的部分锥形构型的杯[4]芳烃，利用对Cu²⁺和Hg²⁺呈现的荧光分子开关识别模式实现对Hg²⁺比率荧光检测；他们还报道了基于Hg²⁺/Li⁺光开关效应的交替构型的硫杂杯[4]冠醚的Hg²⁺比率荧光探针。通常，Ag⁺由于电子转移和系间窜越过程会猝灭探针的荧光发射，增强型Ag⁺探针不多见，而比率型更鲜有报道。 

4-氯-7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑是一种含活性卤素及芳香环的氨基化合物荧光衍生试剂，几乎能与所有伯胺和仲胺类化合物反应。利用其反应活性和优越的光学性能作为探针已用于离子识别，生物跟踪监测，纳米材料以及pH调控等。在小分子荧光团中，萘酰亚胺类因具有高荧光量子产率、光稳定性和化学稳定性以及较大的Stokes位移等特点而得到广泛应用。萘酰亚胺衍生物分子不仅具有共轭平面结构，能够嵌入DNA从而显示较强的抗肿瘤活性，而且分子中的氨基也是很好的活性基团，使得萘酰亚胺常作为荧光分子设计中的备选荧光基团。硫杂杯芳烃是一类由硫原子代替桥联亚甲基而得到的新型硫杂桥联杯芳烃。硫原子使芳香大环结构的刚性、极性都发生变化，形成有别于经典杯芳烃的构象，桥联硫原子对软酸类离子有良好亲和力，可作为新的配位作用位点而表现出良好的识别、亲和及分离能力，显现出新颖识别特性。 

发明内容：本发明的目的在于合成一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂，能高灵敏、高选择性用比率荧光或比率吸收检测微量Ag⁺；同时还能用荧光猝灭或比率吸收法检测F^-或AcO^-的双功能硫杂杯[4]探针试剂，研究荧光探针试剂的合成方法并应用于微量Ag⁺、F^-或AcO^-的检测。 

本发明一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂是以硫杂杯[4]芳烃为平台分子，分别在杯芳烃的下沿2,4-位连接萘酰亚胺和4-氯-7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑基团，1,3-位连接两个甲氧基乙基，得到的一种双荧光基团硫杂杯[4]芳烃试剂，化学名称为1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-[(7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑-4-基)氨基]乙基-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃，简称s1，是一种高灵敏、高选择性检测Ag⁺、F^-或AcO^-比率荧光、比率吸收试剂，结构式为： 

分子式：C₇₂H₈₂N₆O₁₂S₄

分子量：1350.49

熔  点：266~268 ℃

溶解性：溶于二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜等

光谱性质：在N,N-二甲基甲酰胺溶液中的荧光激发波长是470nm，发射波长是535nm，紫外-可见吸收波长是360nm、410 nm及460nm。

本发明一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂的制备方法，其合成路线如下： 

第一步是将硫杂杯[4]芳烃下沿2,4-位的酚羟基与N-羟乙基邻苯二甲酰亚胺连接，得到中间体原料2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃：

第二步是控制构型，在硫杂杯[4]芳烃下沿1,3-位的酚羟基上连接甲氧基乙基修饰基团，得到中间体原料1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃：

第三步是通过肼解得到中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2,4-二(2-氨基乙基)硫杂杯[4]芳烃：

第四步是中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基) -2,4-二(2-氨基乙基)硫杂杯[4]芳烃先与4-吗啡啉-1,8-萘酐反应合成得到中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-(2-氨基乙基)-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃的合成：

第五步是由此中间体与4-氯-7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑反应得到目标化合物1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-[(7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑-4-基)氨基]乙基-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃：

上述一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂的制备方法，各步骤的工艺条件为： 

第一步，中间体原料2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃的合成

N₂保护下，三口烧瓶中加入硫杂杯[4]芳烃、N-羟乙基邻苯二甲酰亚胺、三苯基膦、干四氢呋喃，搅拌溶解后，在冰浴下，缓慢滴加偶氮二甲酸二乙酯，摩尔比按硫杂杯[4]芳烃: N-羟乙基邻苯二甲酰亚胺: 三苯基膦: 偶氮二甲酸二乙酯=1:8~9:3~3.5:3~3.5加入，室温搅拌反应，蒸除溶剂，趁热加入热甲醇，冷却后析出白色固体，柱层析纯化制得中间体原料：

反应温度：室温

反应时间：48h

反应溶剂：四氢呋喃

洗脱剂：乙酸乙酯/正己烷（v/v=1/4）

第二步，中间体原料1,3-交替-二(2-甲氧基乙基) -2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃的合成 

N₂保护下，三口烧瓶中加入2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃、碳酸铯、乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯，摩尔比按2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃:碳酸铯:乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯=1:5.5~6.5:5.5~6.5加入，干乙腈，回流，减压蒸馏除去溶剂，加入稀盐酸调节pH至2~3，氯仿萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化得白色中间体原料：

反应温度：回流

反应时间：36h

反应溶剂：乙腈

洗脱剂：三氯甲烷/石油醚（v/v=2/5）

第三步，中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2,4-二(2-氨基乙基)硫杂杯[4]芳烃的合成  

N₂保护下，三口烧瓶中加入中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃、水合肼，摩尔比按1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃:水合肼=1:18~22加入，乙醇，回流，用氯仿和浓氨水混合溶剂萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化得白色中间体：

反应温度：回流

反应时间：24h

反应溶剂：乙醇

洗脱剂：三氯甲烷/三乙胺（v/v=100/1）

第四步，1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-(2-氨基乙基)-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃的合成

N₂保护下，在三口烧瓶中，加入4-吗啡啉-1,8-萘酐和乙醇，加热并搅拌，当温度升温至50 ℃时，加入1,3-交替-二(2-甲氧基乙基) -2,4-二(2-氨基乙基)硫杂杯[4]芳烃，摩尔比按4-吗啡啉-1,8-萘酐: 1,3-交替-二(2-甲氧基乙基) -2,4-二(2-氨基乙基)硫杂杯[4]芳烃=2~2.5:1加入，加热回流反应，反应停止，减压旋蒸除去溶剂后，粗产物用柱层析纯化，得黄绿色的固体：

反应温度：回流

反应时间：24h

反应溶剂：乙醇

洗脱剂：氯仿/乙酸乙酯（v/v=1/1）

第五步，1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-[(7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑-4-基)氨基]乙基-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃的合成

  N₂保护下，在三口烧瓶中，加入4-氯-7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑，中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-(2-氨基乙基)-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃、碳酸钾，摩尔比按4-氯-7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑:1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-(2-氨基乙基)-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃:碳酸钾=1.2~1.7:1:1~2的摩尔比加入，干乙酸乙酯；加热反应。反应结束后，过滤沉淀，减压旋蒸除去溶剂后，固体多次柱层析，得橙黄色目标产物，即比率荧光探针试剂：

反应温度：60℃

反应时间：8h

反应溶剂：乙酸乙酯

洗脱剂：氯仿/乙酸乙酯（v/v=15/1）；正己烷/乙酸乙酯（v/v=2/1）

本发明所述的一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂的应用，所述试剂s1作为荧光法或紫外吸收光度法中用于检测微量Ag⁺的比率荧光试剂或比率吸收试剂；试剂s1作为荧光法或紫外吸收光度法中用于检测微量F^-或AcO^-的荧光试剂或比率吸收试剂。

所述试剂s1可作为比率荧光法检测微量Ag⁺的试剂，检测的浓度线性范围为两个数量级，检测限低至10^-8 mol·L^-1；试剂s1可作为比率吸收法检测微量Ag⁺的试剂，检测的浓度线性范围为两个数量级，检测限低至10^-7 mol·L^-1。 

述试剂s1用作为荧光猝灭法分别检测微量F^-或AcO^-的试剂，检测的浓度线性范围均为两个数量级，检测限低至10^-9 mol·L^-1；试剂s1用作为比率吸收法检测微量F^-或AcO^-的试剂，检测的浓度线性范围均为两个数量级，检测限低至10^-7 mol·L^-1。 

所述试剂s1在DMF（N,N-二甲基甲酰胺）/H₂O（4/1，v/v）溶液中作为比率荧光检测微量Ag⁺的试剂，测定Ag⁺时，在535nm和605nm处形成比率荧光，在565nm处有等发射点；作为比率吸收检测微量Ag⁺的试剂，测定Ag⁺时，在392nm和460nm、460nm和495nm处分别形成比率吸收，在350nm、415nm及480nm处有等吸收点。 

试剂s1在DMF溶剂中作为荧光猝灭分别检测微量F^-或AcO^-的试剂，在测定F^-或AcO^-时，以470为荧光激发波长，535nm为发射波长；试剂s1作为比率吸收分别检测微量F^-或AcO^-的试剂，在测定F^-或AcO^-时，在395nm和340nm处形成比率吸收，在350nm和460nm处有等吸收点。 

本发明一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂的应用是在不同溶剂介质中，不仅可作为微量Ag⁺离子检测的比率荧光和比率吸收试剂，而且还可作为微量F^-或AcO^-检测的荧光和比率吸收试剂。本发明合成的试剂s1用于比率法测定Ag⁺、F^-或AcO^-，具有比单一波长的检测稳定性好、背景干扰小、选择性高，且检测限低、不需要分离、能在水溶性或非水介质条件下测试等优点。作为荧光和比色试剂的实际应用，操作及控制方法简便，性能优越。 

本发明合成的一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂s1其结构经过核磁共振波谱、质谱和红外光谱表征，数据列于表1。 

附图说明： 

图1试剂s1在DMF/H₂O溶液中，在各种金属离子存在下荧光发射曲线。浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF（N，N二甲基甲酰胺）/H₂O（4/1，v/v）溶液，分别不加金属离子或加入2.00×10^-3mol·L^-1金属离子Ag⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺,Sr²⁺，Hg²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Zn²⁺，Al³⁺， Fe³⁺，Cr³⁺后的荧光光谱。Ag⁺的加入使试剂s1在535nm处的荧光减小，605nm处荧光增大。而其他上述实验金属离子的加入几乎不会改变试剂s1的荧光强度。测试的激发波长为470nm。

图2 共存金属离子对试剂s1的比率荧光法检测Ag⁺的影响。在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1的试剂s1的DMF/H₂O（4/1，v/v）溶液中，测定加入2.00×10^-3mol·L^-1的Ag⁺后试剂s1在波长分别为535nm和605nm处的荧光强度比值。再测定分别向s1-Ag⁺混合溶液中加入同等量的下述其他金属离子之一：Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Zn²⁺，Hg²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Al³⁺，Cr³⁺，Fe³⁺后的荧光强度比值的变化。黑色条表示在s1-Ag⁺混合溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在535nm和605nm处的荧光强度比值的变化。表明试剂s1检测Ag⁺的比率荧光强度不受上述其他金属离子共存的影响。测试的激发波长为470nm，比率荧光发射波长分别为535nm和605nm。 

图3试剂s1在DMF/H₂O溶液中，在各种金属离子存在下的吸收曲线。浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF/H₂O（4/1，v/v）溶液，分别不加金属离子或加入2.00×10^-3mol·L^-1金属离子Ag⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Hg²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Zn²⁺，Al³⁺，Cr³⁺，Fe³⁺后的紫外-可见吸收光谱。试剂s1的DMF/H₂O混合溶液在340nm，410nm、460 nm处有吸收，Ag⁺的加入使试剂s1在340nm处的吸收峰消失，410nm处的吸收峰升高且紫移到392nm，460nm处的吸收峰降低且红移至495nm，同时在350nm、415nm和480nm处出现三个等吸收点，其他实验金属离子的加入几乎不会改变试剂s1的吸收光谱。 

图 4 共存金属离子对试剂s1的紫外光谱法检测Ag⁺的影响。在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1的试剂s1的DMF/H₂O（4/1，v/v）溶液中，加入2.00×10^-3mol·L^-1的Ag⁺后测定波长分别为392、460nm处的吸光度。再分别向s1- Ag⁺混合溶液中加入同等量的下述其他金属离子之一：Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Zn²⁺，Hg²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Al³⁺，Cr³⁺，Fe³⁺后测定波长分别为392、460nm处的吸光度比值的变化。黑色条表示在s1-Ag⁺混合溶液中分别加入上述其他共存金属离子后在波长分别为392、460nm处的吸光度比值的变化。表明试剂s1检测Ag⁺的比率吸收不受上述其他金属离子共存的影响。 

图5 不同浓度Ag⁺对试剂s1的荧光法比率荧光滴定光谱图。在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF/H₂O（4/1，v/v）溶液中分别加入不同浓度Ag⁺，随Ag⁺的加入测得荧光光谱曲线。在535nm处的发射峰逐渐降低，605nm处荧光逐渐增大，在565 nm处形成等发射点，呈现比率荧光。测试的激发波长为470nm。比率荧光波长为535nm、605nm。 

图6 试剂s1的比率荧光光谱法检测Ag⁺的校准曲线。纵坐标为发射波长分别为535nm和605nm处的荧光强度比值，横坐标为Ag⁺的浓度。激发波长为470nm。线性范围为8.0×10^-7~1.2×10^-5 mol·L^-1。 

图7 不同浓度Ag⁺对试剂s1的紫外-可见光谱比率吸收滴定光谱图。在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF/H₂O（4/1，v/v）溶液中分别加入不同浓度Ag⁺，随Ag⁺的加入测得吸收光谱曲线。试剂s1在340nm处的吸收峰消失，410nm处的吸收峰逐渐升高并紫移到392nm，460nm处的吸收峰逐渐降低且红移至495nm，同时在350nm、415nm和480nm处出现三个等吸收点。392nm与460nm波长处、或495nm与460nm处分别形成比率吸收。 

图8 试剂s1的比率吸收紫外光谱法检测Ag⁺的校准曲线。纵坐标为波长分别为392nm和460nm处的吸光度比值，横坐标为Ag⁺的浓度。线性范围为9.0×10^-7 ~1.2×10^-5 mol·L^-1。 

图9试剂s1在DMF溶液中，在各种阴离子存在下荧光发射曲线。浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF溶液，分别不加阴离子或加入2.00×10^-3 mol·L^-1阴离子F^-、Cl^-、Br^-、I^-、HSO₄ ^-、AcO^-、NO₃ ^-、ClO₄ ^-、PF₆ ^-，H₂PO₄ ^-后的荧光光谱。F^-或AcO^-的加入使试剂s1荧光显著降低。而其他上述实验阴离子的加入几乎不会改变试剂s1的荧光强度。测试的激发波长为470 nm。 

图10 共存阴离子对试剂s1荧光法检测F^-的影响。在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF溶液中，加入2.00×10^-3 mol·L^-1的F^-后荧光显著降低。再分别向s1-F^-混合溶液中加入下述同等量的下述其他阴离子之一：Cl^-、Br^-、I^-、HSO₄ ^-、AcO^-、NO₃ ^-、ClO₄ ^-、PF₆ ^-、H₂PO₄ ^-后的荧光强度变化。黑色条表示在试剂s1溶液中分别加入不同阴离子的荧光强度。红色条表示在s1-F^-混合溶液中分别加入上述其他共存阴离子后的荧光强度变化。表明试剂s1检测F^-的荧光强度不受包括AcO^-在内的上述其他阴离子共存影响。激发和发射波长分别为470 nm和535 nm。 

图11 共存阴离子对试剂s1荧光法检测AcO^-的影响。在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF溶液中，加入2.00×10^-3 mol·L^-1的AcO^-后荧光显著降低。再分别向s1-AcO^-混合溶液中加入同等量的下述其他阴离子之一：F^-、Cl^-、Br^-、I^-、HSO₄ ^-、NO₃ ^-、ClO₄ ^-、PF₆ ^-、H₂PO₄ ^-后的荧光强度变化。黑色条表示在试剂s1溶液中分别加入不同阴离子的荧光强度。红色条表示在s1-AcO^-混合溶液中分别加入上述其他共存阴离子后的荧光强度变化。表明试剂s1检测AcO^-的荧光强度不受包括F^-在内的上述其他阴离子共存影响。激发和发射波长分别为470 nm和535 nm。 

图12 不同浓度的F^-对试剂s1的荧光法滴定光谱图。在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF溶液中分别加入不同浓度F^-，随F^-的加入测得的荧光光谱曲线。在535nm处的发射峰逐渐降低。测试的激发波长为470nm。 

图13 试剂s1的荧光法检测F^-的校准曲线。纵坐标为发射波长为535nm处的荧光强度，横坐标为F^-的浓度。激发波长为470nm。线性范围为8.0×10^-7~1.2×10^-5 mol·L^-1。 

图14 不同浓度的AcO^-对试剂s1的荧光法滴定光谱图。在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF溶液中分别加入不同浓度AcO^-，随AcO^-的加入测得的荧光光谱曲线。在535nm处的发射峰逐渐降低。测试的激发波长为470nm。 

图15 试剂s1的光谱法检测AcO^-的校准曲线。纵坐标为发射波长为535nm处的荧光强度，横坐标为AcO^-的浓度。激发波长为470nm。线性范围为8.0×10^-7~1.2×10^-5 mol·L^-1。 

图16试剂s1在DMF溶液中，在各种阴离子存在下的吸收曲线。浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF溶液，分别不加阴离子或加入2.00×10^-3 mol·L^-1阴离子F^-、Cl^-、Br^-、I^-、HSO₄ ^-、AcO^-、NO₃ ^-、ClO₄ ^-、PF₆ ^-、H₂PO₄ ^-后的紫外-可见吸收光谱。F^-或AcO^-的加入分别使试剂s1在360nm处的吸收峰消失，410nm处的吸收峰升高且向短波方向位移15nm，而460nm处的吸收峰不变。其他上述实验阴离子的加入几乎不会改变试剂s1的吸收光谱。 

图17 共存阴离子对试剂s1紫外光谱法检测F^-的影响。在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF溶液中，加入2.00×10^-3 mol·L^-1的F^-溶液后410nm处吸收峰升高向短波方向位移至395nm处。再分别向s1-F^-混合溶液中加入同等量的其他阴离子Cl^-、Br^-、I^-、HSO₄ ^-、AcO^-、NO₃ ^-、ClO₄ ^-、PF₆ ^-、H₂PO₄ ^-、PF₆ ^-后395nm处的吸光度变化。黑色条表示在试剂s1溶液中分别加入不同阴离子后在395nm与340nm处的吸光度比值。红色条表示在s1-F^-混合溶液中分别加入其他共存阴离子后在395nm与340nm处的吸光度比值。表明试剂s1检测F^-的吸光度不受包括AcO^-在内的上述其他阴离子共存的影响。纵坐标为395nm与340nm处的吸光度比值。 

图18 共存阴离子对试剂s1紫外-可见吸收光谱法检测AcO^-的影响。在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF溶液中，加入2.00×10^-3 mol·L^-1的AcO^-溶液后410nm处吸收峰升高向短波方向位移至395nm处。再分别向s1-AcO^-混合溶液中加入同等量的其他阴离子F^-、Cl^-、Br^-、I^-、HSO₄ ^-、NO₃ ^-、ClO₄ ^-、PF₆ ^-、H₂PO₄ ^-、PF₆ ^-后395nm处的吸光度变化。黑色条表示在试剂s1溶液中分别加入不同阴离子后在395nm与340nm处的吸光度比值。红色条表示在s1-AcO^-溶液中分别加入其他共存阴离子后在395nm与340nm处的吸光度比值。表明试剂s1检测AcO^-的吸光度不受包括F^-在内的上述其他阴离子共存的影响。纵坐标为395nm与340nm处的吸光度比值。 

图19 不同浓度F^-对试剂s1的紫外-可见光谱比率吸收滴定光谱图。在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF溶液中分别加入不同浓度F^-，随着F^-的加入测得的吸收光谱曲线。试剂s1在340nm处的吸收峰消失，410nm处的吸收峰逐渐升高且紫移到395nm，同时在350nm和460nm处出现两个等吸收点。395nm与340nm波长处的吸收分别形成比率吸收。 

图20 试剂s1的比率吸收紫外光谱法检测F^-的校准曲线。纵坐标为波长分别为395nm和340nm处的吸光度比值，横坐标为F^-的浓度。线性范围为9.0×10^-7 ~1.2×10^-5 mol·L^-1。 

图21 不同浓度AcO^-对试剂s1的紫外-可见光谱比率吸收滴定光谱图。在浓度为1.00×10^-5 mol·L^-1试剂s1的DMF溶液中分别加入不同浓度AcO^-到试剂s1溶液中，随着AcO^-的加入，分别测得的吸收光谱曲线。试剂s1在340nm处的吸收峰消失，410nm处的吸收峰逐渐升高且紫移到395nm，同时在350nm和460nm处出现两个等吸收点。395nm与340nm波长处的吸收分别形成比率吸收。 

图22 试剂s1的比率吸收紫外光谱法检测AcO^-的校准曲线。纵坐标为波长分别为395nm和340nm处的吸光度比值，横坐标为AcO^-的浓度。线性范围为9.0×10^-7 ~1.2×10^-5 mol·L^-1。 

具体实施方式

实施例一： 

（1）     中间体原料2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃合成

N₂保护，在50mL的圆底烧瓶中，加入硫杂杯[4]芳烃(721mg, 1.00mmol)，N-羟乙基邻苯二甲酰亚胺 (1.75g，8.57mmol)，三苯基膦(800mg，3.05mmol)，干四氢呋喃 20 mL，冰浴下，然后缓慢滴加偶氮二甲酸二乙酯 (531mg，3.05mmol)，加完后，室温搅拌反应48h，蒸除溶剂，趁热加入热甲醇20mL，冷却，析出大量白色固体粗产品，粗产品柱层析分离（洗脱剂：乙酸乙酯/正己烷，v/v=1/4）得白色产品748 mg，产率70%。m.p. 288~290℃; ¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz), δ(ppm): 0.738[ s, 9H, C(CH₃)₃], 1.284[s,9H, C(CH₃)₃], 4.457(t, 2H, J=5.5 Hz, NCH₂), 4.880(t, 2H, J=6.0Hz, OCH₂), 6.828(s, 2H, ArH), 7.264(d, 2H, J=7.5Hz, OH), 7.487(s, 2H, ArH), 7.560-7.577(m, 2H, ArH), 7.830-7.840 (m, 2H, ArH)。

（2）中间体原料1,3-交替-二(2-甲氧基乙基) -2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃合成 

    N₂保护下，在250mL圆底烧瓶中，加入上步合成得到的原料2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃 (500mg，0.47mmol)，碳酸铯(920mg，2.82mmol)，乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯(649mg，2.82 mmol)，干乙腈100mL，回流36h，后减压蒸馏除去溶剂，加入稀盐酸调节pH至2~3，用氯仿萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析（洗脱剂：三氯甲烷/石油醚，v/v=2/5）得白色固体0.27 g，产率48%。m.p. 203~205℃; ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz)，δ(ppm): 1.296[s, 9H, C(CH₃)₃], 1.365[s, 9H, C(CH₃)₃], 3.198(s, 3H, CH₃), 3.297(t, 2H, J=13.2Hz, NCH₂), 3.725(t, 2H, J=16.8Hz, OCH₂), 4.139(m, 4H, OCH₂), 7.442(s, 2H, ArH), 7.708(m, 2H, ArH), 7.773 (s, 2H, ArH), 7.865(m, 2H, ArH)。

（3）中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2,4-二(2-氨基乙基)硫杂杯[4]芳烃合成 

     N₂保护下，在50mL圆底烧瓶中，加入1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃(500mg，0.41mmol)，80%水合肼(41mg，8.17mmol)，无水乙醇20mL，回流24h。用氯仿和浓氨水的混合溶剂萃取。无水硫酸钠干燥，柱层析（洗脱剂：三氯甲烷/三乙胺，v/v=100/1）得0.32 g白色产品，产率80%。m.p. 288~291℃; ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz),δ(ppm): 1.315[s, 9H, C(CH₃)₃], 1.327[s, 9H, C(CH₃)₃], 2.478(t, 2H, J=16.8Hz, OCH₂), 2.904(t, 2H, J=15.2Hz, OCH₂), 3.148(s, 3H, CH₃), 3.974(t, 4H, J=16.2Hz, OCH₂), 4.005(m, 4H, NH₂), 7.374(s, 2H, ArH), 7.427(s, 2H, ArH)。

（4）中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-(2-氨基乙基)-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃合成 

  N₂保护下，在100 mL三口烧瓶中，加入4-吗啡啉-1,8-萘酐（135 mg，0.48 mmol）和30 mL乙醇，加热并搅拌，当温度升至50 ℃时，加入中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基) -2,4-二(2-氨基乙基)硫杂杯[4]芳烃（200 mg，0.22 mmol），加热回流反应24 h，TLC检测反应进程。反应停止，减压旋蒸除去溶剂后，粗产物用柱层析（洗脱剂：氯仿/乙酸乙酯，v/v=1/1）纯化，得黄绿色的固体104 mg，产率40.5%。m.p. 168~170 ℃; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz)δ(ppm): 1.266[s, 18H, (CH₃)₃], 1.334[s, 18H, (CH₃)₃], 2.586(s, 2H, NH₂), 2.925(q, 4H, J=14.8 Hz, CH₂), 3.162(s, 6H, CH₃), 3.296(t, 4H, J=8.4 Hz, CH₂), 3.945~4.064(q, 12H, CH₂×3), 4.237(t, 4H, J=16.0 Hz, OCH₂), 7.233(d, 1H,J=8.0 Hz, ArH), 7.404(s, 2H, ArH), 7.453(t, 1H, J=4.8 Hz, ArH), 7.469(s, 2H, ArH), 7.728(q, 1H, J=15.6 Hz, ArH), 8.449(d, 1H, J=8.0 Hz, ArH), 8.515(d, 1H, J=8.0 Hz, ArH), 8.580(d, 1H, J=6.4 Hz, ArH)。

（5）1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-[(7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑-4-基)氨基]乙基-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃合成 

  N₂保护下，在100 mL三口烧瓶中，加入4-氯-7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑（90 mg，0.45 mmol），中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-(2-氨基乙基)-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃（360 mg，0.30 mmol），碳酸钾（63 mg，0.30 mmol），45 mL干乙酸乙酯，60 ℃反应8 h。反应结束后，过滤沉淀，减压旋蒸除去溶剂后，固体多次柱层析（洗脱剂：氯仿/乙酸乙酯，v/v=15/1；正己烷/乙酸乙酯，v/v=2/1），得橙黄色固体215 mg，产率52.6%。m.p. 266~268 ℃.¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz)δ(ppm): 1.136[s, 18H, (CH₃)₃)], 1.321[s, 18H, (CH₃)₃], 3.242~3.294(m, 16H, CH_3,  CH₂), 4.033(t, 4H, J =8.8 Hz, CH₂), 4.112~4.173(q, 4H, CH₂), 4.292~4.332(m, 2H, CH₂), 6.258(d, 1H, J=8.4 Hz, ArH), 7.251(d, 1H, ArH), 7.384(d, 2H, J=2.4 Hz, ArH), 7.490(s, 2H, ArH), 7.583(s, 2H, ArH), 7.646(d, 2H, J=2.4 Hz, ArH), 7.738(t, 1H, J=15.6 Hz, ArH), 8.448(d, 1H, J=9.2 Hz, ArH), 8.538(t, 2H, J=16.8 Hz, ArH), 8.605(d, 1H, J=7.2 Hz, ArH); ¹³C NMR (CDCl₃, 400 MHz)δ(ppm): 31.13, 31.20, 31.28, 34.31, 34.36, 39.27, 53.42, 58.82, 66.94, 68.03, 70.35, 115.02, 116.75, 123.02, 125.91, 126.14, 127.92, 127.96, 128.56, 128.59, 129.31, 130.04, 130.17, 130.54, 131.16, 131.34, 132.73, 144.29, 146.13(ArC), 146.52, 146.55, 155.87, 156.79, 157.91, 163.54, 164.06; ESI-MS: m/z 1373.2 [M+Na]⁺。

实施例二： 

本发明分析方法中试剂的配制方法是：

（1）试剂s1溶液的配制：称取13.5 mg的试剂s1，用DMF溶解，配制成100mL溶液，浓度为100μmol·L^-1；

（2）Ag⁺标准溶液：称取分析纯AgNO₃ 20.0mg，用二次蒸馏水溶解，配制成100mL溶液，Ag⁺浓度为2.00×10^-3 mol·L^-1；根据需要用二次蒸馏水逐级稀释到适宜的浓度；

（3）其它共存离子溶液的配制：称取分析纯的各种金属的硝酸盐或盐酸盐，用二次蒸馏水溶解，并配制成浓度为2.00×10^-3 mol·L^-1溶液。

本发明所用紫外-可见分光光度计型号为UV-1800，日本岛津公司公司生产；荧光分光光度计型号为 Cary Eclipse荧光分光光度计，美国VARIAN公司生产。 

实施例三： 

（1）对Ag⁺离子检测

在10.0 mL 容量瓶中加入试剂s1的DMF储备液（1.00×10^-4 mol·L^-1，1mL），Ag⁺离子（2.00×10^-3 mol·L^-1，1 mL），用DMF/H₂O（4/1，v/v）溶液稀释至刻度，摇匀，移入1cm的石英比色皿进行荧光光谱和紫外-可见吸收光谱测定。

设置荧光激发波长为470nm，在1cm的比色皿中加入约3ml试剂s1(1.00×10^-5 mol·L^-1)的DMF/H₂O（4/1，v/v）溶液进行荧光光谱测试，试剂s1在535 nm波长处有荧光发射。加入Ag⁺ (2.00×10^-4 mol·L^-1)后，试剂s1溶液在535nm荧光强度显著红移至605nm，并且在565nm处出现一个等发射点，相同条件下，在试剂s1溶液中分别加入Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺,Sr²⁺，Hg²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Al³⁺，Cr³⁺，Fe³⁺金属离子后，几乎不会改变试剂s1的荧光光谱及强度。试剂s1仅对Ag⁺有选择性比率荧光检测性能，选择波长分别为535nm与605nm波长处的荧光强度的比值进行定量测定（附图1）。 

相同测试条件下，试剂s1检测Ag⁺在535nm与605nm波长处的比率荧光值在上述金属离子分别作为共存离子存在于s1-Ag⁺混合溶液中，当共存离子浓度与Ag⁺离子相当时，对检测Ag⁺的比率荧光强度影响的相对偏差在 5%以内，不干扰测定（附图2）。 

在1cm的比色皿中加入约3ml试剂s1(1.00×10^-5 mol·L^-1)的DMF/H₂O（4/1，v/v）溶液进行紫外-可见吸收光谱测试，试剂s1中加入Ag⁺（2.00×10^-4 mol·L^-1）后，试剂s1在340nm处的吸收峰消失，410nm处的吸收峰升高且紫移到392nm，460nm处的吸收峰降低且红移至495nm，同时在350nm、415nm和480nm处出现三个等吸收点。相同条件下，在试剂s1溶液中分别加入上述金属离子后，几乎不改变试剂s1的吸收光谱及强度，试剂s1仅对Ag⁺有选择性比率荧光检测性能，分别选择392nm与460nm处吸光度或495nm与460nm处的吸光度的比值可进行定量测定（附图3）。 

在上述紫外光谱测试条件下，试剂s1检测Ag⁺在495nm与460nm处的比率吸收值在上述金属离子分别作为共存离子存在于s1-Ag⁺混合溶液中，当共存离子浓度与Ag⁺离子相当时，对检测Ag⁺的比率吸光度影响的相对偏差在 5%以内，不干扰测定（附图4）。 

在上述荧光测试条下，分别测定Ag⁺浓度改变与试剂s1的荧光光谱变化及在535nm和605nm处的荧光强度比值，获得荧光滴定光谱曲线（附图5）及比率荧光法校准曲线(附图6)。由校准曲线的斜率和测定10次空白值的标准偏差，测定并计算得到试剂s1比率荧光法检测Ag⁺的浓度线性范围和检测限列于表2。 

在上述紫外光谱测试条件下，分别测定Ag⁺浓度改变与试剂s1的紫外-可见吸收光谱变化及在392nm与460nm处的吸光度比值，获得吸收光谱滴定曲线（附图7）及比率吸收法校准曲线（附图8）。由校准曲线的斜率和测定10次空白值的标准偏差，测定得到试剂s1紫外-可见吸收法检测Ag⁺的浓度线性范围和检测限列于表2。 

 

（2）对阴离子检测

在10.0 mL 容量瓶中加入试剂s1的DMF储备液(1.00×10^-4 mol·L^-1，1mL)，阴离子F^-、AcO^-（2.00×10^-3 mol·L^-1，1 mL），用DMF稀释至刻度，摇匀，移入1cm石英比色皿进行荧光光谱和紫外-可见吸收光谱测定。

在DMF溶液中，试剂s1（1.00×10^-5 mol·L^-1）在470nm波长激发下，发射535 nm荧光，在365nm紫外灯下观察到强烈的绿色荧光。分别加入F^-或AcO^-（2.00×10^-4 mol·L^-1）后，试剂s1溶液的荧光显著降低（猝灭99%），除F^-或AcO^-的加入有显著的荧光猝灭信号外，其他实验阴离子Cl^-、Br^-、I^-、HSO₄ ^-、NO₃ ^-、ClO₄ ^-、PF₆ ^-，H₂PO₄ ^-对试剂s1溶液均无明显的信号响应，表明试剂s1仅对F^-或AcO^-有选择性荧光猝灭检测性能（附图9）。 

在上述荧光法测试条件下，试剂s1检测F^-的荧光强度在上述阴离子分别作为共存离子存在于s1-F^-混合溶液中，当共存离子浓度与F^-离子相当时，包括AcO^-在内的其他共存阴离子对检测F^-荧光强度影响的相对偏差在 5%以内，不干扰测定（附图10）。 

在上述荧光法测试条件下，试剂s1检测AcO^-的荧光强度在上述阴离子分别作为共存离子存在于s1-AcO^-混合溶液中，当共存离子浓度与AcO^-离子相当时，包括F^-在内的其他共存阴离子对检测AcO^-荧光强度影响的相对偏差在 5%以内，不干扰测定（附图11）。 

在DMF溶液中，以470为荧光激发波长，535nm为发射波长，分别测定F^-或AcO^-浓度改变时相应的试剂s1溶液的荧光强度的变化（附图12、14），获得校准曲线（附图13、15）。分别由校正曲线的斜率和测定10次空白值的标准偏差，测定并计算得到离子浓度检测的线性范围和检测限列于表3、4。 

对试剂s1（1.00×10^-5 mol·L^-1）的DMF溶液进行紫外-可见吸收光谱扫描，分别加入F^-或AcO^-（2.00×10^-4 mol·L^-1)后，使试剂s1在360nm处的吸收峰消失，在410nm处吸收峰升高（吸光度升高0.145）并向紫移至395nm。除F^-或AcO^-的加入使试剂s1有明显的吸收外，上述相同阴离子对试剂s1均无明显的紫外吸收响应（附图16）。试剂s1对F^-或AcO^-具有紫外-可见吸收检测性能。 

在上述紫外-可见吸收测试条件下，试剂s1检测F^-在395nm与340nm处的吸光度比值在上述阴离子分别作为共存离子存在于s1-F^-混合溶液中，当共存离子浓度与F^-相当时，包括AcO^-在内的其他共存阴离子对检测F^-的比率吸光度影响的相对偏差在 5%以内，不干扰测定（附图17） 

在上述紫外-可见吸收法测试条件下，试剂s1检测AcO^-在395nm与340nm处的吸光度比值在上述相同阴离子分别作为共存离子存在于s1-AcO^-混合溶液中，当共存离子浓度与AcO^-相当时，包括F^-在内的其他共存阴离子对检测AcO^-的比率吸光度影响的相对偏差在 5%以内，不干扰测定（附图18）。

在DMF溶液中，分别测定F^-或AcO^-浓度改变时相应的试剂s1溶液在395nm与340nm处的吸光度比值（附图19、21），获得校准曲线（附图20、22）。分别由校正曲线的斜率和测定10次空白值的标准偏差，测定得到离子浓度检测的线性范围和检测限列于表3。 

Claims (8)

1.一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂，其特征是以硫杂杯[4]芳烃为平台分子，分别在杯芳烃的下沿2,4-位连接萘酰亚胺和4-氯-7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑基团，1,3-位连接两个甲氧基乙基，得到的一种双荧光基团硫杂杯[4]芳烃试剂，化学名称为1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-[(7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑-4-基)氨基]乙基-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃，简称s1，是一种高灵敏、高选择性检测Ag⁺、F^-或AcO^-比率荧光、比率吸收试剂，结构式为：

分子式：C₇₂H₈₂N₆O₁₂S₄

分子量：1350.49

熔  点：266～268 ℃

溶解性：溶于二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜等

光谱性质：在N,N-二甲基甲酰胺溶液中的荧光激发波长是470nm，发射波长是535nm，紫外-可见吸收波长是360nm、410 nm及460nm。

2.如权利要求1所述的一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂的制备方法，其特征是合成路线如下：

第一步是将硫杂杯[4]芳烃下沿2,4-位的酚羟基与N-羟乙基邻苯二甲酰亚胺连接，得到中间体原料2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃：

第二步是控制构型，在硫杂杯[4]芳烃下沿1,3-位的酚羟基上连接甲氧基乙基修饰基团，得到中间体原料1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃：

第三步是通过肼解得到中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2,4-二(2-氨基乙基)硫杂杯[4]芳烃：

第四步是中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基) -2,4-二(2-氨基乙基)硫杂杯[4]芳烃先与4-吗啡啉-1,8-萘酐反应合成得到中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-(2-氨基乙基)-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃的合成：

第五步是由此中间体与4-氯-7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑反应得到目标化合物1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-[(7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑-4-基)氨基]乙基-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃：

。

3.根据权利要求2所述的一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂的制备方法，其特征是各步骤的工艺条件为：

第一步，中间体原料2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃的合成

N₂保护下，三口烧瓶中加入硫杂杯[4]芳烃、N-羟乙基邻苯二甲酰亚胺、三苯基膦、干四氢呋喃，搅拌溶解后，在冰浴下，缓慢滴加偶氮二甲酸二乙酯，摩尔比按硫杂杯[4]芳烃: N-羟乙基邻苯二甲酰亚胺: 三苯基膦: 偶氮二甲酸二乙酯=1:8～9:3～3.5:3～3.5加入，室温搅拌反应，蒸除溶剂，趁热加入热甲醇，冷却后析出白色固体，柱层析纯化制得中间体原料：

反应温度：室温

反应时间：48h

反应溶剂：四氢呋喃

洗脱剂：乙酸乙酯/正己烷（v/v=1/4）

第二步，中间体原料1,3-交替-二(2-甲氧基乙基) -2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃的合成 

N₂保护下，三口烧瓶中加入2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃、碳酸铯、乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯，摩尔比按2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃:碳酸铯:乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯=1:5.5～6.5:5.5～6.5加入，干乙腈，回流，减压蒸馏除去溶剂，加入稀盐酸调节pH至2～3，氯仿萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化得白色中间体原料：

反应温度：回流

反应时间：36h

反应溶剂：乙腈

洗脱剂：三氯甲烷/石油醚（v/v=2/5）

第三步，中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2,4-二(2-氨基乙基)硫杂杯[4]芳烃的合成  

N₂保护下，三口烧瓶中加入中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃、水合肼，摩尔比按1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2,4-二(邻苯二甲酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃:水合肼=1:18～22加入，乙醇，回流，用氯仿和浓氨水混合溶剂萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化得白色中间体：

反应温度：回流

反应时间：24h

反应溶剂：乙醇

洗脱剂：三氯甲烷/三乙胺（v/v=100/1）

第四步，1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-(2-氨基乙基)-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃的合成

N₂保护下，在三口烧瓶中，加入4-吗啡啉-1,8-萘酐和乙醇，加热并搅拌，当温度升温至50 ℃时，加入1,3-交替-二(2-甲氧基乙基) -2,4-二(2-氨基乙基)硫杂杯[4]芳烃，摩尔比按4-吗啡啉-1,8-萘酐: 1,3-交替-二(2-甲氧基乙基) -2,4-二(2-氨基乙基)硫杂杯[4]芳烃=2～2.5:1加入，加热回流反应，反应停止，减压旋蒸除去溶剂后，粗产物用柱层析纯化，得黄绿色的固体：

反应温度：回流

反应时间：24h

反应溶剂：乙醇

洗脱剂：氯仿/乙酸乙酯（v/v=1/1）

第五步，1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-[(7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑-4-基)氨基]乙基-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃的合成

  N₂保护下，在三口烧瓶中，加入4-氯-7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑，中间体1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-(2-氨基乙基)-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃、碳酸钾，摩尔比按4-氯-7-硝基苯并-2,1,3-氧杂噁二唑:1,3-交替-二(2-甲氧基乙基)-2-(2-氨基乙基)-4-(4-吗啡啉基-1,8-萘酰亚胺基乙基)硫杂杯[4]芳烃:碳酸钾=1.2～1.7:1:1～2的摩尔比加入，干乙酸乙酯；加热反应，反应结束后，过滤沉淀，减压旋蒸除去溶剂后，固体多次柱层析，得橙黄色目标产物，即比率荧光探针试剂：

反应温度：60℃

反应时间：8h

反应溶剂：乙酸乙酯

洗脱剂：氯仿/乙酸乙酯（v/v=15/1）；正己烷/乙酸乙酯（v/v=2/1）。

4.如权利要求1所述的一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂的应用，其特征是所述试剂s1作为荧光法或紫外吸收光度法中用于检测微量Ag⁺的比率荧光试剂或比率吸收试剂；试剂s1作为荧光法或紫外吸收光度法中用于检测微量F^-或AcO^-的荧光试剂或比率吸收试剂。

5.根据权利要求4所述的一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂的应用，其特征是所述试剂s1可作为比率荧光法检测微量Ag⁺的试剂，检测的浓度线性范围为两个数量级，检测限低至10^-8 mol·L^-1；试剂s1可作为比率吸收法检测微量Ag⁺的试剂，检测的浓度线性范围为两个数量级，检测限低至10^-7 mol·L^-1。

6.根据权利要求4所述的一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂的应用，其特征是所述试剂s1用作为荧光猝灭法分别检测微量F^-或AcO^-的试剂，检测的浓度线性范围均为两个数量级，检测限低至10^-9 mol·L^-1；试剂s1用作为比率吸收法检测微量F^-或AcO^-的试剂，检测的浓度线性范围均为两个数量级，检测限低至10^-7 mol·L^-1。

7.根据权利要求4所述的一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂的应用，其特征是所述试剂s1在DMF（N,N-二甲基甲酰胺）/H₂O（4/1，v/v）溶液中作为比率荧光检测微量Ag⁺的试剂，测定Ag⁺时，在535nm和605nm处形成比率荧光，在565nm处有等发射点；作为比率吸收检测微量Ag⁺的试剂，测定Ag⁺时，在392nm和460nm、460nm和495nm处分别形成比率吸收，在350nm、415nm及480nm处有等吸收点。

8.根据权利要求4所述的一种比率法测Ag⁺、F^-或AcO^-的荧光探针试剂的应用，其特征是试剂s1在DMF溶剂中作为荧光猝灭分别检测微量F^-或AcO^-的试剂，在测定F^-或AcO^-时，以470为荧光激发波长，535nm为发射波长；试剂s1作为比率吸收分别检测微量F^-或AcO^-的试剂，在测定F^-或AcO^-时，在395nm和340nm处形成比率吸收，在350nm和460nm处有等吸收点。