CN109932349A - 一种检测次氯酸的有机硅小分子荧光探针 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测次氯酸的有机硅小分子荧光探针，化学结构式为：。探针本身处于荧光的状态，发射萘酰亚胺的荧光。加入次氯酸之后，探针中的萘酰亚胺与次氯酸作用而影响分子内电荷转移（ICT）过程，使探针萘酰亚胺部分荧光发生淬灭现象。当加入谷胱甘肽之后，已经淬灭的荧光发生荧光恢复的现象。该探针识别位点新颖、荧光恢复、响应速度快、抗干扰能力强。由1,3‑双(3‑氨基丙基)‑1,1,3,3‑四甲基二硅氧烷与5‑甲硫基‑1,8‑萘二甲酸酐于乙醇加热合成，合成原料易得，工艺简单。该探针在激光激发荧光生物标记领域和研究生物样品中次氯酸的生理功能有潜在的应用价值。

Description

一种检测次氯酸的有机硅小分子荧光探针

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测次氯酸的荧光探针及其应用。

背景技术

活性氧是生物体内在很多生理和病理过程起着非常重要作用的一些含氧自由基、氢基自由基和超氧阴离子自由基等和非自由基次氯酸和次氯酸等的总称。生物体内在氧化应激、炎症等生理和病理情况下，通过酶促和非酶促反应产生各种活性氧。近代的生物医学研究表明，体内产生的与一些疾病的发生、发展和机体的老化有着密切的关系。

次氯酸属于活性氧的一种，作为一种高效的杀菌剂，在生命的免疫系统中起到重要的作用。细胞内源性的次氯酸主要由白细胞如单核细胞，嗜酸性细胞，嗜中性粒细胞等中的髓过氧化物酶双氧水氯离子系统来产生。细胞免疫反应产生的次氯酸，但是一旦细胞中次氯酸的浓度发生异常，就会引起包括风湿性关节炎、心血管疾病和癌症在内的多种疾病。正是因为次氯酸具有如此重要的生理和病理学意义，对次氯酸的检测引起了人们的广泛重视。

可用于选择性检测次氯酸的方法有很多，如碘量滴定法、比色法、化学发光法、库仑法、极谱法和辐解法等。然而，这些方法往往比较繁琐，一些工作必须在有机介质或有机水介质中进行，限制其应用。与上述方法相比，荧光探针被认为是生物研究理想的手段，因为荧光检测所需的仪器相对简单，选择性和灵敏度高，检测范围广，响应时间快速，而且检测过程对样品没有破坏，对细胞危害也很小，荧光检测结合显微镜可以提供实时结果。

一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。一般来说，荧光探针由两部分组成一部分是荧光信号基团，另一部分是识别基团，次氯酸的识别位点有硫醚键、苯胺基等。当探针识别目标时，化学反应可以被转换成一个光谱信号。近年来，有较多检测活细胞中次氯酸荧光探针的报道，然而存在原料不易得、合成步骤及操作复杂，抗干扰性差，识别位点单一等多方面的问题。因此，发展新的识别位点应用于次氯酸的检测尤为重要，从而为研究细胞病变过程中次氯酸浓度变化情况提供可视化的检测工具。

有机硅的种类繁多，是因为硅氧烷包含多种基团结构。有机硅小分子有许多优越的性能。常用的有机硅分子具有电绝缘，耐高低温，耐老化，生理惰性好等优点，是其他碳基高分子材料无法比拟的。相反，有机聚合物广泛应用于航空航天，化工，纺织，医疗，轻工，农业，电子等诸多领域。

近年来，能特异性检测次氯酸的小分子荧光探针被大量报道。但是，较少有关于有机硅小分子的荧光材料及功能化的探针被报道。另一方面，硅的阻断作用可避免聚合物聚集而使放光光谱变宽等缺点。因此设计快速灵敏的聚硅氧烷的次氯酸检测的荧光探针具有十分重要的意义。

发明内容

针对目前检测次氯酸的荧光探针的原料不易得、合成步骤及操作复杂，抗干扰性差，识别位点单一等多方面的问题，本发明提供一种检测次氯酸的双光子性能的有机硅小分子荧光探针，识别位点新颖、荧光恢复、响应速度快、抗干扰能力强。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中或生物细胞内次氯酸的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测次氯酸的荧光探针，简称为BSi-1，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：1,3-双(3-氨基丙基)-1,1,3,3-四甲基二硅氧烷与5-甲硫基-1,8-萘二甲酸酐于乙醇加热反应，分离、提纯得化合物，即为探针BSi-1：

。

所述1,3-双(3-氨基丙基)-1,1,3,3-四甲基二硅氧烷与5-甲硫基-1,8-萘二甲酸酐的物质的量比为2:1。

所述反应温度为78 ℃，反应时间为24 h。

所述分离、提纯步骤为：将反应液旋蒸、干燥，以二氯甲烷:甲醇（V/V）=20:1为洗脱液，柱色谱得到化合物BSi-1。

一种上述荧光探针在检测溶液、细胞或生物体中次氯酸的应用。

本发明的机理如下：

。

本发明所述检测次氯酸的荧光探针BSi-1，探针本身处于荧光的状态，因此探针发射萘酰亚胺的荧光，加入次氯酸之后，探针中的萘酰亚胺与次氯酸作用而影响分子内电荷转移（ICT）过程，使探针萘酰亚胺部分荧光发生淬灭现象。当加入谷胱甘肽之后，已经淬灭的荧光发生荧光恢复的现象。

本发明具有以下优点：

本发明所述荧光探针BSi-1能专一识别次氯酸，并以荧光减弱方式实现对次氯酸的识别，尤其是它还可以定向的识别生物中的次氯酸，同时还可以被谷胱甘肽恢复荧光状，具有合成简单、特异性强、响应迅速、抗干扰等特点。在激光激发荧光生物标记领域和研究生物样品中次氯酸的生理功能有潜在的应用价值。

附图说明

图1是探针BSi-1的¹H NMR谱图；

图2是探针BSi-1与次氯酸作用的滴定实验，其中激发波长为405 nm，探针的浓度为10µM；

图3是探针BSi-1与次氯酸作用的动力学实验。其中激发波长为405 nm，探针的浓度为10µM，次氯酸的浓度为10 mmoL/L，测试时间3 min；

图4是探针BSi-1在水相中的选择性，其中激发波长为405 nm，探针的浓度为10 µM，选择性离子的浓度为2.5 mM，活性氧（或者活性氮）浓度为100 μM；

图5是探针BSi-1与次氯酸作用发生淬灭后，谷胱甘肽对其荧光恢复的荧光滴定检测，探针浓度为10 μM，次氯酸浓度为20 μM，激发波长为405 nm；

图6是探针BSi-1对细胞外源性次氯酸细胞成像测试，探针浓度为10 μM，次氯酸浓度为20 μM，激发波长为405 nm。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 荧光探针BSi-1的合成

在250 mL圆底烧瓶中，加入1,3-双(3-氨基丙基)-1,1,3,3-四甲基二硅氧烷0.25 g溶于100 mL乙醇中，再加入0.49 g5-甲硫基-1,8-萘二甲酸酐，78 ℃加热搅拌回流24 h，旋蒸、干燥，以二氯甲烷:甲醇（V/V）=20:1为洗脱液，柱色谱得到化合物BSi-1。其¹H NMR图谱如图1所示。

实施例2 不同浓度的次氯酸对探针BSi-1的荧光滴定检测

配制10 mL浓度为100 mM次氯酸的水溶液及浓度为1 mM的实施例1所得荧光探针BSi-1母液作为备用。

配制探针浓度为10 μM，分别与不同浓度的次氯酸（0、1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20 μM）相互作用，并进行荧光检测（λ_ex=405 nm，λ_em=485 nm），计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与次氯酸浓度标准曲线，如图2。由图2可知，随着次氯酸浓度的增加，反应体系荧光强度快速减弱，当次氯酸浓度达到20 μM时，反应体系荧光直至全部淬灭。

实施例3 探针BSi-1与次氯酸相互作用的动力学测试

配制10 mL浓度为100 mM次氯酸的水溶液及浓度为1 mM的实施例1所得荧光探针BSi-1母液作为备用。

配制探针BSi-1和次氯酸的溶液，其浓度分别为探针10 μM；次氯酸浓度为20 μM。进行荧光检测（λ_ex=405 nm，λ_em=485 nm），前30s，每隔5s测试一次；后面每10s测试一次，约3分钟。计算各体系中随时间变化的荧光强度，建立荧光强度与作用时间标准曲线，如图3所示。由图3可知，反应30 s，反应体系荧光基本全部淬灭。

实施例4 化合物BSi-1荧光探针对不同分子或离子的选择性

配制5 mL浓度为40 mM的各种常规离子（ClO^-、Na⁺、K⁺、Fe³⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Sn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ba²⁺、NO₂ ^-、F^-、I^-、SO₃ ^2-、S₂O₃ ^2-、S^2-、H₂S、H₂O₂、Vc、MnO₂）的PBS水溶液（pH=7.2）及浓度为1 mM的实施例1所得荧光探针BSi-1母液作为备用。

加入25 μL探针母液、500 μL乙醇和500当量的各离子溶液，用磷酸缓冲液PBS（pH=7.2）定容至3 mL，摇匀后30 min进行荧光检测（λ_ex=405 nm，λ_em=485 nm），建立荧光强度与各离子的曲线图，如图4。由图4可知，30 s后，加入ClO^-溶液的荧光发射光谱发生非常明显的减弱变化，其他离子对荧光探针BSi-1的荧光几乎没有影响。

实施例5 谷胱甘肽对其反应后探针的荧光恢复

配制10 mL浓度为100 mM次氯酸的水溶液、100mM谷胱甘肽的水溶液及浓度为1 mM的实施例1所得荧光探针BSi-1母液作为备用。

配制探针BSi-1和次氯酸的溶液，其浓度分别为探针10 μM；次氯酸浓度20 μM，进行荧光检测（λ_ex=405 nm，λ_em=485 nm），荧光全部淬灭时，加入不同100mM的氨基酸（甘氨酸、异亮氨酸、色氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸）的水溶液，进行测试。建立荧光强度与波长的荧光曲线，如图5所示。由图5可知，加入半胱氨酸水溶液后，其荧光强度最多能恢复的数值约为87%。

实施例6 探针BSi-1对斑马鱼成像测试

配制10 mL浓度为100 mM次氯酸的水溶液、100mM谷胱甘肽的水溶液及浓度为1 mM的实施例1所得荧光探针BSi-1母液作为备用。

配制探针BSi-1和次氯酸的溶液，其浓度分别为探针10 μM；次氯酸20 μM，进行斑马鱼成像测试；然后加入次氯酸水溶液30min后，再次成像；然后加入谷胱甘肽水溶液5 min后，再次成像，如图6，a、b、c为BSi-1共聚焦斑马鱼成像图；d、e、g为BSi-1与次氯酸发生淬灭共聚焦斑马鱼成像图；h、i、j为谷胱甘肽对其荧光恢复的共聚焦斑马鱼成像图。由图6可见，加入次氯酸后，斑马鱼体内荧光淬灭；当荧光全都淬灭后，加入谷胱甘肽水溶液，荧光恢复。

Claims (6)

1.一种检测次氯酸的荧光探针，其化学结构式为：

。

2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1,3-双(3-氨基丙基)-1,1,3,3-四甲基二硅氧烷与5-甲硫基-1,8-萘二甲酸酐于乙醇加热反应，分离、提纯得化合物，即为荧光探针。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应物料1,3-双(3-氨基丙基)-1,1,3,3-四甲基二硅氧烷与5-甲硫基-1,8-萘二甲酸酐的物质的量比为2:1。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应温度为78 ℃，反应时间为24h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述分离、纯化步骤为：将反应液旋蒸、干燥，以体积比为20:1的二氯甲烷:甲醇为洗脱液过柱色谱。

6.一种如权利要求1所述的荧光探针在检测溶液、细胞或生物体中次氯酸的应用。