CN109971464A - 一种基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的制备方法。本发明采用氧杂蒽和香豆素二联体作为荧光母体，分别在香豆素母体上引入与过氧化亚硝基特异性反应的二苯基次膦酰氯和在氧杂蒽引入与次氯酸根特异性反应的含硫五元环，当过氧化亚硝基和次氯酸根单独存在或同时存在条件下，在不同的激发波长下发射不同的荧光。该荧光探针能够实现对过氧化亚硝基和次氯酸根的高选择性、高灵敏度检测，在活性小分子检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧 光探针的制备方法
技术领域
本发明涉及有机小分子荧光探针领域，尤其是涉及一种基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的制备方法。
背景技术
过氧化亚硝基和次氯酸根都属于活性氧物种，他们在生物内广泛存在的重要的生物活性物质，在生命体内广泛存在。过氧化亚硝基(ONOO-)是一种具有强氧化性短寿命的活性物种，在生命体内主要由一氧化氮(NO)和超氧阴离子反应而产生。次氯酸根(ClO-)在生命体内主要由髓过氧化物酶的催化作用下，过氧化氢和细胞内的氯离子发生反应生成次氯酸根离子。医学研究表明异常的生理浓度可能会引起疾病，当生命体发生缺血再灌注，体内炎症，发生药物肝损伤，肿瘤等疾病时会引起过氧化亚硝基(ONOO-)和次氯酸根(ClO-)浓度异常，通过检测生物体内异常的过氧化亚硝基(ONOO-)和次氯酸根(ClO-)浓度可以预测特定的疾病。然而，长久以来，检测手段的缺乏阻碍了人们对一在生命体系中作用行为的研究。此前报道的大都为检测单一活性氧物质的，因此，合成具有多检测功能的探针十分有必要。
荧光探针技术作为在分子水平上对研究对象进行研究的分析方法，其开发与利用研究是化学与生物、医学、农业等科学的交叉领域，因其具有选择性好、灵敏度高、操作简便快速、对检测物损伤少等优点已被广泛应用于检测环境和生物体系中的金属阳离子、阴离子、生物体内活性小分子等方面。目前荧光探针已经被广泛应用于环境和生物体中重金属、生物活性小分子等物质的检测。氧杂蒽和香豆素具有较大的摩尔吸光系数、荧光量子产率高、较好的光学稳定性、波长范围宽，生物相容性好等优点已经被广泛的应用于荧光探针的设计与合成。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，通过分子结构的设计，提供了一种水溶性好，响应快，选择性性好，灵敏度高的识别过氧化亚硝基和次氯酸根的荧光探针分子，解决了目前单一探针分子只能检测过氧化亚硝基和次氯酸根中的一种，区分度不够的问题。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针，简称为Dual-NC，其结构式如下：
一种基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的制备方法，具体包括如下反应步骤：
(1)化合物a和化合物b在三氟乙酸存在条件下加热反应，反应完全后分离提纯得到化合物1；
(2)化合物1和芴甲氧碳酰氯在无水乙腈中反应，反应结束后分离提纯得化合物2；
(3)化合物2和劳森试剂在无水甲苯中加热反应，反应结束后分离提纯得化合物3；
(4)化合物3在哌啶和乙腈的混合液中搅拌反应，反应结束后分离提纯得化合物4；
(5)化合物4和化合物5在三乙胺存在条件下于二氯甲烷中反应，反应完全后分离提纯得到化合物6；
(6)化合物6与二苯基次膦酰氯在二氯甲烷中反应，反应结束后分离提纯得到荧光探针 Dual-NC；
其反应式如下：
优选地，所述步骤(1)具体为：将摩尔比为1∶1的化合物a与化合物b加入到三氟乙酸中，于60-90℃加热回流反应6-48h，而后经减压除去溶剂，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，硅胶柱层析分离获得化合物1，产率为50-95％；其中硅胶柱层析分离是以体积比二氯甲烷：甲醇＝1-100∶1为洗脱剂。
优选地，所述步骤(2)具体为：将摩尔比为1∶1-5的化合物1和芴甲氧碳酰氯加入无水乙腈中，加入碳酸氢钠，氮气保护条件下反应12-24h，反应完全后，经过滤，减压除去溶剂，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，硅胶柱层析分离获得化合物2；其中，所述化合物1和碳酸氢钠的摩尔比为1:2，所述硅胶柱层析分离是以体积比石油醚:乙酸乙酯＝1-20∶1为洗脱剂。
优选地，所述步骤(3)具体为：将摩尔比为0.5-1.5∶1的化合物2和劳森试剂溶于无水甲苯中，氮气保护下于111-120℃加热回流反应，TLC监测反应进程，反应完全后，经减压除去溶剂，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，硅胶柱层析分离获得化合物3，产率为30-80％；其中硅胶柱层析分离是以体积比石油醚：乙酸乙酯＝0.5-5∶1为洗脱剂。
优选地，所述步骤(4)具体为：将步骤(3)所得的化合物(3)溶解于哌啶和乙腈的混合液中，TLC监测反应进程，反应完全后，经减压除去溶剂，硅胶柱层析分离获得化合物4，产率为30-80％；其中，所述的哌啶和乙腈的混合溶液中哌啶和乙腈的体积比为5％-35％，所述硅胶柱层析分离是以体积比二氯甲烷∶甲醇＝1-100∶1为洗脱剂。
优选地，所述步骤(5)具体为：将摩尔比为1∶0.5-3的化合物4和化合物5溶解于二氯甲烷中，再加入三乙胺，TLC监测反应进程，反应完全后，经减压除去溶剂，硅胶柱层析分离获得化合物6，产率为30-90％，其中所述硅胶柱层析分离是以体积比CH2Cl2∶ CH3OH＝10-100∶1为洗脱剂。
优选地，所述步骤(6)具体为：将步骤(5)获得的化合物6溶于无水二氯甲烷中，加入三乙胺，于-10-10℃下逐滴滴加二苯基次膦酰氯，TLC监测反应进程，反应完全后，经减压除去溶剂，硅胶柱层析分离获得荧光探针Dual-NC，产率为30-75％，其中，二苯基次膦酰氯与化合6的用量比为100-200μL∶1mmol，所述的硅胶柱层析分离是以体积比CH2Cl2∶ CH3OH＝50-500∶1为洗脱剂，所述的三乙胺与二苯基次膦酰氯的体积比为0.5-1∶1。
上述基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的应用，用于待测样品中过氧化亚硝基和次氯酸根的检测以及过氧化亚硝基和次氯酸根的定量检测。
本发明荧光探针Dual-NC对过氧化亚硝基和次氯酸跟的识别机理如下：
过氧化亚硝基特异性与二苯基次膦酰基反应，香豆素羟基脱保护，从而产生最大发射峰为456nm的荧光；次氯酸根特异性与含硫五元环反应，导致五元环打开，从而产生最大发射为574nm的荧光。
本发明的有益效果是：
本发明提供的基于香豆素和氧杂蒽的能够区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针(Dual-NC)结构新颖，合成方法简单且易分离。
本发明基于香豆素和氧杂蒽的荧光探针Dual-NC，具有响应时间快，灵敏度高的特点。
本发明基于香豆素和氧杂蒽的荧光探针Dual-NC具有高度的专一性，首先识别过氧化亚硝基和次氯酸根最大荧光发射峰(分别为456nm和574nm)相距较远，不会产生干扰，识别基团具有较好的专一性；其次本发明的探针能够排除各种金属离子、活性硫及其它活性氧的干扰，对过氧化亚硝基和次氯酸根的识别具有高度的专一性。
本发明的基于香豆素和氧杂蒽的荧光探针Dual-NC能够适用于生理条件下检测过氧化亚硝基和次氯酸根以及定量检测样品液中过氧化亚硝基和次氯酸根的含量，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明所述荧光探针Dual-NC的合成路线。
图2是本发明所述荧光探针Dual-NC的核磁氢谱图。
图3是本发明所述荧光探针Dual-NC的高分辨质谱。
图4是本发明所述荧光探针Dual-NC对过氧化亚硝基的选择性响应荧光光谱图。
图5是本发明所述荧光探针Dual-NC对次氯酸根的选择性响应荧光光谱图。
图6是本发明所述荧光探针Dual-NC的荧光强度随过氧化亚硝基浓度变化的荧光谱图变化(a)和线性关系图(b)。
图7是本发明所述荧光探针Dual-NC的荧光强度随次氯酸根浓度变化的荧光谱图变化(a) 和线性关系图(b)。
图8是本发明所述荧光探针Dual-NC对过氧化亚硝基响应在456nm荧光强度随时间变化曲线(a)和574nm处荧光强度随时间变化曲线(b)。
图9是本发明所述荧光探针Dual-NC对次氯酸根响应在456nm荧光强度随时间变化曲线(a)和574nm处荧光强度随时间变化曲线(b)。
图10是本发明所述荧光探针Dual-NC对过氧化亚硝基在不同pH的响应荧光光谱图。
图11是本发明所述荧光探针Dual-NC对次氯酸根在不同pH的响应荧光光谱图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例进行详细描述。
实施例1：荧光探针Dual-NC的合成
将10mmol化合物a和10mmol化合物b溶解在50mL三氟乙酸中，于80℃加热回流 18小时，减压蒸馏除去三氟乙酸，加入100mL冰水，用饱和碳酸钾调节pH至12，用二氯甲烷萃取，有机层使用无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，用200-400目的硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1(体积比)，得红色固体化合物1；
将5mmol化合物1和5mmol芴甲氧碳酰氯溶解在50mL无水乙腈中，搅拌至溶解，加入10mmol碳酸氢钠，氩气保护条件下反应12h，反应完全后，过滤，滤液减压除去溶剂，使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，用200-400目的硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1(体积比)，得粉红色固体化合物2；
将2mmol化合物2和2mmol劳森试剂溶解在50mL无水甲苯中，氮气保护条件下115℃加热回流反应，TLC监测反应完全后，减压除去溶剂，采用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压去除溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1(体积比)，得白色化合物3；
将2mmol化合物3溶于30mL哌啶和乙腈的混合溶液(哌啶和乙腈的体积比为5％)中， TLC监测反应至完全后，减压除去溶剂，采用二氯己烷∶甲醇＝10∶1(体积比)为洗脱剂柱层析分离得白色化合物4；
将0.5mmol化合物4和0.5mmol化合物5溶于10mL无水二氯甲烷中，加入20μL三乙胺，TLC监测反应进程，待反应完全后，减压除去溶剂，采用二氯甲烷：甲醇＝20∶1(体积比)为洗脱剂硅胶柱层析分离，得黄色化合物6；
将0.1mmol化合物6溶于20mL无水二氯甲烷中，加入10μL三乙胺，于-10-10℃条件下，将20μL二苯基次膦酰氯逐滴加入体系中，TLC监测反应进程，待反应完全后，减压除去溶剂，采用二氯甲烷：甲醇＝100：1(体积比)为洗脱剂硅胶柱层析分离，得浅黄色化合物即为荧光探针Dual-NC。
以上具体反应式如下(如图1)：
荧光探针Dual-NC的核磁共振氢谱：
1HNMR(CDCl3,400MHz,ppm):8.14(d,J＝7.68Hz,1H),7.95-7.89(m,5H),7.64-7.57(m, 3H),7.56-7.46(m,6H),7.33-7.30(m,1H),7.22(s,1H),7.17(d,J＝7.68Hz,1H),6.83(d,J ＝8.8Hz,1H),6.75(d,J＝8.52Hz,1H),6.62(d,J＝2.36Hz,1H),6.57-6.54(m,1H),6.35(d,J＝10.16Hz, 2H),3.92(d,J＝5.16Hz,2H),3.52(s,2H),3.39-3.34(m,6H),3.27(s,2H),1.20(t,J＝13.76Hz,6H)。
荧光探针Dual-NC的高分辨质谱：HR-MS:m/z,calculatedforC50H43N3O7PS+ [M+H]+860.2554；Found860.2572。
核磁共振氢谱(图2)、高分辨质谱(图3)证明了荧光探针Dual-NC的结构如下：
实施例2：荧光探针Dual-NC的合成
将10mmol化合物a和10mmol化合物b溶解在50mL三氟乙酸中，于80℃加热回流18小时，减压蒸馏除去三氟乙酸，加入100mL冰水，用饱和碳酸钾调节pH至12，用二氯甲烷萃取，有机层使用无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，用200-400目的硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1(体积比)，得红色固体化合物1；
将5mmol化合物1和15mmol芴甲氧碳酰氯溶解在50mL无水乙腈中，搅拌至溶解，加入10mmol碳酸氢钠，氩气保护条件下反应18h，反应完全后，过滤，滤液减压除去溶剂，使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，用200-400目的硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1(体积比)，得粉红色固体化合物2；
将2mmol化合物2和1mmol劳森试剂溶解在50mL无水甲苯中，氮气保护条件下115℃加热回流反应，TLC监测反应完全后，减压除去溶剂，采用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压去除溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1(体积比)，得白色化合物3；
将1mmol化合物3溶于30mL哌啶和乙腈的混合液(哌啶和乙腈的体积比为5％)中，TLC监测反应至完全后，减压除去溶剂，采用二氯己烷∶甲醇＝10∶1(体积比)为洗脱剂柱层析分离得白色化合物4；
将0.5mmol化合物4和1mmol化合物5溶于20mL无水二氯甲烷中，加入20μL三乙胺，TLC监测反应进程，待反应完全后，减压除去溶剂，采用二氯甲烷：甲醇＝40∶1(体积比)为洗脱剂硅胶柱层析分离，得黄色化合物6；
将0.1mmol化合物6溶于20mL无水二氯甲烷中，加入10μL三乙胺，于-10-10℃条件下，将20μL二苯基次膦酰氯逐滴加入体系中，TLC监测反应进程，待反应完全后，减压除去溶剂，采用二氯甲烷：甲醇＝100：1(体积比)为洗脱剂硅胶柱层析分离，得浅黄色化合物即为荧光探针Dual-NC。
具体反应式如图1所示。
实施例3：荧光探针Dual-NC的合成
将10mmol化合物a和10mmol化合物b溶解在50mL三氟乙酸中，于80℃加热回流 18小时，减压蒸馏除去三氟乙酸，加入100mL冰水，用饱和碳酸钾调节pH至12，用二氯甲烷萃取，有机层使用无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，用200-400目的硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1(体积比)，得红色固体化合物1；
将5mmol化合物1和25mmol芴甲氧碳酰氯溶解在100mL无水乙腈中，搅拌至溶解，加入10mmol碳酸氢钠，氩气保护条件下反应24h，反应完全后，过滤，滤液减压除去溶剂，使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，用200-400目的硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1(体积比)，得粉红色固体化合物2；
将2mmol化合物2和1.4mmol劳森试剂溶解在10mL无水甲苯中，氮气保护条件下120℃加热回流反应，TLC监测反应完全后，减压除去溶剂，采用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压去除溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1(体积比)，得白色化合物3；
将1mmol化合物3溶于30mL哌啶和乙腈的混合溶液(哌啶和乙腈的体积比为5％)中， TLC监测反应至完全后，减压除去溶剂，采用二氯己烷∶甲醇＝10∶1(体积比)为洗脱剂柱层析分离得白色化合物4；
将0.5mmol化合物4和2mmol化合物5溶于50mL无水二氯甲烷中，加入20μL三乙胺，TLC监测反应进程，待反应完全后，减压除去溶剂，采用二氯甲烷：甲醇＝100∶1(体积比)为洗脱剂硅胶柱层析分离，得黄色化合物6；
将0.1mmol化合物6溶于20mL无水二氯甲烷中，加入10μL三乙胺，于-10-10℃条件下，将20μL二苯基次膦酰氯逐滴加入体系中，TLC监测反应进程，待反应完全后，减压除去溶剂，采用二氯甲烷：甲醇＝100：1(体积比)为洗脱剂硅胶柱层析分离，得浅黄色化合物即为荧光探针Dual-NC。
具体反应式如图1所示。
实施例4：荧光探针的验证实验
选择性：荧光探针Dual-NC对不同分子或离子的选择性
将实施例1中的Dual-NC荧光探针配置成终浓度为1mM的母液。
配置3ml下列物质Cu2+，Mg2+，Zn2+，Fe2+，Fe3+，Ca2+，HS-，HSO3 -，Hcy， Cys，GSH，NO3 -，NO2 -，-OH，1O2，O2 -(10μM)，H2O2，ONOO-(40μM)，ClO- (30μM)的溶液(其中O2 -的摩尔浓度为10μM，ONOO-的摩尔浓度为40μM，ClO-的摩尔浓度为30μM，其它物质的摩尔浓度均为100μM)，摇匀，用磷酸盐空白作为对照。以上溶液中各加入30μL母液，待半小时后测试荧光强度(激发波长分别为400nm和540nm，最大发射峰分别为456nm和574nm)。
分别以456nm和574nm荧光强度作为纵坐标，以不同离子作为横坐标，作图4和图5，其中1-20分别表示1.Cu2+2.Mg2+3.Zn2+4.Fe2+5.Fe3+6.Ca2+7.HS-8.HSO3 -9.Hcy10.Cys11.GSH12.NO3-13.NO2-14..OH15.1O216.O2-17.H2O218.单独探针19.ONOO-20.ClO-，从图4、图5 可以看出，荧光探针Dual-NC在PBS缓冲体系下(PH＝7.4)，400nm激发条件下，在456nm 荧光发射条件下单一的识别过氧化亚硝基(如图4)，在574nm的荧光发射条件下单一识别次氯酸根(如图5)，其它金属离子、活性硫、活性氧等离子或分子基本不产生干扰；说明本发明的荧光探针Dual-NC对次氯酸根和过氧化亚硝基具有高度的专一识别性，同时可以根据荧光发射峰的变化做到对过氧化亚硝基和次氯酸根进行很好的区分。
定量检测：
不同浓度的过氧化亚硝基下Dual-NC荧光强度变化
采用紫外分光光度计对配置的过氧化亚硝基进行标定，测试其在302nm处的吸光度，根据比尔定律算出浓度，并用水稀释为0.1-10mM共25个浓度，而后向上述选择性验证实验中的Dual-NC荧光探针母液分别加入不同浓度的过氧化亚硝基，反应半小时进行荧光检测(激发400nm，最大发射456nm)，以荧光强度-过氧化亚硝基浓度做曲线，结果如图6所示。
如图6(a)所示，当浓度为0.1μM时，探针Dual-NC即有荧光变化。随着过氧化亚硝基浓度增加，荧光强度不断增加，在0.1-1.0μM时拟合满足线性关系(如图6(b))。因此通过测定荧光强度即可从图中得到溶液中过氧化亚硝基的含量，表明该荧光探针能定量检测样品液中过氧化亚硝基的含量。
不同浓度的次氯酸根下Dual-NC荧光强度变化：
采用紫外分光光度计对配置的次氯酸根进行标定，测试其在350nm处的吸光度，根据比尔定律算出浓度，并用水稀释为0.1-10mM共25个浓度，而后向上述选择性验证实验中的 Dual-NC荧光探针母液中分别加入不同浓度的次氯酸根，反应半小时进行荧光检测(激发400 nm，最大发射456nm)，以荧光强度-次氯酸根浓度做曲线，曲线图如图7所示。
从图7(a)中看出，当浓度为0.1μM时，探针Dual-NC即有荧光变化。随着次氯酸根浓度增加，荧光强度不断增加，在0.1-1.0μM时拟合满足线性关系(如图7(b))，因此通过测定荧光强度即可从图中得到溶液中次氯酸根的含量，表明该荧光探针能定量检测样品液中次氯酸根的含量。
专一性识别：
一定浓度下的过氧化亚硝基Dual-NC荧光强度变化
对已经标定好浓度为40μM的过氧化亚硝基，加入到探针浓度10μM体积3mLPBS 缓冲体系中，每隔2分钟测一次荧光强度变化，结果如图8。
如图8(a)所示，当激发波长为400nm时，探针在456nm处的荧光强度显著变化，几分钟内就可以达到最大值，于此同时，如图8(b)所示，激发波长为540nm时，探针Dual-NC 在574nm处的荧光强度几乎没有变化。表明探针能够在400nm激发下专一性识别过氧化亚硝基，同时574nm处的荧光不受干扰。
一定浓度下的次氯酸根Dual-NC荧光强度变化
对已经标定好浓度为30μM的次氯酸根，加入到探针浓度10μM体积3mLPBS缓冲体系中，每隔2分钟测一次荧光强度变化，结果如图9所示。
如图9(b)所示，当激发波长为540nm时，探针在574nm处的荧光强度显著变化，几分钟内就可以达到最大值，于此同时，如图9(a)所示，激发波长为400nm时，探针Dual-NC 在456nm处的荧光强度几乎没有变化。表明探针能够在540nm激发下专一性识别次氯酸根，同时456nm处的荧光不受干扰。
结合一定浓度下的过氧化亚硝基Dual-NC荧光强度变化的结果(如图8)和一定浓度下的次氯酸根Dual-NC荧光强度变化的结果(如图9)，表明探针在识别过氧化亚硝基和次氯酸根时具有专一性，不会产生互相干扰。
生理条件下的适用性：
不同pH下的Dual-NC识别过氧化亚硝基和次氯酸根的荧光强度变化：
对已经配置好pH为4-10的PBS溶液，分为相同三组，每组pH均为4-10，每个pH值分别取3.0ml至分析瓶中，每一瓶中都加入一定量的探针，使其终浓度为10μM，第一组为单独探针(10μM)，第二组为探针(10μM)+ONOO-(30μM)，第三组为探针(10μM)+ClO-(30 μM)。半小时后，第一组分别在400nm和540nm处激发测试荧光强度，第二组只在400nm 处激发测试荧光强度，结合第一组单独探针在400nm处激发，分别取最大发射456nm处作图，如图10所示。第三组只在540nm处激发测试荧光强度，结合第一组单独探针在540nm 处激发，分别取最大发射574nm处作图，如图11所示。表明该探针能够适用于生理条件下检测过氧化亚硝基和次氯酸根。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针，其特征在于，所述荧光探针分子简称为Dual-NC，其结构式如下：
2.一种如权利要求1所述的基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的制备方法，其特征在于，具体包括如下反应步骤：
(1)化合物a和化合物b在三氟乙酸存在条件下加热反应，反应完全后分离提纯得到化合物1；
(2)化合物1和芴甲氧碳酰氯在无水乙腈中反应，反应结束后分离提纯得化合物2；
(3)化合物2和劳森试剂在无水甲苯中加热反应，反应结束后分离提纯得化合物3；
(4)化合物3在哌啶和乙腈的混合液中搅拌反应，反应结束后分离提纯得化合物4；
(5)化合物4和化合物5在三乙胺存在条件下于二氯甲烷中反应，反应完全后分离提纯得到化合物6；
(6)化合物6与二苯基次膦酰氯在二氯甲烷中反应，反应结束后分离提纯得到荧光探针Dual-NC；
其反应式如下：
3.如权利要求2所述的基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：将摩尔比为1∶1的化合物a与化合物b加入到三氟乙酸中，于60-90℃加热回流反应6-48h，而后经减压除去溶剂，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，硅胶柱层析分离获得化合物1，产率为50-95％；其中硅胶柱层析分离是以体积比二氯甲烷：甲醇＝1-100∶1为洗脱剂。
4.如权利要求2所述的基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：将摩尔比为1∶1-5的化合物1和芴甲氧碳酰氯加入无水乙腈中，加入碳酸氢钠，氮气保护条件下反应12-24h，反应完全后，经过滤，减压除去溶剂，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，硅胶柱层析分离获得化合物2；其中，所述化合物1和碳酸氢钠的摩尔比为1:2，所述硅胶柱层析分离是以体积比石油醚:乙酸乙酯＝1-20∶1为洗脱剂。
5.如权利要求2所述的基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：将摩尔比为0.5-1.5∶1的化合物2和劳森试剂溶于无水甲苯中，氮气保护下于111-120℃加热回流反应，TLC监测反应进程，反应完全后，经减压除去溶剂，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，硅胶柱层析分离获得化合物3，产率为30-80％；其中硅胶柱层析分离是以体积比石油醚：乙酸乙酯＝0.5-5∶1为洗脱剂。
6.如权利要求2所述的基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)具体为：将步骤(3)所得的化合物(3)溶解于哌啶和乙腈的混合液中，TLC监测反应进程，反应完全后，经减压除去溶剂，硅胶柱层析分离获得化合物4，产率为30-80％；其中，所述的哌啶和乙腈的混合溶液中哌啶和乙腈的体积比为5％-35％，所述硅胶柱层析分离是以体积比二氯甲烷∶甲醇＝1-100∶1为洗脱剂。
7.如权利要求2所述的基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)具体为：将摩尔比为1∶0.5-3的化合物4和化合物5溶解于二氯甲烷中，再加入三乙胺，TLC监测反应进程，反应完全后，经减压除去溶剂，硅胶柱层析分离获得化合物6，产率为30-90％，其中所述硅胶柱层析分离是以体积比CH2Cl2∶CH3OH＝10-100∶1为洗脱剂。
8.如权利要求2所述的基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)具体为：将步骤(5)获得的化合物6溶于无水二氯甲烷中，加入三乙胺，于-10-10℃下逐滴滴加二苯基次膦酰氯，TLC监测反应进程，反应完全后，经减压除去溶剂，硅胶柱层析分离获得荧光探针Dual-NC，产率为30-75％，其中，二苯基次膦酰氯与化合6的用量比为100-200μL∶1mmol，所述的硅胶柱层析分离是以体积比CH2Cl2∶CH3OH＝50-500∶1为洗脱剂，所述的三乙胺与二苯基次膦酰氯的体积比为0.5-1∶1。
9.一种如权利要求1所述的基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的应用，用于待测样品中过氧化亚硝基和次氯酸根的检测。
10.一种如权利要求1所述的基于氧杂蒽和香豆素的区分过氧化亚硝基和次氯酸根荧光探针的应用，用于待测样品中过氧化亚硝基和次氯酸根的定量检测。
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