CN111925393B - 用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和/或单线态氧的双功能荧光探针及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于荧光检测技术领域，公开了一种用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和/或单线态氧的双功能荧光探针及其制备方法和用途，通过制备7‑(二乙氨基)香豆素、7‑(二乙氨基)香豆素醛等一系列步骤后，得到用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和/或单线态氧的双功能荧光探针。经过本发明的合成方法改进后，可以有效阻止副反应的发生，极大地减少反应过程中出现难以分离的杂质，从而可以得到高纯度的目标产物。本发明制得的双功能荧光探针不仅可以单独检测氯酸根离子或单线态氧，还可以同时区分次氯酸根离子和单线态氧的水平，也可用于细胞中内源性次氯酸根离子和/或单线态氧的荧光成像。

Description

用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和/或单线态氧的双功 能荧光探针及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及荧光检测技术领域，尤其涉及一种用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和/或单线态氧的双功能荧光探针及其制备方法和用途。
背景技术
活性氧(ROS)是正常氧代谢的天然产物，参与了许多重要的生物活动。次氯酸根离子(ClO-)作为一种重要的活性氧，在宿主先天免疫和维持细胞内氧化还原平衡中发挥着重要的作用。另一方面，单线态氧(1O2)作为另一种重要的活性氧，在细胞的信号传导和基因表达的诱导中都扮演着重要的角色。此外，光动力学疗法(PDT)是一种众所周知的癌症治疗技术，而单线态氧在这一过程中也起着至关重要的作用。ClO-与1O2共存在生命系统中，并且它们在很多情况下是可以相互转化的。
在很多的人类疾病和相关的生物学过程中，次氯酸根离子和单线态氧的相互作用是极其重要的。例如，在炎症过程中产生的次氯酸根离子和单线态氧能够起到杀菌的作用。次氯酸根离子和单线态氧也参与了缺血再灌输的损伤过程，导致胰腺、肾脏、肺和肝脏的损伤；次氯酸根离子和单线态氧经常与细胞膜上的胆固醇反应，形成生物活性介质；由于次氯酸根离子对原生质中乙烯醚的选择性氧化，经常使心血管系统发生动脉粥样硬化性病变；而最近有研究表明单线态氧可以破坏动脉粥样硬化形成的斑块，从而用于治疗动脉粥样硬化性病变；当细胞暴露于次氯酸根离子和单线态氧中时可能会引起细胞应激反应，这是因为激活了调节增殖和凋亡反应的细胞传导信号；次氯酸根离子和单线态氧还能够氧化含硫醇的生物分子并调节细胞氧化还原平衡；次氯酸根离子和单线态氧能够诱导靶细胞中的DNA损伤，从而导致突变负荷增加以及潜在的致癌作用。此外，在脓毒症中也会产生次氯酸根离子和单线态氧，这可能是脓毒症过程中引起相关器官功能障碍的重要原因。
为了更好的认识次氯酸根离子和单线态氧在各种疾病中的重要生物学功能，特别是在剖析它们之间复杂的相互关系时，迫切需要开发出一种可靠的方法来同时区分检测次氯酸根离子和单线态氧。但是，由于次氯酸根离子和单线态氧具有非常类似的高氧化活性，因此在生物系统中同时区分识别次氯酸根离子和单线态氧是一个巨大的挑战。据我们所知，目前还尚没有可区分生物体中次氯酸根离子和单线态氧的分析方法报道。近年来，荧光探针因其适用于对生物系统中感兴趣的分子进行高时空分辨率成像而受到广泛关注。到目前为止，已经构建了许多出色的次氯酸根离子荧光探针和单线态氧荧光探针，并将其应用在了生命系统中的荧光成像，但是这些荧光探针只专注于选择性检测单个分析物(次氯酸根离子或者单线态氧)。尽管这两个活性氧在许多相关的生物学问题上相互作用，但是它们都无法同时对次氯酸根离子和单线态氧有响应。虽然可以将一个次氯酸根离子荧光探针和一个单线态氧荧光探针同时用在此类过程的应用研究中，但是由于两个荧光探针的吸收、分布和代谢曲线不同，从而导致所得到的数据混乱。
线粒体是细胞内ROS的主要来源。特别是单线态氧得寿命相对较短，在活细胞中产生的单线态氧的径向扩散距离只有约155nm，比线粒体的直径还小，这表明细胞内源性的单线态氧主要是分布在线粒体中。因此，在本工作中，我们科学构建了一个能够同时区分识别线粒体中次氯酸根离子和单线态氧的双功能荧光探针WG。
发明内容
针对现有技术中的上述不足之处，本发明提供了一种用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和单线态氧的双功能荧光探针及其制备方法和用途。它不仅选择性好，灵敏度高，而且制备方法简单，并能够区分检测细胞内源性的次氯酸根离子和单线态氧。
本发明是通过如下技术方案实现的：
用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和/或单线态氧的双功能荧光探针，其结构如下：
Figure BDA0002575253660000021
用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和/或单线态氧的双功能荧光探针的制备方法，按照下述步骤进行：
步骤1、称取4-(二乙氨基)水杨醛并将其溶于无水乙醇中，接着加入丙二酸二乙酯，搅拌均匀，再加入哌啶，得到混合液A，将混合液A加热回流搅拌；反应结束后冷却至室温，去除多余的溶剂，在冰水浴条件下，依次加入等量的乙酸和盐酸，然后继续加热回流搅拌反应；反应结束后，将反应后的混合液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液将其pH调至5，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素；
步骤2、首先用等量的三氯氧磷和DMF制备威尔斯试剂，再用DMF将步骤1得到的7-(二乙氨基)香豆素完全溶解，然后将其滴加到制备好的威尔斯试剂中，得到混合液B，加热回流搅拌反应；反应结束后，将反应后的混合液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液将其pH调至5，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素醛。
步骤3、首先将4-(二乙胺基)水杨醛、乙酰乙酸乙酯和哌啶用甲醇溶解，在室温下，让混合物充分搅拌反应。等反应结束后，通过过滤收集得到橙色滤饼，然后在无水乙醇中重结晶纯化得到橙色固体A。
步骤4、首先将步骤2得到的7-(二乙氨基)香豆素醛和步骤3得到的橙色固体A溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，再加入四氢吡咯，然后在室温下搅拌反应。反应结束后，去除多余溶剂，用柱层析法对所得反应后产物进行纯化，得到红色固体B。
步骤5、在氮气保护下，将1，2-二溴乙烷和三苯基膦溶解在甲苯溶液中，充分搅拌后加热回流。反应结束，将其冷却至室温，过滤，得到白色固体C。
步骤6、在氮气保护下，将步骤5得到的白色固体C和硫代乙酸钾溶解在水和乙醇的混合溶剂中，置于室温下搅拌反应。反应结束之后，向混合溶液中加入水并充分混合，然后用二氯甲烷萃取，收集有机相，除去溶剂，得到白色固体D。
步骤7、在氮气保护下，将步骤6中得到的白色固体D溶解在甲醇中，加入盐酸，并将所得的混合物加热回流搅拌反应。反应结束之后，将水加入到混合物中并充分混合。用二氯甲烷萃取，收集有机相。减压蒸馏除去溶剂得到白色固体，然后在无水乙醇中重结晶进一步纯化得到了产物E。
步骤8、将步骤4得到的红色固体B和步骤7得到的产物E完全溶解在三氯甲烷中，在油浴中加热回流搅拌。反应结束后，通过柱层析法进一步纯化得到固体，即得到了用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和单线态氧的双功能荧光探针。
步骤1中，所述4-(二乙氨基)水杨醛、无水乙醇、丙二酸二乙酯、哌啶、乙酸和盐酸的用量比为6g～8g：40mL～60mL：8mL～12mL：1mL～2mL：30mL～40mL：30mL～40mL。
步骤1中，所述第一次加热回流搅拌反应的温度为100～105℃，时间为6～7h，所述第二次加热回流搅拌反应的温度为85～95℃，时间为11～12h，所述重结晶用的温度为90℃。
步骤2中，所述三氯氧磷、7-(二乙氨基)香豆素的用量比为10mL～12mL：4g～6g。
步骤2中，所述加热回流搅拌反应的温度为85～95℃，时间为11～12h，所述重结晶用的温度为90℃。
步骤3中，所述4-(二乙氨基)水杨醛、乙酰乙酸乙酯、哌啶、甲醇的用量比为2g～3g：1mL～2mL：0.5mL～1mL：20mL～30mL。
步骤3中，所述室温下搅拌反应的时间为6～10h。所述重结晶用的温度为90℃。
步骤4中，所述7-(二乙氨基)香豆素、橙色固体A、二氯甲烷、甲醇、四氢吡咯的用量比为0.5g～1g：0.5g～1g：2mL～4mL：2mL～4mL：90μL～100μL。
步骤4中，所述室温下搅拌反应的时间为20～24h。所述除去溶剂的方法为旋转蒸发。
步骤5中，所述1，2-二溴乙烷、三苯基膦、甲苯的用量比为4g～5g：3g～4g：5mL～10mL。
步骤5中，所述加热回流搅拌温度为110℃。所述加热回流搅拌时间为3～5h。
步骤6中，所述白色固体C、硫代乙酸钾、水、乙醇的用量比为2g～3g：1.5g～2.5g：5mL～10mL：10mL～20mL。
步骤6中，所述室温下搅拌反应时间为8h～10h。
步骤7中，所述白色固体D、甲醇、盐酸的用量比为0.5g～1g：10mL～20mL：1mL～2mL。
步骤7中，所述加热回流搅拌温度为70℃。所述加热回流搅拌时间为20h～25h。所述除去溶剂的方法为旋转蒸发。所述重结晶用的温度为90℃。
步骤8中，所述红色固体B、产物E、三氯甲烷的用量比为0.1g～0.2g：0.1g～0.2g：10mL～15mL。
步骤8中，所述加热回流搅拌温度为65℃。所述加热回流搅拌时间为20h～25h。
本发明制备得到的荧光探针，不仅可以单独检测氯酸根离子或单线态氧，还可以同时区分次氯酸根离子和单线态氧的水平，具体使用方法如下：
1、本发明提供的荧光探针可用于同时区分检测甲醇水溶液中次氯酸根离子和单线态氧，具体方法如下：溶液中ClO-的检测：将探针WG溶解在甲醇中制备得到探针WG(5×10-4M)母液。用水稀释一定量的5.2％NaClO制备得到ClO-(5×10-3M)母液。室温下，在50mM磷酸盐缓冲溶液/甲醇(1:4v/v，pH值7.4)中，用探针WG(5μM)与各种浓度的ClO-进行反应，30分钟后测量溶液的荧光发射光谱。
溶液中1O2的检测：1O2分别由Na2MoO4/H2O2体系产生和以四-(N-甲基-4-吡啶基)卟啉(TMPyP4)为光敏剂光照射产生。详细的实验步骤如下：
(1)探针WG与Na2MoO4/H2O2体系产生的1O2在50mM碳酸盐缓冲液/甲醇(1：4v/v，pH10.5)中进行。将不同浓度的过氧化氢溶液加入到含有50μM探针WG和1.0mM Na2MoO4的缓冲溶液中。室温下搅拌30分钟后，用50mM磷酸盐缓冲溶液/甲醇(1：4v/v，pH 7.4)将溶液稀释10倍，然后测量溶液的荧光发射光谱。
(2)在50mM磷酸盐缓冲溶液/甲醇(1:4v/v，pH 7.4)中，通过光照射光敏剂TMPyP4产生的1O2与探针WG反应。将探针WG(5μM)和TMPyP4(5μM)溶解在缓冲溶液(5mL)中，使用白色LED灯(150mW/cm2)作为光源连续照射溶液，然后测量不同光照时间时溶液的荧光发射光谱。
探针WG与其他活性氧、生物分子和金属离子的反应：将30％H2O2、GSH、Cys、MgCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、Fe(NO3)3·9H2O、Zn(NO3)2·6H2O分别配制成各种活性氧(ROS)、生物分子和金属离子溶液。通过Fenton反应生成羟基自由基90(·OH)。使用SNP(硝基铁氰化钠(III)二水合物)生成NO。所有反应均在50mM磷酸盐缓冲溶液/甲醇(1:4v/v，pH7.4)中进行，在室温条件下，探针WG(5μM)与不同分析物在缓冲溶液中孵育30分钟，然后测量溶液的荧光发射光谱。
2本发明提供的荧光探针也可用于细胞中内源性次氯酸根离子和/或单线态氧的荧光成像，具体方法为：
细胞培养：
HepG2细胞：将HepG2细胞孵育于直径为35毫米的培养皿中，置于加含有10％胎牛血清的改良Eagle培养基中，并孵育24h。
RAW264.7细胞：RAW 264.7系来自江苏大学医学院。细胞孵育于35毫米培养皿中，置于含有10％马血清的改良Eagle培养基中，孵育24h。
共定位实验：用1μM探针WG对35毫米玻璃底部培养皿中的活HepG2细胞染色30分钟。然后再用0.5μM MTO(一种商业用途的线粒体定位试剂)对细胞染色30分钟，并且使用激光共聚焦扫描显微镜获取荧光图像。探针WG涉及蓝色通道的荧光在405nm处激发，并在450-490nm记录。绿色通道的荧光在476nm处激发，并在500-550nm处记录。MTO涉及的红色通道的荧光在543nm处激发，并在575-650nm处记录。
RAW 264.7细胞中内源性1O2和ClO-的荧光成像：用1μM探针WG染色对35毫米玻璃底培养皿中的活RAW 264.7细胞染色30分钟。然后，用丙二醇甲醚醋酸酯(PMA，内源性产生ClO-和1O2的活化剂)刺激细胞30分钟。处理完之后用激光共聚焦扫描显微镜获取荧光图像。蓝色通道的荧光在405nm处激发，并在450-490nm处记录。绿色通道的荧光在476nm处激发，并在500-550nm处记录。红色通道的荧光在543nm处激发，并在575-650nm处记录。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供了一种全新的可用于同时区分次氯酸根离子(ClO-)和单线态氧(1O2)的双功能荧光探针，该荧光探针合成方法简单，对次氯酸根离子和单线态氧有很好的选择性：在激发为480nm时，NO，·OH，H2O2，1O2，GSH，Cys，Mg2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+等对检测ClO-没有影响；在激发为530nm时，NO，·OH，H2O2，ClO-，GSH，Cys，Mg2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+等对检测1O2没有影响；在绿色通道中探针WG的荧光强度在0-300μM的浓度范围内与ClO-的浓度呈线性关系，这表明探针WG能够用于ClO-的定量检测，并且表现出极高的灵敏度(检测下限为0.053μM)。在红色通道中探针WG的荧光强度在0-1.4mM浓度范围内与1O2的浓度呈线性关系，并且表现出极高的灵敏度(检测下限为0.35μM)。探针能够在不同的荧光窗口对1O2和ClO-进行区分检测，并且探针能够在大的pH范围内(6-12)，对1O2和ClO-进行区分检测，因此可以在细胞及动物组织内区分检测1O2和ClO-。
(2)经过本发明的合成方法改进后，可以有效阻止副反应的发生，极大地减少反应过程中出现难以分离的杂质，从而可以得到高纯度的目标产物。
(3)本发明开发出了一种新型高性能用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和单线态氧的双功能荧光探针。首个应用到溶液中区分次氯酸根离子和单线态氧的荧光探针，并且首次应用激光共焦扫描显微镜进行荧光成像来区分检测细胞中的次氯酸根离子和单线态氧。为今后科研工作者对研究次氯酸根离子和单线态氧相互协同作用的生理过程提供了技术指引。
附图说明
图1为本发明实施例1中同时区分检测次氯酸根离子(ClO-)和单线态氧(1O2)的荧光探针的合成路线图；
图2为实施例1提供的荧光探针对次氯酸根离子(ClO-)的选择性柱状图；横坐标为不同离子或分子添加情况，纵坐标为荧光强度；
图3为实施例1提供的荧光探针对单线态氧(1O2)的选择性柱状图；横坐标为不同离子或分子添加情况，纵坐标为荧光强度；
图4为实施例1提供的荧光探针检测次氯酸根离子(ClO-)的竞争性柱状图；横坐标为不同可能竞争离子或分子添加情况，纵坐标为荧光强度；
图5为实施例1提供的荧光探针检测单线态氧(1O2)的竞争性柱状图；横坐标为不同可能竞争离子或分子添加情况，纵坐标为荧光强度；
图6为本发明实施例1中荧光探针分子以及荧光探针分子和次氯酸根离子(ClO-)响应后的产物，两者的荧光强度与pH变化关系曲线；横坐标为pH，纵坐标为荧光强度；
图7为本发明实施例1中荧光探针分子以及荧光探针分子和单线态氧(1O2)响应后的产物，两者的荧光强度与pH变化关系曲线；横坐标为pH，纵坐标为荧光强度；
图8为实施例1获得的荧光探针与次氯酸根离子(ClO-)的动力学研究图；横坐标为时间，纵坐标为荧光强度；
图9为实施例1获得的荧光探针与单线态氧(1O2)的动力学研究图；横坐标为时间，纵坐标为荧光强度；
图10为实施例1获得的荧光探针同时区分检测溶液中的次氯酸根离子(ClO-)和单线态氧(1O2)的荧光滴定图；
图11为实施例1获得的荧光探针在细胞线粒体中共定位的荧光成像图；
图12为实施例1获得的荧光探针检测细胞内源性次氯酸根离子(ClO-)和单线态氧(1O2)的荧光成像图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明进行详细描述，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1：
荧光探针的合成。
制备步骤概括为：
步骤1、称取4-(二乙氨基)水杨醛并将其溶于无水乙醇中，接着加入丙二酸二乙酯，搅拌均匀，再加入哌啶，得到混合液A，将混合液A加热回流搅拌；反应结束后冷却至室温，去除多余的溶剂，在冰水浴条件下，依次加入等量的乙酸和盐酸，然后继续加热回流反应；反应结束后，将反应后的混合液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液将其pH调至5，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素；
步骤2、首先用等量的三氯氧磷和DMF制备威尔斯试剂，再用DMF将步骤1得到的7-(二乙氨基)香豆素完全溶解，然后将其滴加到制备好的威尔斯试剂中，得到混合液B，加热回流搅拌反应；反应结束后，将反应后的混合液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液将其pH调至5，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素醛。
步骤3、首先将4-(二乙胺基)水杨醛、乙酰乙酸乙酯和哌啶用甲醇溶解，在室温下，让混合物充分搅拌反应。等反应结束后，通过过滤收集得到橙色滤饼，然后在无水乙醇中重结晶纯化得到橙色固体A。
步骤4、首先将步骤2得到的7-(二乙氨基)香豆素醛和步骤3得到的橙色固体溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，再加入四氢吡咯，然后在室温下搅拌反应。反应结束后，去除多余溶剂，用柱层析法对所得反应后产物进行纯化，得到红色固体B。
步骤5、在氮气保护下，将1，2-二溴乙烷和三苯基膦溶解在甲苯溶液中，充分搅拌后加热回流。反应结束，将其冷却至室温，过滤，得到白色固体C。
步骤6、在氮气保护下，将步骤5得到的白色固体C和硫代乙酸钾溶解在水和乙醇的混合溶剂中，置于室温下搅拌反应。反应结束之后，向混合溶液中加入水并充分混合，然后用二氯甲烷萃取，收集有机相，除去溶剂，得到白色固体D。
步骤7、在氮气保护下，将步骤6中得到的白色固体D溶解在甲醇中，加入盐酸，并将所得的混合物加热回流搅拌。反应结束之后，将水加入到混合物中并充分混合。用二氯甲烷萃取，收集有机相。减压蒸馏除去溶剂得到白色固体，然后在无水乙醇中重结晶进一步纯化得到了产物E。
步骤8、将步骤4得到的红色固体B和步骤7得到的产物E完全溶解在三氯甲烷中，在油浴中加热回流搅拌。反应结束后，通过柱层析法进一步纯化得到固体，即得到了用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和单线态氧的双功能荧光探针。
具体步骤如下：
(1)向150mL烧瓶中加入6g～8g的4-(二乙氨基)水杨醛，用40mL～60mL无水乙醇溶解，接着加入8mL～12mL丙二酸二乙酯，搅拌均匀，再加入1mL～2mL哌啶，得到混合液A，将混合液A在100～105℃加热回流搅拌反应6～7h；反应结束后冷却至室温，用旋转蒸发仪除去多余的溶剂，在冰水浴条件下，依次加入30mL～40mL等量的乙酸和盐酸，然后在85～95℃条件下继续加热回流搅拌反应11～12h；反应结束后，将反应后的混合液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液将其pH调至5，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇在90℃重结晶，真空干燥，得7-(二乙氨基)香豆素土黄色固体4.9276g，产率为73.2％。
(2)首先用10mL～12mL等量的三氯氧磷和DMF制备威尔斯试剂，再用7mL～8mL DMF将步骤1得到的4g～6g 7-(二乙氨基)香豆素完全溶解，再滴加到制备好的威尔斯试剂中，得到混合液B，在85～95℃条件下加热回流搅拌反应11～12h；反应结束后，将反应后的混合液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液将其pH调至5，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇在90℃重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素醛4.6987g，产率为69.8％。
(3)首先将4-(二乙胺基)水杨醛2g～3g、乙酰乙酸乙酯1mL～2mL和0.5mL～1mL哌啶用20mL～30mL甲醇溶解，再将混合物放置在室温下充分搅拌反应6h～10h。等反应结束后，通过过滤收集获得橙色滤饼，然后用无水乙醇在90℃重结晶纯化得到橙色固体A1.75g，产率为65％。
(4)首先将步骤2得到的7-(二乙氨基)香豆素醛0.5g～1g和步骤3得到的橙色固体A 0.5g～1g溶于4mL～6mL二氯甲烷/甲醇(v/v＝1:1)的混合溶剂中，再加入90μL～100μL四氢吡咯，然后在室温下搅拌反应20h～24h。反应结束后，减压蒸馏去除多余的溶剂，用柱层析法(二氯甲烷:石油醚＝1:2，v/v)对所得反应后产物进行纯化，最后得到红色固体B109mg，产率为11％。
(5)在氮气保护下，将1，2-二溴乙烷4g～5g和三苯基膦3g～4g溶解在5mL～10mL甲苯溶液中，充分搅拌后再将混合物加热110℃回流3～5h。反应结束，将其冷却至室温，过滤，得到白色固体C 3.637g，产率为69.83％。
(6)在氮气保护下，将步骤5得到的白色固体C 2g～3g和硫代乙酸钾1.5g～2.5g溶解在15～30mL的水/乙醇(1∶2v/v)中，置于室温下搅拌反应8～10h小时之后，向混合溶液中加入水并充分混合，然后用二氯甲烷萃取，收集有机相。减压蒸馏去除溶剂后，得到白色固体D 1.637g，产率为59.96％。
(7)在氮气保护下，将步骤6得到的白色固体D 0.5g～1g溶解在10mL～20mL甲醇中，随后加入1mL～2mL盐酸，并将所得的混合物加热70℃回流搅拌反应20h～25h。反应结束之后，将水加入到混合物中并充分混合，用二氯甲烷萃取，收集有机相。接着减压蒸馏除去溶剂得到白色固体，然后在无水乙醇中90℃重结晶进一步纯化得到产物E 0.314g，产率为57.83％。
(8)将步骤4得到的红色固体B 0.1g～0.2g和步骤7得到的产物E 0.1g～0.2g完全溶解在10mL～15mL三氯甲烷中，在油浴中加热65℃使其回流搅拌反应20h～25h。反应结束之后通过柱层析法(二氯甲烷：石油醚∶甲醇＝10∶10∶1，v/v/v)进一步纯化，即得到了用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和单线态氧的双功能荧光探针0.021g，产率为12.6％。
实施例2：
实施例1获得的荧光探针对次氯酸根离子(ClO-)和单线态氧(1O2)检测的选择性。
用甲醇配制浓度为5μM的荧光探针分子WG母液，待用。用去离子水配制浓度为1×10-3M的H2O2，1O2，GSH，Cys，Mg2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+溶液，通过Fenton反应生成羟基自由基(·OH)。使用SNP(硝基铁氰化钠(III)二水合物)生成NO。使用Na2MoO4/H2O2体系产生的1O2。当300μM的各种被测物溶液加入到含有5μM荧光探针分子的测试溶液(50mM磷酸盐缓冲溶液/甲醇(1:4v/v，pH 7.4))中，室温下探针WG(5μM)与不同分析物在缓冲溶液中孵育30分钟，然后以480nm为激发波长，测定荧光发射光谱，检测探针分子对不同被测物的响应，其测定结果如图2所示。
用甲醇配制浓度为5μM的荧光探针分子WG母液，待用。用去离子水配制浓度为1×10-3M的H2O2，ClO-，GSH，Cys，Mg2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+溶液，通过Fenton反应生成羟基自由基(·OH)。使用SNP(硝基铁氰化钠(III)二水合物)生成NO。使用Na2MoO4/H2O2体系产生的1O2。当1.4mM当量的各种被测物溶液加入到5μM荧光探针分子的测试溶液(50mM磷酸盐缓冲溶液/甲醇(1:4v/v，pH 7.4))中，室温下探针WG(5μM)与不同分析物在缓冲溶液中孵育30分钟，然后以530nm为激发波长，测定荧光光谱，检测探针分子对不同被测物的响应，其测定结果如图3所示。
从图2的结果中可以发现，只有ClO-(图2中5号样)可使荧光探针的荧光显著增强，而空白样(图2中1号样)、加入其它离子或分子诸如NO，·OH，H2O2，1O2，GSH，Cys，Mg2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+，则没有响应。
从图3的结果中可以发现，只有1O2(图3中6号样)可使荧光探针的荧光显著增强，而空白样(图3中1号样)、加入其它离子或分子诸如NO，·OH，H2O2，ClO-，GSH，Cys，Mg2+，Fe2+，Fe3 +，Zn2+，则没有响应。该结果表明：该荧光探针对次氯酸根离子(ClO-)和单线态氧(1O2)都有很好的选择性。
实施例3：
其它常见离子或分子对实施例1获得的荧光探针检测次氯酸根离子(ClO-)和单线态氧(1O2)的干扰实验。
按照实施例2配制测试溶液，先分别加入300μM的其它可能干扰物到5μM的荧光探针分子测试溶液中，包括空白，NO，·OH，H2O2，1O2，GSH，Cys，Mg2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+，再往这些溶液中分别加入300μM的次氯酸根离子(ClO-)。混合30分钟后，在同样条件下以480nm为激发，进行荧光光谱测试，得到各组溶液的荧光光谱。
按照实施例2配制测试溶液，先分别加入1.4mM的其它可能干扰物到5μM的荧光探针分子测试溶液中，包括空白，NO，·OH，H2O2，ClO-，GSH，Cys，Mg2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+，再往这些溶液中分别加入1.4mM的单线态氧(1O2)。混合30分钟后，在同样条件下以530nm为激发，进行荧光光谱测试，得到各组溶液的荧光光谱。
从图4的结果中可以发现，当体系加入NO，·OH，H2O2，1O2，GSH，Cys，Mg2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+等可能干扰物后，各组的荧光强度与只加次氯酸根离子(ClO-)的空白溶液(图4中4号样)的荧光强度没有明显差异。
从图5的结果中可以发现，当体系加入NO，·OH，H2O2，ClO-，GSH，Cys，Mg2+，Fe2+，Fe3 +，Zn2+等可能干扰物后，各组的荧光强度与只加单线态氧(1O2)的空白溶液(图5中5号样)的荧光强度没有明显差异。
以上结果表明：该发明的荧光探针对次氯酸根离子(ClO-)和单线态氧(1O2)有很高的选择性，不受其它共存离子或分子的干扰。
实施例4：
pH对实施例1获得的荧光探针检测次氯酸根离子(ClO-)和单线态氧(1O2)的影响。
为检测探针分子在不同pH条件下对1O2和ClO-的响应，分别配制了不同pH(2.3-12.5)的磷酸缓冲液。依次测定pH从2.3-12.5体系下实施例1获得的荧光探针的荧光光谱，如图6中线a1所示，在波长为526nm处的荧光强度几乎可以忽略不计且不随pH值的改变而改变。当加入300μM的次氯酸根离子(ClO-)时，pH从6-12的每个不同pH体系的荧光强度均急剧增大，说明该荧光探针对次氯酸根离子(ClO-)的检测在pH值为6-12的范围内不受pH的明显影响，如图6中线b1所示。如图7中线a2所示，实施例1获得的荧光探针在波长为630nm处的荧光强度几乎可以忽略不计，当加入1.4mM的单线态氧(1O2)时，pH从6-12的每个不同pH体系的荧光强度均急剧增大，说明该荧光探针对单线态氧(1O2)的检测在pH值为6-12的范围内不受pH的明显影响，如图7中带线b2所示。因此，该发明的荧光探针在生理条件的pH对次氯酸根离子(ClO-)和单线态氧(1O2)有很好的响应。
实施例5：
实施例1获得的荧光探针的动力学研究。
当300μM的次氯酸根离子(ClO-)加入到5μM的荧光探针分子的测试溶液中，以波长480nm为激发波长，测试荧光光谱，如图8所示，当55s的时候加入次氯酸根离子(ClO-)后溶液的荧光强度很快增强，直到60s后荧光强度几乎不再增强，达到一个恒定值。由此可得，该发明的荧光探针与次氯酸根离子(ClO-)的响应时间在5s内完成，响应速度快。当1.4mM的单线态氧(1O2)加入到5μM的荧光探针分子的测试溶液中，以波长530nm为激发波长，测试荧光光谱，如图9所示，当60s的时候加入单线态氧(1O2)后溶液的荧光强度很快增强，直到80s后荧光强度几乎不再增强，达到一个恒定值。由此可得，该发明的荧光探针与单线态氧(1O2)的响应时间在20s内完成，响应速度较快。
因此该发明的荧光探针与次氯酸根离子(ClO-)和单线态氧(1O2)的响应速度都较快，具有良好的实际应用价值。
实施例6：
实施例1获得的荧光探针的实际应用。
1.实施例1获得的荧光探针同时区分检测溶液中的次氯酸根离子(ClO-)和单线态氧(1O2)。
(1)溶液中ClO-的检测：将探针WG溶解在甲醇中制备得到探针WG(5×10-4M)母液。用水稀释一定量的5.2％NaClO制备得到ClO-(5×10-3M)母液。室温下，在50mM磷酸盐缓冲溶液/甲醇(1:4v/v，pH值7.4)中，用探针WG(5μM)与各种浓度的ClO-进行反应，30分钟后测量溶液的荧光发射光谱。
(2)溶液中1O2的检测：1O2分别由Na2MoO4/H2O2体系产生和以四-(N-甲基-4-吡啶基)卟啉(TMPyP4)为光敏剂光照射产生。
详细的实验步骤如下：探针WG与Na2MoO4/H2O2体系产生的1O2在50mM碳酸盐缓冲液/甲醇(1：4v/v，pH 10.5)中进行。将不同浓度的过氧化氢溶液加入到含有50μM探针WG和1.0mM Na2MoO4的缓冲溶液中。室温下搅拌30分钟后，用50mM磷酸盐缓冲溶液/甲醇(1：4v/v，pH 7.4)将溶液稀释10倍，然后测量溶液的荧光发射光谱。
在50mM磷酸盐缓冲溶液/甲醇(1:4v/v，pH 7.4)中，通过光照射光敏剂TMPyP4产生的1O2与探针WG反应。将探针WG(5μM)和TMPyP4(5μM)溶解在缓冲溶液(5mL)中，使用白色LED灯(150mW/cm2)作为光源连续照射溶液，然后测量不同光照时间时溶液的荧光发射光谱。
如图10所示，用浓度梯度的ClO-(0-550μM)处理后，蓝色荧光通道的强度逐渐减弱(图10a)，并且在绿色荧光通道中出现了发射波长为526nm的荧光发射峰并且荧光强度逐渐增强(图10b)，与此同时在红色荧光通道并没有观察到任何荧光现象(图10c)。因此，使用探针WG能够实现在绿色荧光通道中检测ClO-。用浓度梯度的1O2处理后，在蓝色荧光通道中探针WG的荧光逐渐减弱(图10d)，与此同时在绿色荧光通道并没有观察到任何荧光现象(图10e)，而在红色荧光通道中发射波长为630nm的荧光发射峰的荧光强度明显增强(图10f)。以上结果表明，该发明的荧光探针WG可以区分检测溶液中的次氯酸根离子(ClO-)和单线态氧(1O2)。
2.实施例1获得的荧光探针用于细胞中次氯酸根离子和单线态氧的荧光成像。
具体方法为：
细胞培养：
HepG2细胞：将HepG2细胞孵育于直径为35毫米的培养皿中，置于加含有10％胎牛血清的改良Eagle培养基中，并孵育24h。
RAW264.7细胞：RAW 264.7系来自江苏大学医学院。细胞孵育于35毫米培养皿中，置于含有10％马血清的改良Eagle培养基中，孵育24h。
共定位实验：用1μM探针WG对35毫米玻璃底部培养皿中的活HepG2细胞染色30分钟。然后再用0.5μM MTO(一种商业用途的线粒体定位试剂)对细胞染色30分钟，并且使用激光共聚焦扫描显微镜获取荧光图像。探针WG涉及蓝色通道的荧光在405nm处激发，并在450-490nm记录。绿色通道的荧光在476nm处激发，并在500-550nm处记录。MTO涉及的红色通道的荧光在543nm处激发，并在575-650nm处记录。
如图11是经过WG与MTO共染色的HepG2细胞的共聚焦荧光图像。(a)是蓝色通道的图像(b)是红色通道的图像，(c)是由(a)和(b)叠加后的图像，(d)是共染色的HepG2细胞中图(c)中的线段所示处的ROIs强度分布。结果表明，探针WG可以定位在细胞线粒体中。
RAW 264.7细胞中内源性1O2和ClO-的荧光成像：用1μM探针WG染色对35毫米玻璃底培养皿中的活RAW 264.7细胞染色30分钟。然后，用丙二醇甲醚醋酸酯(PMA，内源性产生ClO-和1O2的活化剂)刺激细胞30分钟。处理完之后用激光共聚焦扫描显微镜获取荧光图像。蓝色通道的荧光在405nm处激发，并在450-490nm处记录。绿色通道的荧光在476nm处激发，并在500-550nm处记录。红色通道的荧光在543nm处激发，并在575-650nm处记录。
如图12所示，当加入PMA的量增多时，蓝色通道的荧光逐渐减弱，绿色通道和红色通道的荧光逐渐增强。表明了探针WG可以用于检测细胞中内源性的次氯酸根离子和单线态氧。

Claims (10)

1.用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和/或单线态氧的双功能荧光探针，其特征在于，结构如下：
Figure FDA0003481675170000011
2.如权利要求1所述的用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和/或单线态氧的双功能荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1、称取4-(二乙氨基)水杨醛并将其溶于无水乙醇中，接着加入丙二酸二乙酯，搅拌均匀，再加入哌啶，得到混合液A，将混合液A加热回流搅拌；反应结束后冷却至室温，去除多余的溶剂，在冰水浴条件下，依次加入等量的乙酸和盐酸，然后继续加热回流搅拌反应；反应结束后，将反应后的混合液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调节pH，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素；
步骤2、首先用等量的三氯氧磷和DMF制备威尔斯试剂，再用DMF将步骤1得到的7-(二乙氨基)香豆素完全溶解，然后将其滴加到制备好的威尔斯试剂中，得到混合液B，加热回流搅拌反应；反应结束后，将反应后的混合液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调节pH，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素醛；
步骤3、首先将4-(二乙胺基)水杨醛、乙酰乙酸乙酯和哌啶用甲醇溶解，在室温下，让混合物充分搅拌反应；等反应结束后，通过过滤收集得到橙色滤饼，然后在无水乙醇中重结晶纯化得到橙色固体A；
步骤4、首先将步骤2得到的7-(二乙氨基)香豆素醛和步骤3得到的橙色固体A溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，再加入四氢吡咯，然后在室温下搅拌反应；反应结束后，去除多余溶剂，用柱层析法对所得反应后产物进行纯化，得到红色固体B；
步骤5、在氮气保护下，将1，2-二溴乙烷和三苯基膦溶解在甲苯溶液中，充分搅拌后加热回流；反应结束，将其冷却至室温，过滤，得到白色固体C；
步骤6、在氮气保护下，将步骤5得到的白色固体C和硫代乙酸钾溶解在水和乙醇的混合溶剂中，置于室温下搅拌反应；反应结束之后，向混合溶液中加入水并充分混合，然后用二氯甲烷萃取，收集有机相，除去溶剂，得到白色固体D；
步骤7、在氮气保护下，将步骤6中得到的白色固体D溶解在甲醇中，加入盐酸，并将所得的混合物加热回流搅拌反应；反应结束之后，将水加入到混合物中并充分混合；用二氯甲烷萃取，收集有机相；减压蒸馏除去溶剂得到白色固体，然后在无水乙醇中重结晶进一步纯化得到了产物E；
步骤8、将步骤4得到的红色固体B和步骤7得到的产物E完全溶解在三氯甲烷中，在油浴中加热回流搅拌；反应结束后，通过柱层析法进一步纯化得到固体，即得到了用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和单线态氧的双功能荧光探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
步骤1中，所述4-(二乙氨基)水杨醛、无水乙醇、丙二酸二乙酯、哌啶、乙酸和盐酸的用量比为6g～8g：40mL～60mL：8mL～12mL：1mL～2mL：30mL～40mL：30mL～40mL；所述第一次加热回流搅拌反应的温度为100～105℃，时间为6～7h，所述第二次加热回流搅拌反应的温度为85～95℃，时间为11～12h，所述重结晶用的温度为90℃；
步骤2中，所述三氯氧磷、7-(二乙氨基)香豆素的用量比为10mL～12mL：4g～6g；所述加热回流搅拌反应的温度为85～95℃，时间为11～12h，所述重结晶用的温度为90℃；
步骤1和步骤2中，用氢氧化钠溶液调节pH时，均为将pH调至5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述4-(二乙氨基)水杨醛、乙酰乙酸乙酯、哌啶、甲醇的用量比为2g～3g：1mL～2mL：0.5mL～1mL：20mL～30mL；所述室温搅拌反应的时间为6～10h；所述重结晶用的温度为90℃。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述7-(二乙氨基)香豆素、橙色固体A、二氯甲烷、甲醇、四氢吡咯的用量比为0.5g～1g：0.5g～1g：2mL～4mL：2mL～4mL：90μL～100μL；步骤4中，所述室温下搅拌反应的时间为20～24h；所述除去溶剂的方法为旋转蒸发。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤5中，所述1，2-二溴乙烷、三苯基膦、甲苯的用量比为4g～5g：3g～4g：5mL～10mL；所述加热回流搅拌温度为110℃；所述加热回流搅拌时间为3～5h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤6中，所述白色固体C、硫代乙酸钾、水、乙醇的用量比为2g～3g：1.5g～2.5g：5mL～10mL：10mL～20mL；所述室温搅拌反应时间为8h～10h。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤7中，所述白色固体D、甲醇、盐酸的用量比为0.5g～1g：10mL～20mL：1mL～2mL；所述加热回流搅拌温度为70℃；所述加热回流搅拌时间为20h～25h；所述除去溶剂的方法为旋转蒸发；所述重结晶用的温度为90℃。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤8中，所述红色固体B、产物E、三氯甲烷的用量比为0.1g～0.2g：0.1g～0.2g：10mL～15mL；所述加热回流搅拌温度为65℃；所述加热回流搅拌时间为20h～25h。
10.将权利要求1中所述式1的化合物用于制备检测细胞线粒体内次氯酸根离子和/或单线态氧的双功能荧光探针的用途。
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