CN110642772A - 检测硝基还原酶的近红外比率荧光探针及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针及其制备方法和应用，制备方法包括：2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚与碘甲烷反应得到1,2,3,3‑四甲基‑3H‑碘代吲哚；环己酮利用Vilsmeier反应得到2‑氯‑1‑甲酰基‑3‑羟甲基环己烯；所得1,2,3,3‑四甲基‑3H‑碘代吲哚与2‑氯‑1‑甲酰基‑3‑羟甲基环己烯脱水缩合反应；所得2‑[2‑[2‑氯‑3‑[(1,3‑二氢‑1,3,3‑三甲基‑2H‑吲哚‑2‑亚基)亚乙基]‑1‑环己烯‑1‑基]乙烯基]‑1,3,3‑三甲基吲哚鎓碘化物与苄胺反应；所得2‑[2‑[2‑苄胺基‑3‑[(1,3‑二氢‑1,3,3‑三甲基‑2H‑吲哚‑2‑亚基)亚乙基]‑1‑环己烯‑1‑基]乙基]‑1,3,3‑三甲基吲哚鎓碘化物与对硝基氯甲酸苄酯反应，得到上述新型荧光探针。该探针对硝基还原酶的检测表现出较高的选择性。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，涉及荧光探针技术，尤其是一种检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
缺氧是恶性肿瘤发生、发展过程中普遍存在的现象，其产生主要与肿瘤无限制生长、耗氧增加、供血不足及肿瘤组织血管发育不良等有关。缺氧环境下，肿瘤细胞具有侵袭性和转移性，预测起来较为困难，并且对传统的放疗、光疗、化疗和免疫疗法都有抗拒性，从而降低了治疗效果。因此，研究缺氧的发生和发展规律，对临床治疗具有重要的指导意义。缺氧荧光探针是一种新兴的检测缺氧的方法，其简单易行、所得数据可靠，并且具有非创伤性特点，因而成为最具潜力的检测方法之一。
由于缺氧环境能诱导硝基还原酶、偶氮还原酶和醌还原酶等一些还原性酶的过度表达，因此缺氧荧光探针大多含有硝基、偶氮或醌等对缺氧有特异性响应的基团。这些荧光探针大多数的吸收和发射波长均在可见光区，容易受生物自身荧光的干扰，比如电子供体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的荧光发射波长范围为430-470nm。近红外光穿透力强，能减少对细胞的伤害，降低自发荧光的背景干扰和组织吸收，适于细胞、组织、活体成像。近红外荧光探针由于其特殊的光物理化学性质，灵敏度高、动态响应范围宽等优点，且其测定条件适宜生命体的生理环境而被广泛地应用于生命科学、医学等相关领域的研究。
肿瘤细胞缺氧通常可导致胞内硝基还原酶(Nitroreductase,NTR)的增加，而硝基还原酶可用于基因或病毒导向的前体药物的癌症治疗和药物筛选。因此，检测硝基还原酶和缺氧对药物开发和肿瘤诊断具有重要意义，设计检测肿瘤细胞缺氧状况的荧光探针以硝基作为特异性识别位点较为普遍。然而，目前通过检测细胞内硝基还原酶来研究缺氧的荧光探针相对匮乏，具有自校正作用的，通过两个波长的变化指示识别的比率型荧光探针就更为稀少。因此设计近红外比率荧光探针对硝基还原酶进行检测是一项具有挑战性的工作。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种选择性好、快速简便的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针，还相应提供该检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针的制备方法及应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针，所述检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针为[2-[2-(4-硝基苄氧羰基)苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，结构式如式(1)：
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷反应，得到1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚，结构式如式(5)：
(2)环己酮进行维尔斯迈尔(Vilsmeier)反应，得到2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯，结构式如式(4)：
(3)步骤(1)所得的1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚与步骤(2)所得的2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯通过脱水缩合反应，得到2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，结构式如式(3)：
(4)步骤(3)所得的2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物与苄胺反应，得到2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，结构式如式(2)：
(5)步骤(4)所得的2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物与对硝基氯甲酸苄酯反应，得到式(1)所示的化合物。
优选的，所述步骤(1)的具体过程为：
将2,3,3-三甲基-3H-吲哚溶于硝基甲烷中，再向其中加入碘甲烷，室温反应24h，有大量固体析出，向其中加入乙醚使其完全沉淀，然后减压过滤，用乙醚淋洗，得固体产物为1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚。
优选的，所述2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷的摩尔比为1∶1.0～2.0。
优选的，所述步骤(2)的具体过程为：
在氩气保护下，将干燥的N,N-二甲基甲酰胺溶于干燥的二氯甲烷，用冰盐浴冷却至0℃，控温0℃缓慢滴加三氯氧磷的二氯甲烷溶液，滴加完反应30min后，将环己酮加入其中，然后将反应液加热至80℃反应3h，反应结束后，将反应液倒入冰水中，静置过夜，有黄色固体析出，减压过滤，得固体产物为2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯。
优选的，所述环己酮进行维尔斯迈尔反应的温度为25～80℃。
优选的，所述步骤(3)的具体过程为：
在双口瓶中加入1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚和2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯，接上分水器，抽换气三次后，在氩气保护下加入正丁醇和甲苯(30mL，v/v＝7:3)。然后，氩气保护下回流搅拌反应10h，反应完毕后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，用乙醚洗涤过滤后，用硅胶色谱柱(二氯甲烷/0-2％甲醇)提纯，得绿色固体产物为2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物。
优选的，所述2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯与1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚的摩尔比为1∶2.0～2.2。
优选的，所述步骤(4)的具体过程为：
在双口瓶中加入2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，抽换气三次后，在氩气保护下加入无水乙腈。溶解后，用微量注射器将苄胺和N,N-二异丙基乙胺加入其中，氩气保护下加热至80℃反应40min，反应完毕后，加入0.1N的盐酸淬灭反应，用二氯甲烷萃取三次，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱(二氯甲烷/0-2％甲醇)提纯，得蓝色固体产物为2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物。
优选的，所述2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物与苄胺的摩尔比为1∶1.0～1.5。
优选的，所述步骤(5)的具体过程为：
在氩气保护下，将2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物和N,N-二异丙基乙胺溶于干燥的二氯甲烷中。将上述反应液冷却至0℃，将对硝基氯甲酸苄酯溶于干燥的二氯甲烷缓慢滴加至其中，加完缓慢升至室温反应12～18h。反应完毕后，用0.1N的盐酸洗涤两次，饱和氯化钠溶液洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱(二氯甲烷/0-5％甲醇)提纯，得绿色固体产物为[2-[2-(4-硝基苄氧羰基)苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物。
优选的，所述2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物与硝基氯甲酸苄酯的摩尔比为1∶1.0～2.0。
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针或上述的制备方法制得的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针的应用，将所述硝基还原酶新型近红外比率荧光探针与磷酸缓冲盐溶液(PBS)和电子供体还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)混合，再加入待测溶液中，得到混合溶液，利用两个不同发射波长处荧光强度变化来检测硝基还原酶的存在与否。
优选的，所述待测溶液中无硝基还原酶时，所述反应溶液的最大荧光发射波长位于805nm处，当加入硝基还原酶后，所述反应溶液的805nm处的荧光减弱，最大荧光发射波长蓝移至747nm处。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明的一种检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针是以硝基为识别单元的荧光探针，实践表明，本发明的荧光探针分子在对硝基还原酶进行检测时表现出了较高的选择性。
2、本发明的一种检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针的制备方法，近红外荧光团合成简单，且后处理过程容易，适于工业化生产。
附图说明
图1为实施例1的式(1)所示的化合物(即检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针)的合成路线图。
图2为实施例1制备的式(3)所示的化合物的1HNMR图谱。
图3为实施例1制备的式(3)所示的化合物的13C NMR图谱。
图4为实施例1制备的式(3)所示的化合物的HRMS图谱。
图5为实施例1制备的式(2)所示的化合物的1HNMR图谱。
图6为实施例1制备的式(2)所示的化合物的13C NMR图谱。
图7为实施例1制备的式(2)所示的化合物的HRMS图谱。
图8为实施例1制备的式(1)所示的化合物的1HNMR图谱。
图9为实施例1制备的式(1)所示的化合物的13C NMR图谱。
图10为实施例1制备的式(1)所示的化合物的HRMS图谱。
图11中(a)为pH值对实施例1制备的式(1)所示的化合物(805nm)和式(2)所示的化合物(747nm)荧光强度的影响示意图，(b)为pH值对实施例1制备的式(1)所示的化合物和式(2)所示的化合物的荧光强度比率(F747nm/F805nm)的影响示意图。
图12中(a)为最佳测试条件下实施例1制备的式(1)所示的化合物与硝基还原酶反应的吸收光谱变化示意图，(b)为实施例1制备的式(1)所示的化合物与硝基还原酶反应时吸光度在645nm和782nm处随时间的变化示意图。
图13中(a)为最佳测试条件下实施例1制备的式(1)所示的化合物与硝基还原酶反应的荧光光谱变化示意图，(b)为实施例1制备的式(1)所示的化合物与硝基还原酶反应的荧光强度比率(F747nm/F805nm)随时间的变化示意图。
图14中(a)为实施例1制备的式(1)所示的化合物与不同浓度硝基还原酶反应的荧光强度比率(F747nm/F805nm)随时间的变化示意图，(b)为实施例1制备的式(1)所示的化合物的荧光强度比率(F747nm/F805nm)随硝基还原酶浓度的变化示意图。
图15为实施例1制备的式(1)所示的化合物与各种分析物反应前后荧光强度比率(F747nm/F805nm)的变化示意图(灰色柱代表探针只经标注的分析物处理，黑色柱代表探针经标注的分析物处理后，再添加硝基还原酶)。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例1：
一种本发明的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针，名称为[2-[2-(4-硝基苄氧羰基)苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，分子式为C47H49IN4O4，结构式如式(1)所示：
上述本实施例的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针的制备方法，其合成路线如图1所示，包括以下步骤：
(1)合成结构式如式(5)所示的1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚：
反应式如式(2)：
具体过程为：将2,3,3-三甲基-3H-吲哚(1.59g,10mmol)溶于硝基甲烷(30mL)中，再向其中加入碘甲烷(2.13g,15mmol)，室温反应24h，有大量固体析出，向其中加入乙醚使其完全沉淀，然后减压过滤，用乙醚淋洗，得固体产物为1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚，产率96％。
(2)合成结构式如式(4)所示的2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯：
反应式如式(3)：
具体过程为：在氩气保护下，将干燥的N,N-二甲基甲酰胺(20mL,273mmol)溶于干燥的二氯甲烷(20mL)，用冰盐浴冷却至0℃，控温0℃缓慢滴加三氯氧磷(17.5ml,115mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液，滴加完反应30min后，将环己酮(5g,50mmol)加入其中，然后将反应液加热至80℃反应3h，反应结束后，将反应液倒入冰水中，静置过夜，有黄色固体析出，减压过滤，得固体产物为2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯，产率92％。
(3)合成结构式如式(3)所示的2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物：
反应式如式(4)：
具体过程为：在双口瓶中加入1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚(1.81g,6mmol)和2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯(518mg,3mmol)，接上分水器，抽换气三次后，在氩气保护下加入正丁醇和甲苯(30mL，v/v＝7:3)。然后，氩气保护下回流搅拌反应10h，反应完毕后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，用乙醚洗涤过滤后，用硅胶色谱柱(二氯甲烷/0-2％甲醇)提纯，得绿色固体产物为2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，产率75％。
式(3)所示的化合物的1H NMR图谱如图2所示，1H NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm)δ8.22(d,J＝14.0Hz,2H),7.61(d,J＝7.2Hz,2H),7.44(t,J＝3.6Hz,4H),7.30-7.26(m,2H),6.28(d,J＝14.4Hz,2H),3.68(s,6H),2.71(t,J＝5.6Hz,4H),1.84(q,J＝5.6Hz,2H),1.67(s,12H)。
式(3)所示的化合物的13C NMR图谱如图3所示，13C NMR(100MHz,d6-DMSO,ppm)δ172.68,152.60,147.70,142.87,142.71,141.02,128.58,126.10,125.16,122.40,111.44,101.89,48.89,31.53,27.34,27.22,25.89,20.45。
式(3)所示的化合物的HRMS图谱如图4所示，HRMS(ESI)for C32H36ClN2 +([M-I]+):calcd:483.25615,found:483.25562。
(4)合成结构式如式(2)所示的2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物：
反应式如式(5)：
具体过程为：在双口瓶中加入2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物(61mg,0.1mmol)，抽换气三次后，在氩气保护下加入无水乙腈(10mL)。溶解后，用微量注射器将苄胺(44μL,0.4mmol)和N,N-二异丙基乙胺(33μL,0.2mmol)加入其中，氩气保护下加热至80℃反应40min，反应完毕后，加入0.1N的盐酸(5mL)淬灭反应，用二氯甲烷(20mL)萃取三次，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱(二氯甲烷/0-2％甲醇)提纯，得蓝色固体产物为2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，产率86％。
式(2)所示的化合物的1H NMR图谱如图5所示，1H NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm)δ8.81(br s,1H),7.57(d,J＝12.8Hz,2H),7.47(t,J＝7.6Hz,2H),7.41-7.37(m,5H),7.30-7.26(m,2H),7.13(d,J＝8.0Hz,2H),7.04(t,J＝7.2Hz,2H),5.72(d,J＝13.2Hz,2H),4.87(d,J＝6.0Hz,2H),3.41(s,6H),2.54(t,J＝6.0Hz,4H),1.75(q,J＝6.4Hz,2H),1.38(s,12H)。
式(2)所示的化合物的13C NMR图谱如图6所示，13C NMR(100MHz,d6-DMSO,ppm)δ168.83,167.76,143.43,139.71,138.25,137.72,128.98,128.03,127.70,127.01,122.45,121.86,119.99,109.00,94.69,52.62,46.92,27.69,25.01,21.27。
式(2)所示的化合物的HRMS图谱如图7所示，HRMS(ESI)for C39H44N3 +([M-I]+):calcd:554.35297,found:554.35223。
(5)合成结构式如式(1)所示的[2-[2-(4-硝基苄氧羰基)苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物：
反应式如式(6)：
具体过程为：在三口瓶中加入化合物2(68mg,0.1mmol)，对硝基氯甲酸苄酯(43.2mg,0.2mmol)加入滴液漏斗中，抽换气三次后，在氩气保护下向三口瓶中加入无水二氯甲烷(20mL)。冰浴至0℃左右，用微量注射器将N,N-二异丙基乙胺(66μL,0.4mmol)加入其中，然后用无水二氯甲烷(10mL)将对硝基氯甲酸苄酯溶解缓慢滴加入其中，加完在氩气保护下缓慢升至室温搅拌反应12～18h。反应完毕后，用0.1M的盐酸(20mL)洗涤两次，饱和碳酸钠溶液(20mL)洗涤一次，饱和食盐水(20mL)洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱(二氯甲烷/0-5％甲醇)提纯得到绿色目标化合物[2-[2-(4-硝基苄氧羰基)苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，产率40％。
式(1)所示的化合物的1HNMR图谱如图8所示，1H NMR(400MHz,CD2Cl2,ppm)δ8.06-8.04(d,J＝8.4Hz,2H),7.43-7.34(m,8H),7.31-7.28(t,J＝7.2Hz,4H),7.25-7.21(t,J＝7.6Hz,3H),7.16-7.14(d,J＝8.0Hz,2H),6.11-6.08(d,J＝14.0Hz,2H),5.18(s,2H),4.78(s,2H),3.58(s,6H),2.85-2.81(m,2H),2.64-2.59(m,2H),2.11(br,1H),2.04(br,1H),1.31(s,6H),1.22(s,6H)。
式(1)所示的化合物的13C NMR图谱如图9所示，13C NMR(100MHz,CD2Cl2,ppm)δ172.9,155.6,154.6,144.0,143.2,142.6,141.1,136.9,131.0,129.3,129.1,129.0,128.3,125.7,124.0,122.5,111.1,101.6,66.5,56.1,49.3,32.3,28.3,28.1,27.8,25.6,21.3。
式(1)所示的化合物的HRMS图谱如图10所示，HRMS(ESI)for C47H49N4O4 +([M-I]+):calcd:733.3748,found:733.3762。
上述本实施例制得的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针的应用，将10mMPBS,pH＝7.4的缓冲溶液和50μM NADPH加入比色皿中，加入本实施例制得的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针混合均匀后，再加入待测溶液进行测试，该待测溶液中无硝基还原酶时，所述反应溶液的最大荧光发射波长位于805nm处，当加入硝基还原酶后，所述反应溶液的805nm处的荧光减弱，最大荧光发射波长蓝移至747nm处。
上述本实施例制得的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针的应用研究：
1、pH值对式(1)所示的化合物和式(2)所示的化合物荧光性质的影响
取实施例1合成的式(1)所示的化合物和式(2)所示的化合物溶于二甲基亚砜中，分别制成2mmol/L的储备液。当pH值不同时，在37℃下以689nm为激发光测量式(1)所示的化合物和式(2)所示的化合物的荧光性质，结果如图11所示。实验结果表明，图(a)式(1)所示的化合物荧光强度在805nm处和式(2)所示的化合物荧光强度在747nm处在生理pH 6.0～8.0范围内几乎不变；图(b)式(1)所示的化合物和式(2)所示的化合物荧光强度比率(F747nm/F805nm)在pH 6.0～8.0几乎保持不变。
2、式(1)所示的化合物与硝基还原酶反应的吸收光谱和荧光光谱研究
在最佳测试条件下，即10mM PBS，pH＝7.4，37℃，50μM NADPH，研究式(1)所示的化合物与硝基还原酶的吸收光谱和荧光光谱性质，结果如图12和图13所示。图12中(a)为式(1)所示的化合物与硝基还原酶反应的吸收光谱变化，(b)为吸光度在645nm和782nm处随时间的变化；图13中(a)为式(1)所示的化合物与硝基还原酶反应的荧光光谱变化，(b)为荧光强度比率(F747nm/F805nm)随时间的变化。
3、式(1)所示的化合物检测硝基还原酶的灵敏度研究
图14中(a)为不同硝基还原酶浓度(0–0.25μg/mL)条件下，式(1)所示的化合物与硝基还原酶反应的荧光强度比率(F747nm/F805nm)随时间的变化，(b)为荧光强度比率(F747nm/F805nm)随硝基还原酶浓度的变化。从图14(a)可知，硝基还原酶浓度越高会使荧光强度比率(F747nm/F805nm)变化更快和更大。由图14(b)可以推算出(1)所示的化合物检测硝基还原酶的检测限为0.0058ng/mL。
4、式(1)所示的化合物对硝基还原酶的选择性研究
图15为式(1)所示的化合物与各种分析物，包括常见金属离子如钠离子(Na+)、钾离子(K+)、钙离子(Ca2+)、镁离子(Mg2+)，活性氧如过氧化氢(H2O2)、次氯酸(ClO-)、过氧叔丁醇(tBuOOH)、超氧阴离子(O2 -)，活性氮如一氧化氮(NO)、亚硝酸盐(NO2 -)、硝酸盐(NO3 -)，生物相关物质如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)、二硫苏糖醇(DTT)、葡萄糖(glucose)和硝基还原酶(nitroreductase)，反应前后荧光强度比率(F747nm/F805nm)进行研究。结果证明，式(1)所示的化合物对硝基还原酶的检测具有高度的选择性。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
Claims (6)
1.一种检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针，其特征在于：所述检测硝基还原酶的新型荧光探针为[2-[2-(4-硝基苄氧羰基)苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，结构式如式(1)：
2.一种如权利要求1所述的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针的制备方法，其特征在于：将2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物与对硝基氯甲酸苄酯反应，得到式(1)所示的化合物，反应式如下：
3.根据权利要求2所述的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针的制备方法，其特征在于：具体制备过程为：在氩气保护下，将2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物和N,N-二异丙基乙胺溶于干燥的二氯甲烷中，将上述反应液冷却至0℃，将对硝基氯甲酸苄酯溶于干燥的二氯甲烷缓慢滴加至其中，加完缓慢升至室温反应12～18h；反应完毕后，用0.1N的盐酸洗涤两次，饱和氯化钠溶液洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱提纯，得绿色固体产物为[2-[2-(4-硝基苄氧羰基)苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物。
4.根据权利要求3所述的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针的制备方法，其特征在于：2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物与对硝基氯甲酸苄酯的摩尔比为1∶1.0～2.0。
5.一种如权利要求1所述的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针或权利要求2～4任一项所述的制备方法制得的检测硝基还原酶的新型近红外比率荧光探针的应用，其特征在于：将所述硝基还原酶新型近红外比率荧光探针与磷酸缓冲盐溶液和电子供体还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸混合，再加入待测溶液中，得到混合溶液，利用两个不同发射波长处荧光强度的变化来检测硝基还原酶的存在与否。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述待测溶液中无硝基还原酶时，所述反应溶液的最大荧光发射波长位于805nm处，当加入硝基还原酶后，所述反应溶液的805nm处的荧光减弱，最大荧光发射波长蓝移至747nm处。
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