CN109134344A - 一种检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针及其制备方法和应用，该探针为2‑[2‑[2‑(4‑叠氮苄氧羰基)苄胺基‑3‑[(1,3‑二氢‑1,3,3‑三甲基‑2H‑吲哚‑2‑亚基)亚乙基]‑1‑环己烯‑1‑基]乙烯基]‑1,3,3‑三甲基吲哚鎓碘化物。制备方法包括：1,2,3,3‑四甲基‑3H‑碘代吲哚与2‑氯‑1‑甲酰基‑3‑羟甲基环己烯脱水缩合反应；所得2‑[2‑[2‑氯‑3‑[(1,3‑二氢‑1,3,3‑三甲基‑2H‑吲哚‑2‑亚基)亚乙基]‑1‑环己烯‑1‑基]乙烯基]‑1,3,3‑三甲基吲哚鎓碘化物与苄胺反应；所得2‑[2‑[2‑苄胺基‑3‑[(1,3‑二氢‑1,3,3‑三甲基‑2H‑吲哚‑2‑亚基)亚乙基]‑1‑环己烯‑1‑基]乙烯基]‑1,3,3‑三甲基吲哚鎓碘化物与氯甲酸对叠氮基苄酯反应，得到上述荧光探针。该探针对硫化氢的检测表现出较高的选择性。

Description

一种检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，尤其涉及一种检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
在生理浓度下，硫化氢在许多生理和病理过程中扮演着重要的角色，包括神经传递、血管舒张、心肌保护、血管生成和抗炎等。如果硫化氢浓度超出生理水平范围，则会引起包括痴呆症、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化等各种严重的疾病。因此，开发和研究可以选择性检测生物体系中硫化氢的技术，对充分了解它在生物体内生理和病理过程中所扮演的角色具有重要意义。随着探针技术的发展，高灵敏度、高选择性的硫化氢荧光检测技术已经成功实现。目前，这些探针的设计都是以化学反应为基础，利用与硫化氢发生特异性化学反应进行识别，主要包括硫化氢与铜离子络合，硫解二硝基苯醚，亲核反应和还原叠氮、硝基或羟胺等。然而，这些探针分子大多数的吸收波长和发射波长都处在可见光区，这使得这些探针很难很好的应用在生物样品的成像分析中。因为许多生物体及其组织在可见光的激发下自身会发射荧光，严重干扰生物样品的荧光检测，如血浆中血清蛋白的荧光波长范围为325-350nm，还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶(NADPH)和胆红素的荧光波长范围为430-470nm，导致荧光信号的背景很强，降低了探针应用的信噪比，使灵敏度和准确性受到了很大的影响。近红外荧光探针的最大吸收波长和发射波长为600-900nm，可有效消除生物样品的自发荧光和自吸收所造成的背景干扰。因此近红外荧光探针在生物样品分析中有明显的优越性。另外，这些探针分子大多数通过单波长的荧光强度变化对硫化氢进行检测，荧光强度往往易受外部环境(如温度)、样品本身(如浓度)、仪器条件(如光散射、光漂白、背景光)等因素的影响，不能提供足够的精度进行定量检测。具有自校正作用的，通过两个波长的变化指示识别的比率型荧光探针则能很好的进行定量检测。因此，对硫化氢具有选择性响应的近红外比率测量型荧光探针的设计和应用具有非常重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种选择性好、快速简便的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针，还相应提供该检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的制备方法及应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针，所述检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针为2-[2-[2-(4-叠氮苄氧羰基)苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，结构式如式(1)：
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷反应，得到1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚，结构式如式(5)：
(2)环己酮进行维尔斯迈尔(Vilsmeier)反应，得到2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯，结构式如式(4)：
(3)步骤(1)所得的1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚与步骤(2)所得的2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯通过脱水缩合反应，得到2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，结构式如式(3)：
(4)步骤(3)所得的2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物与苄胺反应，得到2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，结构式如式(2)：
(5)4-氨基苯甲醇发生叠氮化反应，得到4-叠氮基苯甲醇，结构式如式(6)：
(6)步骤(5)所得的4-叠氮基苯甲醇生成中间体氯甲酸对叠氮基苄酯与步骤(4)所得的2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物反应，得到式(1)所示的化合物。
优选的，所述步骤(1)的具体过程为：
将2,3,3-三甲基-3H-吲哚溶于硝基甲烷中，再向其中加入碘甲烷，室温反应24h，有大量固体析出，向其中加入乙醚使其完全沉淀，然后减压过滤，用乙醚淋洗，得固体产物为1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚。
优选的，所述2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷的摩尔比为1∶1.0～2.0。
优选的，所述步骤(2)的具体过程为：
在氩气保护下，将干燥的N,N-二甲基甲酰胺溶于干燥的二氯甲烷，用冰盐浴冷却至0℃，控温0℃缓慢滴加三氯氧磷的二氯甲烷溶液，滴加完反应30min后，将环己酮加入其中，然后将反应液加热至80℃反应3h，反应结束后，将反应液倒入冰水中，静置过夜，有黄色固体析出，减压过滤，得固体产物为2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯。
优选的，所述环己酮进行维尔斯迈尔反应的温度为25～80℃。
优选的，所述步骤(3)的具体过程为：
在双口瓶中加入1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚和2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯，接上分水器，抽换气三次后，在氩气保护下加入正丁醇和甲苯(30mL，v/v＝7:3)。然后，氩气保护下回流搅拌反应10h，反应完毕后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，用乙醚洗涤过滤后，用硅胶色谱柱(二氯甲烷/0-2％甲醇)提纯，得绿色固体产物为2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物。
优选的，所述2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯与1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚的摩尔比为1∶2.0～2.2。
优选的，所述步骤(4)的具体过程为：
在双口瓶中加入2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，抽换气三次后，在氩气保护下加入无水乙腈。溶解后，用微量注射器将苄胺和N,N-二异丙基乙胺加入其中，氩气保护下加热至80℃反应40min，反应完毕后，加入0.1N的盐酸淬灭反应，用二氯甲烷萃取三次，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱(二氯甲烷/0-2％甲醇)提纯，得蓝色固体产物为2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物。
优选的，所述2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物与苄胺的摩尔比为1∶1.0～1.5。
优选的，所述步骤(5)的具体过程为：
4-氨基苯甲醇用4N硫酸(15mL)溶解，并冷却至0℃。然后将亚硝酸钠溶于水溶解后滴加入其中，控温0℃反应30min后，将叠氮化钠溶于水溶解后滴加入至上述反应液中，缓慢升至室温反应1h，反应结束后，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，过硅胶色谱柱(石油醚/0-10％乙酸乙酯)提纯，得微黄色固体产物为4-叠氮基苯甲醇。
优选的，所述4-氨基苯甲醇与亚硝酸钠和叠氮化钠的摩尔比为1∶1.5～2.0∶1.5～3.0。
优选的，所述步骤(6)的具体过程为：
在三口瓶中加入无水碳酸钠，高温除水后冷却到室温，抽换气三次后，在氩气保护下向其中加入无水甲苯，冰浴至0℃左右，滴加三光气的甲苯溶液，滴加完0℃搅拌30min后，滴加4-叠氮基苯甲醇的甲苯溶液，滴加完缓慢升至室温反应5h，反应完毕后用氩气赶走剩余的光气1h，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到中间体氯甲酸对叠氮基苄酯，真空干燥后将其用无水二氯甲烷溶解，控温0℃缓慢滴加到2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物和N,N-二异丙基乙胺的二氯甲烷溶液中，加完缓慢升至室温反应12～18h。反应完毕后用0.1N的盐酸洗涤两次，饱和碳酸钠溶液洗涤一次，饱和氯化钠溶液洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱(二氯甲烷/0-5％甲醇)提纯，得绿色固体产物为2-[2-[2-(4-叠氮苄氧羰基)苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物。
优选的，所述2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物与4-叠氮基苯甲醇的摩尔比为1∶1.0～2.0。
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针或上述的制备方法制得的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的应用，将所述硫化氢新型近红外比率荧光探针与4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液和二甲基亚砜(DMSO)的缓冲液混合，再加入待测溶液中，得到混合溶液，利用两个不同发射波长处荧光强度变化来检测硫化氢的存在与否。
优选的，所述待测溶液中无硫化氢时，所述反应溶液的最大荧光发射波长位于810nm处，当加入硫化氢后，所述反应溶液的810nm处的荧光减弱，最大荧光发射波长蓝移至744nm处。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明的一种检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针是以叠氮基为识别单元的荧光探针，实践表明，本发明的荧光探针分子在对硫化氢进行检测时表现出了较高的选择性。
3、本发明的一种检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的制备方法，近红外荧光团合成简单，且后处理过程容易，适于工业化生产。
附图说明
图1为实施例1的式(1)所示的化合物(即检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针)的合成路线图。
图2为实施例1制备的式(3)所示的化合物的1H NMR图谱。
图3为实施例1制备的式(3)所示的化合物的13C NMR图谱。
图4为实施例1制备的式(3)所示的化合物的HRMS图谱。
图5为实施例1制备的式(2)所示的化合物的1H NMR图谱。
图6为实施例1制备的式(2)所示的化合物的13C NMR图谱。
图7为实施例1制备的式(2)所示的化合物的HRMS图谱。
图8为实施例1制备的式(1)所示的化合物的1H NMR图谱。
图9为实施例1制备的式(1)所示的化合物的13C NMR图谱。
图10为实施例1制备的式(1)所示的化合物的HRMS图谱。
图11中(a)为pH值对实施例1制备的式(1)所示的化合物(810nm)和式(2)所示的化合物(744nm)荧光强度的影响示意图，(b)为pH值对实施例1制备的式(1)所示的化合物和式(2)所示的化合物的荧光强度比率(F744nm/F810nm)的影响示意图。
图12中(a)为实施例1的式(1)所示的化合物与硫化氢反应的吸收光谱变化示意图，(b)为实施例1的式(1)所示的化合物与硫化氢反应的荧光光谱变化示意图。
图13中(a)为各种阴离子对实施例1的式(1)所示的化合物与硫化氢反应荧光强度比率(F744nm/F810nm)的影响示意图，(b)为活性硫、活性氧、活性氮和生物硫醇对实施例1的式(1)所示的化合物与硫化氢反应荧光强度比率(F744nm/F810nm)的影响示意图。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例1：
一种本发明的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针，名称为2-[2-[2-(4-叠氮苄氧羰基)苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，分子式为C47H49IN6O2，结构式如式(1)所示：
上述本实施例的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的制备方法，其合成路线如图1所示，包括以下步骤：
(1)合成结构式如式(5)所示的1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚：
反应式如式(2)：
具体过程为：将2,3,3-三甲基-3H-吲哚(1.59g,10mmol)溶于硝基甲烷(30mL)中，再向其中加入碘甲烷(2.13g,15mmol)，室温反应24h，有大量固体析出，向其中加入乙醚使其完全沉淀，然后减压过滤，用乙醚淋洗，得固体产物为1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚，产率96％。
(2)合成结构式如式(4)所示的2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯：
反应式如式(3)：
具体过程为：在氩气保护下，将干燥的N,N-二甲基甲酰胺(20mL,273mmol)溶于干燥的二氯甲烷(20mL)，用冰盐浴冷却至0℃，控温0℃缓慢滴加三氯氧磷(17.5ml,115mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液，滴加完反应30min后，将环己酮(5g,50mmol)加入其中，然后将反应液加热至80℃反应3h，反应结束后，将反应液倒入冰水中，静置过夜，有黄色固体析出，减压过滤，得固体产物为2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯，产率92％。
(3)合成结构式如式(3)所示的2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物：
反应式如式(4)：
具体过程为：在双口瓶中加入1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚(1.81g,6mmol)和2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯(518mg,3mmol)，接上分水器，抽换气三次后，在氩气保护下加入正丁醇和甲苯(30mL，v/v＝7:3)。然后，氩气保护下回流搅拌反应10h，反应完毕后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，用乙醚洗涤过滤后，用硅胶色谱柱(二氯甲烷/0-2％甲醇)提纯，得绿色固体产物为2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，产率75％。
式(3)所示的化合物的1H NMR图谱如图2所示，1H NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm)δ8.22(d,J＝14.0Hz,2H),7.61(d,J＝7.2Hz,2H),7.44(t,J＝3.6Hz,4H),7.30-7.26(m,2H),6.28(d,J＝14.4Hz,2H),3.68(s,6H),2.71(t,J＝5.6Hz,4H),1.84(q,J＝5.6Hz,2H),1.67(s,12H)。
式(3)所示的化合物的13C NMR图谱如图3所示，13C NMR(100MHz,d6-DMSO,ppm)δ172.68,152.60,147.70,142.87,142.71,141.02,128.58,126.10,125.16,122.40,111.44,101.89,48.89,31.53,27.34,27.22,25.89,20.45。
式(3)所示的化合物的HRMS图谱如图4所示，HRMS(ESI)for C32H36ClN2 +([M-I]+):calcd:483.25615,found:483.25562。
(4)合成结构式如式(2)所示的2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物：
反应式如式(5)：
具体过程为：在双口瓶中加入2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物(61mg,0.1mmol)，抽换气三次后，在氩气保护下加入无水乙腈(10mL)。溶解后，用微量注射器将苄胺(44μL,0.4mmol)和N,N-二异丙基乙胺(33μL,0.2mmol)加入其中，氩气保护下加热至80℃反应40min，反应完毕后，加入0.1N的盐酸(5mL)淬灭反应，用二氯甲烷(20mL)萃取三次，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱(二氯甲烷/0-2％甲醇)提纯，得蓝色固体产物为2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，产率86％。
式(2)所示的化合物的1H NMR图谱如图5所示，1H NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm)δ8.81(br s,1H),7.57(d,J＝12.8Hz,2H),7.47(t,J＝7.6Hz,2H),7.41-7.37(m,5H),7.30-7.26(m,2H),7.13(d,J＝8.0Hz,2H),7.04(t,J＝7.2Hz,2H),5.72(d,J＝13.2Hz,2H),4.87(d,J＝6.0Hz,2H),3.41(s,6H),2.54(t,J＝6.0Hz,4H),1.75(q,J＝6.4Hz,2H),1.38(s,12H)。
式(2)所示的化合物的13C NMR图谱如图6所示，13C NMR(100MHz,d6-DMSO,ppm)δ168.83,167.76,143.43,139.71,138.25,137.72,128.98,128.03,127.70,127.01,122.45,121.86,119.99,109.00,94.69,52.62,46.92,27.69,25.01,21.27。
式(2)所示的化合物的HRMS图谱如图7所示，HRMS(ESI)for C39H44N3 +([M-I]+):calcd:554.35297,found:554.35223。
(5)合成结构式如式(6)所示的4-叠氮基苯甲醇：
反应式如式(6)：
具体过程为：4-氨基苯甲醇(1.48g,12mmol)用4N硫酸(15mL)溶解，并冷却至0℃。然后将亚硝酸钠(1.66g,24mmol)溶于水(10mL)溶解后滴加入其中，控温0℃反应30min后，将叠氮化钠(2.34g,36mmol)溶于水(10mL)溶解后滴加入至上述反应液中，缓慢升至室温反应1h，反应结束后，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，过硅胶色谱柱(石油醚/0-10％乙酸乙酯)提纯，得微黄色固体产物为4-叠氮基苯甲醇，产率90％。
(6)合成结构式如式(1)所示的2-[2-[2-(4-叠氮苄氧羰基)苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物：
反应式如式(7)：
具体过程为：在三口瓶中加入无水碳酸钠(1.59g,10mmol)，高温除水后冷却到室温，抽换气三次后，在氩气保护下向其中加入无水甲苯(5mL)，冰浴至0℃左右，滴加三光气(592mg,2mmol)的甲苯溶液(10mL)，滴加完0℃搅拌30min后，滴加4-叠氮基苯甲醇(149mg,1mmol)的甲苯溶液(10mL)，滴加完缓慢升至室温反应5h，反应完毕后用氩气赶走剩余的光气1h，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到中间体氯甲酸对叠氮基苄酯，真空干燥后将其用无水二氯甲烷(10mL)溶解，控温0℃缓慢滴加到2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物(68mg,0.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(132μL,0.8mmol)的二氯甲烷溶液(20mL)中，加完缓慢升至室温反应12～18h。反应完毕后用0.1N的盐酸(20mL)洗涤两次，饱和碳酸钠溶液(20mL)洗涤一次，饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱(二氯甲烷/0-5％甲醇)提纯，得绿色固体产物为2-[2-[2-(4-叠氮苄氧羰基)苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，产率20％。
式(1)所示的化合物的1H NMR图谱如图8所示，1H NMR(400MHz,CD2Cl2,ppm)δ7.42-7.35(m,5H),7.32-7.17(m,12H),6.85(d,J＝8.0Hz,2H),6.07(d,J＝14.0Hz,2H),5.04(s,2H),4.75(s,2H),3.58(s,6H),2.84-2.80(m,2H),2.61-2.58(m,2H),2.12(br,1H),1.85(br,1H),1.32(s,6H),1.23(s,6H)。
式(1)所示的化合物的13C NMR图谱如图9所示，13C NMR(100MHz,CD2Cl2,ppm)δ172.80,155.92,155.03,143.20,142.73,141.17,140.24,137.05,133.39,130.96,129.79,129.25,129.06,128.82,128.35,125.56,122.45,119.31,111.01,101.49,67.32,55.93,49.32,32.24,30.06,28.02,27.77,25.51,21.27。
式(1)所示的化合物的HRMS图谱如图10所示，HRMS(ESI)for C47H49N6O2 +([M-I]+):calcd:729.39115,found:729.39144。
上述本实施例制得的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的应用，将10mMHEPES,100mM NaCl,10％DMSO,pH＝7.4的缓冲溶液2mL加入比色皿中，加入本实施例制得的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针混合均匀后，再加入待测溶液进行测试，该待测溶液中无硫化氢时，所述反应溶液的最大荧光发射波长位于810nm处，当加入硫化氢后，所述反应溶液的810nm处的荧光减弱，最大荧光发射波长蓝移至744nm处。
上述本实施例制得的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的应用研究：
1、pH值对式(1)所示的化合物和式(2)所示的化合物的荧光的影响
取实施例1合成的式(1)所示的化合物和式(2)所示的化合物溶于二甲基亚砜中，分别制成2mmol/L的储备液。当pH值不同时，在室温下以676nm为激发光测量式(1)所示的化合物和式(2)所示的化合物的荧光性质，结果如图11所示。实验结果表明，在生理pH6.0～8.0范围内图(a)式(1)所示的化合物荧光强度在810nm处和式(2)所示的化合物荧光强度在744nm处几乎不变；图(b)式(1)所示的化合物和式(2)所示的化合物荧光强度比率(F744nm/F810nm)在pH6.0～8.0几乎保持不变。
2、式(1)所示的化合物与硫化氢反应的吸收光谱和荧光光谱研究
在10mM HEPES,100mM NaCl,10％DMSO,pH＝7.4，研究式(1)所示的化合物与硫化氢反应的吸收光谱和荧光光谱性质，结果如图12所示。图12中(a)图为式(1)所示的化合物与硫化氢反应的吸收光谱图，(b)图为式(1)所示的化合物与硫化氢反应的荧光光谱图。化合物1与硫化氢反应，786nm处的吸收强度减弱，与之同时在645nm处一个新的吸收峰不断增强，如图10(a)所示；化合物1与硫化氢反应，810nm处的荧光发射强度逐渐减弱，与之同时在744nm处一个新的荧光发射峰不断增强，如图10(b)所示。
3、式(1)所示的化合物对硫化氢的选择性研究
为测试式(1)所示的化合物对硫醇的选择性，对式(1)所示的化合物与其它各种分析物(图3.5)包括阴离子如氯化盐(Cl-)、溴化盐(Br-)、碘化盐(I-)、叠氮盐(N3 -)、醋酸盐(AcO-)、碳酸氢盐(HCO3 -)、磷酸氢盐(HPO4 2-)，活性硫如硫氰酸盐(SCN-)、亚硫酸氢盐(HSO3 -)、亚硫酸盐(SO3 2-)、硫代硫酸盐(S2O3 2-)、连二亚硫酸盐(S2O4 2-)、焦亚硫酸盐(S2O5 2-)，活性氧如过氧化氢(H2O2)、次氯酸(ClO-)、过氧叔丁醇(TBHP)、超氧阴离子(O2 -)，活性氮如一氧化氮(NO)、亚硝酸盐(NO2 -)、硝酸盐(NO3 -)，以及生物硫醇如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)，反应后荧光强度比率(F744nm/F810nm)进行了实验研究，结果如图13所示。由图13可知，式(1)所示的化合物对硫化氢的检测具有高度的选择性。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针，其特征在于，所述检测硫化氢的新型荧光探针为2-[2-[2-(4-叠氮苄氧羰基)苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，结构式如式(1)：
2.一种如权利要求1所述的检测过氧化氢的新型近红外比率荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷反应，得到1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚，结构式如式(5)：
(2)环己酮进行维尔斯迈尔(Vilsmeier)反应，得到2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯，结构式如式(4)：
(3)步骤(1)所得的1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚与步骤(2)所得的2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯通过脱水缩合反应，得到2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，结构式如式(3)：
(4)步骤(3)所得的2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物与苄胺反应，得到2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物，结构式如式(2)：
(5)4-氨基苯甲醇发生叠氮化反应，得到4-叠氮基苯甲醇，结构式如式(6)：
(6)步骤(5)所得的4-叠氮基苯甲醇生成中间体氯甲酸对叠氮基苄酯与步骤(4)所得的2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物反应，得到式(1)所示的化合物。
3.根据权利要求2所述的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷的摩尔比为1∶1.0～2.0。
4.根据权利要求2所述的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，环己酮进行维尔斯迈尔反应的温度为25～80℃。
5.根据权利要求2所述的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯与1,2,3,3-四甲基-3H-碘代吲哚的摩尔比为1∶2.0～2.2。
6.根据权利要求2所述的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物与苄胺的摩尔比为1∶1.0～1.5。
7.根据权利要求2所述的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，4-氨基苯甲醇与亚硝酸钠和叠氮化钠的摩尔比为1∶1.5～2.0∶1.5～3.0。
8.根据权利要求2所述的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，2-[2-[2-苄胺基-3-[(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,3,3-三甲基吲哚鎓碘化物与4-叠氮基苯甲醇的摩尔比为1∶1.0～2.0。
9.一种如权利要求1所述的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针或权利要求2～8任一项所述的制备方法制得的检测硫化氢的新型近红外比率荧光探针的应用，其特征在于，将所述硫化氢新型近红外比率荧光探针与4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液和二甲基亚砜的缓冲液混合，再加入待测溶液中，得到混合溶液，利用两个不同发射波长处荧光强度的变化来检测硫化氢的存在与否。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述待测溶液中无硫化氢时，所述反应溶液的最大荧光发射波长位于810nm处，当加入硫化氢(以硫化钠作为前体)后，所述反应溶液的810nm处的荧光减弱，最大荧光发射波长蓝移至744nm处。
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